DE102006026328A1

DE102006026328A1 - Verfahren zur Herstellung eines L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs

Info

Publication number: DE102006026328A1
Application number: DE102006026328A
Authority: DE
Inventors: Brigitte Dr. Bathe; Stephan Hans; Caroline Kreutzer; Hermann Dr. Lotter; Georg Dr. Thierbach
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2008-01-03
Also published as: WO2007141111A3; WO2007141111A2; EP2026662A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tierfuttermitteladditiven auf Fermentationsbrühebasis mit einem hohen Gehalt an L-Lysin und verlustärmere Verfahren zur Herstellung aus durch Fermentation erhaltenen Brühen unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die ausgewählte Mutationen enthalten und diese Futtermitteladditive selbst.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung heller und thermisch stabiler, granulierter Tierfuttermitteladditive auf Fermentationsbrühebasis mit einem hohen Gehalt an L-Lysin und verlustarmer Verfahren zur Herstellung aus durch Fermentation erhaltenen Brühen unter Verwendung ausgewählter coryneformer Bakterien.
Stand der Technik
Tierfuttermittel werden mit einzelnen Aminosäuren entsprechend dem Bedarf der Tiere supplementiert. Zur Supplementierung von Tierfuttermitteln, z. B. mit L-Lysin, wird bisher weit überwiegend das L-Lysin-monohydrochlorid mit einem L-Lysin-Gehalt von ca. 80 % eingesetzt. Da das L-Lysin durch Fermentation hergestellt wird, muß es zur Herstellung des Monohydrochlorids zunächst einmal von allen übrigen Bestandteilen der rohen Fermentationsbrühe in aufwendigen Verfahrensschritten abgetrennt, dann in das Monohydrochlorid umgewandelt und letzteres zur Kristallisation gebracht werden. Dabei fallen eine große Anzahl von Nebenprodukten und die zur Aufarbeitung notwendigen Reagentien als Abfall an. Da eine hohe Reinheit des Tierfuttermittelsupplements nicht immer notwendig ist und zudem in den Nebenprodukten der Fermentation oft noch nutritiv wirksame Wertstoffe enthalten sind, hat es daher in der Vergangenheit nicht an Versuchen gefehlt, die aufwendige Herstellung von Futter-Aminosäuren, insbesondere von reinem L-Lysin-Monohydrochlorid zu vermeiden und die rohe Fermentationsbrühe kostengünstiger in ein festes Tierfuttermittel zu überführen.
Als gravierender Nachteil hat sich die komplexe Zusammensetzung solcher Medien erwiesen, denn diese sind generell nur schlecht zu trocknen, dann hygroskopisch, praktisch nicht rieselfähig, verklumpungsgefährdet, und für die technisch anspruchsvolle Verarbeitung in Mischfutterwerken nicht geeignet. Dies trifft vor allem auf L-Lysin enthaltende Fermentationsprodukte zu. Die einfache Entwässerung der rohen Fermentationsbrühe durch Sprühtrocknung führte zu einem staubigen, stark hygroskopischen und nach kurzer Lagerzeit klumpigen Konzentrat, das in dieser Form nicht als Tierfuttermittel eingesetzt werden kann.
Die EP 0 533 039 betrifft Verfahren zur Herstellung eines Aminosäure-Tierfuttermittelsupplements auf Fermentationsbrühebasis, wobei das Supplement direkt durch Sprühtrocknung aus der Fermentationsbrühe gewonnen werden kann. Hierzu wird bei einer Variante ein Teil der Biomasse vor der Sprühtrocknung abgetrennt. Durch eine sehr saubere Führung der Fermentation, d. h. bei Erhalt einer an organischen Substanzen rückstandsarmen Fermentationsbrühe, kann die Brühe sogar ohne die Biomasse und ohne zusätzlichen Trägerhilfsstoff zu einem handhabbaren Granulat getrocknet werden.
Ca. 20 Gew.-% L-Lysin enthaltende feste Konzentrate sind aus der GB 1 439 121 bekannt, in der auch L-Lysin-haltige Fermentationsbrühen mit einem pH-Wert von 4,5 und einem Bisulfitgehalt beschrieben werden.
In der EP 0 615 693 wird ein Verfahren zur Herstellung eines Tierfuttermittel-Additives auf Fermentationsbrühe-Basis offenbart, bei dem man die Fermentationsbrühe, ggf. nach Entfernung eines Teils der Inhaltsstoffe, zu einem Feinkorn, das zu mind. 70 Gew.-% eine maximale Partikelgröße von 100 µm hat, sprühtrocknet, und dass man dieses Feinkorn in einer zweiten Stufe zu einem Granulat aufbaut, das zu mind. 30 Gew.-% das Feinkorn enthält.
Gemäß GB 1 439 728 wird ein L-Lysin enthaltendes Konzentrat aus einer Fermentationsbrühe hergestellt, die man vor der Aufkonzentration mit HCl auf einen pH von ca. 6,4 ansäuert und der man zur Stabilisierung Bisulfit zusetzt.
Nach der Eindampfung wird weiter auf einen pH-Wert von 4,0 angesäuert und das gewünschte Produkt durch Sprühtrocknung erhalten.
Die EP-A 1 331 220 (≅ US 2003/152633 ) betrifft granulierte Futtermitteladditive, die L-Lysin als Hauptkomponente enthalten.
Dort wurde gefunden, dass die Menge der Gegenionen für das Lysin wie z. B. die der Sulfationen verringert werden kann, indem man während der Fermentation entstehendes Kohlendioxid als Gegenion benutzt. Insgesamt wird ein Anionen/Lysin-Verhältnis von 0,68 bis 0,95 beansprucht.
Die Verringerung der Gegenionen wie z. B. Sulfat im L-Lysin enthaltenden Produkt soll zu einer Verbesserung der hygroskopischen Eigenschaften und der Verbackungsneigung führen.
Weiterhin wird ständig an der Verbesserung der Leistungseigenschaften der L-Lysin ausscheidenden coryneformen Bakterien gearbeitet, um kostengünstig L-Lysinhaltige Fermentationsbrühen herzustellen, aus denen die gewünschten L-Lysin-haltigen Produkte hergestellt werden können.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs mit verbesserten Eigenschaften unter Verwendung ausgewählter coryneformer Bakterien.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt

a) Fermentation eines isolierten L-Lysin produzierenden coryneformen Bakteriums, bevorzugt der Gattung Corynebacterium, ganz besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen für eine bestimmte Zeit, wobei man nach Abschluss der Fermentation,
b) gegebenenfalls das Sulfat/L-Lysin-Verhältnis bestimmt,
c) anschließend gegebenenfalls Ammoniumsulfat zusetzt,
d) den pH-Wert durch Zugabe von Schwefelsäure auf 4,9 bis 5,2 absenkt, wobei man durch die Zugabe der Sulfat-haltigen Verbindung(n) in den Schritten c) und d) ein Sulfat/L-Lysin-Verhältnis von 0,85 bis 1,2 in der Brühe einstellt,
e) das so erhaltene Gemisch aufkonzentriert, trocknet und dabei bevorzugt granuliert und ein Produkt mit einem L-Lysin-Gehalt von 10 bis 70 Gew.-% (bestimmt als Lysinbase, bezogen auf die Gesamtmenge) erhält, und
f) wobei das isolierte coryneforme Bakterium eine Nukleotidsequenz, bevorzugt im Chromosom, enthält, die für eine Lysin insensitive Aspartatkinase kodiert, und wobei das isolierte coryneforme Bakterium eine oder mehrere der Nukleotidsequenzen, bevorzugt im Chromosom, enthält, ausgewählt aus der Gruppe:
g) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 % identisch ist mit SEQ ID NO:6 und an Position 329 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Valin enthält,
h) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 % identisch ist mit SEQ ID NO:12 und an Position 321 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin und gegebenenfalls an Position 8 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin enthält,
i) Nukleotidsequenz, die für eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 %, identisch ist mit SEQ ID NO:18 und einen oder mehrere Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe: an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin und an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, enthält, und
j) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 %, identisch ist mit SEQ ID NO:24 und an Position 111 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin und gegebenenfalls an Position 201 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Alanin, enthält.

Die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kann ebenfalls als OpcA-Polypeptid, OpcA-Polypeptid der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase oder als OpcA-Polypeptid Untereinheit bezeichnet werden. In der EP 1 108 790 (siehe SEQ ID NO:1744 in Tabelle 1) wird das OpcA-Polypeptid auch als „glucose 6-phosphate dehydrogenase assembly Protein" bezeichnet.
Bei den isolierten coryneformen Bakterien handelt es sich bevorzugt um solche der Gattung Corynebacterium. Besonders bevorzugt sind Stämme, die auf folgenden Arten beruhen:
Corynebacterium efficiens, wie zum Beispiel der Stamm DSM44549,
Corynebacterium glutamicum, wie zum Beispiel der Stamm ATCC13032,
Corynebacterium thermoaminogenes wie zum Beispiel der Stamm FERN BP-1539, und
Corynebacterium ammoniagenes, wie zum Beispiel der Stamm ATCC6871,
wobei die Art Corynbacterium glutamicum ganz besonders bevorzugt wird.
Einige Vertreter der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik auch unter anderen Artbezeichnungen bekannt. Hierzu gehören beispielsweise:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium lilium DSM20137
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983), Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991) und in der US-A-5,250,434 .
Stämme mit der Bezeichnung „ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „DSM" können von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERN" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (RIST, Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Der genannte Stamm von Corynebacterium thermoaminogenes (FERN BP-1539) ist in der US-A 5,250,434 beschrieben. Stämme mit der Bezeichnung „NRRL" können von der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS, Peoria, Illinois, US) bezogen werden.
Das Chromosom von Corynebacterium glutamicum wurde vor einiger Zeit vollständig sequenziert (Kalinowski et al., Journal of Biotechnology 104, 5-25 (2003)). Das Chromosom von Corynebacterium efficiens wurde ebenfalls bereits sequenziert (Nishio et al., Genome Res. 13 (7), 1572-1579 (2003)).
Entsprechende Sequenzangaben können den öffentlichen Datenbanken entnommen werden. Geeignete Datenbanken sind beispielsweise die Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK), die Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA), die des Swiss Institute of Bioinformatics (Swissprot, Genève, Switzerland), die Protein Information Resource Database (PIR, Washington, DC, USA) und die DNA Data Bank of Japan (DDBJ, 1111 Yata, Mishima, 411-8540, Japan).
Zusammenfassende Darstellungen zur Genetik, zum Stoffwechsel und zur technischen Bedeutung von Corynebacterium findet man in den Aufsätzen von Ikeda, von Pfefferle et al. und von Mueller und Huebner im Buch „Microbial Production of L-Amino Acids" (Advances in Biochemical Engineering 79, (2003), Springer Verlag, Berlin, Deutschland, Herausgeber: T. Scheper), in der Spezialausgabe „A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" des Journal of Biotechnology (Band 104 (1-3), 2003, Herausgeber: A. Pühler und T. Tauch) und im „Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Herausgeber: L. Eggeling und M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA, 2005).
Mit dem Begriff „isoliertes coryneformes Bakterium" sind durch klassische Mutageneseverfahren erzeugte Mutanten, durch Rekombinationstechniken hergestellte Bakterien und solche Bakterien gemeint, zu deren Herstellung beide Verfahren eingesetzt wurden.
Unter proteinogenen Aminosäuren versteht man die Aminosäuren in der L-Form, die in natürlichen Proteinen, das heißt in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen vorkommen.
Hierzu gehören insbesondere L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Prolin und L-Arginin und deren Salze.
Die Begriffe Protein und Polypeptid sind gegenseitig austauschbar.
Unter einer Lysin insensitive Aspartatkinase versteht man ein Polypeptid bzw. Protein mit Aspartatkinase-Aktivität (EC Nr 2.7.2.4), die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch Mischungen von Lysin und Threonin oder Mischungen von AEC (Aminoethylcystein) und Threonin oder Lysin allein oder AEC allein aufweisen. Derartige Aspartatkinasen werden auch als „feed back" resistente beziehungsweise desensibilisierte Aspartatkinasen bezeichnet. Die für diese desensibilisierten Aspartatkinasen bzw. Aspartatkinasevarianten kodierenden Nukleotidsequenzen werden auch als lysC^FBR-Allele bezeichnet. Informationen zu zahlreichen lysC^FBR-Allelen sind in den öffentlichen Datenbanken verfügbar.
Die Kodierregion des Wildtyp lysC-Gens von Corynebacterium glutamicum entsprechend der Zugangsnummer AX756575 der NCBI Datenbank ist in SEQ ID NO:1 und das von diesem Gen kodierte Polypeptid in SEQ ID NO:2 dargestellt. In der SEQ ID NO:3 sind außerdem die stromaufwärts des 5'-Endes und stromabwärts des 3'-Endes der Kodierregion gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:4 entspricht SEQ ID NO:2.
Die für die Massnahmen der Erfindung eingesetzten coryneformen Bakterien verfügen bevorzugt über ein lysC-Allel, das für eine Aspartatkinasevariante kodiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 besitzt, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe:
lysC A279T (Austausch von L-Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2 gegen L-Threonin; siehe US 5,688,671 und Zugangsnummern E06825, E06826, E08178 und I74588 bis I74597),
lysC A279V (Austausch von L-Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2 gegen L-Valin, siehe JP 6-261766 und Zugangsnummer E08179),
lysC L297Q (Austausch von L-Leucin an Position 297 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2 gegen L-Glutamin; siehe SEQ ID NO:31,
lysC S301F (Austausch von L-Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2 gegen L-Phenylalanin; siehe US 6,844,176 und Zugangsnummer E08180),
lysC S301Y (Austausch von L-Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2 gegen L-Tyrosin, siehe Kalinowski et al. (Molecular and General Genetics 224, 317-324 (1990)) und Zugangsnummer X57226),
lysC T308I (Austausch von L-Threonin an Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Isoleucin; siehe JP 6-261766 und Zugangsnummer E08181)
lysC T311I (Austausch von L-Threonin an Position 311 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2 gegen L-Isoleucin; siehe WO 00/63388 und US 6,893,848 ),
lysC S317A (Austausch von L-Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2 gegen L-Alanin; siehe US 5,688,671 und Zugangsnummer I74589),
lysC R320G (Austausch von L-Arginin an Position 320 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2 gegen Glycin; siehe Jetten et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) und Zugangsnummer L27125),
lysC G345D (Austausch von Glycin an Position 345 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2 gegen L-Asparaginsäure; siehe Jetten et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) und Zugangsnummer L16848),
lysC T380I (Austausch von L-Threonin an Position 380 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2 gegen L-Isoleucin; siehe WO 01/49854 und Zugangsnummer AX192358), und
lysC S381F (Austausch von L-Serin an Position 381 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2 gegen L-Phenylalanin; siehe EP 0435132 )
umfasst.
Es ist bekannt, dass konservative Aminosäureaustausche die Enzymaktivität nur unwesentlich verändern. Dementsprechend kann die in den verwendeten isolierten coryneformen Bakterien enthaltene Aspartatkinasevariante, zusätzlich zu den angegebenen Aminosäureseaustauschen einen (1) oder mehrere konservative Aminosäureaustausch(e) enthalten. Bevorzugt enthält das Polypeptid höchstens zwei (2), höchstens drei (3), höchstens vier (4) oder höchstens fünf (5) konservative Aminosäureaustausche.
Bei den aromatischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den hydrophoben Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Leucin, Isoleucin und Valin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den polaren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Glutamin und Asparagin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den basischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Arginin, Lysin und Histidin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den sauren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Asparaginsäure und Glutaminsäure gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Serin und Threonin gegeneinander ausgetauscht werden.
Durch die genannten konservativen Aminosäureaustausche wird die enzymatische Aktivität der genannten Aspartatkinasevarianten im wesentlichen nicht berührt. „Im wesentlichen nicht berührt" bedeutet, dass sich die enzymatische Aktivität der genannten Aspartatkinasevarianten durch den konservativen Aminosäureaustausch um maximal 10 %, maximal 7,5 %, maximal 5 %, maximal 2,5 % oder maximal 1 % erhöht oder verringert.
Stämme, welche die für die Massnahmen der Erfindung bevorzugten Aspartatkinasevarianten enthalten, können

a) von den öffentlich zugänglichen Stammsammlungen bezogen werden, oder
b) durch Rekombinationstechniken ausgehend von den Nukleotidsequenzen bekannter Aspartatkinase-Allele erzeugt werden, oder
c) durch in-vitro Mutagenesetechniken oder durch chemische Synthese gefolgt von Rekombinationstechniken erzeugt werden, oder
d) durch klassische Mutageneseverfahren, gegebenenfalls gefolgt von Selektion auf AEC haltigen Agarplatten und Sequenzierung des lysC Gens erhalten und identifiziert werden.

Ausführungen zu a):
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die die Aminosäureaustausche lysC A279T und lysC S381F in der Aspartatkinase enthält, ist beispielsweise unter der Bezeichnung NRRL B-11474 ( US 4,275,157 ) bei der ARS Patent Culture Collection hinterlegt.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch lysC A279T in der Aspartatkinase enthält, ist beispielsweise unter der Bezeichnung FERN P-1987 ( US 5,688,671 ) beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology hinterlegt.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die die Aminosäureaustausche lysC S301Y in der Aspartatkinase enthält, ist in der EP 0387527 mit der Bezeichnung DM58-1 beschrieben und in Form des Stammes DM58-1/pDM6 als DSM4697 ( EP 0358940 ) bei der DSM hinterlegt.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch lysC T311I in der Aspartatkinase enthält, ist in der PCT/EP2005/012417 beschrieben und als DSM 16833 bei der DSM hinterlegt.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch lysC S317A in der Aspartatkinase enthält, ist beispielsweise unter der Bezeichnung FERM P- 6464 ( JP 58-170487 ) beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology hinterlegt.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch lysC T380I in der Aspartatkinase enthält, ist beispielsweise unter der Bezeichnung ATCC21529 bei der ATCC hinterlegt.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch lysC S381F in der Aspartatkinase enthält ist unter der Bezeichnung MH20-22B (Menkel et al. Applied and Environmental Microbiology 55, 684-688 (1989))) bekannt. Dieser Stamm ist unter der Bezeichnung DSM 16835 bei der DSMZ hinterlegt.
Ausführungen zu b):
Rekombinationstechniken zum Einbau von identifizierten Mutationen in das Chromosom coryneformer Bakterien sind unter dem Begriff „Allel-Austausch" (gene replacement) bekannt.
Angaben zu Nukleotidsequenzen von lysC^FBR-Allelen können den angegebenen Veröffentlichungen und den in öffentlichen Datenbanken zugänglichen Sequenzangaben entnommen werden.
Bei dem Verfahren des Allelaustausches wird ein DNA-Fragment, welches die interessierende Mutation enthält, in den gewünschten Stamm eines coryneformen Bakteriums überführt und die Mutation durch wenigstens zwei Rekombinationsereignisse beziehungsweise „cross over"-Ereignisse in das Chromosom des gewünschten Stammes inkorporiert, beziehungsweise die im betreffenden Stamm vorhandene Sequenz eines Gens gegen die mutierte Sequenz ausgetauscht.
Die gewünschten Allele können aus den hinterlegten Stämmen mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion oder direkt aus hinterlegter Plasmid DNA gewonnen werden. So ist DNA des lysC^FBR-Allels, das für die Aspartatkinasevariante mit dem Aminosäureaustausch lysC T311I kodiert in Form des Stammes FERM BP-6689 ( US 6,893,848 ) verfügbar.
Dieses Verfahren ist unter anderem bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), bei Schäfer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)), in der EP 1108790 , WO 02/070685 und WO 03/014362 beschrieben. In der US 6,844,176 ist der Einbau von lysC S301F in Corynebacteriun glutamicum DM1636 beschrieben.
Der erfolgte Einbau der erwünschten Mutation bzw. Nukleotidabfolge kann durch Sequenzierung oder auch mit Hilfe der „Fluorescence Ressonance Energy Transfer"-Methode (FREI) durch Schmelzkurvenanalyse (Lay et al., Clinical Chemistry, 43:2262-2267 (1997)) nachgewiesen werden.
Ausführungen zu c):
Da die Nukleotidsequenz des Wildtyps coryneformer Bakterien bekannt ist und die DNA der Bakterien einfach zu isolieren ist, können auch in-vitro Methoden zur Herstellung der gewünschten lysC^FBR-Allele verwendet werden. Hierzu können beispielsweise mutagene Oligonukleotide (T.A. Brown: Gentechnologie fuer Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) oder die Methode von Papworth et al. (Strategies 9(3), 3-4 (1996)) unter Verwendung des "Quik Change Site-directed Mutagenesis Kit" von Stratagene (La Jolla, California, USA) eingesetzt werden.
Weiterhin kann die DNA der gewünschten lysC^FBR-Allele durch chemische Synthese, beispielsweise mit der Phoshoramidit-Methode (Beaucage et al., Tetrahedon Letters 22, 1859-1862 (1981) hergestellt werden.
Die erhaltenen Allele können wiederum durch das oben beschrieben Verfahren des Allelaustauschs in das Chromosom coryneformer Bakterien eingebaut werden.
Ausführungen zu d):
Zur Herstellung von Mutanten können klassische in-vivo Mutageneseverfahren mit Zellpopulationen coryneformer Bakterien unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG), Ethylmethansulfonat (EMS), 5-Bromuracil oder ultraviolettes Licht verwendet werden. Mutagenesemethoden sind beispielsweise im Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) oder bei Tosaka et al. (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978)) oder bei Konicek et al (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)) beschrieben. Typische Mutagenesen unter Verwendung von MNNG umfassen Konzentrationen von 50 bis 500 mg/l oder auch höhere Konzentrationen bis zu maximal 1 g/l, eine Inkubationszeit von 1 bis 30 Minuten bei einem pH von 5,5 bis 7,5. Unter diesen Bedingungen wird die Zahl der lebensfähigen Zellen um einen Anteil von ca. 50 % bis 90 % oder ca. 50 % bis 99 % oder ca. 50 % bis 99,9 % oder mehr reduziert.
Zur Identifizierung von Stämmen, welche die gewünschte Aspartatkinase-Variante enthalten, werden der mutagenisierten Zellpopulation Mutanten entnommen. Anschließend wird das lysC-Gen der Mutanten mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, die Nukleotidsequenz des lysC-Gens dieser Mutanten bestimmt und aus der erhaltenen Nukleotidsequenz die Aminosäuresequenz der kodierten Aspartatkinasevariante bestimmt.
Für die Polymerase-Kettenreaktion werden vorteilhafterweise Primer ausgewählt, die an den stromaufwärts des lysC-Gens gelegenen DNA-Abschnitt und an den stromabwärts des komplementären Stranges des lysC-Gens gelegenen DNA-Abschnitts binden (siehe SEQ ID NO:3). Gegebenenfalls können auch Primer ausgewählt werden, die innerhalb der Kodierregion des lysC-Gens binden.
Gegebenenfalls wird die mutagenisierte Zellpopulation vorher einer Selektion auf Minimalagar unterworfen, der mit AEC oder Mischungen von AEC und L-Threonin supplementiert worden ist. Bei dieser Vorgehensweise werden die entsprechenden gegenüber AEC resistenten Stämme für das weitere Auswahlverfahren verwendet. Weiterhin kann die Aktivität der Aspartatkinase charakterisiert werden. Es ist außerdem möglich, die Stämme durch Fermentation in einem geeignetem Medium zu charakterisieren. Anleitungen hierzu finden sich beispielsweise in der US 6,893,848 . Bei Verwendungen von geeigneten Roboteranlagen, wie beispielsweise bei Zimmermann et al. (VDI Berichte Nr. 1841, VDI-Verlag, Düsseldorf, Deutschland 2004, 439-443) oder Zimmermann (Chemie Ingenenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005)) beschrieben, können zahlreiche Mutanten in kurzer Zeit untersucht werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden ganz besonders isolierte coryneforme Bakterien bevorzugt, deren Aspartatkinasevarianten einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe lysC A279T, lysC L297Q, lysC S317A, lysC T380I und lysC S381F enthalten.
In der SEQ ID NO:31 ist die Kodierregion eines lysC-Allels beschrieben, das für eine Aspartatkinasevariante kodiert, die an Position 279 L-Threonin (lysC A279T) und an Position 317 L-Alanin (lysC S317A) enthält. SEQ ID NO:32 zeigt die Aminosäuresequenz des Polypeptids.
In der SEQ ID NO:33 ist die Kodierregion eines lysC-Allels beschrieben, das für eine Aspartatkinasevariante kodiert, die an Position 297 L-Glutamin (lysC L297Q) und an Position 317 L-Alanin (lysC S317A) enthält. SEQ ID NO:34 zeigt die Aminosäuresequenz des Polypeptids.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein isoliertes Polynukleotid, das für eine Aspartatkinasevariante kodiert, die an Position 297 von SEQ ID NO:2 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Leucin, bevorzugt L-Glutamin und gegebenenfalls einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe lysC A279T, lysC A279V, lysC S301F, lysC S301Y, lysC T308I, lysC T311I, lysC S317A, lysC R320G, lysC G345D, lysC T380I, lysC S381F, und lysC S317A enthält. Gegenstand der Erfindung sind auch Vektoren die das Polynukleotid enthalten. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin coryneforme Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum die das Polynukleotid enthalten und in denen es gegebenenfalls überexprimiert ist. Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Lysin enthaltenen Futtermitteladditiven durch Fermentation der genannten Bakterien in einem geeignetem Nährmedium wobei sich in den Zellen der Bakterien oder im Nährmedium L-Lysin akkumuliert. Das gebildete L-Lysin wird anschließend gesammelt und gegebenenfalls isoliert oder zusammen mit dem grössten Teil (> 50 %) der Biomasse durch Wasserentzug zu einem festen Produkt weiterverarbeitet.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten isolierten coryneformen Bakterien enthalten darüber hinaus eine oder mehrere, bevorzugt mindestens zwei, besonders bevorzugt mindestens drei und ganz besonders bevorzugt vier der Nukleotidsequenzen, ausgewählt aus der Gruppe:

1. Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 %, bevorzugt zu ≥ 97 %, ≥ 98 % oder ≥ 99 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist mit SEQ ID NO:6 und an Position 329 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Valin, bevorzugt L-Methionin, enthält;
2. Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 %, bevorzugt zu 97 %, ≥ 98 % oder ≥ 99 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist mit SEQ ID NO:12 und an Position 321 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin, bevorzugt L-Serin und gegebenenfalls an Position 8 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin, bevorzugt L-Threonin enthält;
3. Nukleotidsequenz, die für eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 %, bevorzugt zu 97 %, ≥ 98 % oder ≥ 99 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist mit SEQ ID NO:18 und einen oder mehrere Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe: a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin, c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin enthält; und
4. Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 %, bevorzugt zu 97 %, ≥ 98 % oder ≥ 99 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist mit SEQ ID NO:24 und an Position 111 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin, bevorzugt L-Phenylalanin oder L-Alanin, und gegebenenfalls an Position 201 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Alanin, bevorzugt L-Serin, enthält.

Insbesondere ist die Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Aktivität kodiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:6 besitzt, wobei diese an Position 329 L-Methionin anstelle L-Valin enthält, zu ≥ 90 % oder ≥ 95 %, bevorzugt zu ≥ 97 % oder ≥ 98 % identisch mit SEQ ID NO:5. In SEQ ID NO:9 ist ein Beispiel für eine derartige Nukleotidsequenz dargestellt.
Insbesondere ist die Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:12 besitzt, wobei diese an Position 321 L-Serin anstelle Glycin und gegebenenfalls an Position 8 L-Threonin anstelle L-Serin enthält, zu ≥ 90 % oder ≥ 95 %, bevorzugt zu ≥ 97 % oder ≥ 98 % identisch mit SEQ ID NO:11. In SEQ ID NO:15 ist ein Beispiel für eine derartige Nukleotidsequenz dargestellt.
Insbesondere ist die Nukleotidsequenz, die für eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:18 besitzt, wobei diese einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe an Position 107 L-Histidin anstelle L-Tyrosin, an Position 219 L-Asparagin anstelle L-Lysin, an Position 233 L-Serin anstelle L-Prolin und an Position 261 L-Histidin anstelle L-Tyrosin enthält, zu 90 % oder ≥ 95 %, bevorzugt zu ≥ 97 % oder ≥ 98 % identisch ist mit SEQ ID NO:17. In SEQ ID NO:21 ist ein Beispiel für eine derartige Nukleotidsequenz dargestellt.
Insbesondere ist die Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität kodiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:24 besitzt, wobei diese an Position 111 L-Phenylalanin oder L-Alanin anstelle L-Serin und gegebenenfalls an Position 201 L-Alanin anstelle L-Serin enthält, zu ≥ 90 % oder ≥ 95 %, bevorzugt zu ≥ 97 % oder ≥ 98 % identisch mit SEQ ID NO:23.
In SEQ ID NO:27 und 29 sind Beispiele für derartige Nukleotidsequenzen dargestellt.
Isolierte coryneforme Bakterien, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die für ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, welches den angegebenen Aminosäureaustausch an Position 329 besitzt, sind in der PCT/EP2005/012417 beschrieben. In dieser Patentanmeldung wird die Mutante DSM16834 beschrieben, welche eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Variante kodiert, welche an der Position 329 anstelle L-Valin die Aminosäure L-Methionin enthält. Dieser Aminosäureaustausch wird auch als gnd V329M bezeichnet.
In SEQ ID NO:5 ist die Kodierregion des 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Gens des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum dargestellt. Das 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Gen wird allgemein auch als gnd-Gen bezeichnet. In SEQ ID NO:6 ist die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids wiedergegeben. In SEQ ID NO:7 sind zusätzlich zur Kodierregion die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:8 ist identisch mit SEQ ID NO:6. In SEQ ID NO:9 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des in der Mutante DSM16834 vorhandenen gnd-Allels wiedergegeben. In SEQ ID NO:10 ist die Aminosäuresequenz der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Variante angegeben.
Isolierte coryneforme Bakterien, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches den angegebenen Aminosäureaustausch an Position 321 und gegebenenfalls den an Position 8 enthält, sind in der PCT/EP2006/060851 beschrieben. In dieser Patentanmeldung wird die Mutante DSM17119 beschrieben, welche eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Variante kodiert, welche an der Position 321 anstelle Glycin die Aminosäure L-Serin und gegebenenfalls an Position 8 anstelle L-Threonin die Aminosäure L-Serin enthält. Der Aminosäureaustausch an Position 321 wird auch als zwf G321S und der an Position 8 als zwf S8T bezeichnet.
In SEQ ID NO:11 ist die Kodierregion des Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Gens des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum dargestellt. Das Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Gen wird allgemein auch als zwf-Gen bezeichnet. In SEQ ID NO:12 ist die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids wiedergegeben. In SEQ ID NO:13 sind zusätzlich zur Kodierregion die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:14 ist identisch mit SEQ ID NO:12. In SEQ ID NO:15 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des in der Mutante DSM17119 vorhandenen zwf-Allels wiedergegeben. In SEQ ID NO:16 ist die Aminosäuresequenz der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Variante angegeben.
Isolierte coryneforme Bakterien, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die für eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche die angegebenen Aminosäureaustausche an einer oder mehrerer der Positionen 107, 219, 233 und 261 der Aminosäuresequenz besitzt, sind in der DE 10 2005 023 829 beschrieben. In dieser Patentanmeldung wird die Mutante DSM 17223 beschrieben, die für ein OpcA-Polypeptid kodiert welche an Position 107 L-Histidin anstelle L-Tyrosin, an Position 219 L-Asparagin anstelle L-Lysin, an Position 233 L-Serin anstelle L-Prolin und an Position 261 L-Histidin anstelle L-Tyrosin enthält. Diese Aminosäureaustausche werden auch als opcA Y107H, opcA K219N, opcA P233S und opcA Y261H bezeichnet.
In SEQ ID NO:17 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des OpcA-Polypeptids des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum dargestellt. Das Gen das für das OpcA-Polypeptid kodiert wird allgemein auch als opcA-Gen bezeichnet. In SEQ ID NO:18 ist die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids wiedergegeben. In SEQ ID NO:19 sind zusätzlich zur Kodierregion die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:20 ist identisch mit SEQ ID NO:18. In SEQ ID NO:21 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des in der Mutante DSM17223 vorhandenen opcA-Allels wiedergegeben. In SEQ ID NO:22 ist die Aminosäuresequenz der OpcA Variante angegeben.
Isolierte coryneforme Bakterien, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die für ein Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität kodiert, welches die angegebenen Aminosäureaustausche an Position 111 und gegebenenfalls den an Position 201 besitzt, sind in der PCT/EP2005/057216 beschrieben. In dieser Patentanmeldung wird die Mutante DSM 16937 beschrieben, welche eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Malat-Chinon-Oxidoreduktase Variante kodiert, welche an Position 111 anstelle L-Serin die Aminosäure L-Penylalanin enthält. Dieser Aminosäureaustausch wird auch als mqo S111F bezeichnet. In der PCT/EP2005/057216 wird außerdem eine Mutante beschrieben, welche eine Nukleotidsquenz enthält, die für eine Malat-Chinon-Oxidoreduktase Variante kodiert, welche an Position 111 anstelle L-Serin die Aminosäure L-Alanin und an Position 201 anstelle L-Alanin die Aminosäure L-Serin enthält. Diese Aminosäureaustausche werden auch als mqo S111A und mqo A201S bezeichnet.
In SEQ ID NO:23 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion der Malat-Chinon-Oxidoreduktase des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum dargestellt. Das Gen, das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodiert wird allgemein auch als mqo-Gen bezeichnet. In SEQ ID NO:24 ist die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids wiedergegeben. In SEQ ID NO:25 sind zusätzlich zur Kodierregion die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:26 ist identisch mit SEQ ID NO:24. In SEQ ID NO:27 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des in der Mutante DSM 16937 vorhandenen mqo-Allels wiedergegeben. In SEQ ID NO:28 ist die Aminosäuresequenz der Malat-Chinon-Oxidoreduktase Variante wiedergegeben. In der SEQ ID NO:29 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des mqo-Allels einer Mutante beschrieben, die die Aminosäureaustausche mqo S111A und mqo A201S enthält. In der SEQ ID NO:30 ist die Aminosäuresequenz dieser Malat-Chinon-Oxidoreduktase Variante wiedergegeben.
Zur Herstellung der isolierten coryneformen Bakterien, welche eine oder mehrere der angegebenen Aminosäureaustausche in der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase, der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, dem OpcA-Polypeptid und der Malat-Chinon-Oxidoreduktase enthalten, können die angegebenen klassischen Mutageneseverfahren und die angegebenen in vitro Mutageneseverfahren und Allelaustauschverfahren eingesetzt werden. Gegebenenfalls werden die Methoden miteinander kombiniert. Zur Identifizierung der Mutationen werden die Polynukleotidsequenzen der entsprechenden Gene beziehungsweise Allele mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion, vorzugsweise unter Verwendung von Primern, die an die stromaufwärts und stromabwärts der betreffenden Gene liegenden Polynukleotidsequenzen binden, amplifiziert und die erhaltenen PCR-Produkte anschließend sequenziert.
Für ein erfindungsgemäßes Verfahren können unter anderem beispielsweise folgende isolierte coryneforme Bakterien eingesetzt werden:
Die Mutante DM1910, die unter der Bezeichnung DSM 18255 bei der DSMZ hinterlegt wurde.
Die Mutante DM1910 wurde durch zwei Runden von Mutagenese und Screening ausgehend von Corynebacterium glutamicum NRRL B-11474 hergestellt. Der Stamm DM1910 enthält neben den die Apartatkinase betreffenden Mutationen lysC A279T und lysC S381F ein gnd-Allel, das für eine 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, die den Aminosäureaustausch gnd V329M enthält und ein zwf-Allel, das für eine Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase kodiert, die den Aminosäureaustausch zwf G321S enthält.
Ausgehend von der Mutante DM1910 wurde durch das Verfahren des Allelaustausches unter Verwendung des in der US Patentanmeldung 60/710314 beschriebenen Austauschvektors pK18mobsacB opcAaa4ex der Stamm DM1917 hergestellt. Dieser Stamm enthält ein opcA-Allel, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das die Aminosäureaustausche opcA Y107H, opcA K219N, opcA P233S und opcA Y261H enthält.
Die Mutante DM1913, die unter der Bezeichnung DSM 18256 bei der DSMZ hinterlegt wurde.
Die Mutante DM1913 wurde ausgehend von ATCC14067 durch mehrere Runden Mutagenese, Screening und Analyse ausgewählter Gene isoliert. Sie enthält ein gnd-Allel, das für eine 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, die den Aminosäureaustausch gnd V329M enthält, ein zwf-Allel, das für eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, die den Aminosäureaustausch zwf G321S enthält, ein opcA-Allel, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das die Aminosäureaustausche opcA Y107H und opcA K219N enthält, ein mqo-Allel, das für eine Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodiert, die die Aminosäureaustausche mqo S111A und mqo A201S enthält und ein lysC-Allel, das für eine Aspartatkinase kodiert, die den Aminosäureaustausch lysC S317A enthält.
Ausgehend von diesem Stamm wurde durch das Verfahren des Allelaustauschs ein Stamm hergestellt, dessen Aspartatkinase zusätzlich zum Aminosäureaustausch lysC S317A den Aminosäureaustausch lysC T279A enthält. Dieser Stamm wurde als DM1918 bezeichnet.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren können auch coryneforme Bakterien verwendet werden, in denen die genannten Varianten der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, der OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase einzeln, oder in Kombination miteinander überexprimiert vorliegen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren kann es außerdem vorteilhaft sein verschiedene Enzyme der Lysinbiosynthese ausgehend von L-Asparaginsäure zu überexprimieren. Hierzu können die im Stand der Technik bekannten Gene von Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Streptomyces coeliclor, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, Bifidobacterium longum, und Saccharomyces cerevisiae verwendet werden. Vorzugsweise werden die endogenen Gene beziehungsweise Polynukleotide coryneformer Bakterien verwendet.
Unter endogenen Genen beziehungsweise Polynukleotiden versteht man die in der Population einer Art wie zum Beispiel Corynebacterium glutamicum vorhandenen offenen Leserahmen (ORF), Gene oder Allele beziehungsweise deren Polynukleotide.
Unter Überexpression versteht man allgemein eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration oder Aktivität einer Ribonukleinsäure, eines Proteins oder eines Enzyms.
Die Erhöhung der Konzentration oder Aktivität lässt sich beispielsweise dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der entsprechenden Polynukleotide chromosomal oder extrachromosomal um mindestens eine Kopie erhöht.
Eine weit verbreitete Methode zur Erhöhung der Kopienzahl besteht darin, dass man das entsprechende Polynukleotid in einen Vektor, bevorzugt ein Plasmid, einbaut, der von einem coryneformen Bakterium repliziert wird. Geeignete Plasmidvektoren sind beispielsweise pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64:549-554) oder die von Tauch et al. (Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)) beschriebenen pSELF-Vektoren. Ein Übersichtsartikel zum Thema Plasmide in Corynebacterium glutamicum findet sich bei Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).
Weiterhin kann man als Vektoren Transposons, Insertionselemente (IS-Elemente) oder Phagen einsetzen. Derartige genetische Systeme sind beispielsweise in den Patentschriften US 4,822,738 , US 5,804,414 und US 5,804414 . In gleicher Weise kann das in der WO 92/02627 beschriebene IS-Element ISaB1 oder das Transposon Tn 45 des Plasmids pXZ10142 (zitiert im „Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Herausgeber: L. Eggeling und M. Bott)) verwendet werden
Eine andere verbreitete Methode zur Erzielung einer Überexpression ist das Verfahren der chromosomalen Genamplifikation. Bei dieser Methode wird mindestens eine zusätzliche Kopie des interessierenden Polynukleotids in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums eingefügt. Derartige Amplifikationsverfahren sind beispielsweise in der WO 03/014330 oder WO 03/040373 beschrieben.
Eine weitere Methode zur Erzielung einer Überexpression besteht darin, das entsprechende Gen beziehungsweise Allel in funktioneller Weise (operably linked) mit einem Promotor beziehungsweise einer Expressionskassette zu verknüpfen. Geeignete Promotoren für Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise in dem Übersichtsartikel von Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003) beschrieben. Weiterhin können die hinlänglich bekannten von Amann et al. (Gene 69(2), 301-315 (1988)) und Amann und Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)) beschriebenen Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc verwendet werden. Ein derartiger Promotor kann beispielsweise stromaufwärts des betreffenden Gens, typischerweise im Abstand von ungefähr 1-500 vom Startkodon eingefügt werden.
Durch die Maßnahmen der Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Polypeptids im allgemeinen um mindestens 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % oder 500 %, maximal bis 1000 % oder 2000 % bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Polypeptids im Stamm vor der zur Überexpression führenden Massnahme, erhöht.
Vorzugsweise wird/werden ein oder mehrere der Gene beziehungsweise Allele ausgewählt aus der Gruppe

a) ein für eine L-Lysin insensitive Aspartatkinase kodierendes lysC^FBR-Allel,
b) ein für eine Aspartatsemialdehyd Dehydrogenase kodierendes asd-Gen,
c) ein für eine Dihydrodipicolinat Synthase kodierendes dapA-Gen ( EP 0 197 335 )
d) ein für eine Dihydrodipicolinat Reduktase kodierendes dapB-Gen,
e) ein für eine Tetrahydrodipicolinat Succinylase kodierendes dapD-Gen,
f) ein für eine Succinylaminopimelat Transaminase kodierendes dapC-Gen,
g) ein für eine Succinylaminosuccinylase kodierendes dapE-Gen,
h) ein für eine Diaminopimelate Epimerase kodierendes dapF-Gen ( US 6,670,156 ),
i) ein für eine Diaminopimelat Dehydrogenase kodierendes ddh-Gen ( US 6,090,597 )
j) ein für eine Diaminopimelat Decarboxylase kodierendes lysA-Gen ( US 4,861,722 ; US 6,090,597 ), und
k) ein für eine Lysin-Permease kodierendes lysE-Gen ( US 6,858,406 ).

Ganz besonders bevorzugt wird die gemeinsame Überexpression zweier oder mehrerer der Gene ausgewählt aus der Gruppe lysC^FBR-Allel, dapA-Gen, dapB-Gen, ddh-Gen und lysA-Gen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren kann es außerdem vorteilhaft sein verschiedene Enzyme der Glykolyse und des Citronensäurezyklus oder der L-Threonin-Biosynthese abzuschwächen oder coryneforme Bakterien zu verwenden in denen diese abgeschwächt vorliegen.
Der Begriff „Abschwächung" bzw. „Abschwächen" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym bzw. Protein inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der Genprodukte herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls werden beide Maßnahmen kombiniert.
Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246 , bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170:5949-5952 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26:3584-3590 (1998), bei Pátek et al. (Microbiology 142:1297-309 (1996) und Journal of Biotechnology 104:311-323 (2003)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
Ein Beispiel für die gezielte Regulation der Genexpression ist die Klonierung des abzuschwächenden Gens unter die Kontrolle eines durch Zugabe dosierter Mengen von IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induzierbaren Promotors wie zum Beispiel des trc-Promotors oder des tac-Promotors. Hierzu eignen sich Vektoren wie beispielsweise der Escherichia coli Expressionsvektor pXK99E ( WO 0226787 ; hinterlegt gemäß Budapester Vertrag am 31. Juli 2001 in DH5alpha/pXK99E als DSM14440 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)) oder pVWEx2 (Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Deutschland (1997)), die eine IPTGabhängige Expression des klonierten Gens in Corynebacterium glutamicum ermöglichen.
Eingesetzt wurde diese Methode beispielsweise in der Patentschrift WO 0226787 zur regulierten Expression des deaD-Gens durch Integration des Vektors pXK99EdeaD in das Genom von Corynebacterium glutamicum und von Simic et al. (Applied and Environmental Microbiology 68:3321-3327 (2002)) zur regulierten Expression des glyA-Gens durch Integration des Vektors pK18mobglyA' in Corynebacterium glutamicum.
Eine weitere Methode zur spezifischen Verringerung der Genexpression ist die Antisense-Technik, wobei kurze Oligodesoxnyukleotide oder Vektoren zur Synthese längerer Antisense-RNA in die Zielzellen gebracht werden. Die Antisense-RNA kann dort an komplementäre Abschnitte spezifischer mRNAs binden und deren Stabilität verringern oder die Translatierbarkeit blocken. Ein Beispiel hierzu findet der Fachmann bei Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10):4366-4371).
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61:1760-1762 (1997)) und Möckel („Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen von mindestens einem (1) Basenpaar bzw. Nukleotid in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des durch die Mutation hervorgerufenen Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense mutations") oder Nichtsinnmutationen („nonsense mutations") gesprochen. Die Fehlsinnmutation führt zu einem Austausch einer gegebenen Aminosäure in einem Protein gegen eine andere, wobei es sich insbesondere um einen nicht-konservative Aminosäureaustausch handelt. Hierdurch wird die Funktionsfähigkeit bzw. Aktivität des Proteins beeinträchtigt und auf einen Wert von ≥ 0 bis 75 %, ≥ 0 bis 50 %, ≥ 0 bis 25 %, ≥ 0 bis 10 % oder ≥ 0 bis 5 % reduziert. Die Nichtsinnmutation führt zu einem Stop-Kodon im Kodierbereich des Gens und damit zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), die dazu führen, dass falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als Folge der Mutation ein Stop-Kodon im Kodierbereich, so führt dies ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation.
Deletionen von mindestens einem (1) oder mehreren Kodonen führen typischerweise ebenfalls zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Polypeptids im allgemeinen auf 0 bis 75 %, 0 bis 50 %, 0 bis 25 %, 0 bis 10 %, 0 bis 5 % oder 0 bis 1 % der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt. Unter einem „Ausgangsmikroorganismus" versteht man den Mikroorganismus, an dem die Massnahmen der Abschwächung durchgeführt werden.
Vorzugsweise wird/werden ein oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

a) ein für eine Pyruvatkinase kodierendes pyk-Gen,
b) eines oder beide der für die Untereinheiten der Pyruvat-Dehydrogenase kodierenden Gene aceE und aceF ( DE 10 2005 045 301 ),
c) ein für die Citratsynthase kodierendes gltA-Gen,
d) ein für die Homoserin-Dehydrogenase kodierendes hom-Gen,
e) ein für die Homoserin-Kinase kodierendes thrB-Gen,
f) ein für die Threonin-Synthase kodierendes thrC-Gen,
g) ein für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierendes pck-Gen ( US 6,872,553 ),
h) ein für die Pyruvat-Oxidase (= Pyruvat-Chinon Oxidoreduktase) kodierendes poxB-Gen ( EP 1 096 013 ), und
i) ein für das malic enzyme (EC 1.1.1.40) kodierendes mez-Gen (= malE-Gen) ( EP 1 367 130 ) abgeschwächt.

Die Fermentation der coryneformen Bakterien, kann kontinuierlich – wie beispielsweise in der PCT/EP 2004/008882 beschrieben – oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Lysin durchgeführt werden. Eine Zusammenfassung allgemeiner Art über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) verfügbar.
Das zu verwendende Kulturmedium beziehungsweise Fermentationsmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology„ der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Die Begriffe Kulturmedium und Fermentationsmedium beziehungsweise Medium sind gegenseitig austauschbar.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Saccharose-haltige Lösungen aus der Zuckerrüben- oder Zuckerrohrherstellung, Stärke, Stärkehydrolysat und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin, Methanol und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, bevorzugt Ammoniak oder Ammoniumsulfat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze beispielsweise in Form von Sulfaten von Metallen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und Eisen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren beispielsweise Homoserin und Vitamine beispielsweise Thiamin, Biotin oder Pantothensäure zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen der jeweiligen Aminosäure zugesetzt werden.
Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur PH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser bevorzugt Ammoniak oder Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Der pH wird im Allgemeinen auf einen Wert von 6,0 bis 9,0 vorzugsweise 6,5 bis 8 eingestellt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium gegebenenfalls geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Verwendung von Flüssigkeiten, die mit Wasserstoffperoxid angereichert sind, ist ebenfalls möglich. Gegebenenfalls wird die Fermentation bei Überdruck, beispielsweise bei einem Druck von 0,03 bis 0,2 MPa, gefahren. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20 °C bis 45 °C und vorzugsweise bei 25 °C bis 40 °C. Bei batch-Verfahren wird die Kultivierung solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum der gewünschten Aminosäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere Kultivierungszeiten möglich.
Beispiele für geeignete Fermentationsmedien finden sich unter anderem in den Patentschriften US 5,770,409 , US 5,840,551 und US 5,990,350 , US 5,275,940 oder US 4,275,157 . Weitere Beispiele für Fermentationsmedien finden sich bei Ozaki und Shiio (Agricultural and Biological Chemistry 47(7), 1569-1576, 1983) und Shiio et al. (Agricultural and Biological Chemistry 48(6), 1551-1558, 1984).
Methoden zur Bestimmung von L-Lysin und anderer L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed Phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51:1167-1174) beschrieben.
Die auf diese Weise hergestellte Fermentationsbrühe wird anschließend erfindungsgemäß weiterverarbeitet.
Unter einer Fermentationsbrühe versteht man ein Fermentationsmedium, in dem ein Mikroorganismus für eine gewisse Zeit und bei einer gewissen Temperatur kultiviert wurde. Das Fermentationsmedium beziehungsweise die während der Fermentation eingesetzten Medien enthält/enthalten sämtliche Substanzen beziehungsweise Komponenten, die eine Vermehrung des Mikroorganismus und eine Bildung der gewünschten Aminosäure sicherstellt.
Bei Abschluss der Fermentation enthält die entstandene Fermentationsbrühe dementsprechend a) die infolge der Vermehrung der Zellen des coryneformen Bakteriums entstandene Biomasse (= Zellmasse) des Mikroorganismus, b) das im Laufe der Fermentation gebildete L-Lysin, c) die im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte und d) die durch die Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile des/der eingesetzten Fermentationsmediums/Fermentationsmedien beziehungsweise der Einsatzstoffe wie beispielsweise Vitamine wie Biotin, Aminosäuren wie Homoserin oder Salze wie Magnesiumsulfat.
Zu den organischen Nebenprodukte gehören Stoffe, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen gegebenenfalls neben L-Lysin erzeugt und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Hierzu zählen L-Aminosäuren, die im Vergleich zum erwünschten L-Lysin weniger als 30 %, 20 % oder 10 % ausmachen. Hierzu gehören weiterhin organische Säuren, die ein bis drei Carboxyl-Gruppen tragen wie zum Beispiel Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Apfelsäure oder Fumarsäure. Schließlich gehören dazu auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose.
Typische für industrielle Zwecke geeignete Fermentationsbrühen haben einen L-Lysingehalt von 40 g/kg bis 180 g/kg oder 50 g/kg bis 150 g/kg. Der Gehalt an Biomasse (als getrocknete Biomasse) beträgt im Allgemeinen 20 bis 50 g/kg.
Gegebenenfalls wird die Biomasse aus der Fermentationsbrühe vor den weiteren Verfahrensschritten teilweise oder ganz entfernt.
Die erhaltene Fermentationsbrühe wird anschließend erfindungsgemäß weiterverarbeitet, in dem man ein Verfahren durchführt das mindestens folgende Schritte umfasst:

a) gegebenenfalls das Verhältnis Sulfat/L-Lysin misst,
b) anschließend gegebenenfalls Ammoniumsulfat zusetzt,
c) den pH-Wert durch Zugabe von Schwefelsäure auf 4,0 bis 5,2, insbesondere 4,9 bis 5,1 absenkt, wobei man durch die Zugabe der Sulfat-haltigen Verbindung(n) in den Schritten b) und c) ein Sulfat/L-Lysin-Verhältnis von 0,85 bis 1,2, bevorzugt 0,9 bis 1,0 besonders bevorzugt > 0,9 bis < 0,95 in der Brühe einstellt, und
d) das so erhaltene Gemisch durch Wasserentzug aufkonzentriert, und bevorzugt granuliert,

Unter Sulfat-haltigen Verbindungen im Sinne der oben genannten Verfahrensschritte sind insbesondere Ammoniumsulfat und Schwefelsäure gemeint.
Auf diese Weise erhält man ein Produkt mit einem L-Lysin-Gehalt von 10 bis 70 Gew.-% (ber. als Lysinbase, bezogen auf die Gesamtmenge) und einem molaren Sulfat/L-Lysin-Verhältnis von 0,85 bis 1,2, bevorzugt 0,9 bis 1,0, besonders bevorzugt > 0,9 bis < 0,95.
Das molare Sulfat/L-Lysin-Verhältnis V wird nach der Formel: V = 2 × [SO₄ ^2–]/[L-Lysin] berechnet.
Diese Formel berücksichtigt die Tatsache, dass das SO₄ ^2– Anion zweiwertig ist. Ein Verhältnis V = 1 bedeutet, dass ein stöchiometrisch zusammengesetztes Lys₂(SO₄) vorliegt, während bei einem Verhältnis von V = 0,9 ein 10%iger Sulfatunterschuss und bei einem Verhältnis von V = 1,1 ein 10 % Sulfatüberschuss gefunden wird.
Es ist möglich, die Fermentation in Gegenwart einer solchen Menge von Ammoniumsulfat durchzuführen, dass nach Beendigung der Fermentation bereits ein Sulfat/Lysin-Verhältnis vorliegt, das im erfindungsgemäß beanspruchten Bereich liegt. Gegebenenfalls entfällt dann die Messung des L-Lysin/Sulfat Verhältnisses. Die weitere Zugabe von Ammoniumsulfat ist dann gegebenenfalls auch nicht mehr erforderlich.
Wird über die erfindungsgemäße pH-Wertabsenkung hinaus Säure zugesetzt, sind wegen der Pufferwirkung der in der Brühe enthaltenen Verbindungen erhöhte Mengen an Säure erforderlich, die dann zu einer unerwünschten Denaturierung und Auflösung der Zellen der coryneformen Bakterien führen können.
In einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante wird der Fermentationsbrühe eines oder mehrerer der Salze der schwefeligen Säure (Sulfite) ausgewählt aus der Gruppe Ammonium-, Alkali-, und Erdalkalisalz in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gew.-%, bevorzugt 0,1 bis 0,3 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,1 bis 0,2 Gew.-% bezogen auf die Fermentationsbrühe zugesetzt. Bevorzugt wird Alkalihydrogensulfit und besonders bevorzugt Natriumhydrogensulfit eingesetzt.
Die Sulfite, insbesondere Natriumhydrogensulfit werden bevorzugt als Lösung vor der Aufkonzentration der Fermentationsbrühe zugesetzt. Die eingesetzte Menge wird bevorzugt bei der Einstellung des Sulfat-/L-Lysinverhältnisses berücksichtigt.
Der bei der Aufarbeitung von Fermentationsbrühen im Allgemeinen auftretende Verlust an L-Lysin wird durch die erfindungsgemäßen Masnahmen um bis zu ca. 50 % verringert.
So wurde festgestellt, dass die Einstellung des pH-Wertes in der Fermentationsbrühe auf Werte pH ≥ 4 bis ≤ 5,2, die Erhöhung des Sulfat/L-Lysin Verhältnisses auf 0,85 bis 1,2 und eine Sulfitzugabe von 0,01 bis 0,5 Gew.-% in der Fermentationsbrühe den Verlust an L-Lysin während der Aufarbeitung der Fermentationsbrühe deutlich reduzierte.
Dabei führt die Kombination der verschiedenen Maßnahmen vor der Aufarbeitung zu einem synergistischen Effekt im Vergleich zur Summe der Einzeleffekte.
In nicht behandelten Fermentationsbrühen (keine Zugabe eines der Zuschlagstoffe, das heißt Ammoniumsulfat, Schwefelsäure oder Natriumhydrogensulfit) resultierte bei der Einengung zum Konzentrat ein mittlerer Lysinverlust von ca. 3,5 Gew.-% (ohne Granulationsschritt). Die Erhöhung des Sulfatverhältnisses durch Zugabe von Ammoniumsulfat führte zu einem mittleren Lysinverlust von ca. 3,2 Gew.-%, die alleinige pH-Werteinstellung reduzierte den Lysinverlust auf ca. 1,4 Gew.-%.
Die Kombination von pH-Werteinstellung und Erhöhung des Sulfat-Anteils zeigte eine höhere Schutzwirkung für das L-Lysin und resultierte in einem Lysinverlust von ca. 0,9 Gew.-%. Die Kombination aller drei Zuschlagstoffe ergab einen mittleren Lysinverlust von ca. 0,6 Gew.-% bzw. 0,7 Gew.-%. Dies entspricht einer relativen Reduktion des Lysinverlustes um ca. 80 %.
Bei der sich nach der Herstellung des Konzentrates anschließenden Granulation bleiben die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens weitgehend erhalten. Während bei der Granulation von Konzentraten aus unbehandelten Fermentationsbrühen Lysinverluste bis ca. 5 Gew.-% beobachtet wurden, ergaben sich bei Konzentraten aus erfindungsgemäß vorbehandelten Fermentationsbrühen ca. 2 Gew.-%. Dies entspricht einer relativen Reduktion des Lysinverlustes um ca. 60 %.
Als Folge der Vorbehandlung von L-Lysin-haltiger Fermentationsbrühe durch Erniedrigung des pH-Wertes, Erhöhung der Sulfatbilanz und Zugabe von Sulfit wird die Ausbeute an L-Lysin erhöht.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Lysin enthaltenden Futtermitteladditiven werden solche Vorgehensweisen bevorzugt, bei denen Produkte erhalten werden, die Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten.
Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden wie z. B. der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Gegebenenfalls wird die Biomasse beziehungsweise die Biomasse enthaltene Fermentationsbrühe während eines geeigneten Verfahrensschrittes inaktiviert.
In einer Verfahrensweise wird die Biomasse vollständig oder nahezu vollständig entfernt, so dass keine (0 %) oder höchstens 30 %, höchstens 20 %, höchstens 10 %, höchstens 5 %, höchstens 1 % oder höchstens 0,1 % Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einer bevorzugten Verfahrensweise wird die Biomasse nicht oder nur in geringfügigen Anteilen entfernt, sodass sämtliche (100 %) oder mehr als 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % oder 99,9 % Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt.
Fermentationsbrühen, aus denen die Biomasse teilweise oder insgesamt entfernt wurde, können auch zur Standardisierung bei der Herstellung des Produkts eingesetzt werden. Dies gilt natürlich auch für die reinen Verbindungen L-Lysinbase und Lysinsulfat.
Erfindungsgemäß wird die erhaltene Fermentationsbrühe vor der Aufkonzentration mit Schwefelsäure angesäuert und gegebenenfalls mit Ammoniumsulfat versetzt. Schließlich kann die Brühe auch durch Zusatz von bevorzugt Natriumbisulfit (Natriumhydrogensulfit) oder einem anderen Salz beispielsweise Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalz der schwefligen Säure stabilisiert und aufgehellt werden.
Wird Biomasse ganz oder teilweise abgetrennt, erfolgt dies bevorzugt vor der erfindungsgemäßen Absenkung des pH-Werts und der Zugabe von Ammoniumsulfat und Sulfitsalz.
Bei der gegebenenfalls vorgenommenen Abtrennung der Biomasse werden gegebenenfalls in der Fermentationsbrühe enthaltene organische oder anorganische Feststoffe teilweise oder ganz entfernt. Die in der Fermentationsbrühe gelösten organischen Nebenprodukte und die gelösten nicht verbrauchten Bestandteile des Fermentationsmediums (Einsatzstoffe) bleiben mindestens teilweise (> 0 %), bevorzugt zu mindestens 25 %, besonders bevorzugt zu mindestens 50 % und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 75 % im Produkt. Gegebenenfalls bleiben diese auch vollständig (100 %) oder nahezu vollständig das heißt > 95 % oder > 98 % im Produkt. In diesem Sinne bedeutet der Begriff „Fermentationsbrühebasis", dass ein Produkt mindestens einen Teil der Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält.
Anschließend wird der Brühe mit bekannten Methoden wie Erhitzen bzw. Aufheizen z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers oder Fallfilmverdampfers, oder durch Umkehrosmose oder Nanofiltration Wasser entzogen beziehungsweise eingedickt bzw. aufkonzentriert. Diese aufkonzentrierte Brühe kann anschließend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren wie zum Beispiel in der zirkulierenden Wirbelschicht gemäß PCT/EP 2004/006655 beschrieben, zu rieselfähigen, feinteiligen oder grobkörnigen Produkten insbesondere zu Granulat aufgearbeitet werden. Gegebenenfalls wird aus dem erhaltenen Granulat durch Sieben oder Staubabtrennung ein Produkt mit der gewünschten Korngröße isoliert.
Es ist ebenfalls möglich, ein feinteiliges Pulver oder grobkörniges Produkt direkt d. h. ohne vorherige Aufkonzentrierung durch Sprühtrocknung oder Sprühgranulation aus der erfindungsgemäß behandelten Fermentationsbrühe zu gewinnen.
Das rieselfähige, feinteilige Pulver kann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden.
Die Granulate sind z. B. herstellbar nach den Verfahren gemäß EP-B 0 615 693 oder EP-B 0 809 940 , US 5 840 358 oder WO 2005/006875 oder WO 2004/054381 .
Unter „rieselfähig" versteht man Pulver, die aus einer Serie von Glasauslaufgefäßen mit verschieden großen Auslauföffnungen mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5 mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).
Mit „feinteilig" ist ein Pulver mit überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngröße von 20 bis 200 µm Durchmesser gemeint.
Mit „grobkörnig" ist ein Produkt mit einem überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngröße von 200 bis 2000 µm Durchmesser gemeint.
Der Begriff „staubfrei" bedeutet, daß das Produkt lediglich geringe Anteile (< 5 %) an Körngrößen unter 100 µm Durchmesser enthält.
Die Bestimmung der Korn- bzw. Teilchengrößen kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden. Die entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur „Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" von R. H. Müller und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) oder im Lehrbuch „Introduction to Particle Technology" von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998) beschrieben.
Bevorzugt sind Produkte mit einem Anteil von ≥ 97 Gew.-% einer Korngröße von 100 bis 1800 µm oder einem Anteil von 95 Gew.-% einer Korngröße von 300 bis 1800 µm Durchmesser. Der Anteil an Staub d. h. Partikeln mit einer Korngrösse < 100 µm liegt bevorzugt bei > 0 bis 1 Gew.-% besonders bevorzugt bei maximal 0,5 Gew.-%. Das Schüttgewicht der bevorzugten Produkte beträgt im Allgemeinen 600 bis 950 kg/m³, insbesondere 650 bis 900 kg/m³.
Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten ( EP-A 0 743 016 ) Stearaten.
Weiterhin ist es vorteilhaft die Oberfläche der erhaltenen Granulate mit Ölen zu versehen so wie es in der WO 04/054381 beschrieben ist. Als Öle können Mineralöle, pflanzliche Öle oder Mischungen pflanzlicher Öle verwendet werden. Beispiele für derartige Öle sind Sojaöl, Olivenöl, Sojaöl/Lecithingemische. In gleicher Weise sind auch Silikonöle, Polyethylenglykole oder Hydroxyethycellulose geeignet. Durch die Behandlung der Oberflächen mit den genannten Ölen erzielt man eine erhöhte Abriebfestigkeit des Produktes und einen Verringerung des Staubanteils. Der Gehalt an Öl im Produkt beträgt 0,02 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt 0,02 bis 1,0 Gew.-%, und ganz besonders bevorzugt 0,2 bis 1,0 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Futtermitteladditivs.
Alternativ kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
Schließlich kann das Produkt auch durch Beschichtungsverfahren („Coating") mit Filmbildnern wie beispielsweise Metallcarbonate, Kieselsäuren, Silikate, Alginate, Stearate, Stärken, Gummis und Celluloseether, wie in der DE-C 41 00 920 beschrieben, in einen Zustand gebracht werden, in dem es stabil gegenüber der Verdauung durch Tiermägen insbesondere dem Magen von Wiederkäuern ist.
Zur Einstellung einer gewünschten L-Lysin-Konzentration im Produkt kann je nach Anforderung während des Verfahrens das L-Lysin in Form eines Konzentrates oder gebenenfalls einer weitgehend reinen Substanz beziehungsweise deren Salz in flüssiger oder fester Form hinzugefügt werden. Diese können einzeln oder als Mischungen zur erhaltenen oder aufkonzentrierten Fermentationsbrühe, oder auch während des Trocknungs- oder Granulationsprozesses hinzugefügt werden.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten festen Produkte sind bevorzugt Granulate und haben unter anderem folgende Eigenschaften:
Sie haben einen pH-Wert von 3,5 bis 5,1 insbesondere 4,0 bis 5,0, bevorzugt 4,2 bis 4,8 gemessen in wässriger Suspension. (Für die P^H-Messung wird eine 10 Gew.-%ige Suspension in entionisiertem Wasser hergestellt und der pH bei 25°C mit einer PH-Elektrode gemessen. Der Messwert stellt sich nach ca. 1 Minute konstant ein.)
Sie weisen trotz des erhöhten Sulfatgehalts einen deutlich höheren „Weissgrad", eine geringere Hygroskopizität und eine bessere Stabilität bei thermischer Belastung als Granulate mit demselben L-Lysingehalt auf, die suspendiert einen pH-Wert von 5,3 bis 5,7 und ein Sulfat/L-Lysin- Verhältnis im Bereich von z. B. 0,75 bis 0,87 zeigen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Die Farbwerte bzw. der „Weissgrad" der Produkte, bevorzugt Granulate, werden nach dem in der Deutschen Industrienorm 5033 (DIN 5033) definierten Dreibereichsverfahren (L*a*b*-Farbmessung) bestimmt. Hierfür kann ein 3-Bereichs-Farbmessgerät zur Farb- und Remissionsmessung wie beispielsweise das Farbmessgerät vom Typ Micro Color II LMC der Firma Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) verwendet werden. Hierbei wird die diffuse Reflexion der Probe unter einem Winkel von 8° gemessen. Das reflektierte Licht wird dabei über einen Lichtleiter in das Gerät zur Aufspaltung auf die exakt definierten Normfarbfilter übertragen. Gemessen wird gegen einen Kalibrierstandard.
Die Farbwerte liegen bevorzugt in den Bereichen:
ohne Hydrogensulfitzusatz: L* 65-70, a* 6-8, b* 20-25
mit Hydrogensulfitzusatz: L* > 70-80, a* 4-< 6, b* > 25-30.
Sie haben einen Lysingehalt (gerechnet als Lysinbase) von 10 Gew.-% bis 70 Gew.-%, bevorzugt 30 bis 60 Gew.-% oder 30 bis 65 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 40 Gew.-% bis 60 Gew.-% oder 40 Gew.-% bis 65 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Produkts.
Das Verhältnis von Sulfat zu L-Lysin im Produkt beträgt 0,85 bis 1,2, bevorzugt 0,9 bis 1,0, besonders bevorzugt > 0,9 bis < 0,95.
Im Allgemeinen liegt der Wassergehalt zwischen 0,1 Gew.-% und maximal 5 Gew.-%. Der Wassergehalt beträgt bevorzugt maximal 4 % Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 3 % Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 2,5 Gew.-%. Wassergehalte von maximal 2 Gew.-% sind ebenfalls möglich.
Eine Reinkultur des Corynebacterium glutamicum Stammes DM1910 wurde am 15. Mai 2006 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen gemäß Budapester Vertrag (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 18255 hinterlegt.
Eine Reinkultur des Corynebacterium glutamicum Stammes DM1913 wurde am 15. Mai 2006 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen gemäß Budapester Vertrag (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 18256 hinterlegt.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines festen L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt a) Fermentation eines isolierten L-Lysin produzierenden coryneformen Bakteriums in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen für eine bestimmte Zeit, wobei man nach Abschluss der Fermentation, b) gegebenenfalls das Sulfat/L-Lysin-Verhältnis bestimmt, c) anschließend gegebenenfalls Ammoniumsulfat zusetzt, d) den pH-Wert durch die Zugabe von Schwefelsäure auf 4,9 bis 5,2 absenkt, wobei man durch die Zugabe der Sulfat-haltigen Verbindungen in den Schritten c) und d) ein Sulfat/L-Lysin-Verhältnis von 0,85 bis 1,2 in der Brühe einstellt, e) das so erhaltene Gemisch durch Wasserentzug aufkonzentriert und trocknet, und f) wobei das isolierte coryneforme Bakterium eine Nukleotidsequenz, die für eine Lysin insensitive Aspartatkinase kodiert, und eine oder mehrere der Nukleotidsequenzen enthält, ausgewählt aus der Gruppe: g) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu 95 % identisch ist mit SEQ ID NO:6 und an Position 329 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Valin enthält, h) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 % identisch ist mit SEQ ID NO:12 und an Position 321 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin und gegebenenfalls an Position 8 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin enthält, i) Nukleotidsequenz, die für eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 %, identisch ist mit SEQ ID NO:18 und einen oder mehrere Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe: an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin und an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, enthält, und j) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 %, identisch ist mit SEQ ID NO:24 und an Position 111 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin und gegebenenfalls an Position 201 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Alanin, enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem man die Reihenfolge der Zugaben von Ammoniumsulfat und Schwefelsäure umdreht.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, bei dem man vor der Aufkonzentration ein Alkalihydrogensulfit in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Fermentationsbrühe, zusetzt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, bei dem man nach Abschluss der Fermentation 0 bis 100 % der während der Fermentation gebildeten Biomasse entfernt und die Schritte b) bis j) anschließt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, bei dem man die Oberfläche des Granulats mit einem Öl in einer Menge von 0,02 bis 2 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge des Futtermitteladditivs, belegt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, bei dem man ein coryneforme Bakterium der Gattung Corynebacterium einsetzt.
Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem man das coryneforme Bakterium der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aspartatkinase die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 aufweißt, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe A279T, A279V, S301F, S301Y, T308I, S317A, R320G, T311I, G345D, T380I und S381F aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aspartatkinase den Aminosäureaustausch S317A aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aspartatkinase den Aminosäureaustausch A279T aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Aspartatkinase zusätzlich den Aminosäureaustausch S381F aufweist.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Aktivität eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 % identisch ist mit SEQ ID NO:6 und an Position 329 L-Methionin enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Aktivität die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:6 aufweist, wobei an Position 329 L-Methionin enthalten ist.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 % identisch ist mit SEQ ID NO:12 und an Position 321 L-Serin enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:12 aufweist, wobei an Position 321 L-Serin enthalten ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:12 aufweist, wobei an Position 321 L-Serin und wobei an Position 8 Threonin enthalten ist.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 % identisch ist mit SEQ ID NO:18 und einen oder mehrere Aminosäureaustausche enthält ausgewählt aus der Gruppe: an Position 107 L-Histidin anstelle Lysin, an Position 219 L-Asparagin anstelle Lysin, an Position 233 L-Serin anstelle L-Prolin und an Position 261 L-Histidin anstelle L-Tyrosin.
Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:18 aufweist, und einen oder mehrere Aminosäureaustausche enthält ausgewählt aus der Gruppe: an Position 107 L-Histidin anstelle Lysin, an Position 219 L-Asparagin anstelle Lysin, an Position 233 L-Serin anstelle L-Prolin und an Position 261 L-Histidin anstelle L-Tyrosin.
Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:18 aufweist, wobei an Position 107 L-Histidin, an Position 219 L-Asparagin, an Position 233 L-Serin und an Position 261 L-Histidin enthalten ist.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu ≥ 95 %, identisch ist mit SEQ ID NO:24 und an Position 111 L-Phenylalanin oder L-Alanin enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:24 aufweist, wobei an Position 111 L-Phenylalanin oder L-Alanin enthalten ist.
Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:24 aufweist, wobei an Position 111 L-Phenylalanin oder L-Alanin und an Position 201 L-Serin enthalten ist.
Isoliertes Polynukleotid das für ein Polypeptid mit Aspartatkinase-Aktivität kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 kodiert, wobei an Position 297 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Leucin enthalten ist und wobei das Polypeptid gegebenenfalls zusätzlich einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe lysC A279T, lysC A279V, lysC S301F, lysC S301Y, lysC T308I, lysC T311I, lysC S317A, lysC R320G, lysC G345D, lysC T380I, lysC S381F, und lysC S317A enthält.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid an Position 297 L-Glutamin enthält.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid zusätzlich den Aminosäureaustausch lysC S317A enthält.
Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 24 und 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid an Position 297 L-Glutamin und an Position 317 L-Alanin enthält.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid von einem Polynukleotid kodiert wird, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:33 umfasst.
Vektor enthaltend ein Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 23-27.
Isolierte coryneforme Bakterien, die ein Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 23-27 enthalten.
Coryneforme Bakterien, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 28 transformiert worden sind.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Lysin haltigen Futtermitteladditiven, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt: a) Fermentation der Bakterien gemäß den Ansprüchen 29 und 30 in einem geeignetem Nährmedium, b) Akkumulation des L-Lysins in dem Nährmedium oder in den Zellen des coryneformen Bakteriums.
Das isolierte coryneforme Bakterium, das unter der Nummer DSM 18255 bei der DSMZ hinterlegt worden ist.
Das isolierte coryneforme Bakterium, das unter der Nummer DSM 18256 bei der DSMZ hinterlegt worden ist.
Festes L-Lysin enthaltendes Tierfuttermittelsupplement, auf Fermentationsbrühebasis, wobei a) das Sulfat/L-Lysin-Verhältnis im Supplement sich auf 0,85 bis 1,2 beläuft b) das Supplement einen pH-Wert von 3,5 bis 5,1 aufweist und c) 0 bis 100 % der während der Fermentation gebildeten Biomasse aus coryneformen Bakterien im Supplement enthalten sind mit der Maßgabe d) dass die coryneformen Bakterien eine Nukleotidsequenz, die für eine Lysin insensitive Aspartatkinase kodiert und eine oder mehrere der Nukleotidsequenzen enthalten, ausgewählt aus der Gruppe e) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu 95 % identisch ist mit SEQ ID NO:6 und an Position 329 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Valin enthält. f) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 % identisch ist mit SEQ ID NO:12 und an Position 321 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin und gegebenenfalls an Position 8 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin enthält, g) Nukleotidsequenz, die für eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu 95 %, identisch ist mit SEQ ID NO:18 und einen oder mehrere Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe: an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin und an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, enthält, und h) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu 95 %, identisch ist mit SEQ ID NO:24 und an Position 111 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin und gegebenenfalls an Position 201 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Alanin, enthält.