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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Mikroskop, in dessen Beleuchtungsstrahlengang
ein Beugungsgitter angeordnet ist, durch welches dem Beleuchtungslicht
eine Struktur in Form einer periodischen Intensitätsverteilung
aufgeprägt
wird.
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Auf
eine Probe gerichtetes Beleuchtungslicht mit periodischer Intensitätsverteilung
im Querschnitt des Lichtbündels
ist beispielsweise für
Mikroskope erforderlich, bei denen aus mehreren Detektionsrichtungen
Bildinformationen aus unterschiedlichen Ebenen in der Tiefe einer
Probe erfaßt
und ortsaufgelöst, d.
h. in Zuordnung zu ihren Raumkoordinaten X, Y, Z, gespeichert werden,
um so optische Schnitte durch die Probe und aus mehreren optischen
Schnitte ein dreidimensionales Bild der Probe elektronisch rekonstruieren
zu können.
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Dabei
besteht häufig
die Forderung, die Periode der Strukturierung in unkomplizierter
Weise verändern
zu können.
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So
kann beispielsweise mit der Anpassung der Periode an die numerische
Apertur der Abbildungsoptik die Dicke eines optischen Schnittes
minimiert werden.
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Weiterhin
besteht insbesondere bei Applikationen, die den Einsatz mehrerer
verschiedener Anregungswellenlängen
erfordern, zum Beispiel bei Kolokalisationsmessungen, oftmals das
Bedürfnis,
die optische Schnittdicke in Abhängigkeit
von der jeweils vorgegebenen Anregungswellenlänge einstellen zu können.
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Darüber hinaus
ist es gelegentlich erforderlich, die optische Schnittdicke zu verändern, um
das Signal- zu Rauschverhältnis
bei der Detektion der Bildinformationen zu erhöhen.
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Mit
dem „APOTOME”, einem
Einschub-Modul für
den Fluoreszenzstrahlengang von Lichtmikroskopen der Firma Carl
Zeiss AG, Deutschland, wird die Struktur mit einem in einem Zwischenbild
des Mikroskops angeordneten Gitter erzeugt. Die Periode dieser Struktur
wird bestimmt mit dem Periodizitätsintervall
des Gitters. Eine Veränderung
der Periode der Struktur wird durch den Austausch von Gittern mit verschiedenen
Periodizitätsintervallen
vorgenommen.
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Nachteilig
dabei ist die zu geringe Flexibilität bei der Untersuchung derselben
Probe mit unterschiedlich strukturiertem Beleuchtungslicht. Für das Auswechseln
der Gitter mit verschiedenen Periodizitätsintervallen untereinander
ist ein verhältnismäßig hoher
Zeitaufwand erforderlich. Dabei können auch nur diskrete Änderungen
der Periode realisiert werden, wodurch insbesondere die Anwendung
eines in dieser Weise ausgestatteten Mikroskops im Zusammenhang
mit Kolokalisationsmessungen erschwert wird.
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Davon
ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, den Aufbau eines
derartigen Mikroskops so weiterzuentwickeln, daß die Veränderung der periodischen Strukturierung
des Beleuch tungslichtes in vereinfachter Weise und auch nicht nur
diskret möglich
ist.
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Erfindungsgemäß wird diese
Aufgabe bei einem Mikroskop, in dessen Beleuchtungsstrahlengang
ein Beugungsgitter angeordnet ist, durch welches dem Beleuchtungslicht
eine Struktur in Form einer periodischen Intensitätsverteilung
aufgeprägt wird,
dadurch gelöst,
daß
- – das
sich in Richtung Z ausbreitende Beleuchtungslicht zu einer Linie
geformt auf das Beugungsgitter gerichtet ist,
- – das
sich in Richtung X erstreckende Periodizitätsintervall des Beugungsgitters
eine in Richtung Y verlaufende kontinuierliche oder progressive Variation
aufweist, und
- – das
Beugungsgitter in Richtung Y relativ zu dem linienförmigen Beleuchtungslicht
verschiebbar ist.
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Die
vorstehend angegebenen Richtungen sind im Sinne der vorliegenden
Erfindung Richtungen eines Koordinatensystems X, Y, Z und demzufolge orthogonal
ausgerichtet.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung ist das Beugungsgitter als transmittierendes Amplitudengitter
ausgebildet. Die Länge
l der Linie, mit der das Beleuchtungslicht auf das Beugungsgitter
trifft, entspricht der Ausdehnung des Beugungsgitters in der Richtung
X, die Breite b dieser Linie ist um ein Vielfaches geringer als
die Ausdehnung des Beugungsgitters in der Richtung Y.
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Das
Periodizitätsintervall
kann im Bereich von 200 bis 2500 Linien pro Millimeter liegen, wobei die
Variation bzw. die Zu- oder Abnahme des Periodizitätsintervalls
parallel in Richtung Y verläuft.
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Bevorzugt
ist das Beugungsgitter in einer zur Probenebene konjugierten Zwischenbildebene
angeordnet, die durch ein Detektionsobjektiv und eine Tubuslinse
definiert ist.
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Zum
Zweck der Ausbildung der auf das Beugungsgitter gerichteten Beleuchtungslinie
kann in Ausbreitungsrichtung des Beleuchtungslichtes gesehen vor
dem Beugungsgitter eine Zylinderlinse angeordnet sein. Vorteilhaft
ist dann unmittelbar hinter dem Beugungsgitter eine zweite Zylinderlinse
vorgesehen, wobei beide Zylinderlinsen parallel zueinander ausgerichtet
sind und bezüglich
ihrer Wirkungsweise gemeinsam ein Zylinderteleskop bilden. Dabei fokussiert
die erste Zylinderlinse das Beleuchtungslicht durch das Gitter hindurch
und die zweite Zylinderlinse kollimiert das Beleuchtungslicht wieder.
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Die
Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispieles näher erläutert werden.
In den zugehörigen
Zeichnungen zeigen
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1 das
Prinzip eines Mikroskopaufbaus mit einer Anordnung zur Strukturierung
des Beleuchtungslichtes nach Stand der Technik,
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2 das
Prinzip eines Mikroskopaufbaus mit der erfindungsgemäßen Anordnung
zur Strukturierung des Beleuchtungslichtes mit variabler Strukturperiode.
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Eine
dem Stand der Technik entsprechende Anordnung ist in 1a dargestellt. Hierbei wird das Licht
der Lichtquelle LQ mittels eines Kollimators L1 quasi gebündelt. Die
Linse L2 beleuchtet ein im Zwischenbild ZB1 stehendes transmittierendes
Amplitudengitter G, welches das Licht entlang der Koordinatenrichtung
X strukturiert. Nach Durchgang durch das Amplitudengitter G gelangt
das Beleuchtungslicht zunächst
durch eine erste Tubuslinse TL1 und anschließend durch das Objektiv O hindurch
auf eine sich in der Probenebene PR befindende Probe.
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Dabei
wird in der Probe Fluoreszenzlicht angeregt, das von der Probe kommend
vom Objektiv O gesammelt wird, in der dem Beleuchtungslicht entgegengesetzten
Richtung durch das Objektiv O hindurch zum Strahlteiler MDB gelangt,
dort aufgrund des Stokes-Shifts vom Beleuchtungslicht getrennt wird
und, nachdem es eine zweite Tubuslinse TL2 passiert hat, auf einen
Detektor D trifft, der sich in einem zweiten Zwischenbild ZB2 der
Mikroskopanordnung befindet.
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Dabei
wird, wie in 1b dargestellt, auf dem
Amplitudengitter G im Zwischenbild ZB1 ein kreisförmiger Bereich
B beleuchtet, der dem Sehfeld des Mikroskops in diesem Zwischenbild
ZB1 entspricht. Die Positionierung des Amplitudengitters G im Zwischenbild
ZB1 gewährleistet
dessen scharfe Abbildung in die Probenebene PR.
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Diese
bisher bekannte Anordnung hat den Nachteil, daß eine Veränderung der periodischen Strukturierung
des Beleuchtungslichtes in Richtung X nur durch Austausch von Amplitudengit tern
G mit verschiedenen Periodizitätsintervallen
möglich
ist und mit dem Austausch von Gittern auch nur eine diskrete Beeinflussung
des Periodizitätsintervalls
vorgenommen werden kann.
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Um
dagegen eine Veränderung
der periodischen Strukturierung des Beleuchtungslichtes in vereinfachter
Weise zu ermöglichen,
ist erfindungsgemäß das Beleuchtungslicht
zu einer in Richtung X ausgedehnten Linie L geformt auf das Amplitudengitter
G gerichtet, das Periodizitätsintervall
des Amplitudengitters G weist eine in Richtung Y verlaufende kontinuierliche
oder progressive Veränderung
auf, und das Amplitudengitter G ist in Richtung Y relativ zu dem
linienförmig
auftreffenden Beleuchtungslicht verschiebbar gelagert. 2 zeigt
das Prinzip eines dementsprechenden Mikroskopaufbaus.
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In
einer ersten Ansicht des erfindungsgemäßen Mikroskopaufbaus sind in 2a der Beleuchtungs- und der Abbildungsstrahlengang
senkrecht zu der Richtung dargestellt, in welcher sich die periodische
Struktur im Beleuchtungslicht ausbreitet.
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Der Übersichtlichkeit
halber wurden in 2 die Bezeichnungen für die optischen
Baugruppen beibehalten, die bereits anhand 1 erläutert worden
sind und die auch prinzipiell dieselbe Wirkungsweise haben wie in
der Darstellung nach 1.
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In 2a ist in dem von der Lichtquelle LQ kommenden
und mittels des Kollimators L1 nahezu gebündelten Licht ein Zylinderteleskop
vorgesehen, von dem eine erste Zylinderlinse ZL1 vor dem im Zwischenbild
ZB1 stehenden Amplitudengitter G und eine zweite Zylinderlinse ZL2
hinter dem Amplitudengitter G angeordnet ist. Die übrigen in 2 gezeigten
Baugruppen behalten ihre Funktion wie im Beispiel nach 1 bei.
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Die
beiden Zylinderlinsen ZL1 und ZL2 sind parallel zueinander ausgerichtet
und wirken gemeinsam als Zylinderteleskop, wobei die erste Zylinderlinse
ZL1 das Beleuchtungslicht durch das Amplitudengitter G hindurch
fokussiert und die zweite Zylinderlinse ZL2 das Beleuchtungslicht
wieder kollimiert.
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2b zeigt die erfindungsgemäße Anordnung
in einer Ansicht parallel zur Strukturierungsrichtung mit den Baugruppen
und wie in 2a dargestellt. Hier ist
erkennbar, daß das
Amplitudengitter G im Fokus der Tubuslinse TL1 positioniert ist.
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Aufgrund
der Zylinderlinse ZL1 entsteht eine Beleuchtungslinie L, die wie
in 2c dargestellt auf das Amplitudengitter
G trifft. Die Linie L des Beleuchtungslichtes hat die Länge l mit
mindestens der Ausdehnung des Amplitudengitters G in Richtung X,
die Breite b der Linie L ist um ein Vielfaches kleiner als die Ausdehnung
des Amplitudengitters G in Richtung Y.
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Wird
das Amplitudengitter G in Richtung Y relativ zu dem zu der Linie
Z geformten Beleuchtungslicht verschoben, trifft das Beleuchtungslicht
auf Regionen des Amplitudengitters G mit unterschiedlichen Periodizitätsintervallen.
In Abhängigkeit
von der Verschiebeweite dringt dabei das Beleuchtungslicht durch
verschiedene Periodizitätsintervalle,
wodurch sich auch die periodische Struktur des auf die Probe treffenden
Beleuchtungslichtes ändert.
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Ein
wesentlicher Vorteil der Erfindung besteht darin, daß durch
die Verschiebung des Amplitudengitters G in Richtung Y in Abhängigkeit
von dem jeweils eingesetzten Objektiv O, von der jeweils verwendeten
Wellenlänge
des Beleuchtungslichtes und von der Empfindlichkeit des verwendeten
Detektors D folgende Betriebsarten möglich sind:
- – Multicolorbildgebung
mit gleicher optische Schnittdicke,
- – Multicolorbildgebung
mit geringster optischer Schnittdicke bei Erzeugung von bestmöglichen optischen
Schnittbildern nahe der Grenzfrequenz des Objektivs O,
- – Bildgebung
mit vergrößerter optischer
Schnittdicke zum Zweck der Erhöhung
des Signal-/Rauschverhältnisses,
wobei die Vergrößerung des
optischen Schnittes in einer Vergrößerung des zu messenden Probenvolumens
resultiert, so daß sich
die Signalstärke
relativ zum Untergrund erhöht.
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- B
- Bereich
- b
- Breite
- D
- Detektor
- G
- Amplitudengitter
- L
- Linie
- l
- Länge
- LQ
- Lichtquelle
- L1
- Kollimator
- L2
- Linse
- MDB
- Strahlteiler
- O
- Detektionsobjektiv
- PR
- Probenebene
- TL1
- Tubuslinse
- TL2
- Tubuslinse
- X,
Y, Z
- Richtung
- ZL1
- Zylinderlinse
- ZL2
- Zylinderlinse
- ZB1
- Zwischenbildebene/Zwischenbild
- ZB2
- Zwischenbildebene/Zwischenbild
- ZL1
- Zylinderlinse
- ZL2
- Zylinderlinse