DE10103211C1

DE10103211C1 - Kulturmedium

Info

Publication number: DE10103211C1
Application number: DE2001103211
Authority: DE
Inventors: Ursula Kastner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-01-24
Filing date: 2001-01-24
Publication date: 2002-07-18
Anticipated expiration: 2021-01-25
Also published as: WO2002059276A2; WO2002059276A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Kulturmedium, enthaltend: a) 1-99 Gew.-% FCS und b) 1-99 Gew.-% adultes Rinderserum, wobei die Summe der Anteile der Komponenten a) und b) stets 100 Gew.-% beträgt.

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Kulturmedium, das einsetzbar ist für die in vitro-Kultivierung von biologischem Material, insbesondere für die Kultivierung ganzer Embryonen der Ratte und der Maus.

Hintergrund der Erfindung

Es ist wohlbekannt, dass ganze Embryonen von Nagern außerhalb des Muttertieres in vitro angezüchtet werden können. Diese an spruchsvolle Kulturtechnik, die in den sechziger Jahren von New (New 1966a; New 1966b; New, (1967) entwickelt wurde, findet seit ca. 40 Jahren weltweit Anwendung und führte zu tiefgreifenden Einblicken in die Embryonalentwicklung, wobei wachstumsregulato rische, morphogenetische als auch metabolische Prozesse, die während der Organogenese im Embryo ablaufen, grundlegend aufgek lärt werden konnten. Die Nagerembryonen werden dabei schnellstmöglich nach Entnahme aus dem Muttertier in jeweils 4-7 ml Kulturmedium in versiegelten und begasten Kulturgefäßen für 24 bis 48 Stunden in einem temperierten Brutschrank rotierend inkubiert (Steele et al., 1974; New et al., 1976), wobei in vi tro unter optimalen Kulturbedingungen eine fast ebenso gute Entwicklung des Embryos wie in vivo erzielbar ist.

Anwendungsgebiete der Methode zur Kultivierung ganzer Embryonen sind das Screening von Substanzen mit einem vermuteten terato genen Potential sowie das Studium teratogener Mechanismen unter Ausschaltung maternaler Effekte. Der Conterganfall mit 10.000 starken Fehlbildungen an Neugeborenen erzeugte in den sechziger Jahren beachtliche Aufmerksamkeit und legte so den Grundstein für ein gehobenes Bewusstsein für mögliche, durch Chemikalien hervorgerufene Fehlbildungen und andere ernsthafte Risiken in der Schwangerschaft. Es wird angenommen, dass ca. 65.000 Chemi kalien in der Umwelt vorliegen (Schardein et al., 1993) und jährlich Hunderte, wenn nicht Tausende neuer Chemikalien hinzuk ommen. Nur ein Bruchteil, etwa einige wenige Tausend davon, sind bisher auf ein mögliches teratogenes Potential hin getestet wor den. Die "Segment II-Testung" wurde zwar eingeführt, eine Ver fahrensweise zur Testung von Arzneimitteln und anderer Chemikalien, wobei das übliche Testprotokoll eine tägliche Gabe der Testsubstanz an schwangere Tiere während der Organogenese vorsieht, gefolgt von der morphologischen Untersuchung und Beur teilung der Feten kurz vor der Geburt. Der Einsatz von zwei Spe zies (üblicherweise sind das Ratte und Kaninchen) und drei Testkonzentrationen ist dabei gefordert, die so gewählt werden müssen, dass die Höchstdosis einige Zeichen maternaler Toxizität zeigt. Dieses Testprozedere ist zwar geeignet, um gefährliche Chemikalien zu identifizieren, dennoch ist es ausgesprochen teuer. Daher hat sich die in vitro-Kultur ganzer Embryonen als weniger aufwendige Screeningmethode etabliert, um Nagerembryonen während der kritischen Phase der Organogenese den Testchemika lien auszusetzen. Die üblicherweise durchgeführte Testung sieht dabei so aus, dass dem Kulturmedium die betreffenden Chemikalien zugesetzt werden und die kultivierten Embryonen nach Abschluss der Kulturphase mit Hilfe eines Scoring Systems (Brown et al., 1981) hinsichtlich bestimmter Endpunkte wie z. B. Anzahl der Somiten, Proteingehalt des Embryos, Scheitel-Steiß-Länge und morphologischer Entwicklungsparameter (z. B. Kopf-, Ohr-, Augen- und Herzentwicklung) unter möglicher Einbeziehung der Histologie auf mögliche Fehlbildungen hin beurteilt werden. Dosis- Wirkungsbeziehungen erlauben so Rückschlüsse auf ein mögliches teratogenes Potential der untersuchten Testsubstanz.

Kitchin et al. (1986) sahen die Vorteile der Kultur ganzer Em bryonen auf dem Gebiet des Screenings, wobei (1) die Testsub stanz unter kontrollierten Bedingungen verabreicht werden kann unter Ausschluss maternaler Wechselwirkungen mit unbekannter Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung; (2) Em bryonen verschiedener Spezies (hauptsächlich Ratte und Maus) können der Testsubstanz in identischen Testkonzentrationen aus gesetzt werden; (3) spezifische, die Wurfgröße beeinflussende Effekte können umgangen werden, da die Embryonen individuell kultiviert werden können, und (4) metabolisch aktivierende Sys teme können dem Kulturmedium zugesetzt werden.

Nachteile des Kultursystems ganzer Embryonen sind die vergleich sweise hohen Kosten für die Herstellung des Kulturmediums selbst. Im Gegensatz zu vielen Zell- und Organkultursystemen, in denen die verschiedensten Rezepturen chemisch-definierter Kul turmedien mit Zusatz von wenig oder gar keinem Serum zum Einsatz kommen, ist der Nährstoffbedarf ganzer Embryonen so hoch, dass bis heute das Kulturmedium für ganze Embryonen meist immer noch aus selbstgewonnenem Rattenserum mit einem Serumanteil von mindestens 70% besteht, welches von Anwendern unter hohem Kos ten- und Arbeitsaufwand und unter strenger Beachtung der Tier schutzrichtlinien gewonnen werden muss. Als Spendertiere werden dafür Ratten in großer Anzahl benötigt, die aufgrund der erfor derlichen Punktion zur Blutentnahme und des hohen Blutverlustes sterben. Das unter Einhaltung bekannter Standardprotokolle ge wonnene Rattenserum wird dabei noch vor der Gerinnung zentrifu giert, um eine Doppelherzbildung zu vermeiden und üblicherweise auch noch einer Hitzeinaktivierung für 30 Minuten bei 56°C un terzogen, bevor es einsetzbar ist als Kulturmedium (Steele et al., 1974; New et al., 1976; Cockroft, 1977; New, 1978).

Stand der Technik

Obwohl einige beachtliche Anstrengungen unternommen wurden, es sentielle und das Wachstum und die Differenzierung beein flussende Elemente von Rattenserum zu identifizieren, um ein chemisch-definiertes Medium für die Kultur ganzer Embryonen zu entwickeln, sind bisher nur wenige Ersatzstoffe für das Rat tenserum selbst vorgeschlagen worden. Zum Beispiel, haben einige Arbeitsgruppen humanes Serum für die Kultivierung von Rattenem bryonen ausgetestet (Shepard et al., 1970; Chatot et al., 1980; Gupta et al., 1983), jedoch sind die Resultate weder so gut noch so konsistent wie der Einsatz von Rattenserum (Steele, 1985).

Klug entwickelte 1985 ein Kulturmedium auf der Basis von Serum adulter Rinder, angereichert mit D+-Glucose und Methionin, welches in einem 4-Wochentakt von Kühen aus der Rinderklinik der FU-Berlin gewonnen wird (Klug et al., 1985a; Klug et al., 1990). Das Blut dieser ausgesuchten Rinder darf dabei vor der Abtren nung des Serums nicht zur Gerinnung gelangen; jedoch erwies sich bisher aus unbekannten Gründen nicht jede Spenderkuh als geeignet, und bei Verlust der erfolgreichen Spenderkuh mussten aufwendige Vortestungen von neuem beginnen. Ferner standen bei jedem Gewinnungszyklus immer nur maximal 0,5 Liter Serum zur Verfügung.

Kommerziell erhältliche Seren bovinen Ursprungs, ob vom Fetus, Kalb oder adulten Tier, die im Großmaßstab von ca. 1.000-Literpools je Charge prozessiert und von verschiedenen Herstellern weltweit angeboten werden, haben den Nachteil, dass sie das Wachstum und die Differenzierung der Embryonen in vitro nicht unterstützen, da sie entweder zu viele toxische Bestand teile enthalten oder wachstumsfördernde Inhaltsstoffe fehlen (Flick et al., 1999).

Die grundlegende Technik der Kultur ganzer Embryonen der Ratte, durchgeführt in Rattenserum als auch in Rinderserum, die bis heute weltweit Anwendung finden, sollen daher die drei Referen zen nochmals beispielhaft aufzeigen.

1. Steele C. E. and New D. A. T. (1974) Serum variants causing the formation of double hearts and other abnormalities in explanted rat embryos. J. Embryol. exp. Morp. 31, 707-719. Diese Referenz beschreibt u. a. das optimierte Verfahren zur Serumgewinnung und das optimierte Kulturmedium für die Kultur ganzer Embryonen in einem statischen als auch in einem rotierendem System.
Kulturmedium: Rattenserum aus eigener Herstellung, gewonnen aus der dorsalen Aorta von adulten Ratten
Zusammensetzung: Rattenserum, unverdünnt
Supplemente: keine
Aussagen: (1) Rattenblut muss sofort und noch vor der völligen Gerinnung zentrifugiert werden, um eine Doppelherzbildung bei den kultivierten Embryonen zu vermeiden. (2) Rattenserum muss für 30 Minuten bei 56°C hitzeinaktiviert werden.
2. New D. A. T., Coppola P. T. and Cockroft D. L. (1976) Improved development of head-fold rat embryos in culture resulting from low oxygen and modifications of the culture serum. J. Reprod. Fertil. 48, 219-222. Diese Referenz beschreibt die optimierte Serumgewinnung, das optimierte Kulturmedium als auch die optimierte Kulturtechnik ganzer Embryonen in einem rotierendem System.
Kulturmedium: Rattenserum aus eigener Herstellung, gewonnen aus der dorsalen Aorta von adulten Ratten
Zusammensetzung: Rattenserum, unverdünnt
Supplemente: keine
Aussagen: (1) Rattenblut muss sofort und noch vor der völligen Gerinnung zentrifugiert werden. (2) Rattenserum muss für 30 Min uten bei 56°C hitzeinaktiviert werden. (3) die kultivierten Embryonen entwickeln sich am besten in einer initialen Gasphase, die nur 5% Sauerstoff enthält.
3. Klug S., Lewandowski C. and Neubert D. (1985a). Modifica tion and standardization of the culture of early post implantation embryos for toxicological studies. Archs Toxicol. 58, 84-88. Diese Referenz beschreibt die Serumgewinnung, das optimierte Kulturmedium als auch die optimierte Kulturtechnik ganzer Embryonen in einem rotierendem System.
Kulturmedium: Rinderserum aus eigener Herstellung, gewonnen von einer adulten, nicht trächtigen Spenderkuh
Zusammensetzung: [Rinderserum : Tyrode (6 ml + 1 ml)]
Supplemente: 3 mg D+-Glucose/ml Kulturmedium sowie 75 (g Methionin/ml Kulturmedium.
Aussage: (1) Durch Punktion der Vena Jugularis gewonnenes Blut einer adulten Spenderkuh muss sofort und noch vor der völligen Gerinnung zentrifugiert werden. (2) Rinderserum einer adulten Spenderkuh muss für 30 Minuten bei 56°C hitzeinaktiviert werden.
4. Die kultivierten Embryonen entwickeln sich am besten in einer initialen Gasphase, die nur 10% Sauerstoff initial en thält. (4) Serum einer adulten Spenderkuh muss supplementiert werden (s. o.).

Es ist festgestellt worden, dass ganze Embryonen nicht in käu flichen Fetalen Kälberseren kultiviert werden können, da offen sichtlich wichtige wachstumsfördernde Inhaltsstoffe fehlen oder FCS im allgemeinen zu toxisch für Embryonen ist. Dieses wurde bereits publiziert (Flick et al., 1999).

Gemäß dem Stand der Technik gibt es kein mikrobiologisches Kul turmedium, welches aus mindestens zwei unterschiedlichen Grundkomponenten bovinen Ursprungs zusammengesetzt ist und kein Verfahren zu dessen Herstellung, das Wachstum und Differen zierung von ganzen Embryonen in vitro ermöglicht bzw. fördert.

Technisches Problem der Erfindung

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein in großen Mengen verfügbares Medium zur Kultivierung von Embryonen nicht-menschlicher Säugetiere anzugeben, in welchem die embryon ale Entwicklung gut abläuft, insbesondere Wachstum und Differen zierung von Embryonen der Ratte und der Maus in vitro über einen Kulturzeitraum von mindestens 24 bis 48 Stunden erlaubt, und welches dennoch einfach und preisgünstig herstellbar ist.

Es sollte standardisierbar und gut charakterisierbar sein, die notwendigen aktiven Inhaltsstoffe enthalten und frei von Toxink onzentrationen sein, die das Wachstum der Embryonen in vitro behindern könnten.

Grundzüge der Erfindung

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Kulturmedium enthaltend: a) 1-99 Vol.-% FCS und b) 1-99 Vol.-% adultes Rinderserum, wobei die Summe der Anteile der Kom ponenten a) und b) stets 100 Vol.-% beträgt. Kälberserum wird für die Zwecke der Erfindung als unter den Begriff des adulten Rinderserums fallend betrachtet.

Ein erfindungsgemäßes Kulturmedium weist keinerlei oder allen falls nur wenige Inhaltsstoffe, die von der Ratte abstammen. Es besteht teilweise oder völlig aus kommerziell erhältlichen Kom ponenten und ist folglich einfach, preiswert und in großen Men gen herstellbar. Überraschenderweise ermöglicht ein erfindungsgemäßes Kulturmedium dennoch ein gleichwertiges Wachstum und eine gleichwertige Differenzierung der ganzen Em bryonen in vitro, verglichen mit den Medien des Standes der Technik. Es ist aufgrund der eingesetzten Komponenten sehr gut charakterisierbar und erlaubt ein kontrolliertes Wachstum der ganzen Embryonen in vitro.

Das Kulturmedium nach der Erfindung weist als Grundkomponenten mindestens zwei verschiedene Seren bovinen Ursprungs auf, die nach verschiedenen separat ablaufenden Verfahren zu deren Aufre inigung miteinander vereinigt und schließlich optional mit ver schiedenen Wachstumsfaktoren angereichert werden.

Die zwei Seren bovinen Ursprungs liefern offenbar praktisch alle notwendigen Nährstoffe für die zu kultivierenden Embryonen. Denn mit der Kombination von mindestens zwei unterschiedlichen Seren bovinen Ursprungs werden unterschiedliche Nährstoffkomponenten, die für Wachstums- und Differenzierungsprozesse notwendig sind, dem Embryo über das Kulturmedium nach der Erfindung angeboten. Insbesondere werden vermutlich über den Zusatz von FCS bestimmte fetale Komponenten in das Kulturmedium nach der Erfindung einge bracht und zugleich toxische Komponenten des Serums adulter Tiere unter das toxische Level herunterverdünnt. Zum Beispiel ist es bekannt, dass unbehandelte adulte bovine Sera hohe Titer von IgG's aufweisen, die nicht hitzelabil sind und die die Ver sorgung des Embryos mit Nährstoffen über eine Schädigung des Dottersackes behindern (Brent, 1998). Das FCS enthält jedoch aufgrund des Alters der Feten im allgemeinen immer äußerst nie drige Titer von IGG. Durch Zusatz von hohen Mengenanteilen des FCS zum Anteil des adulten Rinderserums wird daher der Ge samttiter von IgG stark verdünnt und offensichtlich unter das toxische Level gebracht. Die mengenmäßigen Anteile des Serums adulter Tiere stellen vermutlich Substanzen dem Kulturmedium nach der Erfindung als Inhaltsstoffe zur Verfügung, die nicht im FCS enthalten sind.

Die Erfindung lehrt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Kulturmediums mit den folgenden Merk malen: A) die Komponente a) den folgenden Verfahrensschritten unterworfen wird: A1) die Komponente a) wird auf 15 bis 20°C abgekühlt, A2) dann wird eine Filtration mit einer Ausschlußgrenze im Bereich von 100 bis 500 nm, vorzugsweise von 200 bis 250 nm, durchgeführt, A2' optional wird das in Stufe A2) erhaltene Filtrat auf eine Temperatur unter -10°C, vorzugsweise unter -20°C, eingefroren und für einen Zeitraum von zumindest 1 Tag, vorzugsweise zumindest 6 Tage, zwischengelagert, A3) anschließend erfolgt bei einer Temperatur von 30 bis 45°C, vor zugsweise 35 bis 40°C, insbesondere 37°C; eine Begasung für eine Dauer von 0,1 bis 100 min., vorzugsweise 1 bis 10 min., höchstvorzugsweise 3 bis 5 min., mit einer Mischung aus CO₂, O₂ und N₂, gefolgt von einer Inkubation bei gleicher Temperatur, wobei ein pH von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise von 7,0 bis 8,0, höchstvorzugsweise von 7,4 bis 7,6, eingestellt wird, A4) danach erfolgt eine Filtration gemäß Stufe A2), A5) das in Stufe A4 erhaltene Filtrat wird der Stufe C zugeführt, B) die Komponente b) wird den folgenden Verfahrenstufen zugeführt: B0) optional erfolgt eine Hitzeinaktivierung, B1) es wird eine Filtration mit einer Ausschlußgrenze im Bereich von 100 bis 500 nm, vorzug sweise von 200 bis 250 nm, durchgeführt, B1') optional wird das in Stufe B1) erhaltene Filtrat auf eine Temperatur unter -10°C, vorzugsweise unter -20°C, eingefroren und für einen Zeitraum von zumindest 1 Tag, vorzugsweise zumindest 6 Tage, zwisch engelagert, B2) anschließend erfolgt bei einer Temperatur von 30 bis 45°C, vorzugsweise 35 bis 40°C, insbesondere 37°C; eine Begasung für eine Dauer von 0,1 bis 100 min., vorzugsweise 1 bis 10 min., höchstvorzugsweise 3 bis 5 min., mit einer Mischung aus CO₂, O₂ und N₂, gefolgt von einer Inkubation bei gleicher Tem peratur, wobei ein pH von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise von 7,0 bis 8,0, höchstvorzugsweise von 7,4 bis 7,6, eingestellt wird, B3) danach erfolgt eine Filtration gemäß Stufe A2), B4) das in Stufe B3 erhaltene Filtrat wird der Stufe C zugeführt, C) die Produkte aus den Stufen A5) und B4) werden miteinander in Anteilen gemäß Anspruch 1 gemischt. Es kann sich empfehlen, den Stufen A1) und/oder B0) ein schnelles definiertes Auftauen gefrorenen Aus gangsserums vorzuschalten. Das Auftauen kann dabei auf eine Tem peratur von 20 bis 50°C, vorzugsweise von 30 bis 45°C, höchstvorzugsweise von 35 bis 40°C, erfolgen.

Weiterhin lehrt die Erfindung die Verwendung eines erfindungs gemäßen Kulturmediums nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Kul tivierung von Rodentenembryonen, insbesondere Rattenembryonen.

Es können auch Zellen (wobei menschliche embryonale Stamm zellen sind menschliche Keimbahnzellen ausgeschlossen sind) oder Gewebe mit einem erfindungsgemäßen Kulturmedium kultiviert werden.

Schließlich lehrt die Erfindung die Verwendung eines erfindungs gemäßen Kulturmediums in einem Verfahren zur Untersuchung von prospektiven Wirkstoffen auf teratogene Wirkung mit den fol genden Verfahrenstufen: a1) trächtigen Rodenten werden Roden tenembryonen entnommen und in ein Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 10 eingebracht und kultiviert, a2) dem Kulturme dium wird vor oder nach dem Einbringen der Rodentenembryonen der prospektive Wirkstoff in einer physiologisch wirksamen Dosis zugegeben, a3) nach einer definierten Kultivierungsdauer werden die Rodentenembryonen auf Fehlbildungen untersucht.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Bevorzugt ist es, wenn das Kulturmedium a) 20-80 Vol.-%, vorzugsweise 40-60 Vol.-% FCS und b) 20-80 Vol.-%, vor zugsweise 40-60 Vol.-% adultes Rinderserum enthält. Die Komponente a) kann hitzeinaktiviert sein. Die Hitzeinak tivierung wird dann für zumindest 5 min., vorzugsweise zu mindest 15 min., höchstvorzugsweise für zumindest 30 min., bei 40 bis 70°C, vorzugsweise bei 50 bis 60°C, insbeson dere bei 56°C, durchgeführt. Die Komponente b) braucht nicht hitzeinaktiviert zu sein. Vorzugsweise ist kein Rat tenserum enthalten.

Im Kulturmedium können als weitere Komponenten, bezogen auf 100 Gewichtsteile der Komponenten a) und b) enthalten sein: c) 0, 005 bis 0,5, vorzugsweise 0,01 bis 0,1, insbesondere 0,05, Gewichtsteile eines Zuckers oder einer Mischung aus Zuckern und/oder d) 0,0001 bis 0,01, vorzugsweise 0,0005 bis 0,005, insbesondere 0,00125 Gewichtsteile einer natür lichen oder synthethischen Aminosäure und/oder e) 1 bis 100, vorzugsweise 10 bis 40, insbesondere 16,7, Gewicht steile einer Pufferlösung. Der Zucker kann D(+)-Glucose und/oder die Aminosäure kann Methionin sein. Der Einsatz von D(+)-Glucose kann sich empfehlen, da dieser Stoff in bo vinen Seren in geringerem Maße als in Rattenserum enthalten ist. Der Zusatz von Methionin ist hilfreich, um den Schluß des Neuralrohrs zu gewährleisten und weitere Fehlbildungen zu verhindern. Es ist auch möglich, Vitamine dem Kulturme dium zuzufügen.

Das Kulturmedium nach der Erfindung bietet den Vorteil, dass es aus bovinen Grundkomponenten besteht und daher im Vergleich zum üblicherweise benutzten Rattenserum sehr kostengünstig ist. Auf Grund seiner Zusammensetzung aus fetalen sowie aus adulten Grundbausteinen bovinen Ursprungs und durch weitere Anreicherung desselben mit bekannten Wachstumsfaktoren ist das Kulturmedium nach der Erfindung in der Lage, die extrem hohen Bedürfnisse von Embryonen der Ratte oder der Maus in vitro in dem Maße zu be friedigen, dass die Potenz des Kulturmediums nach der Erfindung gleichwertig wenn nicht sogar besser ist als das bisher in der Literatur verwendete adulte Rinderserum und dem Rattenserum sehr ähnliche wachstumsfördernde Eigenschaften aufweist. Bei der Kul tivierung der Embryonen im Kulturmedium nach der Erfindung konnten ein normales Wachstum sowie eine normale Differenzierung der Embryonen festgestellt werden und ein Auftreten von in der Literatur beschriebenen Doppelherzen (Steele et al, 1974) verne int werden.

Bestimmte wichtige Schritte des Verfahrens zur Herstellung des Kulturmediums nach der Erfindung betreffen die Präzipitation bestimmter Proteinfraktionen durch Auftau- und Einfriervorgänge. Es ist wohlbekannt, dass Serum beim Einfrierprozess ansteigenden Salzkonzentrationen ausgesetzt wird. Schnelles Einfrieren minim iert dieses "Aussalzen", erhöht jedoch den Sauerstoffgehalt in der Lösung und kann somit auch Oxidationsvorgänge fördern.

Bei der Aufreinigung von Part A und Part B sollten folgende Punkte Beachtung finden. Beim Einfrieren von proteinhaltigen Lösungen kann die Funktion dieser Lösung, wie z. B. enzymatische Aktivität als auch die Proteinstruktur beeinflusst und verändert werden. Diese Effekte variieren mit Kühl-, Einfrier- und Auftauzyklen, mit der Dauer des Einfrierens und der Temperatur als auch mit der Zusammensetzung der Lösung. Jedes Protein antwortet anders auf diese physikalische Behandlung, d. h. jede einzelne Behandlung mag nicht optimal sein für ein bestimmtes Protein des Serumpools. Einige Enzyme tolerieren die ver schiedenen Einfrier- als auch -auftauzyklen besser als andere, z. B. sind fibrilläre Proteine empfindlicher gegenüber dem Ein frierprozess als globuläre Proteine (Fennema O., 1982) Weiterhin kann die Autooxidation zur Bildung und Freisetzung freier Radi kale führen, die wiederum fast alle Serumkomponenten nachteilig verändern können. Es ist wohlbekannt, dass Serum viele Prooxi dantien enthält, unter ihnen sind Hämoglobin und Xanthinoxidase die zwei Wichtigsten. Xanthinoxydase ist nicht hitzeinaktivier bar, dennoch kann man seine schädliche Aktivität durch die Auswahl eines Serums mit niedrigem Hämoglobingehalt begrenzen. Die ebenfalls schädliche Photooxydation muss durch geeignete Lichtschutzmaßnahmen minimiert werden.

Ein Maximum an wachstumsfördernder Potenz für das Kulturmedium kann dadurch erzielt werden, daß alle Seren schnellstmöglich aufgetaut werden, indem man die Serum-Flaschen direkt in ein 37°C Wasserbad einbringt. Wenn man das Serum langsam auftaut, erfährt das Serum an der Wandung der Containerflasche eine Salzkonzentrierung, bei der bestimmte Serumkomponenten höheren Salzkonzentrationen als erwünscht ausgesetzt werden. Es ist da her wünschenswert, die folgende Empfehlung einzuhalten: Erstens; Resuspendierung der viskösen Anteile durch periodisches Schwenken der Serumflasche während des Auftauprozesses, wobei jedoch eine Schaumbildung ausgeschlossen sein muss; und zweitens, schnelles Wiedereinfrieren des Serums, indem man die Serum enthaltenen Flaschen direkt in einen Supercooler einbringt und die Probe eingefroren lagert bei minus 18 bis minus 35°C, vorzugsweise bei minus 20 bis minus 30°C, bevorzugterweise je doch bei minus 22 bis minus 24°C.

Eine weitere Option ist die Hitzeinaktivierung des Serumpools bei 50-60°C über 10-45 Minuten, welche die Toxizität des Serums vermindern kann. Man sah anfangs die Hitzeinaktivierung als not wendig an, um hitzeempfindliche Komponenten, wie z. B. das Kom plement, zu zerstören. Es ist im Rahmen der Erfindung jedoch festgestellt worden, dass es nicht notwendig ist, das fetale Serum einer Behandlung mit Hitze auszusetzen, um das Komplement zu zerstören, da offensichtlich die Auftau- und Einfrierprozesse sowie das Erwärmen der Seren auf 37°C hitzelabile Komplementfak toren in ausreichender Weise selbst schon zerstören. Weiterhin besteht keine Notwendigkeit zur Hitzeinaktivierung, etwa um schädliche Mycoplasmen zu zerstören, da das kommerziell erhältliche FCS ursprünglich bereits durch drei hintere inandergeschaltete Filter mit einer Porengröße von 0.1 µm von Lieferantenseite filtriert wurde. Gegensätzlich zu allen Protokollen zur Whole Embryo Kultur wurde daher auch fest gestellt, dass eine Hitzeinaktivierung des FCS wenig, wenn nicht gar keinen Nutzen für das Wachstum der ganzen Embryonen hat. Ferner, dass trotz nicht durchgeführter Hitzeinaktivierung keine Doppelherzbildung auftrat und allgemein nur dazu führt, dass die Wachstumsraten insgesamt vermindert sind. Eine Hitzeinak tivierung, sollte sie notwendig erscheinen, sollte daher streng überwacht werden durch ein Verfahren, welches wiederholbar ist. 500 ml-Flaschen sollten immer portioniert werden in kleine Ali quots von 10-100 ml, vorzugsweise 50 ml, um zu garantieren, dass das Serum der Hitze nicht unnötig lange ausgesetzt wird und dass die Serumfraktionen schnellstmöglich wieder eingefroren als auch wieder aufgetaut werden können. Es sollten dabei Glasflaschen und keine Plastikflaschen benutzt werden, da Glas ein besserer Wärmeleiter ist.

Eine optionale Behandlung ist die zusätzliche Anreicherung des Part C mit bestimmten Vitaminen. Es ist bekannt (Cockroft et al., 1988), dass viele Vitamine für Wachstum und Differenzierung von Embryonen wichtig sind. Der Bedarf an einer breiten Palette von Vitaminen hängt jedoch nachweislich vom eingesetzten Somitenstadium ab. So ist für Rattenembryonen bekannt, dass frühere Stadien wie z. B. der Gestationstag 9.0 eine eindeutige Notwendigkeit für die Anwesenheit von Pantothenat, Riboflavin, myo-Inositol, Folsäure und Niacinamid zeigt, wohingegen spätere embryonale Stadien (Tag 10.5) nur einen absoluten Bedarf an Ri boflavin aufweisen. Diese Daten wurden jedoch durch Dialysever suche ermittelt. Auch wenn einzelne Vitamine durch Lagerungsdauer des Serums sowie durch die Präzipitationsvorgänge im Kulturmedium nach der Erfindung verloren gegangen sein soll ten, so ist doch davon auszugehen, dass immer ein gewisser Grundgehalt an Vitaminen darin noch enthalten ist, der abhängig vom eingesetzten Embryonalstadium schon ausreichend sein kann, um Wachstum und Differenzierung der Embryonen in vitro angemes sen zu ermöglichen.

Neben der zweckmäßigen Anreicherung des Kulturmediums mit Me thionin (Coelho et al., 1989., Coelho et al., 1990) und Glucose (Ellington, 1987) ist eine zusätzliche Anreicherung des Part C mit weiteren freien Aminosäuren, aber auch mit anderen in der Whole Embryo Literatur beschriebenen Wachstumsfaktoren wie z. B. Albumin, Fetuin, EGF, IGF-I, IGF-II, VEGF, Insulin, eisengesät tigten Transferrin, Lipiden und weiteren möglich, um eine noch optimalere Proteinsynthese und eine normale Entwicklung der Em bryonen in vitro zu garantieren.

Um bakterielles Wachstum oder das anderer Mikroorganismen in folge der verschiedenen Aufreinigungsschritte zu verhindern, ist eine nachträgliche, weitere Sterilisierung des Kulturmediums zu empfehlen, z. B. durch Verwendung von sterilen Filterkartuschen (z. B. Schleicher & Schuell), wobei zu bedenken ist, dass wachstumsfördernde Komponenten wiederum verloren gehen könnten. Bakterielle Sterilität sowie der Ausschluss des Wachstums von Pilzen kann überprüft werden durch direkte Kulturtechniken in Flüssigmedien gemäß den üblichen Standardvorschriften. Steril ität gegenüber Mycoplasmmen kann überprüft werden durch direkte Kulturtechniken in Flüssigmedien, Immunfluoreszenz und Färbung mit Hoechst Farbstoffen. Virale Sterilität kann nachgewiesen werden gemäß Verfahren 9CFR113.53. Endotoxine können gemessen werden im LAL Assay und sollten eine Konzentration von ≦ 10 EU/ml, vorzugsweise 1-5 EU/ml, und bevorzugterweise ≦ 1 EU/ml aufweisen. Hämoglobin kann spectrophotometrisch gemessen werden und sollte einen Wert von ≦ 20 mg/dl nicht überschreiten, vorzugsweise ≦ 10 mg/dl und bevorzugterweise einen Wert ≦ 3 mg/dl aufweisen.

Als letzte Maßnahme kann der Gesamtproteingehalt des Kulturmedi ums nach der Erfindung eingestellt werden durch zweckdienliche Konzentrierungs- als auch Verdünnungsmaßnahmen, um dasselbe auf einen gewünschten Kontrollbereich von 5-8 g/dl Gesamtprotein, vorzugsweise auf 6-7 g/dl, einzustellen. Gleichzeitig können Elektrolytlevels (K+, Na+, etc.) auf jedes gewünschte Level eingestellt werden; vor zugsweise werden sie folgendermaßen eingestellt: [Na+] = 100-200 meq/Liter; [K+] = 1-20 meq/Liter; [Ca+2] = 1-5 meq/Liter. Bevor zugte Werte sind [Na+] = 150 meq/Liter; [K+] = 5-6 meq/Liter; [Ca+2] = 3-4 meq/Liter. Der pH-Wert wird auf 6-8, bevorzugt auf 7.5 bis 7.6 eingestellt. Die Osmolarität ist niedrig und sollte zwischen 285 und 315 mosm liegen, vorzugsweise zwischen 295 und 305 mosm.

Der Ausdruck "Serum bovinen Ursprungs" umfasst FCS als auch adultes Rinderserum von Spendertieren in jeder Hinsicht, das nicht vorbehandelt ist in irgendeiner Weise mit dem beabsi chtigten Ziel einer Aufreinigung oder um Proteine daraus zu separieren, mit Ausnahme der notwendigen Schritte zur Gewinnung von Serum aus Blut. Das adulte Serum kann jedoch auch durch Se rum von Kühen jüngeren Alters ersetzt werden unter eventuell dann notwendiger Anreicherung mit definierten Wachstumsfaktoren, die im Serum von jüngeren Kühen eventuell nicht in gleicher Menge enthalten sind wie im Serum adulter Spendertiere. Jedes erwähnte Serum sollte jedoch von höchster Qualität sein: stren ger Herkunftsnachweis und Abstammung von gesunden Herden, die nachgewiesenermaßen Virus negativ sind (via modifiziertem 9CFR 113.53), ferner ein geschlossenes System zur Blutgewinnung, sorgfältige Temperaturkontrolle, schnellstmögliche Abtrennung von Serum und Blutkuchen sowie Nachweis normaler biochemischer Profile und Zellkulturperformance. Weiterhin muss das Serum nie drige Endotoxinwerte (< 10 EU/ml) aufweisen sowie Hämoglobinge halte, die unter 10 mg/dl liegen; alles das sind Indikatoren dafür, dass das Serum sorgfältig gesammelt und schnellstmöglich unter minimalster Zelllysis und minimalster Freisetzung von My coplasmen und Viren aufgearbeitet wurde. Hohe alpha- Globulingehalte, normale beta-Globulingehalte und niedrige Im munglobulingehalte sind wünschenswert. Analysenzertifikate garantieren weiterhin, dass spezifische Releasekriterien einge halten wurden und dass das Serum nicht gepoolt wurde mit Serum von Spendertieren anderen Alters. Ein Elektrophoreseprotokoll und ein ausführlicher Assayreport geben weitere wertvolle Hin weise auf den Serumpool. Serum von USDA-Qualität und aus Ur sprungsländern wie Neuseeland und Australien sind wichtige Voraussetzungen für das Verfahren zur Herstellung des Kulturme diums nach der Erfindung.

Der Ausdruck "Lipide" umfasst allgemein die Alkohol- und Äther löslichen Bestandteile, die unlöslich in Wasser sind. Sie umfas sen die Fette, Fettsäuren, Öle, essentielle Fettsäuren, Waxe, Steroide, Phospholipide, Glycolipide, Sulfolipide, Aminolipide und Chromolipide (Lipochromes). Der Begriff beinhaltet auch Lipoproteine, Triglyceride, als auch die Lipid enthaltenden Hüllen und Membranen von Mycoplasmen.

Der Ausdruck "Endotoxin", in der Literatur auch bekannt als "bakterielles Pyrogen", bezieht sich auf die hitzestabilen Tox ine, die in der Bakterienzelle vorkommen aber nicht in in Zellkultur angezüchteten intakten Bakterien, und die gewöhnlich freigesetzt werden von sog. durch Autolysis freigesetzten Bakterien infolge von Zelltod. Endotoxine werden hauptsächlich gefunden in Darmbakterien, aber auch in bestimmten gramnegativen Kokken. Endotoxine wirken pyrogen, erhöhen die Zellpermeabilität und haben profunde Effekte auf das Zellwachstum, besonders auf Zellen lymphoiden Ursprungs aber auch auf ganze Embryonen (Flick et al., 1999) Die Aktivität ist dabei meist die gleiche, unab hängig davon, von welcher Art Bakterium sie abstammen. Endotox ine werden mit Hilfe des LAL Assays nachgewiesen.

Der Ausdruck "Hämoglobin" bezieht sich auf den roten Blut farbstoff als unverkennbaren Marker für die Lysis roter Blutzel len und infolgedessen auch als Marker für die Lysis weißer Blutzellen. Da weiße Blutzellen potentielle Verunreinigungen enthalten können, sichert ein niedriger Hämoglobinwert zu, dass das Risiko von Verunreinigungen durch Lysis weißer Blutzellen minimal ist. Hämoglobin wird spectrophotometrisch gemessen.

Der Ausdruck "Alpha Globuline" bezieht sich auf die Proteine, die im Blutserum und Blutplasma auf Trägermedien wie z. B. Zellu loseacetatfolien mit Hilfe der Elektrophorese in 5 Hauptgruppen trennbar sind und nach Ordnung elektrophoretischer Mobilität bei pH 8,6 in der α-Fraktion wandern und in α1- und α2-Globuline wiederum einteilbar sind. Inhalt überprüfen auf Richtigkeit.

Der Ausdruck "Beta Globuline" bezieht sich auf die Proteine, die im Blutserum und Blutplasma auf Trägermedien wie z. B. Zellu loseacetatfolien mit Hilfe der Elektrophorese in 5 Hauptgruppen trennbar sind und nach Ordnung elektrophoretischer Mobilität bei pH 8,6 in der β-Fraktion wandern.

Der in dieser Niederschrift benutzte Ausdruck "Immunglobuline (IgG)" bezieht sich auf die Proteine, die im Blutserum und Blutplasma auf Trägermedien wie z. B. Zelluloseacetatfolien mit Hilfe der Elektrophorese in 5 Hauptgruppen trennbar sind und nach Ordnung elektrophoretischer Mobilität bei pH 8,6 in der gamma-Fraktion wandern. Hierzu gehören die IgG, IgA, IgM, IgD und IgE. Die IgG's können quantitativ auch mit dem Nephelometer gemessen werden.

Die Herstellung von Rinderserum aus bovinem Blut ist in der Fachwelt wohlbekannt und wird daher hier nicht näher erläutert. Dabei werden Kühe, egal welchen Geschlechts, jedoch vorzugsweise nicht trächtig; egal ob Grasfütterung oder Kornfütterung; jedoch vorzugsweise Kornfütterung; und vorzugsweise älter als 1 Jahr herangezogen zur Blutspende unter Standardverfahren, welches unter Klug et al., 1985a ausführlich publiziert ist.

Die Herstellung von FCS ist ebenfalls in der Fachwelt wohl bekannt und wird daher ebenfalls hier nicht näher erläutert.

Das Kulturmedium nach der Erfindung ist lagerungsstabil bei mi nus 22 bis minus 24°C für mindestens 2 Jahre oder kann für den Einsatz anderer Zwecke lyophylisiert werden.

Die volumenmäßigen Anteile des sog. Part A als auch des sog. Part B können variiert werden, um Part C zu erhalten. Bevorzugt sind dabei jedoch Mischungsverhältnisse, in denen das Adulte Rinderserum in 50-98%, und das FCS in 2-50 Volumenprozent darin enthalten sind, dennoch können die Volumenanteile des Part A bis auf 5 Volumenanteile (von insgesamt 6 Gesamtvolumenanteilen) erhöht werden. Der Einsatz von solchen gemischten Kulturmedien ist deswegen vorteilhaft, da er die hohen Kosten des FCS senkt aber gleichzeitig die Anwendungsgebiete auch für die Zellkultur durch den Einsatz von FCS stark erweitert. Besonders vorzuziehen sind Kombinationen aus adultem bovinen Serum und FCS, jedoch kann das adulte Serum auch durch Serum vom neugeborenen Kalb ersetzt werden.

Um ein besseres Verständnis der Erfindung zu erzielen und viele der daraus resultierenden Vorteile aufzuzeigen, möge die fol gende detaillierte Beschreibung die Erfindung im Einzelnen ver ständlicher machen; worin Abb. 1 und Abb. 2 jeweils ein Flowchart zeigen, welche Herstellungsverfahren zur Bereit stellung erfindungsgemäßer Kulturmediumen mit verschiedenen adulten Rinderseren beschreiben.

Beispiel 1 Herstellungsweg eines Kulturmediums aus kommerziell erhältlichen Komponenten Part A

Ein bei minus 22 bis minus 24°C gelagertes, kommerziell erhältliches Serum von Feten (FCS) wird unter kontrollierten Bedingungen aufgetaut. Eine erste Fraktion, die schädliche Kom ponenten enthält, präzipitiert dabei aus der Lösung, die durch Filtration abgetrennt wird. Der abgetrennte erste Überstand wird für mindestens eine Woche eingefroren. Nach dem Auftauen dieses sog. ersten Überstandes wird dieser mit einem adäquaten Gas gemisch zur Einstellung des pH versetzt und unter Rollbewegungen in einem Inkubator bei 37°C gehalten, wobei eine zweite Fraktion aus dem Serum auspräzipitiert. Diese Fraktion enthält Restfibrin und andere Substanzen, die das Wachstum der kultivierten Embryo nen eher behindern als fördern. Demgemäss wird dieses zweite feste Retentat vom sog. zweiten Überstand durch Filtration ab getrennt und verworfen.

Part B

Ein bei minus 22 bis minus 24°C gelagertes, kommerziell erhältliches Serum adulter Rinder wird unter kontrollierten Bedingungen aufgetaut. Eine erste Fraktion, die schädliche Kom ponenten enthält, präzipitiert dabei aus der Lösung, die durch Filtration abgetrennt wird. Der abgetrennte erste Überstand wird für mindestens eine Woche eingefroren. Nach dem Auftauen dieses sog. ersten Überstandes wird dieser mit einem adäquaten Gas gemisch zur Einstellung des pH versetzt und unter Rollbewegungen in einem Inkubator bei 37°C gehalten, wobei eine zweite Fraktion aus dem Serum auspräzipitiert. Diese Fraktion enthält Restfibrin und andere unbekannte Substanzen, die mehr das Wachstum der kul tivierten Embryonen behindern als fördern. Demgemäss wird dieses zweite feste Retentat vom sog. zweiten Überstand durch Filtra tion abgetrennt und verworfen.

Part C

Volumenmäßig gleiche oder unterschiedliche Anteile der sog. zweiten Überstände aus dem sog. Part A und dem sog. Part B werden alsdann zusammengemischt und man erhält Part C.

Beispiel 2 Herstellungsweg eines Kulturmediums aus teilweise käuflichen Komponenten Part A

Ein bei minus 22 bis minus 24°C gelagertes, kommerziell erhältliches Serum von Feten (FCS) wird unter kontrollierten Bedingungen aufgetaut. Eine erste Fraktion, die schädliche Kom ponenten enthält, präzipitiert dabei aus der Lösung, die durch Filtration abgetrennt wird. Der abgetrennte erste Überstand wird für mindestens eine Woche eingefroren. Nach dem Auftauen dieses sog. ersten Überstandes wird dieser mit einem adäquaten Gas gemisch zur Einstellung des pH versetzt und unter Rollbewegungen in einem Inkubator bei 37°C gehalten, wobei eine zweite Fraktion aus dem Serum auspräzipitiert. Diese Fraktion enthält Restfibrin und andere unbekannte Substanzen, die mehr das Wachstum der kul tivierten Embryonen behindern als fördern. Demgemäss wird dieses zweite feste Retentat vom sog. zweiten Überstand durch Filtra tion abgetrennt und verworfen.

Part B

Ein bei minus 22 bis minus 24°C gelagertes Serum einer adulten Spenderkuh, gewonnen nach Klug et al., (1985a), wird unter kontrollierten Bedingungen aufgetaut. Eine erste Fraktion, die schädliche Komponenten enthält, präzipitiert dabei aus der Lösung, die durch Filtration abgetrennt wird. Der abgetrennte erste Überstand wird für mindestens eine Woche eingefroren. Nach dem Auftauen dieses sog. ersten Überstandes wird dieser mit einem adäquaten Gasgemisch zur Einstellung des pH versetzt und unter Rollbewegungen in einem Inkubator bei 37°C gehalten, wobei eine zweite Fraktion aus dem Serum auspräzipitiert. Diese Frak tion enthält Restfibrin und andere unbekannte Substanzen, die mehr das Wachstum der kultivierten Embryonen behindern als fördern. Demgemäss wird dieses zweite feste Retentat vom sog. zweiten Überstand durch Filtration abgetrennt und verworfen.

Part C

Beispiel 3 Ausführliche Beschreibung des Verfahrens zur Her stellung eines Kulturmediums nach Beispiel 1 Part A

Eine kommerziell erhältliche 500-ml Flasche mit fetalem bovinem Serum wird unter leichten Schwenkbewegungen und schnellstmöglich unter kontrollierten Bedingungen in einem 37°C Wasserbad aufgetaut. Nachdem das auf getaute Serum sorgfältig vermischt wurde, wird es unter sterilen Bedingungen portioniert, vorzugsweise in 50 ml Volumina und so fort und schnellstmöglich auf 15-20°C durch Schwenken der Flasche in einem Eisbad heruntergekühlt. Der erste Überstand wird durch Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengröße von 0.22 µm (Schleicher & Schuell, #) und hoher Proteinbindung abfiltriert vom festen ersten Pellet. Der sog. erste Überstand wird dann anschließend sofort und schnellstmöglich durch Einbringen der Probe in einen Quickcooler eingefroren, wo er für mindestens eine Woche bei minus 22 bis minus 24°C verbleibt. Nach Ablauf dieser Zeit wird der sog. er ste Überstand wieder schnellstmöglich unter kontrollierten Bedingungen in einem 37°C Wasserbad aufgetaut, gefolgt von ster iler Begasung des sog. 2. Überstandes mit 5% CO₂, 10% O₂ und 85% N₂ für 1-10 Minuten, vorzugsweise 2-5 Minuten und bevorzugter weise für 3.5 Minuten, um den pH-Wert auf 6.5-8.5, vorzugsweise auf 7.0-8.0 und bevorzugterweise auf 7.4-7.6 einzustellen. Der sog. erste Überstand wird dann für 1-4 Stunden bei 35-39°C bei 1-50 rpm rotiert, bevorzugterweise für 2 Stunden bei 37.0-37.5°C mit 25 rpm. Dem weiteren Aufreinigungsprozeß schließt sich danach eine sofortige Filtration des Serums durch eine Fil terkartusche mit einer Porengröße von 0.22 µm (Schleicher & Schuell) und hoher Proteinbindung an, wobei das Pellet ver worfen und der sog. zweite Überstand gesondert aufgefangen und lichtgeschützt gelagert wird bei 15 bis 20°C.

Part B

Eine kommerziell erhältliche 500-ml Flasche mit adultem bovinem Serum wird unter leichten Schwenkbewegungen und schnellstmöglich unter kontrollierten Bedin gungen in einem 37°C Wasserbad aufgetaut. Nachdem das aufgetaute Serum sorgfältig vermischt wurde, wird es unter sterilen Bedingungen portioniert, vorzugsweise in 50 ml Volumina und so fort und schnellstmöglich auf 15-20°C durch Schwenken der Flasche in einem Eisbad heruntergekühlt. Der erste Überstand wird durch Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengröße von 0.2 µm (Schleicher & Schuell) und hoher Proteinbindung abfiltriert vom festen ersten Pellet. Der sog. erste Überstand wird dann anschließend sofort und schnellstmöglich durch Einbringen der Probe in einen Quickcooler eingefroren, wo er für mindestens eine Woche bei minus 22 bis minus 24°C verbleibt. Nach Ablauf dieser Zeit wird der sog. er ste Überstand wieder schnellstmöglich unter kontrollierten Bedingungen in einem 37°C Wasserbad aufgetaut, gefolgt von ster iler Begasung des sog. 2. Überstandes mit 5% CO₂, 10% O₂ und 85% N₂ für 1-10 Minuten, vorzugsweise 2-5 Minuten und bevorzugter weise für 3.5 Minuten, um den pH-Wert auf 6.5-8.5, vorzugsweise auf 7.0-8.0 und bevorzugterweise auf 7.4-7.6 einzustellen. Der sog. erste Überstand wird dann für 1-4 Stunden bei 35-39°C bei 1-50 rpm rotiert, bevorzugterweise für 2 Stunden bei 37.0-37.5°C mit 25 rpm. Dem weiteren Aufreinigungsprozess schließt sich danach eine sofortige Filtration des Serums durch eine Fil terkartusche mit einer Porengröße von 0.22 µm (Schleicher & Schuell) und hoher Proteinbindung an, wobei das Pellet ver worfen und der sog. zweite Überstand gesondert aufgefangen und lichtgeschützt gelagert wird bei 15 bis 20°C.

Part C

Das Verfahren zur Herstellung des Kulturmediums nach der Erfindung wird fortgeführt, indem unter sterilen Bedingungen bestimmte Volumina des sog 2. Überstandes aus dem sog. Part A vermischt werden mit bestimmten Volumina des sog. 2. Überstandes aus dem sog. Part B, wodurch man Part C erhält. Part C kann danach zusätzlich angereichert werden mit essentiellen bekannten Wachstumsfaktoren, entweder vor oder nach der Vereinigung der sog. Part A und Part B.

Beispiel 4 Ausführliche Beschreibung eines Verfahrens zur Her stellung eines Kulturmediums Part A

Eine kommerziell erhältliche 500-ml Flasche mit fetalem bovinem Serum wird unter leichten Schwenkbewegungen und schnellstmöglich unter definierten Bedingungen in einem 37°C Wasserbad aufgetaut. Nachdem das aufgetaute Serum sorgfältig vermischt wurde, wird es unter sterilen Bedingungen portioniert, vorzugsweise in 50 ml Volumina und sofort und schnellstmöglich auf 15-20°C durch Schwenken der Flasche in einem Eisbad herun tergekühlt. Der erste Überstand wird durch Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengröße von 0.22 µm (Schleicher & Schuell) und hoher Proteinbindung abfiltriert vom festen ersten Pellet. Der sog. erste Überstand wird dann anschließend sofort und schnellstmöglich durch Einbringen der Probe in einen Quickcooler eingefroren, wo er für mindestens eine Woche bei minus 22 bis minus 24°C verbleibt. Nach Ablauf dieser Zeit wird der sog. erste Überstand wieder schnellstmöglich unter kontrollierten Bedingungen in einem 37°C Wasserbad aufgetaut, gefolgt von steriler Begasung des sog. 2. Überstandes mit 5% CO₂, 10% O₂ und 85% N₂ für 1-10 Minuten, vorzugsweise 2-5 Minuten und bevorzugterweise für 3.5 Minuten, um den pH-Wert auf 6.5-8.5, vorzugsweise auf 7.0-8.0 und bevor zugterweise auf 7.4-7.6 einzustellen. Der sog. erste Überstand wird dann für 1-4 Stunden bei 35-39°C bei 1-50 rpm rotiert, bevorzugterweise für 2 Stunden bei 37.0-37.5°C mit 25 rpm. Dem weiteren Aufreinigungsprozess schließt sich danach eine sofor tige Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengröße von 0.22 µm (Schleicher & Schuell) und hoher Pro teinbindung an, wobei das Pellet verworfen und der sog. zweite Überstand gesondert aufgefangen und lichtgeschützt gelagert wird bei 15 bis 20°C.

Part B

Serum wird von einer gesunden, vorzugsweise nicht trächtigen Spenderkuh nach bekanntem Verfahren gewonnen und auf gearbeitet (Klug et al., 1985a) und in 50 ml Volumina in Glas flaschen für mindestens eine Woche eingefroren. Dieses Serum wird dann unter leichten Schwenkbewegungen und schnellstmöglich unter kontrollierten Bedingungen in einem 37°C Wasserbad aufgetaut. Nachdem das aufgetaute Serum sorgfältig vermischt wurde, wird es sofort und schnellstmöglich auf 15-20°C durch Schwenken der Flasche in einem Eisbad herun tergekühlt. Der erste Überstand wird durch Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengröße von 0.2 µm (Schleicher & Schuell) und hoher Proteinbindung abfiltriert vom festen ersten Pellet. Der sog. erste Überstand wird dann anschließend sofort und schnellstmöglich durch Einbringen der Probe in einen Quickcooler eingefroren, wo er für mindestens eine Woche bei minus 22 bis minus 24°C verbleibt. Nach Ablauf dieser Zeit wird der sog. erste Überstand wieder schnellstmöglich unter kontrollierten Bedingungen in einem 37°C Wasserbad aufgetaut, gefolgt von steriler Begasung des sog. 2. Überstandes mit 5% CO₂, 10% O₂ und 85% N₂ für 1-10 Minuten, vorzugsweise 2-5 Minuten und bevorzugterweise für 3.5 Minuten, um den pH-Wert auf 6.5-8.5, vorzugsweise auf 7.0-8.0 und bevor zugterweise auf 7.4-7.6 einzustellen. Der sog. erste Überstand wird dann für 1-4 Stunden bei 35-39°C bei 1-50 rpm rotiert, bevorzugterweise für 2 Stunden bei 37.0-37.5°C mit 25 rpm. Dem weiteren Aufreinigungsprozess schließt sich danach eine sofor tige Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengröße von 0.22 µm (Schleicher & Schuell) und hoher Prote inbindung an, wobei das Pellet verworfen und der sog. zweite Überstand gesondert aufgefangen und lichtgeschützt gelagert wird bei 15 bis 20°C.

Part C

Beispiel 5 Anwendungsgebiete

Das Kulturmedium nach der Erfindung ist nützlich in allen An wendungsgebieten der Zell- und Gewebekultur, in denen FCS be nutzt wird. Es kann auch als kostengünstiges Ersatzkulturmedium eingesetzt werden auf dem Gebiet der Zellkultur, wie sie in Ham, R. G. und McKeeham, W. L., supra beschrieben sind. Es können viele verschiedene Zellinien darin angezüchtet werden, da die Kul tivierung nicht auf eine einzige Zellinie beschränkt ist. Nor malerweise beträgt der Gehalt an Serum in Gewebekulturmedien 2-20 Volumenprozent, bevorzugterweise ungefähr 10%. Das An wendungsgebiet umfasst Monolayerkulturen, Suspensionskulturen und Clonierungskulturen. Das bedeutendste Anwendungsgebiet für das Kulturmedium nach der Entwicklung besteht jedoch in der An wendung als Kulturmedium ganzer Nagerembryonen speziell für die Kultivierung von Embryonen der Ratte.

Beispiel 6 Kulturtechnik und Testansatz der Embryonen für den Gestationstag 9,5)

Trächtige Ratten vom Gestationstag 9,5; wobei die ersten 24 Stunden nach der Verpaarung "Tag 0" genannt werden (unter Nach weis von Spermien im Vaginalabstrich), wurden durch Dekapitation getötet und deren Embryonen basierend nach der Kulturtechnik von Steele et al. (1974), New et al. (1976) und Klug et al. (1985a) für 48 Stunden kultiviert. Die Embryonen wurden vor Einsatz in die Kultur gestaged nach Brown et al. (1991), und nur mittlere Headfold-Stadien (mit 2 und 3 Somiten) wurden in den Testansatz aufgenommen.

Je 3-4 Embryonen wurden dafür in rotierenden Penicillinflaschen (25 rpm) bei 38,5°C in 7 ml Kulturmedium für 48 Stunden kul tiviert. Die mit dem Kulturmedium und den Embryonen beschickten Kulturflaschen wurden initial begast mit 10% O₂, 5% CO₂ und 85% N₂. Nach 36 Stunden Kultur wurden die Kulturflaschen erneut be gast, jetzt aber mit einem Gasgemisch von 50% O₂, 5% CO₂ und 45% N₂. Am Ende des Kulturzeitraums von 48 Stunden wurden die Embry onen bezüglich Wachstum und Entwicklung auf Basis eines Scoring systems (Brown et al. (1981) und Klug et al. (1985a) beurteilt. Daten in den Tabellen 1 und 2 geben die Medianwerte (mittlere Zahl in der betreffenden Spalte) als auch das dritte Quartil (obere Zahl in der betreffenden Spalte) und das erste Quartil (untere Zahl in der betreffenden Spalte) wieder.

Der Testansatz bestand immer aus 6 ml Testserum und 1 ml Puffer, wobei allen bovinen Testseren über den zugesetzten Puffer pro ml Kulturmedium zusätzlich 3 mg D+-Glukose und 75 (g Methionin zugesetzt wurde, da bekannt ist, daß bovine Seren im Allgemeinen weniger Glukose als Rattenserum enthalten und zusätzlich Me thionin benötigen, um den Schluß des Neuralrohrs zu gewährleisen und um weitere Fehlbildungen zu verhindern.

Unverdünntes Rattenserum, von Spendertieren nach Steele et al. (1974) und New et al. (1976) gewonnen und aufbereitet, kam un supplementiert zum Einsatz (6 ml Rattenserum plus 1 ml Puffer) und diente als Referenz.

Tabelle 1 zeigt die Kulturergebnisse von Tag 9.5 Rattenembryonen nach 48 Stunden Kultur. Unverdünntes Rattenserum, welches nach Steele and New, 1974 gewonnen wurde, diente hierbei als Refer enz-serum. Es wurden ausgetestet 3 verschiedene Chargen adultes bovines Serum nach Klug et al., (1985a) sowie 2 verschiedene Chargen kommerziell erhältliches FCS höchster Qualität sowie Kulturmedien nach Beispiel 2/4. Alle Seren wurden für 30 Min einer Hitzebehandlung bei 56°C unterzogen. Die Ergebnisse zei gen, daß die erfindungsgemäßen Kulturmedien ein deutlich besseres Wachstum und eine bessere und normale Differenzierung der Embryonen ermöglicht als adultes bovines Serum nach Klug et al., (1985a). Das erfindungsgemäße Kulturmedium ermöglicht dies bis zu einer starken Verschiebung der Volumenanteile von Part A und Part B, nämlich bis auf 5 Volumenanteile FCS (Part A) und 1 Volumenanteil adultes bovines Serum (Part B). FCS als Kulturme dium ist nicht förderlich und führt zu einer hohen Fehlbildungsrate, einem sehr niedrigen Proteinwert und mangel haftem Längenwachstum (CR).

Tabelle 2 demonstriert die Kulturergebnisse von Tag 9.5 Rat tenembryonen nach 48 Stunden Kultur. Es wurde speziell die Dauer der Hitzeinaktivierung variiert. Die Ergebnisse zeigen, daß adultes Serum, welches nach Klug et al., (1985a) gewonnen und aufgearbeitet wurde, einer Hitzeinaktivierung unterzogen werden muß, wohingegen FCS nicht hitzebehandelt werden darf (vergleiche hierzu auch mit hitzebehandeltem FCS, Tabelle 1). Das Kulturme dium nach Beispiel 1/3 als auch das Kulturmedium nach Beispiel 2/4 ermöglichen ein gutes Wachstum und eine normale Differen zierung der Embryonen in vitro als das Kulturmedium nach Klug et al., (1985a), vergleiche hierzu auch mit Tabelle 1.

Beipiel 7 Kulturtechnik und Testansatz der Embryonen für den Gestationstag 10.1

Trächtige Ratten vom Gestationstag 10.1; wobei die ersten 24 Stunden nach der Verpaarung "Tag 0" genannt werden (unter Nach weis von Spermien im Vaginalabstrich), wurden durch Dekapitation getötet und deren Embryonen basierend nach der Kulturtechnik von Steele et al. (1974) und New et al. (1976), und in Anlehnung an die Basistechnik von Klug et al. (1985a) für 50 Stunden kul tiviert. Die Embryonen wurden vor Einsatz in die Kultur gestaged nach Fujinaga et al. (1995), und nur Embryonen des Stadiums 12 (8 Somiten) und Stadium 13 (9 Somiten) wurden in den Testansatz aufgenommen.

Je 3 Embryonen wurden dafür in rotierenden Penicillinflaschen (25 rpm) bei 38,5°C in 7 ml Kulturmedium für 50 Stunden kul tiviert. Die mit dem Kulturmedium und den Embryonen beschickten Kulturflaschen wurden initial begast mit 15% O₂, 5% CO₂ und 80% N₂. Nach 36 Stunden Kultur wurden die Kulturflaschen erneut be gast, jetzt aber mit einem Gasgemisch von 40% O₂, 5% CO₂ und 55% N₂ und ein drittes Mal nach 43 Stunden mit 85% O₂, 5% CO₂ und 10% N₂. Am Ende des Kulturzeitraums von 50 Stunden wurden die Embryonen bezüglich Wachstum und Entwicklung auf Basis eines Scoringsystems (Brown et al. (1981) und Klug et al. (1985a) beurteilt. Daten in den Tabellen 3 bis 5 geben die Medianwerte (mittlere Zahl in der betreffenden Spalte) als auch das dritte Quartil (obere Zahl in der betreffenden Spalte) und das erste Quartil (untere Zahl in der betreffenden Spalte) wieder.

Tabelle 3 zeigt die Kulturergebnisse von Tag 10.1 Rattenembryo nen nach 50 Stunden Kultur. Unverdünntes Rattenserum, welches nach Steele and New, 1974 gewonnen wurde, diente hierbei als Referenzserum. Es wurden ausgetestet unverdünntes, kommerziell erhältliches FCS und unverdünntes, kommerziell erhältliches adultes Rinderserum, welche beide ebenfalls für 30 Min. bei 56°C hitzebehandelt wurden. Die Ergebnisse zeigen, daß nur das Rat tenserum ein gutes Wachstum und eine normale Differenzierung der Embryonen ermöglicht.

Tabelle 4 demonstriert die Kulturergebnisse von Tag 10.1 Rat tenembryonen nach 50 Stunden Kultur im Kulturmedium nach Beispiel 1/3 bzw. 2/4. Es wurden ausgetestet verschiedene kom merziell erhältliches FCS und verschiedene kommerziell erhältli che adulte Rinderseren. Alle adulten Seren wurden dabei einer Hitzebehandlung unterzogen. Die Ergebnisse zeigen, daß das Kul turmedium in beiden Fällen ein gutes Wachstum und eine normale Differenzierung der Embryonen in vitro ermöglicht, und daß das FCS von einem qualitativ hochwertigen Serum stammen sollte.

Tabelle 5 demonstriert im direkten Vergleich die Kulturergeb nisse von Tag 10.1 Rattenembryonen nach 50 Stunden Kultur im Kulturmedium. Die Ergebnisse zeigen, daß das Kulturmedium nach Beispiel 1/3 ebenso wie nach 2/4 ein gutes Wachstum und eine normale Differenzierung der Embryonen in vitro ermöglicht; daß eine zusätzliche Anreicherung des Kulturmediums mit Vitaminen (Riboflavin und myo-Inositol) vorteilhaft ist und daß eine strenge Stadieneinteilung bei Selektion der Embryonen für die Kultur zu erfolgen hat.

Tabelle 1

Kulturergebnisse von Tag 9.5 Rattenembryonen nach 48 Stunden in unverdünnten oder verdünnten bovinen Seren (Medianwerte)

Tabelle 2

Kulturergebnisse von Tag 9.5 Rattenembryonen nach 48 Stunden in verschiedenen bovinen Seren und nach verschiedenen Hitzeinaktivierungsschemata (Medianwerte)

Tabelle 3

Kulturergebnisse von Tag 10.1 Rattenembryonen nach 50 Stunden in verschiedenen unverdünnten bovinen Seren (Medianwerte)

Es wurden nur Embryonen vom Stadium 12/s8 und Stadium 13/s9 (Fujinaga, 1995) kultiviert.

Tabelle 4

Kulturergebnisse von Tag 10.1 Rattenembryonen nach 50 Stunden in verschiedenen verdünnten Seren (Medianwerte)

Tabelle 5

Kulturergebnisse von Tag 10.1 Rattenembryonen nach 50 Stunden in verschiedenen Seren (Medianwerte)

Direkter Vergleich des Kulturmediums nach Anspruch . . ., welches nach Flowchart Abb. 1 hergestellt wurde und der Potenz des Kulturmediums nach Anspruch . . ., welches nach Flowchart Abb. 2 (und unter weiterer Anreicherung mit Vitaminen) hergestellt wurde.

Diese zwei Beispiele verdeutlichen auch die Notwendigkeit einer exkten Standardisierung der Embryonen bei Kulturbeginn, die nach Fujinaga, 1995 erfolgte.

Literatur

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Die folgenden Abkürzungen wurden verwendet:
#: Bestellnummer
%: Prozent
µ: mikro-
µg/E: Microgramm pro Embryo
°C: Grad Celsius
1 + 1: ein Volumenanteil plus ein Volumenanteil
2 + 1: zwei Volumenanteile plus ein Volumenanteil
5 + 1: fünf Volumenanteile plus ein Volumenanteil
Abn: Abnormitäten
BS: adultes Rinderserum eigener Herstellung von einer Spenderkuh aus eigener Herde
BSA: Serumalbumin vom Rind
Ca: Kalzium
cBS: käufliches adultes Rinderserum von weltweit operierenden Serenlieferanten
CO₂: Kohlendioxyd
CR: Scheitel-Steiß-Länge
dl: Deziliter
EGF: Epidermal Growth Factor
et al.: und andere Autoren
FCS: Fetales Kälberserum
G: käufliches Serum von Life Technologies (Gibco)
gm: Gramm
H: käufliches Serum von Hyclone
h: Stunde(n)
HBSS: Hank's Balanced Salt Solution, chemisch-definierte Pufferlösung
Herst: Hersteller des Testserums
IGF: Insulin-Like Growth Factor
K: Kalium
L: Liter
lot: Charge
M: Molar
mg: Milligramm
min: Minute(n)
ml: Milliliter
mm: Millimeter
mM: Millimolar
mosm: Milliosmol (µmol/Kg)
n: Anzahl der in vitro getesteten Embryonen
N₂: Stickstoff
Na: Natrium
nm: Nanometer
NO: Serum wurde nicht verdünnt
O: Serum eigener Herstellung von einer Spenderkuh aus eigener Herde
O₂: Sauerstoff
Prot: Proteingehalt des ganzen Embryos nach Entfernen der Hüllen
rpm: Umdrehungen pro Minute
Score: Bewertungsschema (siehe Brown und Fabro, 1981)
Som: Somiten
t: angewendete Temperatur bei der Hitzeinaktivierung
v: Volumen
VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor
Verd: Verdünnung des Testserums

Claims

1. Kulturmedium enthaltend:

a) 1-99 Vol.-% FCS und
b) 1-99 Vol.-% adultes Rinderserum,

wobei die Summe der Anteile der Komponenten a) und b) stets 100 Vol.-% beträgt.

2. Kulturmedium nach Anspruch 1, enthaltend

a) 20-80 Vol.% FCS und
b) 20-80 Vol.-% adultes Rinderserum.

3. Kulturmedium nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kompo nente a) hitzeinaktiviert ist.

4. Kulturmedium nach Anspruch 3, wobei die Hitzeinak tivierung für zumindest 5 min. bei 40 bis 70°C durchgeführt ist.

5. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Komponente b) nicht hitzeinaktiviert ist.

6. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei kein Rattenserum enthalten ist.

7. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 6, enthal tend als weitere Komponenten, bezogen auf 100 Gewicht steile der Komponenten a) und b):

a) 0,005 bis 0,5 Gewichtsteile eines Zuckers oder einer Mischung aus Zuckern und/oder
b) 0,0001 bis 0,01 Gewichtsteile einer natürlichen oder synthethischen Aminosäure und/oder
c) 1 bis 100, Gewichtsteile einer Pufferlösung.

8. Kulturmedium nach Anspruch 7, wobei der Zucker D(+)-Glucose und/oder die Aminosäure Methionin ist.

9. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 8 dadurch erhältlich, daß

A) die Komponente a) den folgenden Verfahrensschritten unterworfen wird:
- 1. die Komponente a) wird auf 15 bis 20°C abgekühlt,
- 2. dann wird eine Filtration mit einer Ausschlußgrenze im Bereich von 100 bis 500 nm durchgeführt,
- 3. anschließend erfolgt bei einer Temperatur von 30 bis 45°C eine Begasung für eine Dauer von 0,1 bis 100 min. mit einer Mischung aus CO₂, O₂ und N₂, gefolgt von einer Inkubation bei gleicher Temperatur, wobei ein pH von 6,5 bis 8,5 eingestellt wird,
- 4. danach erfolgt eine Filtration gemäß Stufe A2),
- 5. das in Stufe A4 erhaltene Filtrat wird der Stufe C zugeführt,
B) die Komponente b) wird den folgenden Verfahrenstufen zugeführt:
- 1. es wird eine Filtration mit einer Ausschlußgrenze im Bereich von 100 bis 500 nm durchgeführt,
- 2. anschließend erfolgt bei einer Temperatur von 30 bis 45°C eine Begasung für eine Dauer von 0,1 bis 100 min. mit einer Mischung aus CO₂, O₂ und N₂, gefolgt von einer Inkubation bei gleicher Temperatur, wobei ein pH von 6,5 bis 8,5 eingestellt wird,
- 3. danach erfolgt eine Filtration gemäß Stufe A2),
- 4. das in Stufe B3 erhaltene Filtrat wird der Stufe C zugeführt,
C) die Produkte aus den Stufen A5) und B4) werden mite inander in Anteilen gemäß Anspruch 1 gemischt.

10. Verfahren zur Herstellung eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit den folgenden Merkmalen:

A) die Komponente a) den folgenden Verfahrensschritten unterworfen wird:
- 1. die Komponente a) wird auf 15 bis 20°C abgekühlt,
- 2. dann wird eine Filtration mit einer Ausschlußgrenze im Bereich von 100 bis 500 nm durchgeführt,
- 3. anschließend erfolgt bei einer Temperatur von 30 bis 45°C eine Begasung für eine Dauer von 0,1 bis 100 min. mit einer Mischung aus CO₂, O₂ und N₂, gefolgt von einer Inkubation bei gleicher Temperatur, wobei ein pH von 6,5 bis 8,5 eingestellt wird,
- 4. danach erfolgt eine Filtration gemäß Stufe A2),
- 5. das in Stufe A4 erhaltene Filtrat wird der Stufe C zugeführt,
B) die Komponente b) wird den folgenden Verfahren stufen zugeführt:
- 1. es wird eine Filtration mit einer Ausschlußgrenze im Bereich von 100 bis 500 nm durchgeführt,
- 2. anschließend erfolgt bei einer Temperatur von 30 bis 45°C eine Begasung für eine Dauer von 0,1 bis 100 min. mit einer Mischung aus CO₂, O₂ und N₂, gefolgt von einer Inkubation bei gleicher Temperatur, wobei ein pH von 6,5 bis 8,5 eingestellt wird,
- 3. danach erfolgt eine Filtration gemäß Stufe A2),
- 4. das in Stufe B3 erhaltene Filtrat wird der Stufe C zugeführt,
C) die Produkte aus den Stufen A5) und B4) werden miteinander in Anteilen gemäß Anspruch 1 gemischt.

11. Verwendung eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Kultivierung von Zellen, Geweben, oder Roden tenembryonen.

12. Verwendung eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem Verfahren zur Untersuchung von prospektiven Wirkstoffen auf teratogene Wirkung mit den folgenden Verfahrenstufen:

1. trächtigen Rodenten werden Rodentenembryonen entnommen und in ein Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 10 eingebracht und kultiviert,
2. dem Kulturmedium wird vor oder nach dem Einbringen der Rodentenembryonen der prospektive Wirkstoff in einer physiologisch wirksamen Dosis zugegeben,
3. nach einer definierten Kultivierungsdauer werden die Rodentenembryonen auf Fehlbildungen untersucht.