DE102005043609A1

DE102005043609A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung eines Fadens aus Seidenproteinen

Info

Publication number: DE102005043609A1
Application number: DE102005043609A
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr. Scheibel; Daniel Dr. Hümmerich
Original assignee: Technische Universitaet Muenchen
Current assignee: Technische Universitaet Muenchen
Priority date: 2005-09-13
Filing date: 2005-09-13
Publication date: 2007-03-22
Also published as: EP1924725B1; JP2009508012A; JP4929283B2; KR20080044890A; WO2007031301A2; WO2007031301A3; CN101297068B; US20090137781A1; CA2622496C; US7868146B2; EP1924725A2; KR101255403B1; CA2622496A1; US20110201783A1; CN101297068A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Fadens aus Seidenproteinen sowie eine Vorrichtung, die zur Durchführung des Verfahrens geeignet ist. Darüber hinaus ist die Erfindung auf daraus gewonnene Fäden sowie deren Verwendung gerichtet. Die Erfindung macht von einer Diffusionseinheit Gebrauch, die zur Erzeugung qualitativ hochwertiger Seidenfäden mit hoher Ausbeute führt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Fadens aus Seidenproteinen sowie eine Vorrichtung, die zur Durchführung des Verfahrens geeignet ist. Darüberhinaus ist die Erfindung auf daraus gewonnene Fäden sowie deren Verwendung gerichtet.
Natürliche Seide, z.B. Spinnenseide, ist ein außergewöhnliches Material, das eine sehr hohe Zugfestigkeit in Kombination mit einer hohen Dehnbarkeit aufweist. Aufgrund dieser Eigenschaften wird seit Jahren versucht, dieses Material in größeren Mengen herzustellen. Da es nicht möglich ist, Tiere wie z.B. Spinnen für diesen Zweck einzusetzen, konzentriert sich die Forschung auf die Untersuchung von Verfahren, bei denen das Ausgangsmaterial für die Seide (z.B. Spinnenseidenproteine) rekombinant gewonnen und anschließend zu einem Faden versponnen wird.
Als Rohmaterial finden dabei authentische Seidenproteine (rekombinante Proteine, die mit Hilfe authentischer Seidengensequenzen gewonnen werden) und synthetische Seidenproteine (auf synthetischen Genen basierende Proteine, deren Primärsequenz weitgehend der natürlichen Sequenz entspricht) Verwendung. Die Qualität eines künstlich hergestellten Fadens wird vermutlich sowohl von dem eingesetzten Rohmaterial als auch von dem angewandten Spinnverfahren bestimmt.

Wie beim natürlichen Spinnprozess müssen bei künstlichen Spinnversuchen die Seidenproteine von einer löslichen Form in eine unlösliche fibrilläre Form überführt werden, deren Struktur dem authentischen Faden möglichst gleich kommen soll. Die Arbeitsgruppe von Jelinski entwickelte dazu einen Mikrospinnapparat, der die Verspinnung weniger Milligramm Seidenprotein zu mehreren Meter langen Seidenfäden erlaubte (Liivak et al., 1998). Als Ausgangsmaterial wurde in Hexafluoroisopropanol gelöste Seide der Spinne Nephila clavipes verwendet. Das so gelöste Protein wurde durch eine Spinndüse in ein Fällungsbad aus Aceton gespritzt. So erhaltene Fäden waren jedoch sehr spröde und wiesen kaum strukturelle Ähnlichkeit mit natürlichen Seidenfäden auf (Seidel et al., 1998; Seidel et al., 2000). Erst durch Behandlung mit Wasser und durch nachträgliches Ziehen des Fadens (post spin draw) konnten sowohl mechanische als auch strukturelle Parameter verbessert werden. Die Eigenschaften der natürlichen Seide wurden allerdings nicht erreicht (Seidel et al., 2000).

Eine andere Gruppe entwickelte eine Spinnmethode, in der ein Methanol/Wasser Gemisch als Fällungsbad zum Einsatz kam. Damit konnten ein synthetisches Seidenprotein und rekombinantes MaSp1 der Spinne Nephila clavipes aus einer harnstoffhaltigen Lösung heraus zu Fäden versponnen werden. Diese waren jedoch ebenfalls spröde (Arcidiacono et al., 2002).

Mit der gleichen Methode konnte rekombinantes, ohne chaotrope Reagenzien gelöstes, ADF-3 zu Fäden versponnen werden. Auch in diesem Fall konnten die Eigenschaften des Fadens durch post spin draw verbessert werden (Lazaris et al., 2002). Die Zugfestigkeit natürlicher Fäden wurde jedoch nicht erreicht. Die Firmen Oxford Biomaterials (Oxford, Großbritannien), Spin'Tech GmbH (Ludwigsburg, Deutschland) und das Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH (Mainz, Deutschland) haben nach Kenntnisstand der Erfinder ein Verfahren entwickelt, mit dem Seidenproteine durch ein Mikrodialyse- oder ähnliches Verfahren zu Fäden versponnen werden kann.

Daneben gibt es erfolgreiche Versuche, durch sog. Elektrospinning aus Seidenproteinen Fäden zu gewinnen (Prof. Frank Ko, Drexel University, Philadelphia, PA, U.S.A.). Über die mechanischen Eigenschaften der so hergestellten Fäden ist bisher jedoch noch nichts veröffentlicht worden.

US 2003/0201560 betrifft eine Vorrichtung zum Spinnen von Fäden aus Proteinlösungen. Es wird dargelegt, daß die Vorrichtung einen trichterförmigen Abschnitt aufweist, durch den die Proteinlösung bzw. "Dope" hindurchgeleitet wird, wobei diese Passage zumindest teilweise aus einem semipermeablen und/oder porösen Material besteht.

WO 2005/017237 betrifft unter anderem eine Vorrichtung zur Assemblierung von Proteinen. Die Vorrichtung weist eine rohrförmige Passage umfaßt, deren Wände teilweise permeabel oder porös sind. Dies hat den Vorteil, pH, Wassergehalt und Ionenzusammensetzung zu kontrollieren.

WO 2004/057069 betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung von Objekten, insbesondere auch zum Spinnen von Fäden aus Spinnenseidenproteinen. Dieses Verfahren betrifft schwerpunktmäßig den Sol-Gelübergang der Proteinlösung, der beispielsweise durch Zusatz von Kalium, vorzugsweise Kaliumfluorid, erreicht wird. Darüber hinaus wird hier angegeben, daß die zur Durchführung des Verfahrens verwendete Vorrichtung ein „transition compariment" aufweist, das semipermeabel oder porös ausgebildet sein kann.

WO 2003/060099 beschäftigt sich mit der Herstellung von Spinnenseidenfasern bzw. Biofilamenten. In der geschilderten Vorrichtung wird eine „extrusion unit" beschrieben, durch die die Spinnenseidenproteinlösung hindurchgeführt wird. Insbesondere ist WO 2003/060099 auf die Einbringung der Filamente in ein Koagulationsbad nach Luftkontakt gerichtet.

Die bisher verwendeten und publizierten Verfahren zum Verspinnen von Spinnenseidenproteinen basieren folglich zumeist auf der Injektion einer Proteinlösung in ein Fällungsbad. Zur Stabilisierung des löslichen Zustandes der Proteine in der Spinnlösung sind darin in der Regel chaotrope Stoffe oder organische Lösungsmittel enthalten. Um den Effekt dieser Zusätze aufzuheben und die Assemblierung der Proteine auszulösen, sind dem Fällungsbad entsprechend lyotrope Agenzien beigesetzt.

Demgegenüber ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Erzeugung von Seidenproteinen bereit zu stellen, die den Einsatz des Fällungsbades und den Zusatz nicht natürlicher, chaotroper oder lyotroper Mittel unnötig machen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, durch ein Verfahren und eine Vorrichtung stabile Seidenfäden herzustellen, die mechanische Eigenschaften aufweisen, die den natürlichen Seidenproteinen nahe kommen oder diesen entsprechen. Eine zusätzliche Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung von Seidenproteinen mit großer Ausbeute, d.h. in einer Menge, die für die großtechnische Herstellung der Seidenproteine geeignet ist.

Diese Aufgaben werden durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Wie bereits oben angesprochen basieren die bisher verwendeten Verfahren zum Verspinnen von Spinnenseidenproteinen zumeist auf der Injektion einer Proteinlösung in ein Fällungsbad, wobei zur Stabilisierung des löslichen Zustandes der Proteine in der Spinnlösung darin in der Regel chaotrope, lyotrope Stoffe oder organische Lösungsmittel enthalten sind.

Es hat sich herausgestellt, dass im Gegensatz dazu die natürliche Seidenassemblierung, z.B. in der Spinne, durch andere Faktoren vermittelt wird. Ein Schlüsselprozess ist dabei eine u.a. durch Zugabe von Kalium- und Phosphationen induzierte Phasentrennung der Spinnlösung in eine wässrige, proteinarme und eine proteinreiche Phase. Die Streckung der proteinreichen Phase durch Zug am fertigen Faden führt anschließend zur Assemblierung der Seidenproteine.

Die im Vergleich zur natürlichen Spinnenseide verhältnismäßig schlechten mechanischen Eigenschaften der künstlich gesponnenen Fäden nach dem Stand der Technik weisen darauf hin, dass Phasentrennung und Streckung wichtige Faktoren für die Entstehung mechanisch stabiler Strukturen sind. Diese Erkenntnis wurde jedoch bisher nicht zur Erzeugung von Seidenfäden genutzt.

Der Ansatz der vorliegenden Erfindung enthält mehrere Unterschiede im Vergleich zu den oben beschriebenen Spinnverfahren des Stands der Technik:
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert ausschließlich auf wässrigen Lösungen ohne Zusätze von nichtnatürlichen, chaotropen oder lyotropen Mitteln. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen liegen die Proteine damit vermutlich in einem konformationellen Zustand vor, der dem natürlichen Zustand entspricht.

Änderungen der Zusammensetzung der Spinnlösung werden durch Diffusion erreicht. Damit kann die Lösung in einen assemblierungskompetenten Zustand versetzt werden, ohne sofort einen festen Zustand einnehmen zu müssen, wie dies bei einem Fällungsbad der Fall ist.

Die Fadenassemblierung wird durch Zug an der Proteinreichen Phase abgeschlossen. Aus Untersuchungen an chemischen Polymeren ist bekannt, dass die Streckung konzentrierter Polymerlösungen zu einer Ausrichtung der einzelnen Polymerketten und damit einer erhöhten Stabilität einer daraus gebildeten Faser führt. Es ist zu vermuten, dass daher die hier verwendete, auf Zug basierende Spinnmethode den auf Druck basierenden Methoden überlegen ist.

Die in der vorliegenden Erfindung verwirklichten Neuerungen orientieren sich am natürlichen Spinnprozess. Da dieser Prozess der einzige bisher bekannte Weg ist, stabile Spinnenseidenfäden herzustellen, führt die Anpassung der künstlichen Spinnmethode an diesen Prozess zu einer Verbesserung der Fadenqualität.

Der Spinnapparat der vorliegenden Erfindung erlaubt Hochleistungsfasern aus synthetischer Spinnenseide herzustellen, die in vielen Bereichen der Technik und Industrie ihre Anwendungen finden. Neben ballistischen Anwendungen, wie der Entwicklung kugelsicherer Ausrüstungsgegenstände, könnten synthetische Spinnenseiden ebenfalls für Fallschirme, Spezialseile und Netze, Sportartikel, Textilien, aber auch für Leichtbaukomponenten von Flugzeugen verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft die folgenden Aspekte und Ausführungsformen:
Gemäß eines ersten Aspektes betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fadens aus Seidenproteinen, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellen einer Lösung aus Seidenproteinen,
b) Überführen der Lösung in eine Diffusionseinheit, die eine Kalium- und Phosphationen enthaltende Zusammensetzung aufweist;
c) Hindurchführen der Lösung durch die Diffusionseinheit, wobei die Lösung mit den aus der Diffusionseinheit diffundierenden Kalium- und Phosphationen in Berührung kommt;
d) Auftrennen der Lösung in eine Seidenproteinreiche und -arme Phase;
e) Gewinnen des Seidenfadens aus der proteinreichen Phase.

Es sei darauf hingewiesen, dass der Begriff „Seidenproteine" wie in dieser Anmeldung verwendet, im Prinzip keinerlei Einschränkung unterliegt. Das einzige Erfordernis ist die Fähigkeit der Proteine, sich unter geeigneten Bedingungen zu einem Faden assemblieren zu können. Im engeren Sinne sind die Seidenproteine durch Proteine natürlicher Herkunft charakterisiert, d.h. Proteine, die beispielsweise von Spinnentieren (Arachnida) oder Insekten (Insecta) abgeleitet sind. Als Beipiele für die Herkunft der Proteine sind der Seidenspinner (Bombyx mori), die Florfliege (Chrysoperla carnea), die Kreuzspinne (Araneus diadematus) und die goldene Seidenspinne (Nephila clavipes) zu nennen.

Die hier verwendeten Seidenproteine können authentisch sein, d.h. die natürlichen Sequenzen darstellen, oder können synthetisch sein, d.h. auf synthetischen Genen basierende Proteine, deren Primärsequenz weitgehend der natürlichen Sequenz entspricht.

Die einzelnen Seidenproteinsequenzen sind dem Fachmann durch Datenbanken zugänglich, es sei hier nur beispielhaft auf die Sequenzen ADF-3 und ADF-4 von Araneus diadematus verwiesen, die unter der Nr. U47855 und U47856 zugänglich sind.

Der Begriff „Diffusionseinheit" wie hierin verwendet beschreibt ein Speichermedium, das eine Diffusion von Bestandteilen aus diesem hinaus und in dieses hinein ermöglicht. Es handelt sich bei der Diffusionseinheit der vorliegenden Erfindung nicht um die im Stand der Technik gebräuchliche poröse oder semipermeable Membran, durch die ein einseitiger Durchtritt von Bestandteilen ohne Speichereigenschaft ermöglicht werden soll. Die Diffusionseinheit der vorliegenden Erfindung kann eher als Matrix bezeichnet werden, in der einerseits die für die Bildung von proteinreichen- und armen Phasen notwendigen Kalium- und Phosphationen zur Diffusion bereitgestellt werden und in die andererseits die (für die Fadenassemblierung nicht zu verwendende) proteinarme Phase der Seidenproteinlösung aufgenommen wird.

In einer Ausführungsform enthält die in a) bereitgestellte Spinnlösung zumindest 1%-50%, bevorzugt 10-40 %, am meisten bevorzugt 20-30 % (G/V) an Seidenprotein. Der pH der Lösung bewegt sich erfahrungsgemäß von 4,0-12,0, bevorzugt von 6,5-8,5 und ist am meisten bevorzugt 8,0. Diese Lösung wird auch als „Dope" bezeichnet. "Dope" bedeutet eine Flüssigkeit oder Lösung, die zusätzlich zu Proteinmonomeren Proteinaggregate einschliessen kann, beispielsweise Dimere, Trimere und/oder Tetramere. Diese Proteinlösung kann zusätzlich zu den unten aufgeführten Lösungsmitteln auch Zusatzstoffe wie z.B. Konservierungsmittel sowie Mittel zur Steigerung der Stabilität oder Verarbeitbarkeit der Lösung beeinhalten.

Im erfindungsgemäßen Verfahren umfasst die Lösung vorzugsweise ein polares Lösungsmittel, das aus Wasser, Alkoholen und Gemischen hiervon ausgewählt ist. Beispiele für Alkohole umfassen Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol oder mehrwertige Alkohole wie Glycerin oder Propylenglykol. Die letztgenannten Lösungsmittel können neben ihren Lösungsmitteleigenschaften auch als Mittel zur Einstellung der Viskosität und/oder als Konservierungsmittel eingesetzt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform schliesst der Schritt der Gewinnung des Seidenfadens ein In-Berührung-Bringen der proteinreichen Phase mit einem Gas oder einer Flüssigkeit ein. In der Regel wird das Gas ein Sauerstoff enthaltendes Gas sein, d.h. dann, wenn u.a. eine Oxidationswirkung erwünscht ist. Andererseits kann das Gas auch ein Inertgas wie z.B. Stickstoff, Argon, Helium etc. sein. In Frage kommen auch Gemische dieser Gase.

Neben dem Kontakt mit gasförmigen Substanzen kann auch ein in-Berührung-Bringen mit Flüssigkeiten in Betracht kommen, wobei hier als Beispiele Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Aceton, Acetonitril, bevorzugt Methanol zu nennen sind.

Die Diffusionseinheit der vorliegenden Erfindung ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform aus einem Gelmaterial gebildet. Eingesetzt wird als Gelmaterial bevorzugt ein Hydrogel, insbesondere ein Hydrogel, das Polyacrylamid-, Cellulosederivat-, Polyvinylmethylether-(PVME), Polystyrol-Polybutadien-(PS-PB), Stearylacrylat-, Polyethylen-(PE), Polystyrol-(PS), Polyvinylalkohol-(PVA), Polyacrylsäure-, Poly(N-vinylpyrrolidon)-(PVP), Polyethylenterephthalat-(PET), Polyisopropylenacrylamid-, Polyethersulfonsäure- und/oder Silikonhydrogele umfasst.

Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung des oben definierten Verfahrens, mit:

– einer ersten Vorrichtung, die eine Lösung aus Seidenproteinen in die Diffusionseinheit verbringt;
– der Diffusionseinheit, die einen Kanal zur Durchführung der Lösung aufweist, der mit einer Kalium- und Phosphationenenthaltenden Zusammensetzung umgeben ist, wobei die Lösung mit den aus der Diffusionseinheit diffundierenden Kalium- und Phosphationen in Berührung kommt, sodass die Diffusionseinheit am Ausgang ihres Kanals die in eine Seidenproteinreiche und -arme Phase aufgetrennte Lösung bereitstellt; und
– einer zweiten Vorrichtung, die den Seidenfaden aus der proteinreichen Phase der Lösung generiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die erste Vorrichtung als eine mit einer steuerbaren Pumpe gekoppelte Spritze ausgebildet. Beispielsweise steuert eine Steuervorrichtung, wie beispielsweise ein Mikrocontroller, die steuerbare Pumpe. Vorzugsweise weist die Steuervorrichtung ferner einen Speicher auf, in welchem ein Ablaufprogramm für die Ansteuerung der steuerbaren Pumpe abspeicherbar ist.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung ist die erste Vorrichtung als ein steuerbares Pumpsystem ausgebildet, das die Lösung in einem kontinuierlichen Prozess in die Diffusionseinheit verbringt. Insbesondere ist das oben beschriebene Steuerprogramm derart ausgebildet, dass es den kontinuierlichen Prozess für das Verbringen der Lösung in die Diffusionseinheit steuert und somit sicherstellt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung weist das Pumpsystem zumindest eine Schlauchpumpe auf.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung weist die Diffusionseinheit am Ausgang ihres Kanals eine Verjüngung oder eine Düse auf, mittels der das Austreten der Lösung aus der Diffusionseinheit steuerbar ist. Die Düse oder Verjüngung ist insbesondere trichterförmig aufgebaut, wobei sich ihre Querschnittsflächen nach außen hin verkleinern.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung ist die zweite Vorrichtung als eine mittels einer Antriebsvorrichtung angetriebene Walze oder Rolle ausgebildet, die den Seidenfaden aus einem Tropfen, der sich am Ausgang der Diffusionseinheit aus der proteinreichen Phase der Lösung bildet, zieht. Insbesondere ist auch die Antriebsvorrichtung mit der Steuervorrichtung gekoppelt, so dass das in dem Speicher der Steuervorrichtung gespeicherte Ablaufprogramm auch die Antriebsvorrichtung steuert, so dass insbesondere der kontinuierliche Prozess für das Ziehen des Fadens sichergestellt ist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung zieht die Walze oder Rolle den Spinnseidenfaden mittels einer für die Proteinassemblierung notwendigen Zugkraft.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung ist die Diffusionseinheit als eine austauschbare Kartusche ausgebildet.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung weist die Antriebsvorrichtung einen Motor und/oder ein Getriebe auf.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung besitzt der Kanal der Diffusionseinheit zur Durchführung der Lösung einen im Wesentlichen konstanten Innendurchmesser.

Hiermit unterscheidet sich der Ansatz der vorliegenden Erfindung insbesondere vom Stand der Technik, z.B. der US 2003/0201560: der rohrförmige Abschnitt ist hier in allen Ausführungsformen als Trichter dargestellt. Es wird ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die Molekülorientierung in einer Faser verbessert werden kann, wenn eine Düse mit einer konvergenten Geometrie verwendet wird. Die vorliegende Erfindung folgt diesem Ansatz vorzugsweise nicht.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung weist die Diffusionseinheit eine dritte Vorrichtung auf, mittels der die proteinarme Phase aus der Diffusionseinheit entfernbar ist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung ist die dritte Vorrichtung als eine Vakuumpumpe ausgebildet.

In einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Faden, der durch das oben definierte Verfahren herstellbar ist. Dieser Faden wird vorzugsweise in Technik und Industrie für ballistische Anwendungen, wie der Entwicklung kugelsicherer Ausrüstungsgegenstände, zur Herstellung von Fallschirmen, Spezialseilen und Netzen, Sportartikeln, Textilien, aber auch für Leichtbaukomponenten von Flugzeugen verwendet.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Abbildungen und Beispielen verdeutlicht werden. Die Abbildungen zeigen Folgendes:
1 ein schematisches Blockdiagramm eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Herstellung eines Fadens aus Seidenproteinen;
2 ein schematisches Blockschaltbild eines Ausführungsbeispiels der Diffusionseinheit gemäß der vorliegenden Erfindung;
3 eine photographische Abbildung einer Vorrichtung der vorliegenden Erfindung;
4 eine photographische Abbildung einer Diffusionseinheit der vorliegenden Erfindung;
5 gibt eine Analyse des assemblierten Fadens wider.
In allen Abbildungen sind gleiche beziehungsweise funktionsgleiche Elemente und Vorrichtungen – sofern nichts anderes angegeben ist – mit denselben Bezugszeichen versehen worden.
In 1 ist ein schematisches Blockschaltbild eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung 1 dargestellt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Seidenfadens 7 aus Seidenproteinen weist eine erste Vorrichtung 2, eine Diffusionseinheit 4 und eine zweite Vorrichtung 6 auf.
Die erste Vorrichtung 2 verbringt die Lösung 3 aus Seidenproteinen in die Diffusionseinheit 4. Vorzugsweise ist die erste Vorrichtung 2 als eine mit einer steuerbaren Pumpe 21 gekoppelte Spritze 22 ausgebildet. Vorzugsweise ist zwischen der Pumpe 21 und der Spritze 22 ein Reservoir 23 für die Lösung 3 angeordnet. Gemäß 1 bezeichnet das Bezugszeichen F die Flussrichtung der Lösung 3 in das Reservoir 23. Weiterhin kann die erste Vorrichtung 2 als ein steuerbares Pumpsystem ausgebildet sein, das die Lösung 3 in einem kontinuierlichen Prozess in die Diffusionseinheit 4 verbringt. Vorzugsweise weist das Pumpsystem zumindest eine Schlauchpumpe auf.
Beispielsweise ist die erste Vorrichtung 2 mit der Diffusionseinheit 4 mittels eines Schlauches 9 verbunden.
Die Diffusionseinheit 4 weist einen Kanal 41 zur Durchführung der Lösung 3 auf. Der Kanal 41 ist mit einer Kalium- und Phosphationen enthaltenden Zusammensetzung 42 umgeben. Die Lösung 3 kommt mit den aus der Diffusionseinheit 4 diffundierenden Kalium- und Phosphationen in Berührung, so dass die Diffusionseinheit 4 am Ausgang 43 ihres Kanals 41 die in eine seidenproteinreiche Phase 5 und eine seidenproteinarme Phase aufgetrennte Lösung 3 bereitstellt. Vorzugsweise weist die Diffusionseinheit 4 am Ausgang 43 ihres Kanals 41 eine Verjüngung oder eine Düse 44 auf, mittels der das Austreten der Lösung 3 aus der Diffusionseinheit 4, insbesondere mittels ihrer geometrischen Ausgestaltung steuerbar ist.
Ferner weist die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 die zweite Vorrichtung 6 auf, die den Seidenfaden 7 aus der proteinreichen Phase 5 der Lösung 3 generiert. Insbesondere ist die zweite Vorrichtung 6 als eine mittels einer Antriebsvorrichtung angetriebene Walze oder Rolle ausgebildet, die den Seidenfaden 7 aus einem Tropfen, der sich am Ausgang 43 der Diffusionseinheit 4 aus der proteinreichen Phase 5 der Lösung 3 bildet, zieht. Insbesondere zieht die Walze 6 den Spinnseidenfaden 7 mittels einer für die Proteinassemblierung notwendigen Zugkraft. Insbesondere weist die Antriebsvorrichtung, die die Walze 6 antreibt, einen Motor und/oder ein Getriebe auf.
2 zeigt ein besonders bevorzugtes Ausführungsbeispiel der in 1 dargestellten Diffusionseinheit 4. Vorzugsweise ist der Innendurchmesser d des Kanals 41, der zur Durchführung der Lösung 3 dient, im Wesentlichen konstant.
Die Diffusionseinheit 4 ist vorzugsweise als austauschbare Kartusche ausgebildet, so dass die Diffusionseinheit 4 insbesondere dann ausgetauscht werden kann, wenn sie mit proteinarmer Phase der Lösung 3 gesättigt ist. Die Diffusionseinheit 4 weist insbesondere eine dritte Vorrichtung auf, mittels der die proteinarme Phase aus der Diffusionseinheit 4 entfernbar ist. Beispielsweise ist diese dritte Vorrichtung als eine Vakuumpumpe ausgebildet. Außerdem bezeichnet die in 2 dargestellte Einheit mit dem Bezugszeichen 45 ein Pufferreservoir.
Die hier beschriebene Erfindung integriert diese Prozesse in ein Spinnverfahren, das die maschinelle Herstellung mechanisch belastbarer Proteinfäden erlaubt.
1 zeigt eine schematische Darstellung des Spinnverfahrens der Erfindung anhand einer Ausführungsform. Dieses Verfahren beinhaltet im Wesentlichen vier Komponenten. Eine regelbare Motor/Getriebeeinheit sorgt dafür, dass über eine Spritze die Spinnlösung kontinuierlich in eine Diffusionseinheit nachgeführt wird. In dieser aus einem Gel bestehenden Einheit diffundieren Kalium- und Phosphationen in die Spinnlösung, was zu einer Phasentrennung führt. Proteinreiche und -arme Phasen werden weiter zum Ausgang der Diffusionseinheit transportiert und treten dort mit Luft in Kontakt. Dieser Kontakt ist essentiell für den Spinnprozess und führt vermutlich zur Reduktion der wässrigen Phase durch Trocknungsprozesse und zur Oxidation der Proteinmolekülbestandteile.
Aus dem gebildeten Tropfen proteinreicher Phase kann ein Faden gezogen werden (2). Durch Aufwickeln des Fadens auf eine über einen regelbaren Motor angetriebene Walze wird der für die Proteinassemblierung notwendige Zug aufrechterhalten und eine kontinuierliche Fadenbildung erreicht. 2 zeigt Elemente der Diffusionseinheit gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
Die Funktionsfähigkeit der vorgestellten Methode konnte durch die Konstruktion eines Prototyps gezeigt werden (3). Die Motor- und Getriebeeinheit sowie das Gerüst des Prototyps wurden aus Elementen eines Metallbaukastens (Compakt Technik GmbH, Schriesheim, Deutschland) aufgebaut. Für die Nachführung der Spinnlösung wurde eine 25 μl Glasspritze mit Metallnadel (Gauge 22, Point Style 3; Hamilton, Bonadutz, Schweiz) verwendet. 3 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung.
Die Diffusionseinheit besteht aus einem 20 % Polyacrylamidgel, das in 0,5 M Kaliumphosphat pH 8,0 equillibriert wird. Durch das Gel führte ein Kanal mit 0,7 mm Durchmesser, der in einer Plastikspitze mit einem Innendurchmesser von ca. 0,2 mm endet (4). Der Proteinfaden wird von einer mit ca. 60 rpm rotierenden Teflonwalze von 4 cm Durchmesser aufgewickelt. 4 ist eine Obersicht über die Diffusionseinheit.
Mit diesem Prototypen konnte eine 25 %ige Lösung des synthetischen Seidenproteins (AQ)₂₄NR3 (siehe (Huemmerich et al., 2004) zu einem 4 μm dicken Faden versponnen werden (5). 5 gibt eine Analyse des assemblierten Fadens wider. (A) Der Faden wird mittels der Teflonwalze aufgewickelt. (B) Rasterelektronenmikroskopische Bild des entstandenen Fadens. (C) Mit freundlicher Unterstützung der Gruppe von Prof. Eduard Arzt am MPI für Metallforschung in Stuttgart wurden die mechanischen Parameter des Fadens im Vakuum bestimmt. (D) Rasterelektronenmikroskopisches Bild der Seidenabruchkante nach Abreißen des Fadens im mechanischen Zugversuch.
Referenzen

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Huemmerich, D., Helsen, C. W., Quedzuweit, S., Oschmann, J., Rudolph, R. & Scheibel, T. (2004) Primary structure elements of spider dragline silks and their contribution to protein solubility. Biochemistry 43: 13604-12
Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W. & Karatzas, C. N. (2002) Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science 295: 472-6
Liivak, O., Blye, A., Shah, S. & Jelinski, L. W. (1998) A Microfabricated Wet-Spinning Apparatus To Spin Fibers of Silk Proteins. Structure-Property Correlations. Macromolecules 31: 2947-51
Seidel, A., Liivak, O. & Jelinski, L. W. (1998) Artificial Spinning of Spider Silk. Macromolecules 31: 6733-6
Seidel, A., Liivak, O., Calve, S., Adaska, J., Ji, G. D., Yang, Z. T., Grubb, D., Zax, D. B. & Jelinski, L. W. (2000) Regenerated spider silk: Processing, properties, and structure. Macromolecules 33: 775-80
Vollrath, F. & Knight. D. P. (2001) Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature 410: 541-8

1: Vorrichtung
2: erste Vorrichtung
3: Lösung
4: Diffusionseinheit
5: Seidenproteinreiche Phase
6: zweite Vorrichtung
7: Seidenfaden
8: Ort der Fadenassemblierung
9: Schlauch
21: Pumpe
22: Spritze
23: Reservoir
41: Kanal
42: Kalium- und Phosphationen enthaltende Zusammensetzung
43: Ausgang
44: Düse
45: Pufferreservoir
d: Durchmesser
F: Flussrichtung

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Fadens aus Seidenproteinen, das die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Lösung aus Seidenproteinen, b) Überführen der Lösung in eine Diffusionseinheit, die eine Kalium- und Phosphationen enthaltende Zusammensetzung aufweist; c) Hindurchführen der Lösung durch die Diffusionseinheit, wobei die Lösung mit den aus der Diffusionseinheit diffundierenden Kalium- und Phosphationen in Berührung kommt; d) Auftrennen der Lösung in eine Seidenproteinreiche und -arme Phase; e) Gewinnen des Seidenfadens aus der proteinreichen Phase.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Spinnlösung zumindest 1%-50%, bevorzugt 10-40 %, am meisten bevorzugt 20-30 % (G/V) an Seidenprotein enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der pH der Lösung 4,0-12,0, bevorzugt 6,5-8,5, am meisten bevorzugt 8,0 beträgt.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lösung natürliche oder synthetische Seidenproteine umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Seidenproteine von den Arten Bombyx mori, Araneus diadematus und/oder Nephila clavipes abgeleitet sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lösung ein polares Lösungsmittel umfasst, das vorzugsweise aus Wasser, Alkoholen und Gemischen hiervon ausgewählt ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gewinnung des Seidenfadens ein In-Berührung-Bringen der proteinreichen Phase mit einem Gas oder einer Flüssigkeit einschliesst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Gas aus O₂, Inertgasen oder Gemischen hiervon ausgewählt ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Diffusionseinheit aus einem Gelmaterial gebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Gelmaterial aus Hydrogelen, insbesondere aus Polyacrylamid, Cellulosederivaten, Polyvinylmethylether (PVME), Polystyrol-Polybutadien (PS-PB), Stearylacrylat, Polyethylen (PE), Polystyrol (PS), Polyvinylalkohol (PVA), Polyacrylsäure, Poly(N-vinylpyrrolidon) (PVP), Polyethylenterephthalat (PET), Polyisopropylenacrylamid, Polyethersulfonsäure, Silikonhydrogelen ausgewählt ist.
Vorrichtung (1) zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, mit: einer ersten Vorrichtung (2) die eine Lösung (3) aus Seidenproteinen in die Diffusionseinheit (4) verbringt; der Diffusionseinheit (4), die einen Kanal (41) zur Durchführung der Lösung (3) aufweist, der mit einer Kalium- und Phosphationenenthaltenden Zusammensetzung (42) umgeben ist, wobei die Lösung (3) mit den aus der Diffusionseinheit (4) diffundierenden Kalium- und Phosphationen in Berührung kommt, sodass die Diffusionseinheit (4) am Ausgang (43) ihres Kanals (41) die in eine seidenproteinreiche und -arme Phase (5) aufgetrennte Lösung (3) bereitstellt; und einer zweiten Vorrichtung (6), die den Seidenfaden (7) aus der proteinreichen Phase (5) der Lösung (3) generiert.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die erste Vorrichtung (2) als eine mit einer steuerbaren Pumpe (21) gekoppelte Spritze (22) ausgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die erste Vorrichtung (2) als ein steuerbares Pumpsystem ausgebildet ist, das die Lösung (3) in einem kontinuierlichen Prozess in die Diffusionseinheit (4) verbringt.
Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei das Pumpsystem zumindest eine Schlauchpumpe aufweist.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 14, wobei die Diffusionseinheit (4) am Ausgang (43) ihres Kanals (41) eine Verjüngung oder eine Düse (44) aufweist, mittels der das Austreten der Lösung (3) aus der Diffusionseinheit (4) steuerbar ist.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 15, wobei die zweite Vorrichtung (6) als eine mittels einer Antriebsvorrichtung angetriebene Walze oder Rolle ausgebildet ist, die den Seidenfaden (7) aus einem Tropfen, der sich am Ausgang (43) der Diffusionseinheit (4) aus der proteinreichen Phase (5) der Lösung (3) bildet, zieht.
Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Walze oder Rolle (6) den Spinnseidenfaden (7) mittels einer für die Proteinassemblierung notwendigen Zugkraft zieht.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 17, wobei die Diffusionseinheit (4) als eine austauschbare Kartusche ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 18, wobei die Antriebsvorrichtung einen Motor und/oder ein Getriebe aufweist.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 19, wobei der Kanal (41) der Diffusionseinheit (4) zur Durchführung der Lösung (3) einen im Wesentlichen konstanten Innendurchmesser (d) aufweist.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 20, wobei die Diffusionseinheit (4) eine dritte Vorrichtung aufweist, mittels der die proteinarme Phase aus der Diffusionseinheit (4) entfernbar ist.
Vorrichtung nach einem oder mehreren Ansprüche 11 bis 21, wobei die dritte Vorrichtung als eine Vakuumpumpe ausgebildet ist.
Faden, der durch das Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-10 herstellbar ist.
Verwendung des Fadens nach Anspruch 23 in Technik und Industrie für ballistische Anwendungen, wie der Entwicklung kugelsicherer Ausrüstungsgegenstände, zur Herstellung von Fallschirmen, Spezialseilen und Netzen, Sportartikeln, Textilien und für Leichtbaukomponenten von Flugzeugen.