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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur automatisierten Durchführung von affinitätsbasierten Assays zur Bestimmung eines Analytgehalts von Proben eines Prozessmediums.
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Dabei wird eine Probe des Prozessmediums, gegebenenfalls nach einer Vorbehandlung mit einem oder mehreren Assay-Reagenzien, einer Messeinrichtung zugeführt, die dazu ausgestaltet ist, ein Messsignal zu generieren, das einen Messwert einer vom Analytgehalt der Probe abhängigen Messgröße repräsentiert. Eine automatisierte Durchführung solcher Assays ist mittels eines automatischen Analysegeräts möglich. Analysegeräte mit festphasengebundenen Affinitäts-Immunosensoren sind beispielsweise aus
DE 10 2010 064 391 A1 ,
DE 10 2010 064 392 A1 ,
WO 2012/055606 A1 und
WO 2012/055607 A1 bekannt.
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Zur quantitativen Bestimmung eines Analytgehalts, z. B. einer Konzentration des Analyten, in einer Probe mittels eines affinitätsbasierten Assays ist es notwendig, die Beziehung zwischen einem vom Analytgehalt abhängigen Messsignal und dem Analytgehalt durch eine mathematische Funktion beschreiben zu können. Diese ist für den jeweiligen angewendeten Assay (z. B. kompetitiv, nicht-kompetitiv) in der Regel bekannt.
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Bei einem kompetitiven Assay kann die Abhängigkeit des Messsignals von der in der Probe vorliegenden Analytkonzentration beispielsweise mittels einer logistischen Funktion mit vier Parametern beschrieben werden:
wobei der Parameter a das Signal bei infinitesimaler Analytzugabe, b die Steigung im Testmittelpunkt (ca. 50% Signalrückgang), c der Testmittelpunkt und d das minimale Sensorsignal bei Analytüberschuss ist.
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Um eine Kalibrierfunktion eines mittels eines automatischen Analysegeräts durchgeführten kompetitiven Assays zu ermitteln, wird eine Messreihe mit mehreren Proben bekannter Analytkonzentration ermittelt und die obige Funktion an die erhaltenen Messwerte angepasst. Die Umkehrfunktion der so ermittelten Kalibrierfunktion ergibt die zur Berechnung der Analytkonzentration aus dem erhaltenen Messsignal benötigte Analysenfunktion.
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Affinitätsbasierte Assays besitzen ein sehr großes Anwendungspotenzial, da sie modular aufgebaut sein können und damit auf eine Vielzahl verschiedenartiger Analyte anpassbar sein können. Zudem besitzen solche Assays häufig eine sehr hohe Sensitivität. Bei vielen Anwendungen ist es erwünscht, mit ein und demselben Messprinzip einen großen Konzentrationsverlauf, z. B. über drei und mehr Größenordnungen, bestimmen zu können. Eine Beispiel für solche Anwendungen sind biotechnologische Produktionsprozesse, bei denen die Zunahme der Produktkonzentration verfolgt werden soll.
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Beispielsweise liegt der Produktgehalt von Proben, die einem auf der Expression rekombinanter, therapeutischer humaner Antikörper in Zellkulturtechnik basierenden Prozess entnommen werden, nach Inokulieren bei einigen μg/ml und steigt während einer 14-tätigen bis dreiwöchigen Fermentation auf deutlich über 1 mg/ml; dies entspricht einem Anstieg von mehr als 3 Größenordnungen.
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Um das Produkt bzw. einen Produktgehalt einer Probe mittels affinitätsbasierter Assays zu bestimmen muss die Probe daher vor der Messung häufig vorverdünnt werden, da der typische Detektionsbereich von affinitätsbasierten Assays meist bei geringen Konzentrationen liegt und üblicherweise einen zu geringen Konzentrationsbereich, nämlich etwa ein bis zwei Größenordnungen, abdeckt. Dabei hängt die Messgenauigkeit der Konzentrationsmessung auch davon ab, dass die Verdünnung nicht zu hoch und nicht zu gering gewählt wird.
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Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur automatisierten Durchführung von affinitätsbasierten Assays anzugeben, das eine verbesserte Messgenauigkeit, insbesondere über einen großen Bereich von Analytgehalten, zur Verfügung stellt.
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Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur automatisierten Durchführung von affinitätsbasierten Assays nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen angegeben.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur automatisierten Durchführung von affinitätsbasierten Assays zur Bestimmung eines Analytgehalts von Proben eines Prozessmediums,
werden in zeitlichen Abständen nacheinander einzelne dem Prozessmedium entnommen Proben einer Messeinrichtung zugeführt,
wobei die Messeinrichtung jeweils einen Messwert einer von dem Analytgehalt der Proben abhängigen Messgröße erfasst,
wobei mindestens eine oder mehrere der Proben verdünnt werden, bevor sie der Messeinrichtung zugeführt werden,
wobei ein zur Verdünnung einer Probe anzuwendender Verdünnungsfaktor aus einem anhand einer zuvor der Messeinrichtung zugeleiteten Probe erfassten Messwert ermittelt wird.
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Der Verdünnungsfaktor gibt das Verhältnis zwischen dem Volumen der verdünnten (Endvolumen) und dem Volumen der unverdünnten Probe (Anfangsvolumen) an.
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Die Messeinrichtung gibt ein von dem aktuellen Messwert der Messgröße abhängiges, insbesondere elektrisches, Messsignal aus, das von einer Steuerungs-/Auswertungseinrichtung ausgewertet werden kann um den Analytgehalt der Probe zu ermitteln.
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Es hat sich in Experimenten gezeigt, dass abhängig von der Analysenfunktion ein Konzentrationsbereich des Analyten in einer als Probe dienenden Lösung existiert, in welchem relative Schwankungen des den aktuellen Messwerts repräsentierenden Messsignals (diese entsprechen dem Messfehler) zu einem minimalen relativen Fehler der mittels der Analysenfunktion aus dem Messsignal bestimmten Analytkonzentration führen. Mit anderen Worten: Es lässt sich, abhängig von der Analysenfunktion ein Wertebereich für den Analytgehalt der zu untersuchenden Probe ermitteln, in dem der Messfehler, mit dem der erfasste Messwert behaftet ist, sich nur minimal auf den Fehler des daraus ermittelten Analytgehalts auswirkt (vgl. 2). Es ist daher anzustreben, Messungen in diesem optimalen Messbereich innerhalb des Detektionsbereiches durchzuführen. Indem ein zur Verdünnung einer Probe anzuwendender Verdünnungsfaktor aus einem anhand einer zuvor der Messeinrichtung zugeleiteten Probe erfassten Messwert ermittelt wird, lässt sich der Analytgehalt der Probe so einstellen, dass er innerhalb des Wertebereichs liegt, in dem der Fehler, mit dem der aus dem affinitätsbasierten Assay ermittelte Analytgehalt behaftet ist, minimal ist.
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Neben dieser Auswirkung von über den gesamten Messsignalbereich konstanten Messfehlern auf die relativen Fehler bei der Konzentrationsbestimmung ist bei kompetitiven Assayformaten zusätzlich festzustellen, dass bei eingesetzten Analytkonzentrationen in der Probe, welche Konzentrationen nahe dem Testmittelpunkt c der Kalibrierfunktion (vgl. Gleichung (1)) entsprechen, die relativen Fehler bei der Konzentrationsbestimmung geringer sind gegenüber denen, die sich bei Analytkonzentrationen ergeben, welche durch Messsignalwerte nahe unter dem Wert von a (Gleichung (1)) oder nahe über dem Wert von d bestimmt wurden. Der Messsignalwert liegt nahe a, wenn der Kompetitor in deutlichem Überschuss gegenüber dem Analyten vorliegt. Entsprechend liegt der Messsignalwert nahe d, wenn der Analyt gegenüber dem Kompetitor in deutlichem Überschuss vorliegt. In beiden Fällen verstärkt sich der Einfluss der jeweiligen Eingangskonzentrationsfehler von Analyt und Kompetitor in der zu bestimmenden Probenlösung bei der Erfassung der Messgröße (bei kompetitiven Assays im Zusammenhang mit dem von Rezeptor gebundenen Kompetitor stehend) in Abhängigkeit vom Überschuss. Unter der Annahme, dass Analyt und Kompetitor gleiche Affinität zum Rezeptor besitzen, liegen am Testmittelpunkt hingegen beide Liganden in der Probenlösung im gleichen Verhältnis von eins zueinander vor, wodurch sich die Konzentrationsfehler von Analyt und Kompetitor nicht weiter verstärken und die Messgröße mit minimalem Gesamtfehler erfasst wird. Es ist daher weiter anzustreben, Messungen im Konzentrationsbereich um den Testmittelpunkt durchzuführen.
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Vorteilhaft wird aus einem aktuell, d. h. zuletzt, erfassten Messwert der auf die jeweils nächste der Messeinrichtung zuzuführende Probe anzuwendende Verdünnungsfaktor ermittelt. Es ist alternativ oder zusätzlich auch möglich, einen oder mehrere Messwerte weiter zurückliegender Messungen bei der Ermittlung des auf nächste Probe anzuwendenden Verdünnungsfaktors zu berücksichtigen.
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In einer Ausgestaltung umfasst das Verfahren im Einzelnen die Schritte:
- – Zuführen einer ersten Probe zu der Messeinrichtung;
- – Erfassen eines von dem Analytgehalt der ersten Probe abhängigen, ersten Messwerts;
- – Berechnen eines auf eine der Messeinrichtung nach der ersten Probe zuzuführenden zweiten Probe anzuwendenden Verdünnungsfaktors aus dem ersten Messwert;
- – Verdünnen der zweiten Probe unter Anwendung des ermittelten Verdünnungsfaktors;
- – Zuführen der zweiten Probe zu der Messeinrichtung; und
- – Erfassen eines von dem Analytgehalt der zweiten Probe abhängigen zweiten Messwerts.
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Die erste Probe kann ebenfalls vor Zuleitung zu der Messeinrichtung anhand eines vorgegebenen Verdünnungsfaktors verdünnt werden. Der erste Messwert kann der zuletzt erfasste, aktuelle Messwert sein.
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Der Verdünnungsfaktor kann beispielsweise nach Vorgabe einer zu erwartenden Konzentration der Probe und unter Kenntnis der Kalibrierfunktion bzw. des Detektionsbereiches des genutzten Assays berechnet werden.
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Weiter kann das Verfahren das Berechnen eines auf eine der Messeinrichtung nach der zweiten Probe zuzuführenden dritten Probe anzuwendenden Verdünnungsfaktors anhand des ersten und des zweiten Messwerts, insbesondere durch ein Interpolationsverfahren, z. B. Regression, umfassen.
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Die Proben können in zeitlichen Abständen nacheinander aus einem in einem Prozessbehälter enthaltenen Prozessmedium entnommen werden, in dem ein, insbesondere biologischer oder biotechnologischer, Produktionsprozess durchgeführt wird, und in dem mindestens während eines Zeitintervalls, innerhalb dessen mehrere Proben aus dem Prozessbehälter entnommen werden, eine Konzentration des Analyten kontinuierlich ansteigt.
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Bevor die Proben der Messeinrichtung zugeführt werden, können den Proben, insbesondere nach ihrer Verdünnung, ein oder mehrere Assay-Reagenzien zugesetzt werden.
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Ist das Prozessmedium ein Medium eines zu überwachenden, insbesondere biotechnologischen, Prozesses, können in die Berechnung des Verdünnungsfaktors zusätzlich qualitative oder semiquantitative Informationen über den zu überwachenden Prozess mit einfließen, da sich mit Hilfe von mathematischen Modellen biotechnologische Prozesse beschreiben lassen. Bei beispielsweise biotechnologischen Mikroorganismenkulturen fließen Aspekte der Mikroorganismen-Wachstumskinetik und Aspekte durch die Art des Prozessbehälters bzw. die Art der Betriebsführung des biotechnologischen Prozesses in ein Modell ein, welches prinzipiell auf der Massebilanz beruht. Häufig in der Praxis angewandte Betriebsmodi sind der Satzbetrieb (Batch-Betrieb), der kontinuierliche und der semikontinuierliche (fed-batch- bzw. Zulauf-)Betrieb. Die Unterscheidung erfolgt, je nachdem ob das betrachtete System (im Allgemeinen ist dies der Prozessbehälter) gegenüber der Flüssigphase geschlossen (Batch), teiloffen (fed-batch) oder offen (kontinuierlich) ist. Besonders beim Batch-Betrieb erfolgt die Zunahme der Produktkonzentration über mehrere Größenordnungen und die Mikroorganismenkultur zeigt einen charakteristischen, mit mathematischen Modellen, z. B. auf Grundlage der so genannten MONOD-Kinetik, beschreibbaren, Wachstumsverlauf, wobei häufig eine wachstums-gekoppelte Produktbildung erfolgt. Die Berücksichtigung solcher zusätzlicher Informationen kann z. B. die Auswahl und Verwendung einer Extrapolationsfunktion zur Bestimmung des Verdünnungsfaktors umfassen, wobei mittels der Extrapolationsfunktion der die sich aus der Entwicklung der Konzentration des Analyten in dem zu überwachenden Prozess ergebende aktuelle Analytkonzentration anhand eines zuletzt gemessenen Analytgehalts oder anhand der in mehreren zuvor durchgeführten Messungen ermittelten Analytgehalte prognostiziert wird.
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Durch die Verdünnung kann der Analytgehalt der Probe derart eingestellt werden, dass sich der sich aus Schwankungen des Messsignals ergebende Fehler des anhand des Messsignals ermittelten Analytgehalts im Vergleich zu dem sich mit einer Messung an der unverdünnten Probe entsprechend ergebenden Fehler verkleinert.
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In einer vorteilhaften Ausgestaltung erfolgt die Berechnung und die Einstellung der Verdünnung in der Probe automatisiert mit Hilfe eines bioanalytischen Messsystems, insbesondere mittels eines automatischen Bioanalysators, welches insbesondere eine Steuerungs-/Auswerteeinheit mit einer elektronischen Datenverarbeitungseinrichtung umfasst.
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Die anhand von Proben eines Prozessmediums während eines ersten Prozesses bis zum Ende der Überwachung dieses ersten Prozesses erfassten Messwerte bilden eine erste Messreihe. Vorteilhaft können die während der Erfassung der ersten Messreihe ermittelten Verdünnungsfaktoren gespeichert werden, z. B. in einem Speicher der Steuerungs-/Auswerteeinheit des erwähnten bioanalytischen Messsystems. Diese können bei einer späteren Erfassung von Messwerten anhand von Proben eines Prozessmediums eines zweiten Prozesses für die Durchführung von deren Verdünnung zur Ermittlung einer entsprechenden zweiten Messreihe zur Verfügung gestellt werden. Vorteilhaft ist es in diesem Fall, wenn die zeitlichen Abstände, in denen Proben der Messeinrichtung zugeführt und Messwerte erfasst werden, bei der Überwachung beider Prozesse identisch sind und der erste und der zweite Prozess gleichartige Prozesse sind. Bei gleichartigen Prozessen stimmen Art und Konzentration der beteiligten Prozessmedien und der ggfs. beteiligten Mikroorganismen sowie Reaktionsbedingungen wie Temperatur und Druck im Wesentlichen überein, so dass die für die erste Messreihe ermittelten Verdünnungsfaktoren auch auf weitere, in gleichartigen Prozessen zu ermittelnde Messreihen, anwendbar sind. Auf diese Weise kann das Analysegerät Verdünnungsfaktoren für typische Prozessverläufe erlernen, so dass die aktuellen Verdünnungsfaktoren nicht jedes Mal erneut errechnet werden müssen.
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Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. eines Verfahrens nach einer der hier beschriebenen Ausgestaltungen umfasst eine Steuerungs-/Auswerteeinheit, welche eine elektronische Datenverarbeitungseinrichtung und ein von der Datenverarbeitungseinrichtung ausführbares Computerprogramm umfasst, das der Durchführung des Verfahrens dient. Die Vorrichtung kann weiter eine Probenentnahme-Vorrichtung zur Entnahme der Proben aus dem Prozessbehälter sowie Zuleitungen und Transport- und Dosiermittel, wie z. B. ein System von Ventilen und/oder eine oder mehrere Pumpen, zum Transport vorgegebener Volumina der Proben über durch Flüssigkeitsleitungen gebildete Transportwege zu der Messeinrichtung sowie zur Zuführung und Dosierung von vorgegebenen Volumina von Verdünnungsflüssigkeit und gegebenenfalls von der Probe zuzusetzenden Assay-Reagenzien, ebenfalls über durch Flüssigkeitsleitungen gebildete Transportwege, zur Probe umfassen. Die Steuerungs-/Auswerteeinheit kann dazu ausgestaltet sein, die Förder- und Dosiermittel zur Durchführung des Affinitäts-Assays einschließlich des hier beschriebenen Verfahrens zu steuern.
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Die Vorrichtung umfasst außerdem die bereits erwähnte Messeinrichtung, die einen Sensor aufweist, der dazu ausgestaltet ist, einen Messwert einer mit dem in der ggfs. verdünnten und ggfs. mit Assay-Reagenzien versetzten Probe korrelierten Messgröße zu erfassen. Diese Messgröße kann beispielsweise eine Intensität einer Lumineszenz-Strahlung oder eine Intensität einer nach Wechselwirkung mit dem Analyten oder mit einem Reaktionsprodukt einer unter Beteiligung des Analyten verlaufenden chemischen Reaktion, insbesondere durch Absorption, gewandelten Messstrahlung sein. Das Computerprogramm kann zur Ermittlung von Analytkonzentrationen dazu ausgestaltet sein, anhand eines von dem Sensor zur Verfügung gestellten Messsignals unter Verwendung der hinterlegten Analysenfunktion einen Wert der Analytkonzentration zu berechnen.
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In einem für die Steuerungs-/Auswerteeinheit zugänglichen Speicher können Extrapolationsfunktionen hinterlegt sein, die der Ermittlung eines Verdünnungsfaktors unter Berücksichtigung zusätzlicher qualitativer oder semi-quantitativer Informationen über den zu überwachenden Prozess dienen.
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Das Computerprogramm kann in einer vorteilhaften Ausgestaltung eine Selbstlern-Funktion zum Erlernen von Verdünnungsfaktoren für gleichartige Bioprozesse aufweisen.
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Die Erfindung wird im Folgenden anhand der in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispiele erläutert. Es zeigen:
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1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
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2 eine graphische Darstellung der Konzentration eines Analyten (Analysenfunktion) als Funktion des Messsignals
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In 1 ist eine Vorrichtung 4 zur automatischen Analyse einer Probe eines Prozessmediums dargestellt. Die Vorrichtung 4 weist eine zentrale Steuerungs-/Auswerteeinheit 3 auf, die dazu dient, den gesamten Ablauf des Assay-Verfahrens einschließlich der Messwertbestimmung zu steuern. Die Steuerungs-/Auswerteeinheit 3 umfasst eine Datenverarbeitungseinrichtung mit einem oder mehreren Mikroprozessoren und Datenspeichern sowie ein, beispielsweise in einem Datenspeicher der Steuerungs-/Auswerteeinheit abgelegtes, Computerprogramm, das der Steuerung der Vorrichtung 4 zur Durchführung des Assay-Verfahrens und der Messwertbestimmung dient.
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Der Prozessbehälter 1 kann beispielsweise ein Fermenter sein, in dem ein biotechnologischer Prozess, der der Erzeugung eines Produktes dient, durchgeführt wird. Mit dem Prozessbehälter ist die Analysevorrichtung 4 über einen Prozessanschluss 2 verbunden, über den dem Prozessbehälter 1 Proben eines in dem Prozessbehälter 1 enthaltenen Prozessmediums entnommen werden können. Die Analysevorrichtung 4 umfasst außerdem einen Vorratsbehälter 5 mit einer zur Verdünnung der Proben verwendeten Flüssigkeit. Als Verdünnungsflüssigkeit kommt beispielsweise ein Puffer, welcher ähnlich dem für das Prozessmedium genutzten Puffersystem ist, in Frage, um Konformationsänderungen der Analyt-Moleküle durch starke Änderungen der Umgebungsbedingungen zu minimieren. Die Vorrichtung 4 umfasst einen weiteren Vorratsbehälter 7, in dem ein Assayreagenz enthalten ist, das den aus dem Prozessbehälter entnommenen, gegebenenfalls verdünnten Proben zur Durchführung des Assays zugesetzt werden kann. Die Vorrichtung 4 kann selbstverständlich je nach Art des durchzuführenden Assays auch mehrere Vorratsbehälter mit Assayreagenzien enthalten. Außerdem umfasst die Vorrichtung 4 einen Abfallbehälter 12 für verbrauchte Flüssigkeiten.
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Die Messeinrichtung 10 ist insbesondere dazu ausgestaltet, ein Messsignal einer Messgröße auszugeben, deren Wert von der Analytkonzentration in der Probe abhängt. Beispielsweise kann die Messeinrichtung auf einem Substrat immobilisierte Rezeptoren umfassen, an die zu detektierende Zielmoleküle, z. B. der Analyt und/oder ein Kompetitor des Analyten oder ein aus dem Assayreagenz und dem Analyten gebildetes Konjugat, durch spezifische Wechselwirkung binden. Die Messeinrichtung kann dazu ausgestaltet sein, von der Konzentration der an die Rezeptoren gebundenen Zielmoleküle und damit von der Konzentration des Analyten in der Probe abhängige Lumineszenz-Signale oder andere von der Analytkonzentration in der Probe abhängige optische Messgrößen zu erfassen.
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Die automatische Analysevorrichtung 4 weist eine Vielzahl von Flüssigkeitsleitungen auf, die den Prozessanschluss 2, den Vorratsbehälter 5 mit der Verdünnungsflüssigkeit und den Reagenzbehälter 7 mit der Messeinrichtung 10 und diese mit dem Abfallgefäß 12 verbinden. Einige oder alle dieser Flüssigkeitsleitungen sind mittels (nicht in der 1 gezeigten) Ventileinrichtungen wahlweise sperrbar oder freigebbar. Außerdem umfasst die Analysevorrichtung 4 Flüssigkeitstransportmittel, z. B. Pumpen oder pneumatische oder hydraulische Druckgeber, die zum Transport von Proben, Verdünnungsflüssigkeit, Assayreagenzien und/oder dem Abfall zuzuführender Flüssigkeiten über die Flüssigkeitsleitungen dienen. Die Steuerungs-/Auswerteeinheit 3 ist dazu ausgestaltet, die Ventile und Flüssigkeitstransportmittel zur Zuführung der Probe bzw. der mit den Flüssigkeiten versetzen Probe zu der Messeinrichtung 10 bzw. zur Abführung verbrauchter Proben nach der Messung aus der Messeinrichtung 10 in den Abfallbehälter zu steuern. Dies erlaubt eine vollständig automatisierte Durchführung von Assays zum Nachweis eines Analytgehalts in aus dem Prozessbehälter 1 entnommenen Proben.
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Hierzu wird beispielsweise vor dem Zuleiten einer Probe zu der Messeinrichtung 10 deren Messbereitschaft durch geeignete, komplett automatisiert ablaufende Verfahrensschritte, welche auch das sukzessive Durchleiten des Assayreagenz aus dem Vorratsbehälter 7 beinhaltet, sichergestellt. Aus einem in einem Prozessbehälter 1 enthaltenen Prozessmedium werden Proben über einen Prozessanschluss 2 entnommen und über Flüssigkeitsleitungen zu der Messeinrichtung 10 transportiert. Die zur Verdünnung der Probe verwendete, in dem Vorratsbehälter 5 enthaltene Flüssigkeit wird vor Zuleitung der Probe in die Messeinrichtung 10 der Probe zugeführt. Der Probe wird außerdem vor Zuführung zur Messeinrichtung das in dem Vorratsbehälter 7 enthaltene Assayreagenz zugeleitet. Alle Flüssigkeiten gelangen nach Durchleitung in das Abfallgefäß 12.
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Die Messeinrichtung 10 weist einen optischen Sensor auf, der einen optischen Detektor, wie z. B. eine Photodiode oder ein Photodiodenarray, umfassen kann, welcher dazu ausgestaltet ist, eine durch eine in der Messeinrichtung 10 durchgeführte chemische Reaktion erzeugte und von der Analytkonzentration in der Probe abhängige Chemilumineszenzstrahlung zu erfassen und ein von der Intensität der erfassten Strahlung abhängiges elektrisches Messsignal auszugeben.
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In einer anderen Ausgestaltung kann der optische Sensor zusätzlich zu dem Empfänger eine oder mehrere, z. B. eine oder mehrere LEDs umfassende, Lichtquellen aufweisen, wobei der Empfänger und die eine oder mehreren Lichtquellen in der Weise relativ zueinander angeordnet sind, dass von der oder den Lichtquellen ausgesendete Strahlung nach Durchlaufen einer in der Messeinrichtung 10 gebildeten Absorptionsmesszelle auf den Empfänger trifft. Ein derartig ausgestalteter optischer Sensor kann für Absorptionsmessungen zur Bestimmung des Analytgehalts verwendet werden, indem die, ggfs. verdünnte und mit Assay-Reagenzien versetzte, Probe oder ein aus einer unter Beteiligung des in der Probe enthaltenden Analyten verlaufenden chemischen Reaktion gebildetes Reaktionsprodukt in die Absorptionsmesszelle transportiert wird und mittels des Detektors die von der Konzentration des Analyten bzw. des Reaktionsprodukts abhängige Intensität der von der Lichtquelle ausgesendeten Strahlung nach Durchlaufen der Absorptionsmesszelle erfasst und in ein elektrisches Messsignal gewandelt wird.
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Die Steuerungs-/Auswerteeinheit 3 ist zur Steuerung der Messeinrichtung 10, insbesondere des optischen Sensors, mit dieser verbunden. Soweit der Sensor eine oder mehrere Lichtquellen umfasst, steuert die Steuerungs-/Auswerteeinheit 3 die Lichtquelle zur Aussendung von Messstrahlung.
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Das durch die Messeinrichtung 10 erzeugte elektrische, von der Analytkonzentration der Probe abhängige, Messsignal wird von der Steuerungs-/Auswerteeinheit 3 erfasst. Zur Bestimmung eines Messwerts der Analytkonzentration aus dem Messsignal ist in einem Speicher der Steuerungs-/Auswerteeinheit 3 eine Analysenfunktion hinterlegt, die, wie eingangs beschrieben, mittels Kalibriermessungen ermittelbar ist. Anhand der Analysenfunktion ordnet die Steuerungs-/Auswerteeinheit dem erfassten Messsignal einen Messwert zu und gibt diesen an eine übergeordnete Einrichtung, zum Beispiel an eine übergeordnete Prozesssteuerung, und/oder oder an eine Anzeigeeinrichtung, z. B. ein Display, aus.
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Es stellte sich in Experimenten heraus, dass zu beachten ist, dass abhängig von der Analysenfunktion ein Konzentrationsbereich des Analyten in der zu messenden Probe existiert, bei welchem dieselben relativen Schwankungen des Signals (Messfehler) zu minimalen Schwankungen bei der bestimmten Analytkonzentration führen. Es ist anzustreben, Messungen in diesem optimalen Messbereich innerhalb des Detektionsbereiches durchzuführen. In der 2 ist die Analysenfunktion bei einem kompetitiven Assay dargestellt (gestrichelte Linie). Die linke y-Achse (cAnalyt) gibt die Funktionswerte der Analysenfunktion als Funktion des Messsignals an. In 2 ist auch der Verlauf des relativen Fehlers der Konzentration (Summe relativer Fehler; punktierte Linie) als Summe aus denselben relativen positiven und negativen Schwankungen des Messsignals dargestellt. Die rechte y-Achse (Summe relative Fehler [%]) in 2 gibt die Werte des relativen Fehlers an. Im hier gezeigten Beispiel beträgt der sich aus den positiven und negativen Abweichungen des Messsignals ergebende Messfehler ±5% des Messsignals. Es ist deutlich erkennbar, dass bei der hier über den gesamten Messsignalbereich konstanten maximalen Messsignalabweichung bzw. Messsignalschwankung von ±5% Messsignale unter 1 und über 1,4 zu relativen Fehlern der ermittelten Konzentration von größer 36% führen. Daher ist der Verdünnungsfaktor automatisiert derart einzustellen, dass die Analytkonzentration der aktuell zu messenden Probe im optimalen Konzentrationsbereich von im vorliegenden Beispiel zwischen 18 μg/ml bis 40 μg/ml liegt.
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Häufig ist der qualitative Verlauf der Produktzunahme in biotechnologischen Prozessen aus Vorversuchen zur Etablierung des Prozesses im Rahmen der Entwicklung des Prozesses bekannt. Ist das Produkt oder eine Substanz, deren Konzentration von der Produktkonzentration abhängt, der Analyt, kann unter der Annahme einer kontinuierlichen Zunahme, unter Kenntnis des zu überwachenden Prozesses und aus dem vorhergehend bestimmten Analytgehalt der nächste/zukünftige Analytgehalt, z. B. der bei der nächsten Messung voraussichtlich vorliegende Analytgehalt (d. h. der Analytgehalt, der in der nächsten aus dem Prozessbehälter 1 entnommenen und der Messeinrichtung 10 zugeleiteten Probe vorliegt) prognostiziert bzw. abgeschätzt werden. Dies kann beispielsweise anhand des zuletzt gemessenen einzelnen Messwerts oder durch ein Interpolationsverfahren anhand zuvor ermittelter Werte erfolgen. Hierzu dienen beispielsweise die letzten beiden erfassten Messwerte. Ausgehend davon wird ein Verdünnungsfaktor bestimmt, welcher auf die anschließend dem Prozessbehälter 1 entnommene Probe automatisiert durch Zuleitung von Verdünnungsflüssigkeit aus dem Behälter 5 zu der Probe vor Zuführung zur Messeinrichtung 10 angewandt wird und welcher als Multiplikationsfaktor in die Konzentrationsbestimmung miteinfließt. Dabei wird idealerweise eine Verdünnung erzielt, welche zur Messung im optimalen Messwertbereich führt.
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Zu dieser Abschätzung des nächsten Analytgehalts und zur Bestimmung der bei der nächsten Messung auf die Probe anzuwendenden Verdünnung dient ein in der Steuerungs-/Auswerteeinheit 3 hinterlegtes Programm. Die für das Programm erforderlichen Parameter, insbesondere Extrapolationsfunktionen, welche vorzugsweise zusätzlich qualitative oder semiquantitative Informationen über den zu überwachenden Prozess berücksichtigen, können in einem Speicher hinterlegt sein, auf den die Steuerungs-/Auswerteeinheit bei Ausführung des Programms Zugriff hat.
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Das Programm kann in vorteilhafter Weise selbstlernend ausgestaltet sein, d. h. dass die abgeschätzten Analytgehalte nacheinander entnommener Proben bzw. die daraus ermittelten Verdünnungen in einem Speicher abgelegt und für spätere Messreihen verwendet werden können. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn die Vorrichtung zur Analyse einer Probenflüssigkeit regelmäßig zur Überwachung gleichartiger Bioprozesse, insbesondere desselben Bioprozesses, eingesetzt wird.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102010064391 A1 [0002]
- DE 102010064392 A1 [0002, 0036]
- WO 2012/055606 A1 [0002]
- WO 2012/055607 A1 [0002]
- DE 201010064391 A1 [0036]
- WO 2012055606 A1 [0036]
- WO 2012055607 A1 [0036]
