DD301912A9 - Nisin-Zusammensetzungen fuer die Anwendung als aktivierte Breitspektrumbakterizide - Google Patents

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Sara-Ann Gusik
Stephen D Rubino
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Abstract

Bakteriocin-Zusammensetzungen, die aus lanthioninhaltigen Bakteriocinen und nicht-bakteriziden Stoffen bestehen. Wenn die Bakteriocin-Zusammensetzungen mit einer geeigneten Trägersubstanz verbunden werden, wobei jeder Bestandteil in ausreichender Menge vorhanden ist, so daß die Zusammensetzung sowohl gegen grampositive Bakterien als auch gegen gramnegative Bakterien wirkt, dann werden sie zu aktivierten, schnell wirkenden Breitspektrumbakteriziden, die für eine Reihe verschiedener Anwendungen geeignet sind.

Description

Vorgeschichte der Erfindung
Es handölt sich um einen Teilbeitrag zu der am 22. Juni 1988 unter der Serien-Nr. 209.861 eingereichten Patentanmeldung. Nisin ist ein Polypeptid mit antimikrobischen Eigenschaften, das durch verschiedene Kulturstämme des Bakteriums Streptococcus lactis in der Natur produziert wird. Es ist als Konservierungsmittel für Lebensmittel bekannt, das die Bildung von Sporen bestimmter Arten von grampositiven Bazillen hemmt.
Sowohl oft fälschlicherweise und ungenau als Antibiotikum bezeichnet, wird Nisin richtiger als ein Bakteriocin klassifiziert, d.h. als eine proteinhaltige, durch Bakterien produzierte Substanz, die nur gegen mit den Spezies ihres Ursprungs eng verbundene Spezies antibakteriell wirksam wird. Nisin ist ein natürlich vorkommendes Konservierungsmittel, das in geringer Konzentration in Milch und Käse vorhanden ist und von dem angenommen wird, daß es vollkommen nichttoxisch ist und keine allergischen Reaktionen beim Menschen hervorruft.
Nisin wurde jüngst von der FDA (Food and Drug Administration) als nichtschädlicher direkter Lebensmittelbestandteil bei pasteurisiertem Streichkäse, pasteurisiertem Schmelzkäse und pasteurisiertem Streich· oder Schmelzkäse mit Früchten, Gemüse oder Fleisch anerkannt. Da es sich um ein Polypeptid handelt, werden in Lebensmitteln verbleibende Nisin-Rückstände schnell verdaut.
Eine Zusammenfassung der Eigenschaften von Nisin gibt A. Hurst in „Advances in Applied Microbiology" (Fortschritte in der angewandten Mikrobiologie), 27: 85-123,1981. Diese Publikation enthält allgemeine Erkenntnisse über Nisin. Durch Streptococcus lactis produziertes Nisin ist kommerziell als unreines Präparat Nisaplin™ von ApMn & Barret Ltd. aus Dorset (England) erhältlich und kann durch die Gewinnung natürlich vorkommenden Nisins aus Kulturen des Bakteriums Streptococcus lactis bei anschließender Konzentration von Nisin nach bekannten Methoden hergestellt werden. Es existieren auch Berichte über Methoden zur Herstellung von Nisin auf der Grundlage umgewandelter Kulturstämme von Streptococcus. Siehe Gonzales et al: USA-Patent-Nr. 4.716.115, ausgegeben am 29. Dezember 1987. Gleichfalls sollte es möglich sein, Nisin mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie zu gewinnen.
Nisin ist mit Erfolg als Konservierungsmittel in Milchprodukten wie Schmelzkäse, Sahne und Milch angewandt worden. Jüngste Patente beschäftigen sich mit der Verwendung von Nisin bei Schmelzkäseprodukten. Siehe USA-Patent-Nrn. 4.584.199 und 4.597.972. Der Einsatz von Nisin als Wachstumshemmer für bestimmte grampositive Bakterien ist ausreichend dokumentiert. Jedoch wurde sein vollständiger Erfolg und seine Akzeptierung als Konservierungsmittel für Lebensmittel bisher durch die Annahme beschränkt, daß Nisin gegen gramnegative und zahlreiche grampositive Bakterien nicht wirksam werden kann. Gramnegative Bakterien sind fast immer in Verbindung mit grampositiven Bakterien vorhanden und sind eine Hauptursache für den Verderb und die Verschmutzung von Lebensmitteln. Siehe Taylor: USA-Patent-Nr. 5.584.199, ausgestellt am 22. April 1986, undTaylor: USA-Patent-Nr. 4.597.972, ausgestellt am 1.JuIi 1986: Tsai und Sandine: „Conjugal Transfer of Nisin Plasmid Genes from Streptococcus Lactis 7962 to Leuconostoc Dextranicum 181" (Übertragung von Genen des Nisin-Plasmids von Streptococcus Lactis 7962 auf Leuconostoc Dextranicum 181 mit dem Ziel der Konjugation), Applied and Environmental Microbiology, Februar 1987, S. 352; „A Natural Preservative" (Ein natürliches Konservierungsmittel), Food Engineering Int'l, Mai 1987, S.37-38; „Focus on Nisin" (Nisin im Mittelpunkt), Food Manufacture, März 1987, S.63.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde gefunden, daß entgegen vorherigen Aussagen Nisin enthaltende Zusammensetzungen in Verbindung mit verschiedenen nichtbakteriziden Stoffen im Vergleich zu Nisin allein eine aktivierte breitspektrumbakterizide Aktivität gegen gramnegative Bakterien sowie eine verstärkte Aktivität gegen ein breiteres Spektrum von grampositiven Bakterien aufweisen. Die bakterizide Aktivität gegen grampositive Bakterien verstärkt sich in einem breiteren pH-Bereich als vorhergesagt wurde. Die Erfindung betrifft Bakteriocin-Zusammensetzungen von Nisin oder andere lanthioninhaltige Bakteriocine in Verbindung mit verschiedenen nichtbakteriziden Stoffen, z. B. Chelatoren oder Tensiden. Die Erfindung betrifft weiterhin Zusammensetzungen, die zur Erzeugung aktivierter Breitspektrumbakterizide in einer geeigneten Trägersubstanz aufgelöst oder suspendiert wurden.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Es wurde ausdrücklich gefunden, daß eine Lösung von ungefähr 0,1 Mg/ml bis 300. pg/ml Nisin unter Verwendung von ungefähr 0,1 mM bis 20 mM eines Chelators, z. B. EDTA, das Wachstum gramnegativer Bakterien wie Salmonella typhimurium, Escherichia coil, Pseudomonas aeruglnosa. Bactericides glngivalis, Actinobacillus actlnomycetescomitans und Klebstella pneumoniae praktisch beseitigt und gegenüber grampositiven Bakterien wie Staphylococcus aureus. Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes. Streptococcus agalactlae und Coryneform-Bakterien wirksamer wird als Nisin für sich allein. Obwohl die Aktivierung von Nisin durch einen Chelator von der Konzentration abhängig war, hemmten Konzentrationen von mehr als 20 mM EDTA entgegen den Erwartungen die bakterizide Aktivität von Nisin. Jedoch wurde durch den Einsatz einer proteinhaltigen Trägersubstanz und polyvalenter Polymere, wie Serumalbumin, Collagen, Gelatine, Casein und Keratin, die Wirkungshemmung von Nisin durch Konzentrationen über 2OmM EDTA wesentlich eingeschränkt und damit gleichzeitig das Spektrum erweitert, in dem Nisin durch EDTA aktiviert werden kann.
Es wurde gleichzeitig gefunden, daß eine Lösung von ungefähr 0,1 pg/ml bis 300pg/ml Nisin und ungefähr 0,1 mM bis 2OmM eines Chelators die Wirksamkeit von Nisin gegen gramnegative und grampositive Bakterien bei Einsatz von ungefähr 0,01 % bis 1,0% eines oberflächenaktiven Stoffes noch weiter verstärken. Außerdem wurde gefunden, daß bei alleiniger Verwendung eines oberflächenaktiven Stoffes Nisin eine verstärkte; Aktivität gegen grampositive Bakterien aufweist. In der vorliegenden Erfindung sind geeignete Chelatoren u. a. EDTA, CaEDTA, CaNa2EDTA sowie andere Alkyldiaminotetraacetate, EGTA und Citrat, ohne darauf beschränkt zu sein. Zu den Tensiden, die als Reinigungsmittel wertvoll und für die Kombination mit Nisin geeignet sind, sowohl mit als auch ohne EDTA, zählen u. a. die nichtionogenen Tenside wie Tweene und Tritone sowie Glyceride, ionogene Tenside wie Fettsäuren, quaternäre Verbindungen, anionische Tenside wie Natriumdodecylsulfat, sowie amphotere Tenside wie Cocamidopropylbetain und Emulgatoren.
Da grampositive und gramnegative Bakterien in Lebensmitteln fast immer gemeinsam gefunden werden, wird die Aktivität von Nisin-Zusammensetzungen gegenüber gramnegativen Bakterien wie Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Klebslella pneumoniae, Pseudomonas aeruglnosa, Bacterioides gingivalis, Actinobacillus actinomycetescomitans und andere gramnegative Pathogene und grampositive Bakterien großen Nutzen bringen. Die Bakterizide sind insbesondere zur Bekämpfung und Verhinderung der Verschmutzung von Rohbestandteilen, konservierten Lebensmitteln und Getränken durch Bakterienpathogene und andere fäulniserregende Mikroorganismen geeignet. Potentielle Einsatzgebiete im Zusammenhang mit Lebensmitteln sind u.a. die Behandlung von Fleisch, insbesondere Geflügel, Eiern, Käse und Fisch sowie die Behandlung von Lebensmittelverpackungs- und -transportausrüstungen. Weiterhin ist eine Verwendung als Konservierungsmittel für Lebensmittel, z.B. bei Schmelzkäse, Sahne, Milch und Milchprodukten, bei der Säuberung von Geflügel, Fisch, Fleisch und
Gemüse sowie von Molkerei- und Lebensmittelverarbeitungsanlagen möglich. Die Verwendung von Nisin-Zusammensetzungen sollte jedoch nicht auf den Lebensmittelbereich begrenzt werden, und Nisin-Zusammensetzungen sollten überall dort Anwendung finden, wo gramnegative und grampositive Bakterien beseitigt werden müssen oder sollen. Zur Bildung von Bakteriziden können die Zusammensetzungen in einer geeigneten Trägersubstanz, z. B. einem wäßrigen Lösungsmittel oder einer Pufferlösung, aufgelöst oder in einer geeigneten flüssigen Kolloid- oder polymeren Matrix suspendiert werden. Die Zusammensetzungen bzw. Bakterizide können Salben oder Verbandsstoffen für medizinische Anwendungen, wie die Behandlung von Infektionen, Wundverbände oder chirurgische Implantate, zugesetzt oder auch als Breitspektrumdesinfektionsmittel für die Anwendung auf der Haut und im Mundberoich oder in Form von desinfizierenden Scheuer- und Wischtüchern bzw. Lotionen eingesetzt werden. Die Bakterizide können bei der Reinigung medizinischer Instrumente, als Scheuertücher bei der Vorbereitung der OP-Säle und ähnliches Anwendung finden. Die Bakterizide sind insbesondere unter solchen Bedingungen nützlich, wo eine Desinfizierung der Umgebung erwünscht ist, chemische Germizide aber nicht eingesetzt werden können, da sie die Gefahr des Hinterlassens ätzender oder anderer toxischer Rückstände in sich bergen.
Im Gegensatz zur Aktivität der meisten Breitspektrumgermizide, die durch das Vorhandensein komplexer organischer Stoffe gefährdet sind, werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Gegenwart eines organischen Stoffes, wie Milch oder Serum, als Bakterizide wirksam.
Über Nisin war bekannt, daß es das Wachstum einiger weniger, eng miteinander verwandter, grampositiver Bakterien optimal hemmt, insbesondere bestimmter grampositiver, sporenbildender Bazillen bei pH 5,0. Die bakterizide Aktivität von Nisin in Lösung mit einem Chelator war gegenüber einem breiten Spektrum grampositiver Bakterien bei pH-Werten über 5,0 überraschend schnell und stark erhöht und wurde außerdem gegenüber gramnegativen Bakterien sowohl bei saurem als auch bei basischem pH-Wert, vorzugsweise zwischen 5,0 und 8,0, verstärkt. Aufgrund dieser unerwartet schnellen und sich auf ein breites Spektrum ausdehnenden bakteriziden Aktivität von chelatoraktiviertem Nisin ist es für die Anwendung u. a. als Desinfektionsmittel geeignet.
Nisin gehört zur Klasse der lanthioninhaltigen Peptidbakteriocine. Zu dieser Klasse zählen auch Subtilin, Epidermin, Cinnamycin, Duramycin, Ancovenin und Pep 5. Diese bakteriocinen Peptide worden jeweils von unterschiedlichen Mikroorganismen produziert. Es wurde jedoch gefunden, daß aus bestimmten Kulturen von Bacillus subtilis gewonnenes Subtilin und aus bestimmten Kulturen von Staphylococcus epidermldis gewonnenes Epidermin Molekularstrukturen besitzen, die denen von Nisin sehr ähnlich sind (siehe Hurst, S.85-86, und Schnell et al.: Nature, 333: 276-278). Deshalb wird angenommen, daß aufgrund der molekularen Ähnlichkeiten andere lanthioninhaltige Peptidbakteriocine bei der Beseitigung von Verschmutzungen durch gramnegative und grampositive Bakterien genauso wirksam sind wie Nisin in Verbindung mit Chelatoren und nichtionogenen Tensiden.
Die Wirksamkeit von Nisin-Zusammensetzungen, und in Erweiterung anderer lanthioninhaltiger Peptidbakteriocine, als Bakterizide gegen gramnegative Bakterien überrascht, da das Fachgebiet im allgemeinen nicht von dieser Aktivität von Nisin spricht. Die Aktivierung von Nisin gegen grampositive Bakterien unter Verwendung von EDTA bei einem pH-Wert über 5,0 wird nicht erwartet, weil bisher für Nisin eine optimale Aktivität bei pH 5,0 angenommen wurde. Weiterhin wird mit der Entdeckung einer derartigen Wirksamkeit der Nisin- und lanthioninhaltigen Peptidbakteriozin-Zusammensetzungen als Bakterizide ein seit langem bestehender Bedarf in der Wissenschaft der Lebensmittelkonservierung erfüllt, der es bisher an einer akzeptablen, natürlichen, nichttoxischen Substanz zur wirksamen Bekämpfung eines breiten Spektrums von Bakterien mangelte. Zur Demonstration der größeren und unerwartet schnellen Aktivität der aus Nisin, EDTA und/oder verschiedenen Tensiden bestehenden Zusammensetzung gegen gramnegative und grampositive Bakterien wurde mit den Bakteriziden eine Reihe von Versuchen durchgeführt. Diese Versuche dienen der Veranschaulichung und sollen die vorliegende Erfindung nicht begrenzen. Es ist zu erwarten, daß Nisin durch andere lanthioninhaltige Peptidbakteriocine und EDTA durch andere Chelatoren wirksam ersetzt werden kann.
Die Versuche der folgenden Ausführungsbeispiele wurden alle bei 37°C durchgeführt. Die Wirksamkeit der aktivierten Breitspektrumbakterizide wurde durch die Prüfung der bakteriziden Aktivität anhand der prozentual überlebenden Bakterien nach der Behandlung mit dem Bakterizid bestimmt. Im allgemeinen wurden Bakterien nach der Inkubation einer Suspension von 107 Zellen der Zielspezies pro ml mit dem neuen Bakterizid für eine festgelegte Zeit durch 2minütiges Zentrifugieren gesammelt. Die Bakterizide wurden mit Hilfe eines lösenaen Puffers, weiterhin als Phagenpuffer (5OmM Tris-HCL-Puffer, pH-Wert 7,8,1 mM MgSO4,4 mM CaCI2,0,1 M NaCI und 0,1 Prozent Gelatine) bezeichnet, aus der Bakterienkugel ausgewaschen, nochmals suspendiert und in den Phagenpuffer reihenverdünnt, und 100ml der suspendierten Bakterien wurden auf Agarnährplatten verteilt. Die Zahl der überlebenden Bakterien wurde durch Zählen der eine Kolonie bildenden Einheiten (CFU) nach einer Inkubationszeit von 24 bis 48 Stunden bei einer Temperatur von 370C bestimmt. Ein erfindungsgemäß wirksames Bakterizid verhindert, daß mehr als 0,1 % der Anfangslebendzellzahl der Bakterien überleben.
Ausführungsbeisniel 1 Aktivität von Nisin und eines Chelators gegen prqmnegativo Bakterien (S.typhimurium)
Tabelle 1 zeigt zwei Versuche, die unter Verwendung von 2OmM Tris, pH 8,0, bei einer Temperatur von 370C durchgeführt wurden, mit deren Hilfe die Aktivität des Nisin und nur den Chelator EDTA enthaltenden Bakterizids gezeigt werden soll. Versuch #1 wurde zur Kontrolle ohne Verwendung von EDTA durchgeführt und stellt die alleinige Aktivität von Nisin gegenüber dem gramnegativen Bakterium S.typhimurium dar. Die erhöhten Konzentrationen von Nisin weisen Aktivitäten auf, aber selbst die Aktivität der höheren Konzentrationen ohne Verwendung von EDTA, bei der 1,6% in 100Mg/ml Nisin überleben, ist für ein Lebensmittelkonservierungsmittel vollkommen unzulässig. Der Grad der bakteriziden Aktivität von Nisin in Verbindung mit EDTA ist bedeutsam.
Tabelle 1
Versuch
Anfangs-
lebend-
zellzahl
EDTA
ImM)
Nisin (pg/ml) 30 50
100
300
3,0x10° 5,7x10°
Überlebende S. typhimurium nach 3 Stunden in Prozent 0 100 51,3 - 7,0 1,6
20 2,5 - 10"J - <10"4
Im Versuch #2 (Tabelle 1) wurde Nisin in Verbindung mit 2OmM EDTA untersucht und eine erstaunliche Aktivität der Nisin-Zusammensetzung bei der Beseitigung der gramnegativen Zielbakterien ermittelt.
Tabelle 1 zeigt, daß im Versuch #2 bei einer Konzentration von 2OmM EDTA und 30pg/ml Nisin das Bakterizid eine deutliche bakterizide Aktivität gegenüber S.typhimurium ausweist, während bei Nisin-Konzentrationen von 100μg/ml und darüber das aus Nisin und EDTA bestehende Bakterizid die Bakterien praktisch beseitigt (Überlebenschance von weniger als 10~4%, was darauf hinweist, daß in der Probe keine Bakterien überlebt haben). Die Verbindung von EDTA und Nisin zeigt eine synergistische Wirkung, die die Wirksamkeit von Nisin allein um das 10OOfache übersteigt.
Ausführungsbeispiel 2 Aktivität von Nisin, eines Chelators und eines Tenside gegen gramnegative Bakterien (S.typhimurium)
Es wurden vier Versuche (Tabelle 2) zur Bestimmung der Aktivität des Nisin und EDTA sowie das Tensid Triton X-100 enthaltenden Bakterizids in 2OmM Tris bei einem pH-Wert von 8,0 und einer Temperatur von 370C gegenüber S.typhfmurium durchgeführt. Die Kontrolle (Versuch # 1) ist mit der Kontrolle im Ausführungsbeispiel 1 (Tabelle 1) identisch.
Tabelle 2
Versuch Anfangs- # lebend-
zellzahl
EDTA
ImMI
Triton X-100
10
30
Nisin (pg/ml) 50
100
300
3,Ox 10° 3,Ox 10° 5,7x10° 5,7 x 10°
0 0
20 20
1,0 0,1 1,0
100 37,4 0,03
Überlebende S.typhimurium nach 3 Stunden in Prozent 51,3 - 7,0 1,6
93,0 - 64,0 47,6
<10~3 - - -
<10"4 - <10~4 <10"4
Versuch #2 (Tabelle 2) wurde unter Verwendung von Nisin und 1,0% Triton X-100, aber ohne EDTA durchgeführt. Das Reinigungsmittel allein hemmt die Aktivität von Nisin gegenüber den gramnegativen Bakterien, d.h. Nisin wurde nicht wirksam.
Aus den erfindungsgemäß durchgeführten Versuchen #3 und #4 (Tabelle 2) wird jedoch erkennbar, daß bei Verwendung von 2OmM EDTA in Verbindung mit Triton X-100 ein Bakterizid wirkt, welches die bakterizide·· Aktivität von Nisin gegenüber
S.typhimurium deutlich erhöht.
Die Verbindung von Triton X-100 und EDTA wurde auch bei Weglassen von Nisin wirksam, wenngleich in einem geringeren Grade als unter Verwendung von Nisin. Während in den beiden Versuchen #3 und #4 (Tabelle 2) eine hohe Wirksamkeit der Nisin-Verbindungen festgestellt wurde, läßt die Konzentration von 1,0% Triton X-100 (Versuch #4, Tabelle 2) die höchste
Wirksamkeit erkennen.
Bei Verwendung des nichtionogenen Tensids Triton X-100 in Verbindung mit EDTA wird die Aktivität von Nisin gegenüber gramnegativen Bakterien noch mehr verstärkt als bei dem Bakterizid, das nur Nisin und EDTA enthält (Ausführungsbeispiel 1).
Ausführungsbeispiel 3
Aktivität von Nisin, eines Chelators und eines Tensids gegen gramnegative Bakterien (S. typhimurium) Tabelle 3 zeigt die verstärkte Aktivität des Nisin, 2OmM des Chelators EDTA und das nichtionogene Tensid Tween 20 enthaltenden Bakterizids in einem Puffer von 2OmM Tris, bei einem pH-Wert von 8,0 und einer Temperatur von 370C gegenüber S.typhimurium. Analog zur Verwendung von Triton X-100 (Ausführungsbeispiel 2) weist die Verbindung von Nisin und EDTA
(mit 1 %) Tween 20 die höchste Wirksamkeit auf.
Tabelle 3
Versuch Anfangs- EDTA Tween 20
# lebend (mM) (%)
zeilzahl
10
30
Nisin (pg/ml) 50
100
300
3,0x10° 5,7x10° 4,3 x 106
0 20 20
0 0 1,0
100
2,5 <10"2
Überlebende S.typhimurium nach 3 Stunden in Prozent 51,3 - 7,0 1,6
<10"3 - <10"4 <10"4
AusfOhrungsbelsplel 4
Aktlvitfit von NIsIn, eines Chelators und eines Tenside gegen gramnegative Bakterien (Escherichla coil) Die Wirkung des Nisin und EDTA enthaltenden Bakterizide gegenübor den gramnegativen Bakterien E.coli wurde in Tabelle 4
demonstriert.
Nisin (pg/ml) 30 100 300
Tabelle 4 Anfangs lebend zellzahl EDTA ImM] Triton X-100 (%)
Vorsuch # 1,0 x 10' 1,0 x 107 1,0 x 107 1,0x 107 0 20 0 20 0 0 1,0 1,0
1 2 3 4
Überlobende E. coil nach 2 Stunden in Prozent 100 27 25 8,5
14,5 0,86 0,01 0,001
100 30
1,2 0,8 0,05 <10-4
Die Versuche, mit und ohne EDTA, wurden in einer Pufferlösung von 2OmM Tris, pH-Wert 8,0, jei einer Temperatur von 370C durchgeführt, wobei die Anfangslebendzellzahl 1 x 107 E.cnll-Zellen/ml betrug. Die Wirkung des Bakterizids wurde als Funktion der prozentual überlebenden Bakterien nach zwei Stunden gemessen.
Im Versuch # 1 (Kontrolle, Tabelle 4) ohne EDTA zeigte Nisin eine wenig bedeutsame Aktivität hinsichtlich dor Beseitigung von E.coli. Im Versuch #2 (Tabelle 4), bei dem 2OmM EDTA verwendet wurden, wies die bakterizide Zusammensetzung jedoch eine wesentliche Aktivität gegenüber den E.coli-Bakterien auf. Mit der Erhöhung der Nisin-Konzentration wurde die Aktivität noch weiter verstärkt. Die Verbindung von Nisin mit EDTA als ein Bakterizid demonstriert eine lOOOfache Erhöhung der synergistischen Aktivität gegenüber E. coil. Don Versuchen #3 und #4 (Tabelle 4) kann entnommen werden, daß Triton X-100 keine nennenswerte bakterizide Aktivität gegenüber E.coli aufweist. Triton X-100 scheint tatsächlich die Aktivität von Nisin gegenüber gramnegativen Bakterien, wie sie bei S. typhlmurium (Tabelle 2) gefunden wurde, zu hemmon. Wie jedoch den Tabellen 2 und 4 entnommen werden kann, wird mit der allgemeinen Aktivierung von Nisin durch EDTA die hemmende Wirkung von Triton X-100 im wesentlichen aufgehoben.
Das Nisin und einen Chelator, wie z. B. EDTA, enthaltende Bakterizid scheint demnach selbst bei Vorhandensein eines Tensids ein gegen verschiedene Arten von gramnegativen Bakterien wirksames Lebensmittelkonservierungsmittel zu sein.
Ausführungsbeispiel 5
Aktivität von NIsIn und eines Chelators gegen gramnegative Bakterien (Klebslella pneumoniao) Tabelle 5 zeigt die Aktivität des Nisin und nur EDTA enthaltenden Bakterizids gegenüber den gramnegativen K. pneumoniae-
Bakterien.
Tabelle 5
Versuch Anfangs- EDTA Triton Nisin (Mg/ml)
# lebend- (mM) X-, oO 0 30 100 300
zeilzahl (%)
Überlebende Bakterien nach 2 Stunden in Prozent.
1 107 0 0 100 - 50 38
2 107 20 0 22 0,5 1,1 0,085
Die beiden Versuche, einmal mit und einmal ohne EDTA (Kontrolle), wurden in einer Pufferlösung von 2OmM Tris, pH-Wert 8,0, bei einer Temperatur von 370C durchgeführt, wobei die Anfangslebendzellzahl 107 K. pneumoniae-Zellen/ml betrug. Die Aktivität wurde als eine Funktion der prozentual überlebenden Bakterien nach 2 Stunden gemessen.
Im Versuch # 1 (Kontrolle, Tabelle 5) ohne EDTA zeigte Nisin nur eine wenig bedeutsame bakterizide Aktivität gegenüber
K. pneumoniae. Im Versuch # 2 (Tabelle 5), bei dem 2OmM EDTA verwendet wurden, wies das Bakterizid jedoch eine wesentliche Aktivität gegenüber K. pneumoniae-Bakterien auf. Die Aktivität verstärkte sich mit der Erhöhung der Konzentration von Nisin.
Ausführungsbeispiel 6
Aktivität von Nisin gegen gramnegative Bakterien (Salmonella typhlmurium) ist abhängig von der Chelator-Konzentratlon Die Werte in Tabellu 6 demonstrieren, daß die verstärkte Aktivierung von Nisin gegenüber gramnegativen Bakterien
(S. typhimurium) von der Konzentration von EDTA entweder in 5OmM Natriumacetat, pH-Wert 5,0, oder in 20 mM Tris,
pH-Wert 8,0, bei einer Temperatur von 370C abhängig ist.
Tabelle β
Versuch
pH Anfangs- Nisin
lobond- (Mg/ml)
zellzahl
5,0 3x10" 0
5,0 3x10° 100
8,0 5x10fi 0
8,0 5 χ ΙΟ6 100
0,2
EDTA(mM) 2,0 10
50
100
Überlebondo Bakterien nach 2 Stunden in Prozent 100 - 38,7 15,2 3,5
0,6 10"4 10"4 0,004 0,02
100 - 8,7 14 11,4 45
4 10~4 10~4 10'4 0,6 30
In den Versuchen # 1 und # 3 (Kontrollen, Tabelle 6) wurden EDTA-Konzentrationen bis zu 100 mM ohne Nisin verwendet, und es wurde eine wenig bedeutsame Aktivität der Bakterizide gegenüber S. typhimurlum sowohl bei einem pH-Wert von 5,0 (#1) als auch bei pH-Wert 8,0 (#3) festgestellt. In den Versuchen #2 und #4 (Tabelle 6) dagegen wurden 100 pg/ml Nisin in Verbindung mit EDTA eingesetzt, wodurch die Bakterizide eine wesentliche Aktivität gegenüber S. typhimurlum aufwiesen. Die Aktivität der Bakterizide war bei saurem pH (5,0) und basischem pH (8,0) gleich, ungeachtet der Tatsache, daß die Aktivität von Nisin allein gegenüber grampositiven Bakterien bei einem pH-Wert von 5,0 optimal ist.
Die Aktivierung von N !n durch EDTA war konzentrationsabhängig und erreicht im Bereich zwischen 0,2 mM bis 1OmM bei pH-Werten von 5,0 und 8,0 ihr Optimum. Es war überraschend festzustellen, daß sich bei Konzentrationen über 10 mM EDTA die Aktivierung von Nisin durch LDTA verringerte; dabei ist die Aktivierungsreduzierung bei einem pH-Wert von 8,0 wesentlich größer als bei pH 5,0.
Ausführungsbeispiel 7 Nisin und ein Chelator gegen gramnegative Bakterien (S. typhimurlum)
In Tabelle 7 wird dia Aktivierung von Nisin durch EDTA gegenüber gramnegativen Bakterien unter Verwendung biologischen Gewebes am Beispiel von S.typhimurlum auf Hühnermuskel demonstriert.
Tabelle 7 pH Nisin 0 11,8 0,1
Versuch (Mg/ml) 0,1
# 5,0 0 100
1 5,0 300 7,5 0,2
2 8,0 0 0,02 -
3 8,0 300 0,1
4 8,0 300" 0,09
5
0,3
20
30
100
Überlebende Bakterien' nach 2 Stunden in Prozent
6,4 0,05 0,01 0,003 0,016 0,03 0,02 0,07
5,2
0,02 0,02 0,09 0,47 0,5 - 2,2
0,0002 10~4 0,0004 0,003 - 0,03 0,09
a Nicht aneinanderheftende Zellen b Enthält 1 % Rinderserumalbumin (RSA)
Die Inkubation erfolgte entweder in 5OmM Natriumacetat, pH 5,0, oder 20mM Tris, pH 8,0, bei 37°C. Vor der Verwendung wurden Hühnermuskelwürfel mit Natriumhypochlorit und Povidoniod gesäubert. Zur Beimpfung des Gewebes wurden die Hühnermuskelwürfel in eine Suspension von 108S.typhimurium-Zellen/ml in 2OmM Tris HCI, pH 8,0, getaucht. Den Feuchtigkeitsüberschuß auf den eingetauchten Würfeln ließ man ablaufen. Die Hühnerproben wurden in eine das gesamte Gewebe bedeckende Pufferlösung gelegt, die die Nisin-Zusammensetzung enthält, und dort bei 37°C für 2 Stunden belassen. Danach wurde das Gewebe herausgenommen und in ausreichenden Phagenpuffer gelegt, der das ganze Gewebe bedeckt. Die in der Versuchslösung verbliebenen Bakterien wurden mit Hilfe der Zentrifugierung gesammelt, mit Phagenpuffer gewaschen und mit Bakterien, die durch Phagenpuffer aus dem Gewebe herausgewaschen wurden, zusammengenommen. Die zusammengenommenen Proben (sie werden als „nicht aneinanderheftende" Zellen bezeichnet) wurden serienverdünnt, und Aliquote von 100μΙ wurden zur Bestimmung der Zahl der überlebenden Bakterien plattiert.
Die Versuche # 1 und # 3 (Tabelle 7) wurden ohne Verwendung von Nisin bei pH-Werten von entweder 5,0 oder 8,0 durchgeführt, wobei EDTA allein keine nennenswerte Wirkung auf das Überleben von S. typhimurium-Bakterien aufweist. In den Versuchen # 2 und #4 (Tabelle 7), bei denen 300pg/ml Nisin eingesetzt wurden, zeigten die Bakterizide jedoch eine beträchtliche Aktivität gegenüber S.typhimurium auf Hühnermuskel, sowohl bei pH 5,0 als auch bei pH 8,0.
Die Aktivierung von Nisin durch EDTA war von der Konzentration abhängig, wobei die optimale Konzentration zwischen 0,3 mM und 1OmM EDTA bei pH 5,0 und pH 8,0 liegt. Bei Konzentrationen über 1OmM EDTA und einem pH-Wert von 8,0 verringert sich die Aktivierung von Nisin durch EDTA. Wie jedoch Versuch # 5 (Tabelle 7) entnommen werden kann, wird unter Verwendung von 1,0% Rinderserumalbumin bei pH 8,0 die Wirksamkeit von Nisin gegenüber S.typhimurium auf Hühnermuskel für alle EDTA-Konzentrationen bis zu 10OmM ausgewiesen.
Demnach können Bakterizide, die Nisin und geringe Konzentrationen eines Chelators, wie z.B. 0,1 mM bis 2OmM EDTA, enthalten, hinsichtlich der Beseitigung bzw. Verhinderung der Verschmutzung von Lebensmitteln durch gramnegative Bakterien äußerst wirksam werden.
Tabelle 8 Anfangs- lebend- zellzahl EDTA (mM) BSA (%) 0
Versuch # 6 x 10" 6x106 0 1,0 0 1,0 100 63
1 2
Ausführungsbeispiel 8 Titration der Aktivität von NIsIn gef ien gramnegative Bakterien (S.typhlmurium)
Tabelle 8 kann ontnommen werden, daii unter der Voraussetzung einer optimalen Chelator-Konzentration dio Wirksamkeit des Bakterizide in Tris-Pufferlösung gopcnübor gramnegativen Bakterien beträchtlich ist.
Nisin (Mg/ml) 0,1 0,3 1,0 3,0 10 30 100
Überlebende Bakterien nach 2 Stunden in Prozent - - - - 51,3 - 1,6
0,7 0,08 0,01 0,05 0,01 <10"4 -
Aus Versuch #2 (Tabelle 8) wird ersichtlich, daß die geringe Menge von O^g/ml Nisin in Verbindung mit 1,OmM EDTA in einer Pufferlösung von 2OmM Tris, pH 8,0, und unter Verwendung von 1 % Rinderserumalbumin (RSA) die Zahl der überlebenden S.typhimurium-Bakterien boträchtlich reduziert. Das Bakterizid ist gegenüber gramnegativen Bakterien genauso aktiv wie Nisin allein gegenüber grampositiven Streptokokken.
Ausführungsbeispiel 9 Titration der Aktivität von Nisin gegen gramnegative Bakterien (S.typhimurium)
Die Wirksamkeit eines Bakterizids gegenüber gramnegativen Bakterien unter Verwendung eines biologischen Gewebes wurde unter der Voraussetzung einer optimalen Chelator-Konzentration am Beispiel von S.typhlmurium auf Hühnermuskel in Tabelle 9 demonstriert.
Tabelle 9
Versuch pH Anfangs- EDTA RSA Nisin (pg/ml)
# lebend- (mM) (%) 0 10 100 200 300 zeilzahl
Überlebende Bakterien nach 2 Stunden in Prozent
1 8,0 3x107 0 0 100 -
2 8,0 3X107 1,0 1,0 27 0,26 0,008 0,007 0,006
Vor der Verwendung wurden Hühnermuskelwürfel mit Natriumhypochlorit und Povidonior* gesäubert. Zur Beimpfung des Gewebes wurden die Hühnermuskelwürfel in eine Suspension von 108 S.typhimurlum-Zeilen/ml in 2OmM Tris HCI, pH 8,0, getaucht. Den Feuchtigkeitsüberschuß auf den eingetauchten Würfeln ließ man ablaufen. Das Gewebe wurde in eine das gesamte Gewebe bedeckende Pufferlösung gelegt, die die Nisin-Zusammensetzungen enthält, und dort bei 37°C für 2 Stunden belassen. Danach wurde das Gewebe herausgenommen und in ausreichenden Phagenpuffer gelegt, der das ganze Gewebe bedeckt. Die in der Versuchslösung verbliebenen Bak'erien wurden mit Hilfe der Zentrifugierung gesammelt, mit Phagenpuffer gewaschen und mit Bakterien, die durch Phagenpuffer aus dem Gewebe herausgewaschen wurden, zusammengenommen. Die zusammengenommenen Proben (sie werden als „nicht aneinanderheftende" Zellen bezeichnet) wurden serienverdünnt, und Aliquote von 10ΟμΙ wurden zur Bestimmung der Zahl der überlebenden Bakterien plattiert.
Ausführungsbeispiel 10 Aktivität von Nisin, EDTA und Methylparaben gegen gramnegative Bakterien (S.typhimurium)
Tabelle 10 zeigt die außerordentliche Wirksamkeit eines Nisin und EDTA enthaltenden Bakterizids in Verbindung mit Methylparaben, einem bekannten Konservierungsmittel für Lebensmittel, gegenüber gramnegativen Bakterien.
Tabelle 10
Versuch Anfangs- Nisin EDTAb Methylparaben (%)
# lebend- (pg/ml) (mM) 0 0,1 1,0 zeilzahl
Überlebende Bakterien0 nach 2 Stunden in Prozent
1 3x10" 0 10 11,8 1,0 10"*
2 3x106 300 10 0,03 <10"3 <10"4
b 5OmM Natriumacetat-Puffer, pH 5,0 c Nicht aneinanderheftende Zellen
Vor der Verwendung wurden Hühnermuskelwürfel mit Natriumpochlorit und Povidoniod gesäubert. Zur Beimpfung des Gewebes wurden die Hühnermuskelwürfel in eine Suspension von 108S.typhimurium-Zellen/mlin50mM Natriumacetat-Puffer, pH 5,0, getaucht. Den Feuchtigkeitsüberschuß auf den eingetauchten Würfeln ließ man ablaufen. Das Gewebe wurde in eine das
gesamte Gewebe bedeckende Pufferlösung gelegt, die die Nisin-Zusammensetzungen enthält, und dort für 2 Stunden bei 37°C belassen. Danach wurde das Gewebe herausgenommen und in ausreichenden Phagenpuffer gelegt, der das ganze Gewehe bedeckt. Die in der Versuchslösung verbliebenen Bakterien wurden mit Hilfe der Zentrifugierung gesammelt, mit Phagenpuffer
gewasclien und mit Bakterien, die durch Phagenpuffer gewaicr.en und mit Bakterien, die durch Phagenpuffer aui dem Gewebe herauigewajchen wurden, /uMmmengenornmen. Die eusainrnengenommenen Proben die werden al» ., nicht anetnanderhattende" Zellen bezeichnet) wurden sertenverdunnt. unii Aliquote von 100 rjl wur 'en im Bestimmung der Zahl der überlebenden Bakterien plattiert.
Versuch #1 (Tabelle 10) kann entnommen werden, daß Methylparaben in Verbindung mit 1OmM EDTA nur bei einer Konzentration von 1,0% gegenüber S.typhlmurium wirksam wird. Versuch # 2 (Tabelle 10) zeigt jedoch, daß sich die Wirksamkeit von Methylparaben und Nisin gegenüber S.typhimurium unter Verwendung von 300pg/ml Nisin wesentlich verbesserte.
Die Nisin und EDTA enthaltenden Zusammensetzungen verbessern die Nützlichkeit des in der Lebensmittelindustrie eingesetzten Konservierungsmittels Methylparaben. Außerdem können die Bakterizide zu wesentlichen Reduzierungen hinsichtlich der Konzentrationen führen bzw. die Notwendigkeit des Einsatzes solcher allgemein bekannten, jedoch weniger wünschenswerten Konservierungsmittel wie Methylparaben ausschließen.
Ausführungsbeispiel 11 Aktivität von Nisin und eines Chelators gegen grampositive Bakterien (Staphylococcus aureus)
Die Aktivierung von Nisin durch einen Chelator ist vom pH-Wert abhängig. Die Angaben in Tabelle 11 bestätigen, daß Nisin bei einem pH-Wert von 5,0 eine stärkere bakterizide Aktivität gegenüber S. aureus aufweist als L?· pH 8,0. Bei einem pH-Wert von 5,0 erfolgt keine Aktivierung von Nisin durch EDTA gegenüber S. aurous, und bei EDTA-Konzentrationen über 1OmM hemmt EDTA sogar die bakterizide Aktivität von Nisin. Jedoch ist die bei pH 8,0 durch EDTA aktivierte bakterizide Wirkung von Nisin wesentlich größer als die bakterizide Aktivität von Nisin allein bzw. in Verbindung mit EDTA bei einem pH-Wert von 5,0.
Tabellen Einfluß des pH-Wertes auf die Wirkung von EDTA hinsichtlich dor bakteriziden Aktivität von Nisin gegenüber Staphylococcus
aureus
pH Nisin 0 0,1 0,3 1,0 EDTA ImM) - 1,3 81 - 1,4 100 100 30 100
(pg/ml) 3,0 10 0,2 0,4 3
100 - Überlebende Bakterien nach 2 Stunden* 100 100 -
8,0 0 7,4 0,03 100 1,8 56 -
8,0 3,0 100 - 0,01 - -
5,0 0 0,6 1,0 34 80
5,0 3,0 8,Ox 10ecfu/ml
a Anfangslebendzellzahl:
Die Inkubation erfolgte in 5OmM Natriumacetat-Puffer, pH 5,0. bzw. in 2OmM Tris-HCI-Puffer, pH 8,0, bei 370C.
Berichten zufolge (siehe Hurst) wird die größte bakterizide Aktivität von Nisin allein bei einem pH-Wert von 5,0 oder weniger angegeben, was die Angaben in Tabelle 11 bestätigen. Auf der Grundlage dieser Information wurde angenommen, daß die Aktivierung der bakteriziden Aktivität von Nisin durch EDTA gegenüber S. aureus bei niedrigerem pH-Wert dementsprechend am größten ist. Jedoch konnte, wie Tabelle 11 zu entnehmen ist, entgegen den Erwartungen (siehe Tabelle 6) keine Aktivierung von Nisin durch EDTA gegenüber grampositiven Bakterien bei pH 5,0 beobachtet werden. Dagegen wurde eine Wirkungshemmung von Nisin durch hohe Konzentrationen von EDTA bei pH 5,0 festgestellt. Die Aktivierung von Nisin durch einen Chelator erfolgt nur innerhalb eines Bereichs von Chelator-Konzentrationen und ist im Hinblick auf grampositive Bakterien vom pH-Wert abhängig, wobei ein pH-Wert über 5,0 bevorzugt wird.
Ausführungsbeispiel 12 Aktivität von NIsIn und eines Chelators gegen grampositive Bakterien
Die Verstärkung der bakteriziden Aktivität von Nisin durch EDTA bei pH 8,0 bezieht sich nicht ausschließlich auf S. aureus, einem wichtigen menschlichen Pathogen, sondern kann auch bei für den Zahnbelag verantwortlichen Streptococcus mutans-Bakterien (Tabelle 12 A), dem durch Lebensmittel übertragenen Pathogen Listeria monocytogenes (Tabelle 12 B) und einer gemischten Population von axillaren Coryneform-Bakterien, die Körpergeruch verursachen (Tabelle 12C), beobachtet werden.
Tabelle 12A
DIo Wirkung von EDTA auf die bakterizide Aktivität von NIsIn gegenüber Streptococcus mutans
pH Nisin EDTA (mM)
(pg/ml) 0 0,01 0,1 0,3 1,0 3,0 10 30 100
Überlebende Bakterien nach 2 Stunden' in Prozent 8,0 0 100 ----- - - -
8,0 0,1 4,3 1,8 0,04 0,02 0,06 1 25 100 100
a Anfangslebendzellzahl: 6,0 χ 10'cfu/ml
Die Inkubation erfolgte in 2OmM Tris-HCI, pH 8 Ί, bi i 37°C.
Tabelle 12B
Die Wirkung von EDTA auf die bakterizide Aktivität gegenüber l.isterla monocytogenes
pH Nisin EDTA (mM)
(pg/ml) 0 0,1 0,3 1,0 3,0 10 30 100
Überlebende Bakterien nach 2 Stunden" in Prozent 8,0 0 100 - - 84
8,0 3,0 0,71 0,04 0,04 0,02 0,1 0,64 10 14
a Anfangslebendzellzahl: 6,0 x 10'cfu/ml
Die Inkubation erfolgte in 2OmM Tris-HCI, pH 8,0, bei 37°C.
Tabelle 12C
Die Wirkung von EDTA auf die bakterizide Aktivität von Nisin genenüber Coryneform-Bakterien
pH Nisin EDTA (mM)
(pg/ml) 0 0,1 0,3 1,0 3,0 10
Überlebende Bakterien nach 2 Stunden* in Prozent
8,0 0 100 - 4,6 3,6 8 36
8.0 3 0,22 0,03 0,0009 0,1 - 0,16
a Anfangslebendzellzahl: 1,0x 10ecfu/ml
Die Inkubation erfolgte in 2OmM Tris HCI, pH 8,0, bei 37"C.
Ausführungsbeispiel 13
Schnelle bakterizide Aktivität von chelatoraktiviertem Nisin
Das Nisin und EDTA enthaltende Bakterizid zeigt eine schnelle bakterizide Aktivität., wie den Angaben in Tabelle 13A entnommen werden kann. Suspensionen von 107 Zellen/ml des grampositiven Bakteriums S. mutans wurden in 20 mM Tris-Puffer, pH 7,3, bei 37°C mit verschiedenen, durch 1 mM EDTA aktivierten Nisin-Konzentrationen angesetzt. Die Inkubation der Suspensionen mit den Bakteriziden erfolgte für unterschiedliche Dauer von 0,5 bis 60 Minuten. Die bakterizide Wirksamkeit der Bakterizide wurde mit Hilfe der Bestimmung der prozentual überlebenden Bakterien geschätzt. Unter der Voraussetzung der EDTA-Aktivierung können lOpg/ml Nisin dieses Ansatzes die bakterielle Belastung um 6 Logarithmen innerhalb einer Minute reduzieren.
Eine schnelle bakterizide Aktivität ist die Voraussetzung für eine wirksame Desinfektion. Deshalb sollen die Zusammensetzungen wirksame Bakterizide, wie hier insbesondere demonstriert wurde, in Form von Zusätzen für Mundwasser, Spülungen, Zahncremes oder ähnlichen Mitteln zur Bekämpfung von Zahnbelag bildenden S.mutans-Bakterien sein.
Die Aktivität von durch EDTA aktiviertem Nisin gegen gramnegative Bakterien nach 2-3 Stunden wurde in den Ausführungsbeispielen 1-7 gezeigt. Eine schnelle bakterizide Aktivität von durch EDTA aktiviertem Nisin wird auch gegenüber gramnegativen Bakterien beobachtet; die entsprechenden Angaben sind in Tabelle 13B enthalten.
Tabelle 13A
Kinetik der bakteriziden Aktivität von F-DTA-aktlviertem Nisin gegenüber Streptococcus mutans
Inkubationszeit Nisin (\iglm\) mit 1,OmM EDTA
(Minuten) 0 13 10 30 100
Überlebende Bakterien' in Prozent
3 100
15 30 60 100 0,003
a Kontrolle der Anfangslebendzellzahl: 1,0 χ 10'cfu/ml
Die Inkubation erfolgte in 2OmM Tris-HCI, pH 7,3, bei 370C.
- - - - <10"4
- - <10"4 <10~4 <10"4
0,5 0,002 <10"4 <10"4
0,03 <10"4 <10"4 - -
<10"4
Tabelle 13B Schnelle bakterizide Aktivität von EDTA-aktiviertem Nfsin gegenüber Escherichia coil
EDTA Nisin (pg/ml)
ImM) 0 0,3 1,0 3 10 30 100
Überlebende Bakterien nach 1 Minute1 in Prozent 1,0 100 100 56 0,37 0,013 0,015 0,008
1 Anfangslebendjellzahl: 1,0x 10'cfu/ml
Die Inkubation erfolgte in 20 mM Tris, pH 7,0, bei 37°C.
Ausführungsbeispiel 14 Wirkung von bivalenten Kationen auf die Aktivierung von Nisin durch EDTA
Da bivalente Kationen an EDTA und andere Chclatoren binden, wäre zu erwarten, daß die Aktivierung von Nisin durch EDTA neutralisiert wird. Wie jedoch den Angaben in Tabelle 14 entnommen werden kann, wird die bakterizide Aktivität von Nisin gegen S. mutans durch 1 mM EDTA selbst bei Vorwendung von 1 mM Ca2*-lonen erhöht; eine Wirkungshommung von EDTA-aktiviertem Nisin durch Ca'" -Ionon trat erst bei 3mM auf. Dies ist insbesondere bei Anwendungen im Mundbereich wichtig, wo Ca!ciumionen-Konzentrat:onen eine Rolle spielen.
Tabelle 14 Schnelle bakterizide Aktivität von EDTA-aktiviertem Nisin unter Verwendung von bivalenten Kationon gegenüber Streptococcus mutans
Nisin 0 0,1 0,3 CaCI3ImM) 0,0004 3 10
1,0 <10"4 in Prozent
100 Überlebende Bakterien nach 1 Minute'
0 2,9
3 0,0042 0,0042 18
3E 0,00" 9 0,052 0,06 6,8
30E <10"4 0,0003 0,0001 1,5
100E <10"4
E ImMNa2EDTA * Anfangslebendzellzahl: 1,0 x 102cfu/ml
Die Inkubation erfolgte in 10% fötalem Kälberserum bei 37°C.
Ausführungsbeispiel 15 Aktivität von Nisin und eines Tenside gegen grampositive Bakterien
Die bakterizide Aktivität von Nisin kann auch in alleiniger Vorbindung mit einem Tensid bedeutend verstärkt werden. Dies wird bei einer Grenzkonzentration von Nisin (0,2Mg/ml)am uoutlichsten, wie Tabelle 15A entnommen werden kann. Bei Konzentrationen bis zu 0,1 % weist Monolaurin, ein Tensid von Lebensmittelqualität, eine nur wenig bedeutende bakterizide Aktivität gegenüber Streptococcus agalactiae im komplexen Medium Milch auf. Ebenso zeigt Nisin bei Konzentrationen bis zu 0,2\ig/m\ keine beachtenswerte bakterizide Aktivität in Milch Die Kombination der beiden Stoffe 0,1 % Monolaurin und 0,2 pg/ml Nisin führt zu einer äußerst starken Aktivität gegenüber S. agalactiase. Dieses Bakter.zid ist mehr als 10Omal wirksamer, als vom Additionseffekt erwartet würde, und lOOOOmal wirksamer als die einzelnen Bestandteile für sich. Wenn also die Anwendung von Nisin durch seine erzielbare Wirkung begrenzt wird, kann von einem aus Nisin und einem Tensid bestehenden Bakterizid eine größere Nützlichkeit erwartet werden.
Die Angaben in Tabelle 15B veranschaulichen ein Beispiel für die begrenzte Anwendung von Nisin aufgrund seiner erzielbaren Wirkung. Obwohl Nisin, und insbesondere das sich aus Nisin und EDTA zusammensetzende Bakterizid, eine bakterizide Aktivität gegenüber L. monocytogenes aufweist, demonstrieren die in Tabelle 15B gemachten Angaben, daß in einem komplexen Medium wie Milch die von Nisin erzhlbare Aktivität gegenüber diesem Organismus begrenzt ist. Jedoch wirkt das aus Nisin zusammengesetzte Bakterizid in Verbindung mit dem Glycerid Monooleat in Milch gegen dieses durch Lebensmittel übertragene Pathogen, auch wenn Monooleat für sich keine bakterizide Aktivität gegenüber diesem Organismus aufweist.
Tabelle 15A
Bakterizide Aktivität von Nisin gegenüber Streptococcus agalactiae in Milch bei 37°C
(Aktivierung von Nisin durch Monolaurin) Nisin Monolaurin (%)
(pg/ml) 0 0,01 0,1
Überlebende Bakterien nach 2 Stunden' in Prozent 0 100 100 4,5
0,02 100 100 0,2
0,2 2,2 0,05 0,0008
* Anfangslebendzellzahl: 6,0 χ 107cfu/ml Die Inkubation erfolgte in Milch bei 37°C.
Tabelle 15 B Bakterizide Aktivität von NIsIn gegenüber Listeria monocytogonos In Milch bei 37 C
(Aktivierung von Nisin durch Monooloat) Nisin Monooloat (%)
(ug/ml) 0 0,1 1,0
Üborlobondo Baktorion nnch 2 Stunden1 in f'ro/ont 0 100 67
100 0,56 10° 10
1 Anfangslebendjellzahl: 5,0 χ 10'cfu/ml Die Inkubation erfolgte in Milch bei 370C.

Claims (16)

1. Zusammensetzung aus einem lanthioninhaltigen Bakteriocin und einem Chelator.
2. Zusammensetzung aus einem lanthioninhaltigen Bakteriocin und einem Tensid.
3. Zusammensetzung aus einem lanthioninhaltigen Bakteriocin, einem Chelator und einem Tensid.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 1,2 oder3, dadurch gekennzeichnet, daß das lanthioninhaltige Bakteriocin aus der Nisin, Subtilin, Epidermin, Cinnamycin, Duramycin, Ancovenin und Pep 5 umfassenden Gruppe ausgewählt wird.
5. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelator aus der Alkyldiamintetraacetate, CaEDTA, Na2CaEDTA, EGTA und Citrat umfassenden Gruppe ausgewählt wird.
6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß EDTA das Alkyldiamintetraacetat und Nisin das Bakteriocin ist.
7. Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Tensid aus der Tritone, Tweene, Glyceride, Fettsäuren, Emulgatoren, quaternäre Verbindungen, amphotere und anionische Tenside umfassenden Gruppe ausgewählt wird.
8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die auch ein Konservierungsmittel für Lebensmittel enthält.
9. Aktiviertes Breitspektrumbakterizid, das eine Trägersubstanz, ein lanthioninhaltiges Bakteriocin und einen Chelator enthält.
10. Aktiviertes Breitspektrumbakterizid, das eine Trägersubstanz und ein lanthioninhaltiges Bakteriocin und ein Tensid enthält.
11. Aktiviertes Breitspektrumbakterizid, das eine Trägersubstanz, ein lanthioninhaltiges Bakteriocin, einen Chelator und ein Tensid enthält.
12. Aktiviertes Breitspektrumbakterizid nach Anspruch 9,10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das aus der Nisin, Subtilin, Epidermin, Cinnamycin, Duramycin, Ancovenin und Pep 5 umfassenden Gruppe ausgewählte lanthioninhaltige Bakteriocin und der aus der Alkyldiamintetraacetate, EGTA und Citrat umfassenden Gruppe ausgewählte Chelator in Mengen vorhanden sind, die die Wirksamkeit des Bakterizide gegen mindestens ein Bakterium aus der Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes. Streptococcus agalactiae, Coryneform-Bakterien, Salmonella typhimurium. Escherichia coli, Kiebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bactericides gingivalis und Actinobacillus actinomycetescomitans umfassenden Gruppe aktivieren.
13. Aktiviertes Breitspektrumbakterizid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkyldiamintetraacetat EDTA ist.
14. Aktiviertes Breitspektrumbakterizid nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Tensid aus der Tritone, Tweene, Glyceride, Fettsäuren, quaternäre Verbindungen, Emulgatoren, amphotere und anionische Tenside umfassenden Gruppe ausgewählt wird und in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, damit das Bakterizid eine verstärkte Wirksamkeit gegen mindestens ein Bakterium aus der gramnegative und grampositive Bakterien umfassenden Gruppe aufweist.
15. Aktiviertes Breitspektrumbakterizid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Nisin ungefähr zwischen 0,1 pg/ml und 300Mg/ml und die Konzentration des Chelators ungefähr zwischen 0,1 mM und 2OmM liegt.
16. Aktiviertes Breitspektrumbakterizid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration desTensids ungefähr zwischen 0,01% und 1,0% liegt.
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