DE10162814A1 - Rekonstruiertes Haarfollikelmodell - Google Patents

Rekonstruiertes Haarfollikelmodell

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Abstract

Beschrieben wird ein Haut-/Haaräquivalent, insbesondere ein Haarmodell mit rekonstruierten Papillen (Pseudo-Papillen; PP) in einer rekonstruierten Dermis (Pseudo-Dermis; PD) und seine Herstellung sowie seine Verwendung, insbesondere für medizinische-pharmazeutische Zwecke und zur Anwendung in der Kosmetikindustrie.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Haut-/Haaräquivalent, insbesondere ein Haut-/Haarmodell mit rekonstruierten Papillen (Pseudo-Papillen) in einer rekonstruierten Dermis (Pseudo-Dermis), und seine Herstellung sowie seine Verwendung, insbesondere im Bereich der Medizin, Pharmazie und Kosmetik.
  • Um Wirkstoffe zu finden, die beispielsweise eine biologische Wirkung auf den Haarfollikel ausüben und so Haarpigmentierung, Haarwachstum sowie Haarstruktur beeinflussen können, müssen geeignete in-vitro-Testsysteme existieren, an denen eine solche Wirkung evaluiert werden kann. Diese Testsysteme sollten idealerweise das Screenen einer größeren Anzahl von Stoffen ermöglichen, standardisierbar und kostengünstig sein sowie - falls es sich um in-vitro-Systeme handelt - der in-vivo-Situation möglichst nahe kommen.
  • In der Haarforschung existieren zur Zeit keine geeigneten in-vitro-Modelle, um beispielsweise Haarwachstum, Haarpigmentierung und Haarstruktur zu untersuchen. Eine Zusammenstellung der vorhandenen Methoden sowie eine Schilderung der Nachteile dieser Systeme findet sich z. B. bei K. S. Stenn "Laboratory Assessment of Hair Follicle Growth" in Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 1999; 12: 154-157. Diese Systeme reichen von Monolayer-Zellkulturen über Tier-Modelle und Ex-vivo-Systeme bis hin zu in-vitro-Systemen.
  • Monolayer-Kulturen von Haarfollikelzellen haben den Nachteil, daß sich die Zellen, wenn sie aus ihrem komplexen dreidimensionalen Strukturen herausgenommen werden, anders verhalten, als sie das im Gesamtorgan tun würden. Daher sind Aussagen über die Wirkung von Substanzen auf Haarfollikelzellen, die als Monolayer kultiviert wurden, für die in-vivo-Situation wenig relevant. Tiermodelle sind für die Entwicklung von kosmetischen Produkten nach der Kosmetikrichtlinie verboten. Ex-vivo-Modelle, die in-vitro-Methoden mit in-vivo-Methoden am Tier kombinieren, kommen daher ebenfalls nicht in Betracht. Ähnliche Probleme der Verfügbarkeit von Material sowie der Standardisierbarkeit ergeben sich bei der Verwendung von Hautexplantaten mit Haaren in Kultur. In-vivo-Studien am Menschen werden zwar zur Absicherung der Wirkung durchgeführt, empfehlen sich jedoch erst, wenn ein potenter Wirkstoff entdeckt und in eine Formulierung eingearbeitet wurde, da diese Studien entsprechend teuer und aufwendig sind. Zum Screenen von Substanzen, welche die Haarfarbe beeinflussen, fehlen ebenfalls geeignete in-vitro- Testsysteme.
  • In-vitro-Tests zur Veränderung der Haarpigmentierung durch Beeinflussung der Melaninproduktion der Melanozyten werden ebenfalls hauptsächlich an Einzelzellkulturen durchgeführt. Häufig werden hierzu epidermale Melanozyten oder B16-Melanoma-Zellen verwendet und von den Ergebnissen an diesem Zelltyp auf die Haarmelanozyten extrapoliert, da letztere schwer zu isolieren und zu kultivieren sind. Hinzu kommt, daß in diesen Systemen die komplexe Interaktion der Melanozyten mit dem Haarfollikel fehlt und die Relevanz für die Situation in vivo am Haarfollikel daher in Frage gestellt werden muß. Das gleiche gilt für rekonstruierte Hautmodelle, die (epidermale) Melanozyten enthalten. Tiermodelle, die ebenfalls ein beliebtes Testmodell für Substanzen, welche einen Einfluß auf die Haarpigmentierung haben, darstellen, verbieten sich nach der Kosmetik-Richtlinie, wenn die Substanzen für Kosmetikprodukte eingesetzt werden sollen. In-vivo-Studien am Menschen sind langwierig und teuer und empfehlen sich daher erst, wenn ein potenter Wirkstoff gefunden wurde.
  • Bei der Technik des "Tissue Engineering" werden verschiedene Zellarten aus Gewebe, z. B. der Haut, isoliert und in der Zellkultur als sogenannte Monolayer oder Einzelschicht vermehrt. Aus den Einzelzellen wird dann das Gewebe wieder rekonstruiert. Im Falle der Haut können dazu z. B. Fibroblasten in ein Kollagengel oder eine andere Matrix ausgesät werden, so daß sie proliferieren und eine Pseudo-Dermis bilden. Auf diese können epidermale Keratinozyten aufgebracht werden, die ebenfalls proliferieren und eine Pseudo-Epidermis bilden. Durch Anheben der Kultur an die Luft (sogenanntes "Air-Liquid-Interface") beginnen die Zellen zu differenzieren und ein Stratum corneum auszubilden.
  • In der Haarforschung wurde bisher hauptsächlich mit Zellkulturen, z. B. Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide (ORS-Keratinozyten, ORS = Outer Root Sheath), dermalen Papillenzellen etc. gearbeitet. Es wurden aber auch immer wieder Versuche gemacht, Haarfollikel oder Teile von Haarfollikeln als dreidimensionales Modell, z. B. in einem Kollagengel, zu kultivieren bzw. ganze Haarfollikel durch Kombination verschiedener Haarfollikelzellen zu rekonstruieren.
  • Von M. Michel et al. "Characterization of e new tissue-engineered human skin equivalent with hair" in In Vitro Cell. Dev. Biol. - Animal 35: 318-326, Juni 1999 wird zum ersten Mal über die Insertion eines Haarfollikels in ein rekonstruiertes Hautmodell zum Einsatz in Penetrations-Untersuchungen berichtet. Hierbei werden ganze Haarfollikel eingesetzt, die vorher aus behaarter Haut präpariert werden müssen. Abgesehen von der eingeschränkten Verfügbarkeit des Materials, ist die Standardisierbarkeit bei Verwendung von präparierten Haaren schlecht, da die biologischen Schwankungen groß sind.
  • In der EP 0 285 471 A1 und der EP 0 285 474 A1 wird ebenfalls die Produktion einer künstlichen Haut beschrieben, die aus einem dermalen Layer aus kontraktilen Zellen (Fibroblasten) und extrazellulären Matrixkomponenten besteht, in die ganze Haarfollikel oder Follikelsegmente eingesetzt werden. Dieser wird dann zusätzlich mit Keratinozyten beschichtet, die einen epidermalen Layer ausbilden. Nachteil hierbei ist, daß keine Rekonstruktion der Papillen erfolgt, sondern nur ein Teil des Haarfollikels ohne Papille verwendet wird.
  • Eine japanische Arbeitsgruppe (M. Inamatsu et al. "Hair Follicle Development in Organotypic Culture", Third Intercontinental Meeting of Hair Research Societies (Abstract), Tokyo, 2001) benutzt als Modell für die frühe Phase der Haarentwicklung frisch isolierte dermale Papillen aus Ratten-Schnurrhaaren, die zwischen einem Kollagen-Gel mit Fibroblasten und einer epidermalen Schicht aus Ratten-Keratinozyten inseriert werden. Diese organotypische Kultur wird am Air-Liquid-Interface (Luft-Flüssigkeits-Grenze) kultiviert. Nach 7 Tagen soll es zu einer Verdickung der Epidermis in der Nähe der dermalen Papillen kommen. Hier werden erstens keine humanen Zellen oder Papillen verwendet, zweitens handelt es sich um ganze, aus Haarfollikeln isolierte Papillen und nicht um rekonstruierte Papillen, und drittens werden die Papillen nicht in die Dermis inseriert (z. B. gespritzt oder gepfropft), sondern zwischen die dermale und die epidermale Schicht gelegt. Bei Verwendung von isolierten Papillen ergeben sich die gleichen Probleme der Verfügbarkeit und Standardisierbarkeit wie mit isolierten Haarfollikeln.
  • Ähnliches gilt für die Arbeiten von S. A. J. Watson et al. "Sheep vibrissa dermal papillae induce hair follicle formation in heterotypic skin equivalents" in British Journal of Dermatology (1994) 131, 827-835. Hier werden ebenfalls dermale Papillen oder in einem Kollagengel kultivierte Papillenzellen zwischen Dermis und Epidermis eines Hautäquivalentes plaziert mit dem Ziel, ein Modell für die Entwicklung des Haarfollikel zu erhalten. Die dermalen Papillenzellen wandern jedoch unter diesen Bedingungen in die dermale Matrix ein und formieren sich nicht zu einer Papille, so daß das Modell modifiziert werden muß, indem die Papillen oder die Papillenzellen auf ein dermales Substrat aufgebracht werden, welches anschließend von einer fetalen Maus-Epidermis bedeckt und auf Nacktmäuse transplantiert wird.
  • A. B. Jahoda et al. "Dermal-Epidermal Interactions - Follicle-Derived Cell Populations in the Study of Hair-Growth Mechanisms" in J. Invest. Dermatol. 101: 33S-38S, 1993 gelang es im Jahre 1993, eine follikelähnliche Struktur aus einer Kombination von Haarzellen zu erzeugen, indem sie zunächst Outer Root Sheath-Zellen (ORS-Zellen) in der Kollagenkapsel des Follikels eines Ratten-Schnurrhaares kultivierten und anschließend eine Mischung aus verschiedenen Haarfollikelzellen - dermale Papillenzellen, dermale Sheath-Zellen und Matrixzellen - hinzugaben. Sie benötigten allerdings die stabile Kollagenkapsel des Ratten-Schnurrhaares zur Stabilisierung der Struktur.
  • A. Limat et al. "Outer Root Sheath (ORS) cells organize into epidermoid cystlike spheroids when cultured inside Matrigel®: a light-microscopic and immunohistological comparison between human ORS cells and interfollicular keratinocytes" in Cell Tissue Res. (1994) 275: 169-176 fügen ebenfalls verschiedene Haarfollikelzellen und Hautzellen in einer dreidimensionalen Struktur zusammen, um deren Interaktion zu studieren. Dabei verwenden sie eine Kollagen-(I)-Gel als Basis und betten darauf eine Schicht aus Matrigel®, einer Mischung aus Basalmembrankomponenten, die verschiedene Zellen oder Zellmischungen enthält. Die epidermalen oder ORS-Keratinozyten (= Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide des Haares) bilden dabei im Matrigel® sphäroide Strukturen aus, die aber nicht follikulär aufgebaut sind.
  • Hier werden Layer, die verschiedene Zellen enthalten, übereinandergeschichtet. Es wird jedoch keine neue Struktur innerhalb dieser Schichten, wie die dermale Papille, aufgebaut. Limat et al. beschreiben zwar, daß ORS-Keratinozyten zystoide Strukturen ausbilden können, die im Inneren verhornen, jedoch handelt es sich hierbei nicht um die physiologische Art der Haarschafibildung, sondern um die Differenzierung und Stratum-corneum-Bildung durch zystoid angeordnete Keratinozyten. Die Haarschafibildung erfolgt aber normalerweise durch Matrixzellen, welche oberhalb der dermalen Papille liegen.
  • Die japanische Offenlegungsschrift 10-136977 der Toyobo Co., Ltd., Japan, beschreibt ein künstliches Gewebe und dessen Rekonstruktion, welches an der Grenze zwischen einer Schicht aus Fibroblasten in einem Kollagen-Layer und einer Haarpapillenzellen enthaltenden Kollagenschicht haarschaftähnliche Strukturen aufweist. Dieses Modell soll als Testsystem für die Bestimmung der Verträglichkeit und Wirksamkeit von Wirkstoffen und Kosmetika dienen. Hier gilt das Gleiche wie bei der Veröffentlichung von A. Limat et al.: Bei diesem Modell werden keine dermalen Papillen rekonstruiert, die der dreidimensionalen Struktur des Haarfollikels nachempfunden sind, sondern vielmehr werden die Zellen hier in Schichten übereinander ausgerichtet, und es wird keine neue Struktur nachgebildet. Melanozyten werden offensichtlich in dem beschriebenen Modell ebenfalls nicht eingesetzt. Als Anwendungsmöglichkeit für das Modell werden Wirksamkeitsprüfungen genannt. Es ist jedoch nicht angegeben, welche Endpunkte an dem Modell beurteilt werden sollen, d. h. wie sich die Applikation von Wirkstoffen auf die Struktur des rekonstruierten Modells auswirkt und was daran hinsichtlich der Wirkung dieser Substanz auf Haarwachstum und Haarstruktur abgelesen werden kann.
  • Das "Philpott-Modell" (M. P. Philpott "Human hair growth in vitro", J. Cell. Sci. 97, 463-471, 1990), bei dem isolierte Haarfollikel über 9 Tage in Kultur gehalten werden, hat zum einen den Nachteil der großen Variabilität zwischen den einzelnen Follikeln und damit einer schlechten Standardisierbarkeit und zum anderen der schlechten Verfügbarkeit der Haarfollikel. Daher kann nur eine sehr begrenzte Menge an Wirkstoffen innerhalb eines festgelegten Zeitraums beurteilt werden. Zudem können nur Substanzen bzw. Formulierungen appliziert werden, die im Medium löslich sind, aber keine wasserunlöslichen Substanzen bzw. Formulierungen wie z. B. Cremes.
  • Quasi als Weiterentwicklung des "Philpott-Modells" wurde auch versucht, isolierte Haarfollikel-Segmente in rekonstruierte Hautmodelle zu inserieren (siehe M. Inamatsu et al. sowie M. Michel et al.). Damit finden sich zwar Follikel, Follikelsegmente oder dermale Papillen in Kontakt mit der Dermis, was der in-vivo-Situation näher kommt als bei anderen Modellen des Standes der Technik; allerdings sind die Nachteile dieser Systeme, wenn sie zur Untersuchung von Wirkstoffen genutzt werden sollen, ähnlich wie die des "Philpott-Modells" (schlechte Verfügbarkeit der Haarfollikel, keine Standardisierbarkeit, hoher Aufwand etc.).
  • Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem liegt daher in der Bereitstellung eines Haut-/Haaräquivalents ("Hautmodells"), insbesondere eines Haut-/Haarmodells mit rekonstruierten Papillen in einer rekonstruierten Dermis, welches die zuvor geschilderten Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise vermeidet.
  • Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Auffindung bzw. Bereitstellung eines Haut-/Haaräquivalents bzw. -modells, welches sich als in-vitro- Modellsystem eignet, insbesondere zur Testung und/oder Evaluierung von Wirkstoffen insbesondere auf den Haarfollikel. Insbesondere soll ein solches Modell sich zur Auffindung und Testung pharmazeutisch-medizinischer wie kosmetischer Wirk- bzw. Aktivstoffe eignen. Des weiteren soll ein solches System auch eine in-vitro-Bewertung der Beeinflussung des Haarfollikels, des Haarwachstums, der Haarpigmentierung, der Haarstruktur und dergleichen durch derartige Wirkstoffe ermöglichen.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Haut-/Haaräquivalents, insbesondere eines Haut-/Haarmodells mit rekonstruierten Papillen (Pseudo-Papillen; PP) in einer rekonstruierten Dermis (Pseudo-Dermis; PD), wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:
    • a) Bereitstellung einer geeigneten rekonstruierten Dermis (Pseudo-Dermis; PD);
    • b) Bereitstellung rekonstruierter Papillen (Pseudo-Papillen; PP), die kultivierte Papillenzellen, vorzugsweise dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen), in einer geeigneten Matrix, insbesondere Gelmatrix, umfassen, oder aber Bereitstellung entsprechender Vorläufer solcher rekonstruierten Papillen (Pseudo-Papillen; PP), die kultivierte Papillenzellen, insbesondere dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen), in einem geeigneten matrixbildenden, insbesondere gelbildenden Medium MBMPP umfassen, wobei das matrixbildende, insbesondere gelbildende Medium MBMPP in situ, insbesondere in der rekonstruierten Dermis (Pseudo-Dermis; PD), eine Matrix, insbesondere Gelmatrix, ausbilden kann;
    • c) Einbringung oder Insertion der unter Schritt (b) bereitgestellten rekonstruierten Papillen (Pseudo-Papillen; PP) oder deren Vorläufer in die unter Schritt (a) bereitgestellte Pseudo-Dermis (PD);
    • d) gegebenenfalls Aufbringung einer rekonstruierten Epidermis (Pseudo- Epidermis; PE) auf die Pseudo-Dermis (PD).
  • Im Verfahrensschritt (a) erfolgt also die Bereitstellung einer rekonstruierten Dermis bzw. Pseudo-Dermis. Erfindungsgemäß kann jede aus dem Stand der Technik bekannte Pseudo-Dermis eingesetzt werden, sofern sie für das erfin dungsgemäße Verfahren geeignet ist, dies bedeutet insbesondere, daß sie mit den übrigen Bestandteilen des erfindungsgemäßen Haut-/Haaräquivalents kompatibel ist. Insbesondere umfaßt die erfindungsgemäß eingesetzte Pseudo- Dermis (PD) kultivierte kontraktile Zellen, insbesondere Fibroblasten, vorzugsweise dermale Fibroblasten, in einer geeigneten Matrix. Die Matrix kann insbesondere eine Matrix auf Basis von Kollagen, vorzugsweise Kollagen vom Typ I und/oder Typ III, und gegebenenfalls weiterer Komponenten sein. Die kultivierten kontraktilen Zellen für die Pseudo-Dermis (PD) können in an sich bekannter Weise erhalten werden, beispielsweise dadurch, daß man dermale Fibroblasten aus menschlicher oder tierischer Haut isoliert, anschließend kultiviert und dann aus den resultierenden Einzelschicht-Kulturen (Monolayer-Kulturen) die kontraktilen Zellen gewinnt (beispielsweise durch schonende Trypsinisierung). Zur Kultivierung der kontraktilen Zellen verwendet man ein geeignetes Nährmedium, das insbesondere mit den kontraktilen Zellen kompatibel sein sollte; als erfindungsgemäß geeignetes Nährmedium kann man beispielsweise essentielles Minimalmedium MEM (Modifiziertes Eagle Medium) verwenden.
  • Die Pseudo-Dermis (PD) kann dann erhalten werden durch Mischen der aus Einzelschicht-Kulturen gewonnenen, gegebenenfalls in einem geeigneten Nährmedium befindlichen kontraktilen Zellen mit einem matrixbildenden, insbesondere gelbildenden Medium MBMPD, welches mindestens einen Matrixbildner MBPD, insbesondere Gelbildner, und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält. Das resultierende Gemisch bildet dann eine Matrix, vorzugsweise eine Gelmatrix, aus und kontrahiert schließlich, gegebenenfalls unter Ausstoß von vorhandenem Nährmedium, zu einer Pseudo-Dermis (PD). Bei dem Matrixbildner MBPD, insbesondere Gelbildner, des matrixbildenden, insbesondere gelbildenden Mediums MBMPD kann es sich insbesondere um einen Matrixbildner auf Basis von Kollagen, vorzugsweise Kollagen vom Typ I und/oder Typ III, und gegebenenfalls weiteren Komponenten (z. B. Bestandteile der extrazellulären Matrix der Dermis, vorzugsweise Matrix- und/oder Skleroproteine wie Laminin) handeln.
  • Auf die so bereitgestellte bzw. generierte Pseudo-Dermis (PD) kann man gegebenenfalls ein geeignetes Nährmedium, insbesondere essentielles Minimalmedium MEM, und gegebenenfalls weitere Komponenten auftragen.
  • Die in Schritt (b) bereitgestellten Pseudo-Papillen (PP) umfassen kultivierte Papillenzellen, insbesondere dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen), in einer geeigneten Matrix. Bei der Matrix kann es sich insbesondere um eine Matrix auf Basis von Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ IV, und gegebenenfalls weiteren Komponenten handeln. Die kultivierten dermalen Papillenzellen (Haarpapillenzellen) lassen sich in an sich bekannter Weise herstellen, beispielsweise indem man dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen) aus den Haarfollikeln menschlicher oder tierischer Haut isoliert, anschließend kultiviert und dann aus den resultierenden Einzelschicht-Kulturen (Monolayer-Kulturen), die dermalen Papillenzellen gewinnt, insbesondere durch schonende Trypsinisierung. Die Zahl der Passagen sollte möglichst gering sein, im allgemeinen liegt die Passagenzahl für die dermalen Papillen im Bereich von 1 bis 10, vorzugsweise von 1 bis 3. Die Kultivierung der dermalen Papillenzellen erfolgt in einem geeigneten Nährmedium, wobei man als Nährmedium insbesondere essentielles Minimalmedium MEM, beispielsweise DME-Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium) und/oder RPMI- Medium (vom Roswell Park Memorial Institue entwickeltes Medium) und/oder Chang-Medium verwenden kann, gegebenenfalls zusammen mit weiteren Komponenten, beispielsweise fötalem Kälberserum (FCS), Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ I, und dergleichen. Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Nährmedien für die Kultivierung der dermalen Papillenzellen sind alle auf RPMI oder DMEM basierende Zellkulturmedien, wie z. B. RPMI 1640 (Sigma) mit 20% FCS, Chang-Medium (Irvine Scientific) mit 10% FCS und dergleichen.
  • Die Pseudo-Papillen (PP) werden dann erhalten durch Mischen der aus Einzelschicht-Kulturen gewonnen, gegebenenfalls in einem geeigneten Nährmedium befindlichen Papillenzellen mit einem matrixbildenden, insbesondere gelbildenden Medium MBMPP, welches mindestens einen Matrixbildner MBPP, insbesondere Gelbildner, und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält; das resultierende Gemisch bildet eine Matrix, vorzugsweise ein Gel, aus, welches anschließend, unter Ausstoß des gegebenenfalls vorhandenen Nährmediums, kontrahiert. Aus der kontrahierten Matrix bzw. dem kontrahierten Gel lassen sich dann die Pseudo-Papillen (PP) formen (z. B. durch Ausstechen oder Ausstanzen). Wie im folgenden noch beschrieben, kann die Ausbildung der Pseudo-Papillen (PP) aber auch erst in situ, insbesondere in der Pseudo- Dermis (PD), erfolgen. Das matrixbildende, insbesondere gelbildende Medium MBMPP enthält als Matrixbildner MBPP, insbesondere Gelbildner, mindestens ein Kollagen, vorzugsweise Kollagen vom Typ IV, sowie gegebenenfalls weitere Bestandteile, die insbesondere ausgewählt sind aus der Gruppe von Matrix- und/oder Skleroproteinen, insbesondere Laminin, Gelatine, Chitosan, Glucosaminen, Glucosaminoglykanen (GAG), Heparansulfatproteoglykanen, sulfatierten Glykoproteinen wie Entactin und Nidogen und Wachstumsfaktoren wie Tissue-Growth-Factor-beta (TGF-β), Fibroblasten- Wachstumsfaktor, Tissue-Plasmimogen-Activator und weiteren Wachstumsfaktoren aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Tumor (EHS-Tumor) und/oder der humanen Placenta sowie Mischungen der zuvor genannten Bestandteile. Als erfindungsgemäß geeignete Matrixmaterialien zur Ausbildung der Pseudo-Papillen (PP) können beispielsweise die folgenden Substanzen verwendet werden: Matrigel® Basement Membrane Matrix (Matrigel®), Kollagen, Gelatine, Kollagen/Chitosan/GAG (GAG = Glucosaminoglykan), Glucosamin oder jede andere Art von Matrix.
  • Wie zuvor erwähnt, können die Pseudo-Papillen (PP) dann aus der Matrix, insbesondere dem Gel, geformt werden, wobei die Formgebung der Pseudo- Papillen (PP) entweder vor oder nach der im Schritt (c) durchgeführten Einbringung oder Insertion der Pseudo-Papillen (PP) bzw. deren Vorläufern erfolgen kann.
  • Sowohl der Matrixbildner MBPD für die Ausbildung der Pseudo-Dermis (PD) als auch der Matrixbildner MBPP für die Ausbildung der Pseudo-Papillen (PP) sollte fähig sein, unter Erwärmen, insbesondere unter Erwärmen bei Temperaturen von 20°C bis 40°C, zu gelieren, beispielsweise unter Polymerisation, und das Wachstum und die Differenzierung von Zellen zu fördern. Die Ausbildung der Matrix der Pseudo-Dermis (PD) und die Ausbildung der Matrix der Pseudo-Papillen (PP) erfolgen im allgemeinen in dreidimensionalen Strukturen. Dabei kann die Matrixbildung, insbesondere die Gelbildung, reversibel oder irreversibel sein. Vorzugsweise ist die Matrixbildung, insbesondere Gelbildng, aber irreversibel.
  • Das in Schritt (c) durchgeführte Einbringen oder Inserieren der Pseudo-Papillen (PP) kann auf verschiedene Arten und Weisen erfolgen: Gemäß einer Ausführungsform kann man zunächst geeignete Hohlräume zur Aufnahme der Pseudo-Papillen (PP), insbesondere durch Ausstanzen oder Einstechen, in der Pseudo-Dermis (PD) formen und dann in die so geformten Hohlräume die Pseudo-Papillen (PP), die kultivierte Papillenzellen enthalten und die so geformt sind, daß ihre Abmessungen den in der Pseudo-Dermis (PD) geformten Hohlräume entsprechen, einbringt oder inseriert (beispielsweise durch Einpfropfen). Das Ausstanzen der Pseudo-Dermis (PD) oder Einstechen in die Pseudo-Dermis (PD) kann mit einer z. B. Stanze (z. B. mit einem Durchmesser von 0,5 bis 4 mm, vorzugsweise etwa 2 mm) oder mit einer Knopfkanüle oder mit einer herkömmlichen Kanüle erfolgen.
  • Vor dem Einbringen der Pseudo-Papillen (PP) bzw. ihrer Vorläufer können die ausgestanzten oder eingestochenen Hohlräume in der Pseudo-Dermis (PD) noch ausgekleidet werden (z. B. durch Einsprühen), insbesondere mit mindestens einem Kollagen, vorzugsweise Kollagen vom Typ IV, und/oder weiteren Matrixproteinen, insbesondere Basalmembranproteinen wie Laminin.
  • Gemäß einer weiteren, zweiten Ausführungsform kann man das in Schritt (c) durchgeführte Einbringen oder Inserieren der Pseudo-Papillen (PP) derart durchführen, daß man die Pseudo-Papillen (PP), die die kultivierten dermalen Papillenzellen in einer Gelmatrix umfassen, direkt in die Pseudo-Dermis (PD) einspritzt oder einsticht. Alternativ kann man aber auch die Vorläufer solcher Pseudo-Papillen (PP) in die Pseudo-Dermis (PD) einspritzen oder einstechen; solche Vorläufer bestehen aus einer Mischung aus den kultivierten dermalen Papillenzellen und mindestens einem Matrixbildner MBPP, wie zuvor beschrieben, so daß diese Mischung dann in situ in der Pseudo-Dermis (PD), insbesondere unter Ausgelieren, die Matrix und damit die Pseudo-Papillen (PP) ausbilden, d. h. die Ausbildung der Pseudo-Papillen (PP) erfolgt gemäß dieser Ausführungsform in situ erst in der Pseudo-Dermis (PD).
  • Um das in vivo-System möglichst realitätsnah nachzustellen, erfolgt die in Schritt (c) durchgeführte Einbringung oder Insertion der Pseudo-Papillen (PP) bzw. ihrer Vorläufer in die Pseudo-Dermis (PD) in einem Winkel von 30° bis 90°, insbesondere 40° bis 60°, bezogen auf die Ebene der Pseudo-Dermis (PD).
  • Die Einbringung oder Inserierung der Pseudo-Papillen (PP) in die Pseudo- Dermis (PD) kann in regelmäßigen Abständen durchgeführt werden.
  • Im allgemeinen werden die Pseudo-Papillen (PP) in einer Anzahl bzw. Dichte von 1 bis 50/cm2 Pseudo-Dermis (PD), insbesondere von 3 bis 7/cm2 Pseudo- Dermis (PD), in die Pseudo-Dermis (PD) eingebracht bzw. inseriert.
  • Vor oder nach der in Schritt (c) durchgeführten Einbringung oder Insertion der Pseudo-Papillen (PP) bzw. deren Vorläufern kann gegebenenfalls in Schritt (d) eine rekonstruierte Epidermis (Pseudo-Epidermis; PE) auf die Pseudo-Dermis (PD) aufgebracht werden. Bevorzugt ist die Aufbringung einer solchen Pseudo-Epidermis nach der in Schritt (c) durchgeführten Einbringung bzw. Insertion der Pseudo-Papillen (PP) bzw. deren Vorläufern. Die Pseudo-Epidermis (PE) kann aus kultivierten Keratinozyten, insbesondere Keratinozyten der äußeren Haarwurzelscheide (ORS-Keratinozyten) und/oder epidermalen Keratinozyten, und gegebenenfalls auch aus Melanozyten, insbesondere Melanozyten der äußeren Haarwurzelscheide (ORS-Melanozyten) und/oder epidermalen Melanozyten, und gegebenenfalls weiteren Bestandteilen bestehen. Dabei können die Keratinozyten und die gegebenenfalls vorhandenen Melanozyten jeweils für sich in getrennten, ein- oder mehrlagigen Schichten oder aber zusammen in Mischung als ein- oder mehrlagige Schicht auf die Pseudo-Dermis (PD) aufgebracht werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann wie folgt vorgegangen werden: Zur Herstellung des Modells kann zunächst eine Pseudo-Dermis (PD) aus epidermalen Fibroblasten in einer Kollagenmatrix hergestellt werden. In diese können dann in einem bestimmten Winkel (z. B. 30-90°) "Löcher" gestanzt werden, die dann gegebenenfalls mit Basalmembranproteinen (z. B. Laminin, Kollagen IV etc.) ausgekleidet werden bzw. z. B. mit Matrigel®, einer Mischung aus Basalmem-branproteinen, ausgekleidet werden können; in diese "Löcher" werden dann rekonstruierte Papillen (Pseudo-Papillen; PP) eingesetzt. Diese können beispielsweise gewonnen werden, indem dermale Papillenzellen, die aus Haarfollikelpapillen kultiviert werden, in einer niedrigen Passagenzahl mit einem Gel, z. B. Matrigel®, vermischt werden und ausgelieren; die Pseudo-Papillen (PP) können nach dem Ausgelieren aus dem Gel ausgestanzt und in die Pseudo-Dermis (PD) eingesetzt werden. Das Ausgelieren kann aber auch erst in situ nach Einbringen in die Dermis erfolgen. Alternativ können die in Matrigel® eingebetteten dermalen Papillenzellen aber auch direkt in die Pseudo-Dermis (PD) eingespritzt werden, ohne daß zuvor "Löcher" ausgestanzt worden sind, oder aber es werden die in Matrigel® eingebetteten dermalen Papillenzellen über einen Stichkanal in die Pseudo-Dermis (PD) eingebracht. Auf die Pseudo- Dermis (PD) kann schließlich eine Zellschicht aus Haarfollikel-Melanozyten und/oder ORS-Keratinozyten aufgebracht werden.
  • Gemäß dem erfindungemäßen Verfahren wird also die Papille aus einem geeigneten Gelbildner (z. B. Matrigel®) und kultivierten dermalen Papillenzellen neu rekonstruiert, indem sie in den dermalen Pseudo-Layer bzw. die Pseudo- Dermis (PD) eingebracht bzw. inseriert wird (z. B. eingespritzt, eingepfropft etc.) und außerdem in irgendeiner Weise von der Umgebung abgegrenzt wird. Die rekonstruierten Papillen (Pseudo-Papillen; PP) bestehen aus einer Kombination, die aus einem geeigneten Gelbildner (z. B. Matrigel®) und kultivierten dermalen Papillenzellen besteht. Erfindungsgemäß werden die Papillen also rekonstruiert, indem beispielsweise sogenannte Pseudo-Papillenpfropfen, die der dreidimensionalen Struktur des Haarfollikels nachempfunden sind, in die Pseudo-Dermis (PD) eingesetzt werden, z. B. die beispielsweise in Matrigel® eingebetteten dermalen Papillenzellen direkt in die rekonstruierte dermale Schicht eingespritzt werden.
  • Die Pseudo-Papille (PP) beeinflußt die gegebenenfalls darüberliegende Pseudo-Epidermis (PE) aus Melanozyten und Keratinozyten in ihrer Struktur: Es formiert sich unter diesen Bedingungen eine haarfollikelähnliche Struktur. Das auf diese Weise hergestellte Modell kann beispielsweise zur Untersuchung von Substanzen (pharmakologischen, kosmetischen etc.) auf das Haarwachstum und die Haarstruktur sowie zur Untersuchung der Wirkung von Substanzen auf die Haarpigmentierung benutzt werden.
  • Die einzige Figur zeigt eine schematische Darstellung gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Unter (1) ist schematisch eine Pseudo-Dermis (PD) auf Basis von Fibroblasten in einer Matrix aus Kollagen vom Typ I dargestellt, in die Hohlräume bzw. Aufnahmeöffnungen zur Aufnahme der Pseudo-Papillen (PP) ausgestanzt sind, wobei die Hohlräume mit Kollagen vom Typ IV oder Matrigel® ausgesprüht werden können. Unter (2) ist eine Pseudo-Papillengrundmatrix, bestehend aus Kollagen vom Typ IV oder Matrigel® und dermalen Papillenzellen, dargestellt, aus der dann die eigentlichen Pseudo-Papillen (PP) geformt werden (z. B. durch Ausstanzen). Unter (3) werden dann die geformten, z. B. ausgestanzten Pseudo-Papillen (PP) in die Pseudo-Dermis (PD) eingebracht bzw. inseriert. Es entsteht das unter (4) dargestellte rekonstruierte Papillenmodell. Wie unter (5) dargestellt, kann auf die Pseudo-Dermis (PD) gegebenenfalls eine Pseudo- Epidermis (PE) aufgebracht werden, die beispielsweise aus einer ORS-Keratinozytenschicht oder aber aus einer Abfolge von ORS-Melanozytenschicht und ORS-Kerationzytenschicht bestehen kann. In diesem dreidimensionalen Haar- /Hautmodell bilden sich dann unter (6) follikelähnliche oder follikuloide (follikelartige) Strukturen aus, einschließlich solcher, die an früheste Stadien der Haar-Morphogenese (Morphogenese-Stadien I bis III) erinnern.
  • Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Haar-/Hautäquivalent.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Haut-/Haaräquivalent handelt es sich insbesondere um ein Haut-/Haarmodell mit insbesondere dreidimensional geformten und räumlich abgegrenzten, rekonstruierten Papillen (Pseudo-Papillen; PP) mit follikelähnlichen bzw. follikuloiden Strukturen (einschließlich solcher, die an früheste Stadien der Haar-Morphogenese, d. h. Morphogenese-Stadien I bis III, erinnern), wobei das Haut-/Haaräquivalent eine rekonstruierte Dermis (Pseudo-Dermis; PD) umfaßt, in welche die Pseudo-Papillen (PP) eingebracht oder inseriert sind, wobei die Pseudo-Papillen (PP) kultivierte Papillenzellen, insbesondere dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen), in einer geeigneten Matrix, insbesondere Gelmatrix, umfassen, und gegebenenfalls auf die Pseudo-Dermis (PD) eine rekonstruierte Epidermis (Pseudo-Epidermis; PE) aufgebracht ist.
  • Das erfindungsgemäße Haut-/Haaräquivalent, insbesondere Haarfollikelmodell, umfaßt also im allgemeinen eine Pseudo-Dermis (PD) mit darin rekonstruierten dermalen Papillen (Pseudo-Papillen; PP). Darüber kann eine Schicht von Melanozyten und eine Schicht von Keratinozyten aufgebracht sein, die sich zu einer Pseudo-Epidermis (PE) formiert. Dieses in-vitro-Modell eignet sich beispielsweise für Wirksamkeits- und Verträglichkeitsprüfungen in den Bereichen Pharmazie, Medizin und Kosmetik. In dem erfindungsgemäßen dreidimensionalen Haar-/Hautmodell bilden sich follikelähnliche oder follikuloide (follikelartige) Strukturen aus, einschließlich solcher, die an früheste Stadien der Haar-Morphogenese (Morphogenese-Stadien I bis III) erinnern.
  • Weitere Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Haut-/Haaräquivalents sind Gegenstand der Unteransprüche (Ansprüche 31 bis 47). Für weitere Einzelheiten kann außerdem auf obige Ausführungen zu dem erfindungsgemäßen Verfahren verwiesen werden, die entsprechend auch für das erfindungsgemäße Haut-/Haaräquivalent gelten.
  • Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Haut-/Haaräquivalents, wie sie in den Ansprüchen 48 bis 53 beschrieben ist. Für weitere Einzelheiten kann außerdem auf obige Ausführungen zu dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem erfindungsgemäßen Haut-/Haaräquivalent verwiesen werden, die entsprechend auch für die erfindungsgemäße Verwendung gelten.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein System, insbesondere Testsystem (z. B. ein Screening-System), welches das erfindungsgemäße Haut-/Haaräquivalent umfaßt. Für weitere Einzelheiten kann außerdem auf obige Ausführungen zu dem erfindungsgemäßen Verfahren, dem erfindungsgemäßen Haut-/Haaräquivalent und der erfindungsgemäßen Verwendung, verwiesen werden, die entsprechend auch für das erfindungsgemäße System gelten.
  • Mit der vorliegenden Erfindung sind eine Reihe von Vorteilen verbunden:
    Bei dem erfindungsgemäßen Haut-/Haaräquivalent handelt es sich um ein rekonstruiertes Modell, welches standardisierbarer als der isolierte Haarfollikel ist. Es vermindert den Bedarf an Haarfollikeln und ist näher an der in-vivo- Situation als Monolayer-Systeme. Außerdem stellt es eine Alternative zu Tierversuchen dar.
  • Es handelt sich um ein komplexes dreidimensionales Modell, welches in seiner Struktur und seinem histologischen Aufbau dem Haarfollikel in-vivo gleicht, so daß daraus eine hohe Relevanz der Aussage für die Effektivität und Verträglichkeit von Wirkstoffen (Kosmetika, Pharmazeutika etc.) resultiert.
  • Unter anderem können folgende Endpunkte evaluiert oder gemessen werden, um Aussagen über die Wirksamkeit von Substanzen hinsichtlich einer Verbesserung von Haarstruktur und Beeinflussung des Haarwachstums zu treffen: Proliferation/Apoptose der Keratinozyten über der Pseudo-Papille; Struktur und Anordnung der Keratinozyten über der Pseudo-Papille; Struktur der Epidermis; Struktur des Stratum corneums; Volumen und Struktur der dermalen Papille; Analyse haarspezifischer Keratine; Analyse von Cytokinen, Chemokinen und allen Arten von Botenstoffen, die u. a. von der dermalen Papille gebildet werden; Haar-Chip-Analyse etc. Es handelt sich um das einzige rekonstruierte Haarfollikelmodell, mit dem Einflüsse auf die Haarpigmentierung gemessen werden können (z. B. Pigmentierung der amelanozytischen ORS-Melanozyten; Melaninsysnthese; Melaningranula; Anordnung der Melanozyten; Migration der Melanozyten; Veränderung von Melanozytenmarkern wie TRP-1, TRP-2, NKI/beteb etc.; Abgabe von Melanin an Keratinozyten). Es kann beispielsweise auch für die Haar- Chip-Analyse eingesetzt werden.
  • Das erfindungsgemäße Haar-/Hautmodell eignet sich für die verschiedensten Anwendungen im Bereich der Medizin, Pharmazie und Kosmetik (z. B. zur Wirkstoffindung mit biologischer Wirkung auf den Haarfollikel unter Beeinflussung von Haarpigmentierung, Haarwachstum und Haarstruktur, in in-vitro-Testsysteme, in Screening-Verfahren, für die Entwicklung von kosmetischen Produkten etc.). Das erfindungsgemäße Modell bzw. Äquivalent ermöglicht Aussagen über die Wirkung von Substanzen auf Haarfollikelzellen mit in-vivo-Relevanz. Das erfindungsgemäße Modell bzw. Äquivalent stellt in einem dreidimensionalen Modell Haarfollikel bzw. Teile von Haarfollikeln bereit. Die rekonstruierten Papillen (Pseudo-Papillen: PP) sind - im Gegensatz zu isolierten Haarfollikeln - jederzeit verfügbar und standardisierbar. Es werden dermale Papillen rekonstruiert, welche der dreidimensionalen Struktur des Haarfollikels nachempfunden sind. Auf diese Weise läßt sich bewerten, wie applizierte Wirkstoffe auf die Struktur des rekonstruierten dreidimensionalen Modells wirken und was daran hinsichtlich der Wirkung dieser Substanzen auf dem Haarfollikel (z. B. Haarwachstum, Haarstruktur, Haarpigmentierung etc.) abgelesen werden kann.
  • Weitere Ausführungsformen, Ausgestaltungen, Abwandlungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der vorliegenden Anmeldung ohne weiteres erkennbar und realisierbar, ohne daß er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand des folgenden Ausführungsbeispiels veranschaulicht, welches die vorliegende Erfindung jedoch keinesfalls beschränken soll.
    • AUSFÜHRUNGSBEISPIEL
  • Im folgenden ist die Herstellung eines Haut-/Haarmodells mit rekonstruierten dermalen Papillen (Pseudo-Ppillen; PP), die in eine Pseudo-Dermis (PD) eingebettet bzw. inseriert sind, beschrieben. Dazu werden dermale Papillenzellen entweder in die Pseudo-Dermis (PD) eingespritzt oder mit Hilfe von Stanzen in der Pseudo-Dermis (PD) plaziert. Die Pseudo-Dermis (PD) kann im weiteren Verlauf mit einer Schicht aus ORS- bzw. epidermalen Keratinozyten und Melanozyten bedeckt werden, die eine Pseudo-Epidermis (PE) darstellen. Im folgenden werden die in der nachstehenden Tabelle aufgeführten Abkürzungen verwendet. Abkürzungen

    • Durchführung und Methoden Herstellung der Einzelzellkulturen Dermale Fibroblasten
  • Dermale Fibroblasten werden aus humaner Vorhaut isoliert. Epidermis und Dermis der Vorhaut werden enzymatisch mittels Thermolysin (0,5 mg/nl HEPES-Puffer) voneinander getrennt. Zur Extraktion der Fibroblasten wird die Dermis mit Hilfe von Kollagenase H (0,2 U/ml, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) verdaut (3-4 h bei 37°C). Nach der Inkubationsphase wird die Lösung vorsichtig gemischt, um die Zellen zu vereinzeln, durch ein Zellsieb filtriert und die Zellen abzentrifugiert. Die Kultivierung erfolgte in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) mit Glutamax-I (L-Alanyl-L-Glutamin) mit Natriumpyruvat, 4.500 mg L-1 Glukose und Pyridoxin (Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland), angereichert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) (Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland), 25 µg mL-1 Gentamicin (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) und 100 UI mL-1 Penicillin G (Sigma) [1].
    • Epidermale Keratinozyten
  • Dermale Fibroblasten werden aus humaner Vorhaut isoliert. Epidermis und Dermis der Vorhaut werden enzymatisch mittels Thermolysin (0,5 mg/nl HEPES-Puffer) voneinander getrennt. Zur Extraktion der Keratinozyten wird die Epidermis mittels Trypsin (Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland) verdaut (20 min bei 37°C). Nach der Inkubationsphase wird die Lösung vorsichtig gemischt, um die Zellen zu vereinzeln, durch ein Zellsieb filtriert und die Zellen abzentrifugiert. Die Kultivierung erfolgt in einer Mischung aus DMEM Glutamax I und Ham's F12 (Sigma) (3 : 1), angereichert mit Newborn Calf Serum (NCF, fetal clone II, Hyclone), Epidermal Growth Factor (EGF) (Sigma), Insulin (Sigma), Hydrocortisone (Sigma), Triiodo-L-thyronine (Sigma), Adenine (Sigma), Choleratoxin (Sigma) und Antibiotika [1] auf Feeder-Layern (Dermale Fibroblasten, die zur Inhibierung der Proliferation mit 60 gray bestrahlt worden sind).
    • Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide (ORS-Keratinozyten)
  • ORS-Keratinozyten werden aus gezupften männlichen Haaren des Hinterhaupts isoliert. Zur Extraktion der Keratinozyten werden zunächst die Reste des Haarbulbus mit Hilfe eines Skalpells entfernt und die Follikel mittels Trypsin (Protease von Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland) verdaut (40 min bei 37°C). Nach der Inkubationsphase wird die Lösung vorsichtig gemischt, um die Zellen zu vereinzeln, durch ein Zellsieb filtriert und die Zellen abzentrifugiert. Die Kultivierung erfolgte in einer Mischung aus DMEM Glutamax I und Ham's F12 (Sigma) (3 : 1), angereichert mit Newborn Calf Serum (NCF, fetal clone II, Hyclone), Epidermal Growth Factor (EGF) (Sigma), Insulin (Sigma), Hydrocortisone (Sigma), Triiodo-L-thyronine (Sigma), Adenine (Sigma), Choleratoxin (Sigma) und Antibiotika auf Feeder-Layern (Dermale Fibroblasten, die zur Inhibierung der Proliferation mit 60 gray bestrahlt worden sind).
  • ORS-Melanocyten werden nach Tobin et al. [3] isoliert.
    • Dermale Papillenzellen
  • Dermale Papillenzellen werden aus Kopfhaut (Schläfen- oder Hinterhauptregion) mit intakten Haarfollikeln isoliert. Dazu wird die obere Dermis entfernt und die Follikel samt der dermalen Papille mit Hilfe einer Uhrmacherpinzette aus der Dermis gezupft. Unter der Stereolupe erfolgte die weitere Isolierung der dermalen Papille. Mit Hilfe einer Mikrokapillare erfolgte der Transfer in eine mit Kollagen I beschichtete Kulturflasche. Die Kultivierung erfolgt entweder in RPMI-1640-Medium mit Glutamin (Sigma), angereichert mit 20% fötalem Kälberserum (FCS) (Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland) und Antibiotika oder in Chang's Medium mit 10% fötalem Kälberserum [2].
  • Zur Beschichtung der Kulturflaschen mit Kollagen I wird mit sterilem Aqua bidest. eine 0,1%ige Lösung von Kollagen I aus der Rattenschwanzsehne (Fa. Becton Dickinson) hergestellt und jeweils 1,5 ml in T25-Kultuflaschen verteilt, so daß der gesamte Boden bedeckt ist. Nach ca. 30 min wird das überschüssige Kollagen abgesaugt und die Flaschen vor Gebrauch 1 Tag bei Raumtemperatur getrocknet.
    • Herstellung der Pseudo-Dermis (PD)
  • Zur Etablierung des Haarmodells wird zunächst die Pseudo-Dermis (PD) entwickelt. Dazu werden dermale Fibroblasten der vierten Passage mit Kollagen I aus der Rattenschwanzsehne gemischt und in Multiwell-Platten ausgesät. Ziel hierbei ist es, die Zellzahl, die Kultivierungsdauer, die Schichtdicke sowie die Größe des Dermisäquivalents (Pseudo-Dermis; PD) zu optimieren. Die Herstellung erfolgt jeweils nach folgendem Protokoll: 1 Teil HBSS Puffer (Fa. Gibco BRL) wird mit 8 Teilen Kollagenlösung (Fa. Becton Dickinson) gemischt und mit 1 M Natronlauge neutralisiert. Die Zugabe der gewünschten Zellmenge erfolgte in 1 Teil fötalem Kälberserum (FCS, Fa. Gibco BRL). Die erhaltene Mischung wird in Zellkulturschalen gegossen und 1 h bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Nach Polymerisierung des Kollagens werden die Modelle mit DMEM, supplementiert mit 10% FCS und Penicillin/Streptomycin, überschichtet. Der Mediumwechsel erfolgt dreimal/Woche.
  • Folgende Ansätze werden getestet:


    • Optimierung der Monolayer-Kultur von dermalen Papillenzellen (DPC)
  • Zur Optimierung der Monolayer-Kultur von dermalen Papillenzellen werden zwei verschiedene Medien zur Herstellung der Primärkulturen verwendet.
    • 1. RPMI 1640 (Sigma) mit 20% FCS mit Penicillin/Streptomycin
    • 2. Chang Medium (Fa. Irvine Scientific) mit 10% FCS
  • Zum einen erfolgt die Herstellung der Primärkulturen (P0) in den angegebenen Medien, zum anderen wird untersucht, ob das zur Weiterführung der Kulturen verwendete Medium einen Einfluß auf die Proliferation sowie die Morphologie und Anordnung der Zellen hat.
  • Zur Herstellung der Primärkulturen werden mit Kollagen I beschichtete Zellkulturflaschen verwendet.
    • Einfluß von Matrigel® auf die Proliferation der dermalen Papillenzellen
  • Als umgebendes Medium für die in der Pseudo-Dermis (PD) plazierten dermalen Papillenzellen kann Matrigel® (Fa. Becton Dickinson) verwendet werden [4, 5]. Matrigel® wird aus dem Engelbreth-Holm-Swarm Tumor der Maus gewonnen und enthält hauptsächlich Laminin, Kollagen IV, Heparansulfatproteoglykane, Entactin und Nidogen, außerdem TGF-b, FGF, Tissue Plasminogen Activator und andere Wachstumsfaktoren des EHS-Tumors. Um den Einfluß von Matrigel® auf die Proliferation der DPC zu untersuchen, werden Primärkulturen von DP in mit Matrigel® beschichteten Zellkulturflaschen angelegt und das Wachstum beobachtet. Zum Vergleich werden DP parallel in mit Kollagen I beschichtete Zellkulturflaschen eingesetzt.
    • Herstellung der Einspritzkanäle zum Einsetzen der DPC in die Pseudo- Dermis (PD)
  • Zur Festlegung des optimalen Einspritzverfahrens werden Dermisäquivalente nach der oben beschriebenen Methode hergestellt. Zur Herstellung der Einspritzkanäle werden eine Knopfkanüle, eine herkömmliche Kanüle sowie eine 2-mm-Stanze verwendet. Zur optischen Darstellung der Kanäle wird eine Lösung aus 10% Berliner Blau in 1%iger Agaroselösung hergestellt und mit Hilfe der Knopfkanüle sowie der herkömmlichen Kanüle in das Dermisäquivalent gespritzt. Bei der Verwendung der Stanzen werden die mit den Biopsiestanzen hergestellten Kanäle entweder sofort oder nach 24 h mit Hilfe der Knopfkanüle aufgefüllt. Die Präparation der Kanäle erfolgte mit Hilfe einer Stereolupe. Nach 24 h werden die Modelle zur Herstellung von Kryoschnitten und zur histologischen Untersuchung tiefgekühlt.
    • Ergebnisse
  • Als optimale Bedingungen zur Herstellung der Pseudo-Dermis (PD) werden folgende Parameter festgelegt: 2,5 × 106 Zellen/ml Gel werden über 7 Tage in einer 12-Well-Platte kultiviert. Die Schichtdicke beträgt dabei zum Zeitpunkt der Einsaat 10 mm. Nach 7 Tagen ist das Modell vollständig kontrahiert, wobei die verbleibende Schichtdicke 3,3 mm beträgt, das entspricht einer Kontraktion von ca. 67%.
  • Bei der Herstellung der DPC-Primärkulturen konnte eine verbesserte Proliferation der Zellen in Chang-Medium gegenüber der Verwendung von RPMI- Medium nachgewiesen werden. Bei der Weiterführung der Kulturen ergaben sich keine Unterschiede bezüglich des Zellwachstums zwischen den beiden Medien. Bei der Verwendung beider Medien kommt es sowohl in der Primärkultur als auch in der ersten Passage zu der typischen Anordnung der Zellen in Clustern.
  • Bei der Verwendung von mit Matrigel® beschichtetet Kulturflaschen ergab sich im Vergleich zu mit Kollagen I beschichteten Wachstumsoberflächen ein verlangsamtes Wachstum der Zellen. Dies ist vermutlich auf den hohen Gehalt an ECM-Molekülen in Matrigel® zurückzuführen, der zu einer Begünstigung der Zelldifferenzierung bei verlangsamten Zellwachstum führt.
  • Zur Herstellung der Einspritzkanäle kann eine Knopfkanüle verwendet werden, da mit dieser ein ausreichend großer Kanal hergestellt werden kann, ohne die Pseudo-Dermis (PD) zu durchstechen. Ebenfalls möglich ist die Verwendung von Stanzen, wobei die Kanäle mit der Zell-Matrigel®-Mischung aufgefüllt werden können bzw. die Möglichkeit besteht, in die vorhandenen Kanäle Stanzen aus Matrigel® mit DPC zu plazieren. Anhang I Zusammensetzung der Zellkulturmedien Fibroblasten-Medium

    Keratinocyten-Medium

    Papillenzellen-Medien RPMI-1640-Medium (Fa. Gibco, BRL, Karlsruhe)

    Chang Medium (Fa. Irvine Scientific, Santa Ana, USA)

    Zusammensetzung Chang-Medium D

    • Anhang II Im Ausführungsbeispiel zitierte Literaturstellen
  • [1] K. Schlotmann et al., Cosmetic Efficacy Claims In Vitro Using a 3D Human Skin Model, Int. J. Cosmet. Sci. 23, 310-319 (2001).
    [2] R. Warren et al., Improved Method for the Isolation and Cultivation of Human Skalp Dermal Papilla Cells, J. Invest. Dermatol. 98, 693-699 (1992).
    [3] D. J. Tobin et al., Isolation and Long-Term Culture of Human Hair-Follicle Melanocytes, J. Invest. Dermatol. 104, 86-89 (1995).
    [4] A. Limat et al., Outer root sheath cells organize into epidermoid cystlike spheroids when cultured in Matrigel®. Cell Tissue Res. 275, 169-176 (1994).
    [5] EP 0 218 065 A2.

Claims (54)

1. Verfahren zur Herstellung eines Haut-/Haaräquivalents, insbesondere eines Haut-/Haarmodells mit rekonstruierten Papillen (Pseudo-Papillen; PP) in einer rekonstruierten Dermis (Pseudo-Dermis; PD), wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:
a) Bereitstellung einer rekonstruierten Dermis (Pseudo-Dermis; PD);
b) Bereitstellung rekonstruierter Papillen (Pseudo-Papillen; PP), umfassend kultivierte Papillenzellen, vorzugsweise dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen), in einer geeigneten Matrix, insbesondere Gelmatrix, oder aber Bereitstellung entsprechender Vorläufer solcher rekonstruierten Papillen (Pseudo-Papillen; PP), umfassend kultivierte Papillenzellen, insbesondere dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen), in einem geeigneten matrixbildenden, insbesondere gelbildenden Medium MBMPP, welches in situ, insbesondere in der rekonstruierten Dermis (Pseudo-Dermis; PD), eine Matrix, insbesondere Gelmatrix, ausbilden kann;
c) Einbringung oder Insertion der unter Schritt (b) bereitgestellten rekonstruierten Papillen (PP) oder deren Vorläufer in die unter Schritt (a) bereitgestellte Pseudo-Dermis (PD);
d) gegebenenfalls Aufbringung einer rekonstruierten Epidermis (Pseudo-Epidermis; PE) auf die Pseudo-Dermis (PD).
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo- Dermis (PD) kultivierte kontraktile Zellen in einer geeigneten Matrix umfaßt, insbesondere wobei die Matrix eine Matrix auf Basis von Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ I und/oder Typ III, und gegebenenfalls weiterer Komponenten ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als kontraktile Zellen für die Pseudo-Dermis (PD) Fibroblasten, insbesondere dermale Fibroblasten, verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die kultivierten kontraktilen Zellen für die Pseudo-Dermis (PD) dadurch erhält, daß man dermale Fibroblasten aus menschlicher oder tierischer Haut isoliert, anschließend kultiviert und dann aus den resultierenden Einzelschicht-Kulturen (Monolayer-Kulturen) die kontraktilen Zellen gewinnt, insbesondere durch schonende Trypsinisierung.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung der kontraktilen Zellen, insbesondere Fibroblasten, vorzugsweise dermalen Fibroblasten, in einem geeigneten Nährmedium erfolgt, insbesondere wobei man als Nährmedium essentielles Minimalmedium MEM verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis S. dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Dermis (PD) erhalten wird durch Mischen von aus Einzelschicht-Kulturen gewonnenen, gegebenenfalls in einem geeigneten Nährmedium befindlichen kontraktilen Zellen mit einem matrixbildenden, insbesondere gelbildenden Medium MBMPD für die Pseudo-Dermis (PD), welches mindestens einen Matrixbildner MBPD, insbesondere Gelbildner, und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält, wobei das resultierende Gemisch eine Matrix, vorzugsweise ein Gel, ausbildet und insbesondere unter Ausstoß des gegebenenfalls vorhandenen Nährmediums zu einer Pseudo-Dermis (PD) kontrahiert.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das matrixbildende, insbesondere gelbildende Medium MBMPD als Matrixbildner MBPD, insbesondere Gelbildner, mindestens ein Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ I und/oder Typ III, und gegebenenfalls weitere Komponenten, insbesondere Bestandteile der extrazellulären Matrix der Dermis, vorzugsweise Matrix- und/oder Skleroproteine wie Laminin, umfaßt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Pseudo-Dermis (PD) ein geeignetes Nährmedium, insbesondere essentielles Minimalmedium MEM, und gegebenenfalls weitere Komponenten aufgetragen werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Papillen (PP) kultivierte Papillenzellen, insbesondere dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen), in einer geeigneten Matrix umfassen, insbesondere wobei die Matrix eine Matrix auf Basis von Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ IV, und gegebenenfalls weiteren Komponenten ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die kultivierten dermalen Papillenzellen (Haarpapillenzellen) dadurch erhält, daß man dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen) aus den Haarfollikeln menschlicher oder tierischer Haut isoliert, anschließend kultiviert und dann aus den resultierenden Einzelschicht-Kulturen (Monolayer-Kulturen), die dermalen Papillenzellen gewinnt, insbesondere durch schonende Trypsinisierung.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung der dermalen Papillenzellen in einem geeigneten Nährmedium erfolgt, insbesondere wobei man als Nähmedium essentielles Minimalmedium MEM, insbesondere DME-Medium und/oder RPMI- Medium und/oder Chang-Medium, verwendet, gegebenenfalls zusammen mit weiteren Komponenten, insbesondere fötalem Kälberserum (FCS), Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ I, und dergleichen.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Papillen (PP) erhalten werden durch Mischen von aus Einzelschicht-Kulturen gewonnenen, gegebenenfalls in einem geeigneten Nährmedium befindlichen Papillenzellen mit einem matrixbildenden, insbesondere gelbildenden Medium MBMPP für die Pseudo-Papillen (PP), welches mindestens einen Matrixbildner MBPP, insbesondere Gelbildner, und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält, wobei das resultierende Gemisch eine Matrix, vorzugsweise ein Gel, ausbildet und insbesondere unter Ausstoß des gegebenenfalls vorhandenen Nährmediums kontrahiert.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das matrixbildende, insbesondere gelbildende Medium MBMPP als Matrixbildner MBPP, insbesondere Gelbildner, mindestens ein Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ IV, sowie gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält, die insbesondere ausgewählt sind aus der Gruppe von Matrix- und/oder Skleroproteinen, insbesondere Laminin, Gelatine, Chitosan, Glucosaminen, Glucosaminoglykanen (GAG), Heparansulfatproteoglykanen, sulfatierten Glykoproteinen wie Entactin und Nidogen und Wachstumsfaktoren wie Tissue-Growth-Factor-beta (TGF-β), Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Tissue-Plasmimogen-Activator und weiteren Wachstumsfaktoren aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Tumor (EHS-Tumor) und/oder der humanen Placenta sowie Mischungen der zuvor genannten Bestandteile.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbildung der kontrahierten Matrix, insbesondere des Gels, und/oder der Pseudo-Papillen (PP) in situ in der Pseudo-Dermis (PD) erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Papillen (PP) aus der Matrix, insbesondere dem Gel, geformt werden, wobei die Formgebung der Pseudo-Papillen (PP) entweder vor oder nach der in Schritt (c) durchgeführten Einbringung oder Insertion der Pseudo-Papillen (PP) oder deren Vorläufern erfolgen kann.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Matrixbildner MBPD für die Pseudo-Dermis (PD) und/oder der Matrixbildner MBPP für die Pseudo-Papillen (PP) fähig ist, unter Erwärmen, insbesondere unter Erwärmen bei Temperaturen von 20°C bis 40°C, zu gelieren, insbesondere unter Polymerisation, und das Wachstum und die Differenzierung von Zellen zu fördern.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix der Pseudo-Dermis (PD) und/oder die Matrix der Pseudo- Papillen (PP) eine dreidimensionale Struktur ausbildet.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrixbildung, insbesondere die Gelbildung, reversibel oder irreversibel verläuft.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Einbringen oder Inserieren der Pseudo-Papillen (PP) in Schritt (c) dadurch erfolgt, daß man geeignete Hohlräume zur Aufnahme der Pseudo-Papillen (PP), insbesondere durch Ausstanzen oder Einstechen, in der Pseudo-Dermis (PD) formt und dann in die so geformten Hohlräume Pseudo-Papillen (PP), die kultivierte Papillenzellen enthalten und deren Abmessungen den in der Pseudo-Dermis (PD) geformten Hohlräumen entsprechen, einbringt, inseriert oder einpfropft, oder aber dadurch, daß man die Pseudo-Papillen (PP) oder entsprechende Vorläufer solcher Pseudo-Papillen (PP) in Form einer Mischung aus kultivierten dermalen Papillenzellen und mindestens einem Matrixbildners MBPP, wobei die Vorläufer der Pseudo-Papillen (PP) dann in situ in der Pseudo-Dermis (PD), insbesondere unter Ausgelieren, die Matrix ausbilden, einbringt oder inseriert.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausstanzen oder Einstechen mit einer Stanze, insbesondere mit einem Durchmesser von 0,5 bis 4 mm, vorzugsweise etwa 2 mm, oder mit einer Knopfkanüle oder mit einer herkömmlichen Kanüle erfolgt.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlräume vor dem Einbringen der Pseudo-Papillen (PP) oder ihrer Vorläufer mit mindestens einem Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ IV, und/oder weiteren Matrixproteinen, insbesondere Basalmembranproteinen wie Laminin, ausgekleidet worden sind.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die vorgeformten Pseudo-Papillen (PP) oder die Vorläufer der Pseudo-Papillen (PP) direkt in die Pseudo-Dermis (PD) eingespritzt oder eingestochen werden.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Winkel der in Schritt (c) durchgeführten Einbringung oder Insertion der Pseudo-Papillen (PP) oder ihrer Vorläufer in die Pseudo-Dermis (PD) 30° bis 90°, insbesondere 40° bis 60°, beträgt, bezogen auf die Ebene der Pseudo-Dermis (PD).
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Papillen (PP) in regelmäßigen Abständen in die Pseudo- Dermis (PD) eingebracht oder inseriert werden.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Papillen (PP) in einer Anzahl von 1-50/cm2 Pseudo-Dermis (PD), insbesondere von 3-7/cm2 Pseudo-Dermis (PD), in die Pseudo- Dermis (PD) eingebracht oder inseriert werden.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die gegebenenfalls in Schritt (d) durchgeführte Aufbringung der rekonstruierten Epidermis (Pseudo-Epidermis; PE) vor oder nach der in Schritt (c) durchgeführten Einbringung oder Insertion der Pseudo-Papillen (PP) oder deren Vorläufern erfolgt.
27. Verfahren nach einem der Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Epidermis (PE) kultivierte Keratinozyten, insbesondere Keratinozyten der äußeren Haarwurzelscheide (ORS-Keratinozyten) und/oder epidermale Keratinozyten, und gegebenenfalls auch Melanozyten, insbesondere Melanozyten der äußeren Haarwurzelscheide (ORS-Melanozyten) und/oder epidermale Melanozyten, und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält.
28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinozyten und Melanozyten jeweils für sich in getrennten, ein- oder mehrlagigen Schichten oder aber zusammen in Mischung als ein- oder mehrlagige Schicht auf die Pseudo-Dermis (PD) aufgebracht werden.
29. Haar-/Hautäquivalent, insbesondere Haarmodell mit rekonstruierten Papillen (PP) in einer Pseudo-Dermis (PD), erhältlich nach einem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 28.
30. Haut-/Haaräquivalent, insbesondere Haut-/Haarmodell mit insbesondere dreidimensional geformten und räumlich abgegrenzten, rekonstruierten Papillen (Pseudo-Papillen; PP), umfassend eine rekonstruierte Dermis (Pseudo-Dermis; PD), in welche die Pseudo-Papillen (PP) eingebracht oder inseriert sind, wobei die Pseudo-Papillen (PP) kultivierte Papillenzellen, insbesondere dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen), in einer geeigneten Matrix, insbesondere Gelmatrix, umfassen, und gegebenenfalls auf die Pseudo-Dermis (PD) eine rekonstruierte Epidermis (Pseudo- Epidermis; PE) aufgebracht ist.
31. Haut-/Haaräquivalent nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Dermis (PD) kultivierte kontraktile Zellen, insbesondere Fibroblasten, vorzugsweise dermale Fibroblasten, in einer geeigneten Matrix umfaßt, insbesondere wobei die Matrix eine Matrix auf Basis von Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ I und/oder Typ III, und gegebenenfalls weiterer Komponenten ist.
32. Haut-/Haaräquivalent nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Dermis (PD) erhalten ist durch Mischen von aus Einzelschicht-Kulturen gewonnenen, gegebenenfalls in einem geeigneten Nährmedium befindlichen kontraktilen Zellen, insbesondere Fibroblasten, vorzugsweise dermalen Fibroblasten, mit einem matrixbildenden, insbesondere gelbildenden Medium MBMPD, welches mindestens einen Matrixbildner MBPD, insbesondere Gelbildner, und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält, wobei das resultierende Gemisch zu einer Pseudo- Dermis (PD) kontrahiert ist.
33. Haut-/Haaräquivalent nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das matrixbildende, insbesondere gelbildende Medium MBMPD als Matrixbildner MBPD, insbesondere Gelbildner, mindestens ein Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ I und/oder Typ III, und gegebenenfalls weitere Komponenten, insbesondere Bestandteile der extrazellulären Matrix der Dermis, vorzugsweise Matrix- und/oder Skleroproteine wie Laminin, umfaßt.
34. Haut-/Haaräquivalent nach einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Pseudo-Dermis (PD) ein geeignetes Nährmedium, insbesondere essentielles Minimalmedium MEM, und gegebenenfalls weitere Komponenten, aufgetragen sind.
35. Haut-/Haaräquivalent nach einem der Ansprüche 30 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Papillen (PP) kultivierte Papillenzellen, insbesondere dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen), in einer geeigneten Matrix umfassen, insbesondere wobei die Matrix eine Matrix auf Basis von Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ IV, und gegebenenfalls weiteren Komponenten ist.
36. Haut-/Haaräquivalent nach einem der Ansprüche 30 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Papillen (PP) erhalten sind durch Mischen von aus Einzelschicht-Kulturen gewonnenen, gegebenenfalls in einem geeigneten Nährmedium befindlichen Papillenzellen mit einem matrixbildenden, insbesondere gelbildenden Medium MBMPP für die Pseudo-Papillen (PP), welches mindestens einen Matrixbildner MBPP, insbesondere Gelbildner, und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält, wobei das resultierende Gemisch zu Pseudo-Papillen (PP) kontrahiert ist.
37. Haut-/Haaräquivalent nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das matrixbildende, insbesondere gelbildende Medium MBMPP als Matrixbildner MBPP, insbesondere Gelbildner, mindestens ein Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ IV, sowie gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält, die insbesondere ausgewählt sind aus der Gruppe von Matrix- und/oder Skleroproteinen, insbesondere Laminin, Gelatine, Chitosan, Glucosaminen, Glucosaminoglykanen (GAG), Heparansulfatproteoglykanen, sulfatierten Glykoproteinen wie Entactin und Nidogen und Wachstumsfaktoren wie Tissue-Growth-Factor-beta (TGF-β), Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Tissue-Plasmimogen-Activator und weiteren Wachstumsfaktoren aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Tumor (EHS-Tumor) und/oder der humanen Placenta sowie Mischungen der zuvor genannten Bestandteile.
38. Haut-/Haaräquivalent nach einem der Ansprüche 30 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß der Matrixbildner für die Pseudo-Dermis MBPD und/oder der Matrixbildner für die Pseudo-Papillen MBPP fähig ist, unter Erwärmen, insbesondere unter Erwärmen bei Temperaturen von 20°C bis 40°C, zu gelieren, insbesondere unter Polymerisation, und das Wachstum und die Differenzierung von Zellen zu fördern.
39. Haut-/Haaräquivalent nach einem der Ansprüche 30 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix der Pseudo-Dermis (PD) und/oder die Matrix der Pseudo-Papillen (PP) eine dreidimensionale Struktur ausbildet.
40. Haut-/Haaräquivalent nach einem der Ansprüche 30 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrixbildung, insbesondere die Gelbildung, reversibel oder irreversibel ist.
41. Haut-/Haaräquivalent nach einem der Ansprüche 30 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Papillen (PP) in die Pseudo-Dermis (PD) eingepfropft, eingestochen oder eingespritzt sind.
42. Haut-/Haaräquivalent nach einem der Ansprüche 30 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Papillen (PP) in einem Winkel von 30° bis 90°, insbesondere 40° bis 60°, bezogen auf die Ebene der Pseudo-Dermis (PD), in die Pseudo-Dermis (PD) eingebracht oder inseriert sind.
43. Haut-/Haaräquivalent nach einem der Ansprüche 30 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Papillen (PP) in regelmäßigen Abständen in die Pseudo-Dermis (PD) eingebracht oder inseriert sind.
44. Haut-/Haaräquivalent nach einem der Ansprüche 30 bis 43, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Papillen (PP) in einer Anzahl von 1-50/cm2 Pseudo-Dermis (PD), insbesondere von 3-7/cm2 Pseudo-Dermis (PD), in die Pseudo-Dermis (PD) eingebracht oder inseriert sind.
45. Haut-/Haaräquivalent nach einem der Ansprüche 30 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß die gegebenenfalls aufgebrachte Pseudo-Epidermis (PE) kultivierte Keratinozyten, insbesondere Keratinozyten der äußeren Haarwurzelscheide (ORS-Keratinozyten) und/oder epidermale Keratinozyten, und gegebenenfalls auch Melanozyten, insbesondere Melanozyten der äußeren Haarwurzelscheide (ORS-Melanozyten) und/oder epidermale Melanozyten, und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält.
46. Haut-/Haaräquivalent nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinozyten und Melanozyten jeweils für sich in getrennten, ein- oder mehrlagigen Schichten oder aber zusammen in Mischung als ein- oder mehrlagige Schicht auf die Pseudo-Dermis (PD) aufgebracht sind.
47. Haut-/Haaräquivalent nach einem der Ansprüche 30 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Papillen (PP) in dem dreidimensionalen Haut-/Haaräquivalent follikelähnliche oder follikuloide (follikelartige) Strukturen ausbilden.
48. Verwendung eines Haut-/Haaräquivalents nach den Ansprüchen 29 bis 47 im Bereich der Pharmazie, Medizin oder Kosmetik und Körperpflege.
49. Verwendung eines Haut-/Haaräquivalents nach den Ansprüchen 29 bis 47 zur Auffindung, Untersuchung und/oder (Über-)Prüfung von pharmazeutischen oder kosmetischen Wirkstoffen, insbesondere in bezug auf Verträglichkeit und/oder Wirksamkeit.
50. Verwendung nach Anspruch 49 zur Auffindung, Untersuchung und/oder (Über-)Prüfung von pharmazeutischen oder kosmetischen Wirkstoffen auf Wirkung und/oder Verträglichkeit in bezug auf den Haarfollikel, insbesondere im Hinblick auf die Haarpigmentierung, das Haarwachstum, die Haarstruktur, Haarfarbe und dergleichen.
51. Verwendung eines Haut-/Haaräquivalents nach den Ansprüchen 29 bis 47 für die Entwicklung von pharmazeutischen oder kosmetischen Wirkstoffen.
52. Verwendung eines Haut-/Haaräquivalents nach den Ansprüchen 29 bis 47 in vorzugsweise automatisierten Screening-Verfahren, insbesondere zur Auffindung, Untersuchung und/oder (Über-)Prüfung von pharmazeutischen oder kosmetischen Wirkstoffen.
53. Verwendung eines Haut-/Haaräquivalents nach den Ansprüchen 29 bis 47 zur in-vitro-Bewertung der Beeinflussung des Haarfollikels, der Haarpigmentierung, des Haarwachstums, der Haarstruktur, der Haarfarbe und dergleichen, insbesondere durch pharmazeutische oder kosmetische Wirkstoffe.
54. System, insbesondere Testsystem, umfassend ein Haut-/Haaräquivalent nach den Ansprüchen 29 bis 47.
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