DD301762A9 - Verfahren zur enzymatischen hydrolyse von proteinen - Google Patents

Abstract

Das Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Proteinen ist anwendbar zur Herstellung von Zellzucht- und bakteriologischen Nährmedien in der Diagnostik und Impfstoffproduktion. Die Aufgabe der Erfindung, den Verfahrensablauf der bekannten Hydrolyse von Proteinen mittels Prankreasemulsion so zu verändern, daß keine zelltoxischen Substanzen entstehen, wird dadurch gelöst, daß der Pankreasemulsion Trypsin zugesetzt wird und die Hydrolyse unter aseptischen Bedingungen durchgeführt wird. Die aseptischen Bedingungen werden dadurch erreicht, daß dem proteolytischen Enzymgemisch Peressigsäure zugesetzt wird oder die Abbautemperatur 60 Grad C beträgt. Die so erhaltenen Spaltprodukte enthalten einen hohen Gehalt an freien Aminosäuren und wirken nicht zelltoxisch.{Enzymatische Hydrolyse; Protein; Zellsuchtmedium; bakteriologische Nährmedien; Diagnostik; Impfstoffproduktion; Pankreasemulsion; Trypsin; aseptische Bedingungen; Peressigsäure; Temperatur}

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Das Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Proteinen wird zur Herstellung von Stickstoffquellen für Gewebezellen und Bakterien in der Diagnostik und Impfstoffproduktion der Human- und Veterinärmedizin verwendet.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Stickstoffquellen für Zellzuchtmedien

BAKER et al. (1928) stellten als erste Laktalbuminhydrolysat durch Spaltung von Laktalbumin mit Pepsin her. Aus neueren Firmenschriften ist bekannt, daß das Laktalbumin enzymatisch gespalten wird. Analytische Untersuchungen beweisen, daß gegenwärtig zum Abbau kein Pepsin mehr genommen wird. DÖHNER (1959), BATHKE (1963), SOVETOVA et al. (1966) und die Patentschrift DP 149273 verwenden zur Herstellung von Partialhydrolysaten für Zellzuchtmedien das Enzym gemisch der Pankreasdrüse. Während DÖHNER (1959) Laktalbumin als Substrat verwendet, nimmt BATHKE (1963) Vollmilch, SOVETOVA et al. (1966) und die Patentschrift DD 149273 verwenden Serumproteine bzw. Serumalbumin derGammaglobulinproduktion. Zur Herstellung von Hydrolysaten für die Zellzucht werden bevorzugt Albumin verwendet. Da Stickstoffque.len für Zellzuchtmedien in erster Linie der Aminosauresubstitution dienen, sollen 6;gse in hoher und spezifischer Konzentration enthalten sein (EAGLE, 1955; MORGAN et al. 1950; HERLY et al. 1955). Die für Gewebezellen spezifische Aminosäurezusammensetzung gewährleistet bevorzugt Albumin, vorzugsweise das Laktalbumin (FLASCHENTRÄGER et al., 1951).

Da in der Molke nur etwa 0,5% Laktalbumin enthalten sind, ist die Gewinnung sehr mühsam und arbeitsaufwendig. Die großtechnische, aseptische Gewinnung von Laktalbumin ist sehr erschwert, deshalb ist es sehr schwer, aus dem Substrat Hydrolysate herzustellen, die keine zelltoxischen Substanzen enthalten (DÖHNER, 1959).

Stickstoffquellen für bakteriologische Nährmedien

Die wichtigsten Ausgangsmaterialien für bakteriologische Nährmedien sind Fleischprotein und Casein. Siö werden nach einem Vorschlag von HOTTINGER (1913) auch heute noch mit Pankreas im alkalischen Milieu bei 37°C bis 48^CC gespalten (SU 418525). Da im Pankreas neben den Proteasen noch weitere Enzyme wie Lipasen und Amylasen enthalten sind, treten auch Kohlenhydrat- und Fettsäureprodukte auf, die z.T. auf Bakterien toxisch wirken können. Da die Pankreasdrüse eine gute Nährgrundlage für Bakterien darstellt, ist sis stark bakteriell verunreinigt. Durch diese Bakterien gelangen Lipopolysaccaride (Pyrogene) in das gespaltene Proteinsubstrat und führen zur Unverträglichkeit für einzelne Mikroorganismen. Wenn sie dennoch häufig verwendet werden, so deshalb, weil sie das Protein tief in freie Aminosäuren zu spalten vermögen (KRAMPITZ, I958).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist ein ökonomisches und für Substrate der Zellzucht und bakteriologischer Medien einsetzbares Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Proteinen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, den Verfahrensablauf der bekannten enzymatischen Hydrolyse von Proteinen mittels Pankreasdrüsen so zu verändern, daß die für Gewebezellen und Bakterien toxischen Stoffe wie Fettsäuren und Pyrogenu auf ein Mindestmaß reduziert werden.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die Substratspaltupg unter aseptischen Bedingungen erfolgt und der bekannten Pankreasemulsion bakterienfreies Trypsin zur Erhöhung der Proteaseaktivität zugesetzt wird. Der Zusatz sollte mindestens 1,8g (4 χ 10⁰E) Trypsin pro 100ml Pankreasemulsion (4 χ 10⁵E) betragen. Um aseptische Bedingungenzu erhalten.

wird der Pankreasemulsion erfindungsgomäß pro Liter 1 bis 3 ml Peressigsäure zugesetzt, oder der enzymatischa Abbau wird bei Temperaturen von 55⁰C bis 65⁰C, vorzugsweise bei 6O⁰C durchgeführt.

Als Substrate können alle bekannten Proteine verwendet werden. Erfindungsgemäß eignen sich besonders gut Proteinsubstrate aus Voüei »zw. Eiklar mit Serum im Verhältnis 1:6 bis 1:0 (g/g). Unter diesen Bedingungen wird der Bakteriengehalt während der enzymatischen Spaltung drastisch gesenkt und dadurch pyrogenfreie Lösungen mit hohem Gehalt an freien Aminosäuren erhalten. Die so erhaltenen Spaltprodukte enthalten neben den erforderlichen freien Aminosäuren auch die für Gewebozellen und Bakterien notwendigen Peptide und Spurenelemente. Zelltoxische Produkte, wie Pyrogene, Ammoniak, Fettsäuren und höhere Peptide sind nicht enthalten bzw. so stark reduziert, daß sie nicht als zelltoxische Substanzen wirksam werden. Das richtige Verhältnis freier Aminosäuren zu Peptiden mit dem erforderlichen Molgewicht kann im Sephadexdiagramm nachgewiesen werden.

Ausführ jngen siehe (KLUDAS u. Mitarbeiter, 1987 im Druck) und modifiziert nach KLUDAS et al., im Druck.

Die vorhandenen Peaks müssen eine charakteristische Verteilung aufweisen (siehe Diagramm) und geben somit einen Hinweis auf die Qualität des Produktes für die Zellzüchtung und Kultivierung von Bakterien.

Die nach beschriebenem Verfahren hergestellten Partialhydrolysate sind für Gewebezellen und ernährungsmäßig empfindliche Bakterien gute Stickstoffquellen, die keine oder kaum noch zeilschädigende Substanzen enthalten.

Ausführuniisbeisplele Beispiel 1

Die Eiweißspaltung erfolgt mit 8,5g Pankreas (5,1 χ 10⁴E) pro 100g Feuchtprotein, z.B. Fleisch oder Vollei mit Serum im Verhältnis 1:6 bei pH 8,0, einer Temperatur von 60⁰C und einer Einwirkungszeit von 5 Stunden. Die Beendigung der Spaltung erfolgt nach für diesen Produktionszweig bekannten Methoden.

Beispiel 2

Die Eiweißspaltung erfolgt mit 20ml Pankreasemulsion (8 10⁴E), die mit 0,3% Peressigsäure versetzt ist und 60mg Trypsin (1,4 10⁴E) pro 100g Feuchtprotein, z.B. Fleisch oder Vollei mit Serum im Verhältnis 1:6 (g/g) bei pH 8,0. Man läßt ohne pH-Korrektur während der Verdauungszeit von 5 Stunden bei 48⁰C den pH auf 7,0 sinken. Die Beendigung der Spaltung erfolgt bei pH 7,0 und kurzem Aufkochen. Die pH-Einstellung erfolgt nach für diesen Produktionszweig bekannten Methoden.

Claims (5)

1. Verfahren zur enzymatischem Hydrolyse von Proteinen mittels Pankreasemulsion, gekennzeichnet dadurch, daß während der Spaltung des Proteinsubstrates aseptische Bedingungen hergestellt werc'en und der Pankreasemulsion Trypsin zugesetzt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß zu 100ml Pank/easemulsion (3,0· :0⁵-6,0 · 10⁵E) mindestens 1,8g (4 · 10⁶E) Trypsin zugesetzt werden.

3. Verfahr ^n gemäß Ansprüchen 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die aseptischen Bedingungen durch Zusatz von 1 bis 3ml Peressigsäure oder Chloroform, Toluol, ß-Propiolacton pro Liter Pankreasemulsion hergestellt werden.

4. Verfahren iieinäß Ansprüchen 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die aseptischen Bedingungen durch Erhöhung der Abbautemperatur auf 60⁰C hergestellt werden

5. Verfahren ge maß Ansprüchen 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß als Proteinsubstrat Vollei oder Eiklar mit Sei um im Verhältnis 1:6 bis 1:0 (g/g) verwendet wird.