DE10339727A1

DE10339727A1 - Verfahren zur Bestimmung der adulten Neurogenese

Info

Publication number: DE10339727A1
Application number: DE2003139727
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr. Kempermann; Moritz Brandt; Sebastian Dr. San Diego Jessberger
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 2003-08-22
Filing date: 2003-08-22
Publication date: 2005-03-17
Also published as: WO2005022163A2; WO2005022163A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der adulten Neurogenese, die Verwendung von transient postmitotisch experimierten endogenen Zellbestandteilen zur Bestimmung der adulten Neurogenese sowie einen Bioassay und einen Kit zur Bestimmung dieser.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der adulten Neurogenese, die Verwendung von transient postmitotisch exprimierten endogenen Zellbestandteilen zur Bestimmung der adulten Neurogenese sowie ein Bioassay und einen Kit zur Bestimmung dieser.

Die moderne Neurobiologie ist über weite Teile von der Ansicht geprägt, dass in einem erwachsenen Gehirn nichts regenerieren könne. Diese Auffassung hat sich in Lehrbüchern dergestalt weit festgesetzt, dass von einem Dogma gesprochen werden kann. In den vergangenen Jahren sind immer wieder Beobachtungen gemacht worden, die mit diesem Dogma nicht in Übereinstimmung zu bringen sind. So zeigte sich beispielsweise bei Verletzungen des Gehirns, dass durch Modifikationen der Struktur in nicht verletzten Bereichen zum Teil Aufgaben der zerstörten Areale übernommen werden konnten, wobei diese Modifikation ein Hinweis auf eine Plastizität im adulten Gehirn waren.

Eine Neurogenese im adulten Gehirn wurde erstmals 1965 von Altman und Das als adulte hippocampale Neurogenese beschrieben. Diese und dann im Weiteren detaillierteren experimentellen Daten widersprachen der gängigen Vorstellung von der Architektur des Gehirns und vom Umfang der überhaupt möglichen Plastizität. Insbesondere durch die Arbeiten von Notteboom konnte gezeigt werden, dass in Singvögeln der Vorgang des Lernens mit einer massiven Neubildung von Nervenzellen korreliert. Da jedoch zunächst eine adulte hippocampale Neurogenese bei Primaten nicht gefunden werden konnte, war jedoch die Relevanz dieser Untersuchungen in biomedizinischer, anthropozentrischer Sicht fragwürdig. Im Jahre 1996 konnten durch Kuhn et al experimentelle Versuchsanordnungen etabliert werden, mit denen die adulte hippocampale Neurogenese im Affen und schließlich auch beim Menschenbeschrieben werden konnte.

In der subgranulären Zone des Gyrus dentatus existiert eine Population sich teilender Stamm- oder Vorläuferzellen. Tochterzellen, die aus asymmetrischen Teilungen dieser Zellen hervorgehen, schlagen den Weg zur Differenzierung in Nerven- oder Gliazellen ein. Dabei überlebt nur ein Bruchteil der neugeborenen Zelle, zumeist wird die Mehrheit über apoptotische Mechanismen eliminiert. Wie in der Embryogenese scheint also auch in der adulten Neurogenese ein Überschuss an potentiellen Nervenzellen produziert zu werden, von denen durch Selektionsvorgänge die wirklich benötigten Zellen rekrutiert werden, wobei die Vorgänge der Zellgeburt und des Zelltodes eng miteinander verknüpft sind.

Viele neurologischen Erkrankungen sind mit physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen. der Modulation der adulten Neurogenese bzw. von begleitenden Phänomenen verbunden bzw. haben eine Komponente, die die Hirnregion des Hippocampus betrifft. Insbesondere Lernstörungen und Merkfähigkeitsstörungen sind die Folge derartiger Veränderungen. Die wichtigsten Erkrankungen in diesem Kontext sind der Morbus Alzheimer, die Temporallappenepilepsie sowie die endogene Depression. Es wird vermutet, dass diesen Erkrankungen eine chronische Störung der Anpassungsfähigkeit des Hippocampus zugrunde liegt. Da der Hippocampus – wie bereits ausgeführt – anders als andere Hirnregionen lebenslang neue Nervenzellen produzieren kann, betrifft die gestörte Plastizität auch die Neubildung von Nervenzellen aus lokalen Stamm- und Vorläuferzellen. Es besteht daher in der Fachwelt Einigkeit, dass Medikamente, die die adulte Neurogenese modulieren können, vielversprechende Kandidaten für neuartige Behandlungsoptionen bei den genannten Erkrankungen sind.

Nachteilhafterweise ist jedoch die adulte Neurogenese bisher nur sehr aufwendig zu detektieren und zu bestimmen. Bei den bekannten Methoden ist eine Injektion einer Markersubstanz notwendig, die die teilungsaktiven Zellen markiert. Nach der Markierung kann erst nach dem Ablauf einer bestimmten Zeit, die es den neuen Zellen erlaubt auszureifen, die Neurogenese immun-histochemisch anhand der Markerverteilung untersucht werden. Um zum Beispiel Substanzen auf ihre Wirkung auf die adulte Neurogenese in vivo zu untersuchen, benötigt man daher eine hohe Versuchstierzahl, ein aufwendiges experimentelles Design und eine lange Versuchsdauer.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren und einen Assay bereitzustellen, mit dem die adulte Neurogenese einfach, sicher und effektiv bestimmt werden kann.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Bestimmung der adulten Neurogenese, wobei in mindestens einer Nervenzelle transient postmitotisch exprimierte endogene Zellbestandteile bestimmt werden. Im Sinne der Erfindung kann es beispielsweise vorgesehen sein, die adulte Neurogenese in Ab- und Anwesenheit von Substanzen zu bestimmen, die dahingehend untersucht werden sollen, ob ihre Anwesenheit bzw. Abwesenheit die adulte Neurogenese verändert bzw. moduliert. Hierzu kann die auf ihre neurogene Wirksamkeit hin zu untersuchende Substanz beispielsweise in ein Versuchstier in einer für die betreffende Versuchsreihe standardisierten Weise und für eine bestimmte Dauer verabreicht werden. Dies kann bevorzugt durch tägliche parenterale Verabreichung der Substanz für eine Dauer von 1 bis 4 Wochen erfolgen. Die exakten Werte sind dem Fachmann bekannt und richten sich nach den Vorerfahrungen und gegebenenfalls nach Pilotversuchen mit den entsprechenden Substanzen. Am Ende der jeweiligen durch Pilotversuche bestimmten Versuchszeit wird den Versuchsorganismen eine Probe aus dem Gehirn entnommen oder das Gehirn komplett, bevorzugt werden sie hierzu vorab getötet. Es kann selbstverständlich auch vorgesehen sein, nur ein bestimmtes Hirnareal zu entnehmen, so dass die Tötung des Versuchsorganismus im Sinne der Erfindung nicht zwangsläufig ist. Das entnommene Gehirn bzw. die entnommenen Gewebeteile können entsprechend den üblichen Standardverfahren für die histologische bzw. für die immunhistologische Untersuchung fixiert und vorbereitet werden. Mit spezifischen Erkennungssubstanzen werden dann die transient postmitotisch exprimierten Zellbestandteile und somit die unreifen Nervenzellen im histologischen bzw. im immunhistochemischen Verfahren sichtbar gemacht. Bei den Erkennungssubstanzen kann es sich beispielsweise um Substanzen handeln, die auf der Nukleinsäure- bzw. auf der Aminosäureebene die Zellbestandteile detektieren können. Hierbei kann es sich beispielsweise um Antikörper, um fluoreszierende Markersubstanzen, um Antisense-Konstrukte, um Chelatoren oder um andere dem Fachmann bekannte Strukturen handeln, die mit Zellbestandteilen bevorzugt auf der Proteinebene so wechselwirken können, dass ihre Detektion und insbesondere ihre qualitative und quantitative Bestimmung möglich ist. Bei den zu detektierenden endogenen Zellbestandteilen kann es sich beispielsweise um exprimierte Eiweiße oder um Kohlenhydrate und Lipide handeln. Unter transienter postmitotischer Expression im. Sinne der Erfindung wird die Messbarkeit des ausgewählten endogenen Zellbestandteils während einer Reifeperiode einer neuen Nervenzelle nach Abschluss der Zellteilung verstanden, die unterscheidbar über oder unter der entsprechenden Messbarkeit in reifen Nervenzellen liegt.

Wenn ein Zellbestandteil nur vorübergehend und nur während eines bestimmten Entwicklungsstadiums der Zelle exprimiert wird, so lässt sich umgekehrt durch Detektion dieses Zellbestandteils in Erfahrung bringen, ob sich eine bestimmte Zelle zum Untersuchungszeitpunkt in diesem Entwicklungsstadium befindet.

Die Wechselwirkung der Erkennungsmoleküle mit den zu detektierenden endogenen Zellbestandteilen führt zu einer Markierung bestimmter Zellen, deren Zahl bestimmt wird und gegebenenfalls zur Gesamtzahl der Nervenzelle in der betreffenden Hirnregion ins Verhältnis gesetzt wird. Die Wirksamkeit verschiedener Substanzen auf die Produktion junger Nervenzellen kann so einfach, sicher und effizient verglichen werden und als Maß für die Nervenzellneubildung im erwachsenen Gehirn und die neurogene Wirksamkeit der untersuchten Substanzen genommen werden. Eine Substanz oder eine andere Maßnahme, die zu mehr Nervenzellen in einem frühen Stadium der Entwicklung führt, würde als einer Substanz, in deren Gegenwart nur wenige solcher Zellen gefunden werden, in dieser Hinsicht überlegen angesehen werden.

Es ist selbstverständlich möglich, das Verfahren mit einem Marker oder mit einer Kombination aus zwei oder mehreren durchzuführen. So kann es vorgesehen sein, einen prozentualen Anteil bestimmter Marker zu verwenden. Das Verfahren kann invasiv oder nicht invasiv durchgeführt werden; selbstverständlich ist es möglich, ein nichtinvasives und ein invasives Verfahren zu kombinieren. So kann zunächst eine Bestimmung anhand eines oder mehrerer Marker nicht-invasiv erfolgen, wobei im Anschluss eine invasive Bestimmung mit den gleichen oder anderen Markern wie bei der nicht-invasiven Bestimmung durchgeführt wird.

Ein derartiges Verfahren ermöglicht eine schnelle Durchführung der Testung der adulten Neurogenese und es werden mehr Informationen aus einem einzigen Experiment gewonnen, wobei eine Abfolge an Experimenten, aber auch ein Einzelexperiment mit dem erfindungsgemäßen Verfahren leicht standardisierbar ist. Sofern das Verfahren an Versuchstieren durchgeführt wird, folgt daraus eine Minimierung der zu verwendenden Versuchstiere. Es ist im Sinne der Erfindung, selbstverständlich nicht zwingend, dass das Verfahren an Tieren durchgeführt wird, es kann selbstverständlich auch im humanen Bereich angewendet werden. Sofern das erfindungsgemäße Verfahren beim Menschen angewendet wird, erfolgt die qualitative und/oder quantitative Bestimmung der adulten Neurogenese bevorzugt durch die Erfassung neu gebildeter Zellen, wobei nichtinvasive Verfahren und Vorrichtungen eingesetzt werden. Hierbei kann es sich beispielsweise um bildgebende und nuklearmedizinische Verfahren handeln, wie beispielsweise Positronenemissionstomographie, SPECT, Computertomographie und/oder Kernspintomographie und andere.

Der Nachweis der adulten Neurogenese mittels der genannten Marker, insbesondere Calretinin hat mehrere Vorteile gegenüber den bekannten Verfahren.

Um Aussagen über die Wirksamkeit einer Substanz in der Regulation der Nervenzellneubildung zu machen, sind rein qualitative Aussagen nämlich wenig hilfreich, da ja gegebenenfalls die Überlegenheit der einen Substanz über eine andere dokumentierbar sein sollte und diese sich eben in einem zähl- und messbaren Mehr an Nervenzellen ausdrückt.

In bestimmten experimentellen Kontexten kann das auch bedeuten, dass sich Vorteile in Bezug auf rein qualitative Aussagen ergeben. Insbesondere Calretinin ist im Zytoplasma der neuen Nervenzellen exprimiert, so dass z. B. eine immunhistochemischen Markierung von Calretinin die Struktur der Zelle gut sichtbar macht. Wenn eine zu testende Wirksubstanz sich auf das Aussehen der Zelle auswirkt, kann dies leicht erfasst werden. Auch dies ist bei den bekannten Methoden, deren Markerantigene sich nur im Zellkern befinden, anders: während der Zellkörper und seine Fortsätze eine veränderte Morphologie gut sichtbar machen, ist das am Zellkern sehr viel schwieriger abzulesen. Man wird also insbesondere mit Calretinin den neugebildeten Nervenzellen leichter ansehen können, ob sie sich normal und gesund entwickelt haben.

Die Methode, die Zahl der neugebildeten Nervenzellen über die Zahl der Zellen, die Calretinin exprimieren, abzuschätzen, hat entscheidende praktische Vorteile. Alle neuen Nervenzellen weisen ein sogenanntes Calretininstadium auf, aber dieses Stadium folgt erst, wenn sich die Zahl der Zellen nicht mehr stark ändert, da die Zellen im Calretininstadium die Zellteilungsaktivität eingestellt haben, d. h. postmitotisch geworden sind. Deshalb ist die erfindungsgemäße Methode sehr sensitiv. Da nur die neugebildeten Nervenzellen Calretinin oder die anderen genannten Marker exprimieren, ist die erfindungsgemäße Methode auch sehr spezifisch. Der Hauptvorteil der neuen Methode liegt darin, dass es insbesondere mit Calretinin einen Marker gibt, der die neugebildeten Zellen von anderen Zellen der gleichen Hirnregion unterscheidet, so dass sie einfach erfasst werden können. In jedem anderen bekannten Verfahren müssen die sich entwickelnden Zellen zunächst aufwendig markiert werden, um post hoc in einem weiteren Schritt bestimmen zu können, ob sich markierte Zellen in neue Nervenzellen entwickelt haben. Dies ist umständlicher und weniger ökonomisch, erfordert mehr Tiere im Tierversuch, sofern invasive Verfahren mit Versuchstieren durchgeführt werden, erhöht die Fehlerwahrscheinlichkeit, da die Auswertung schwieriger ist, und ist auch kaum automatisierbar, quantitativ ist die klassische Methode etwas weniger genau, da die Analyse in zwei Schritten erfolgen muss. Die Vorteile der Calretininmethode sind also:

• Hohe Sensitivität und Spezifität
• Einfache, direkte Quantifizierbarkeit mit hoher Genauigkeit und Verlässlichkeit
• Qualitative Aussagen zur Zellstruktur und Morphologie sind problemlos im gleichen Untersuchungsgang möglich
• Geringerer experimenteller Aufwand mit weniger Tieren und billigeren Reagenzien
• potentiell gute Automatisierbarkeit
• Einfacherer Aufbau des Tests (nur eine histologische Färbung, die am normalen Lichtmikroskop ausgewertet werden kann und ebenfalls potentiell automatisierbar ist)
• Die Versuchsorganismen erhalten einzig die Testsubstanz, deren Wirkung auf die Nervenzellneubildung untersucht werden soll, aber keine zusätzliche Markersubstanz, so dass die Auswirkungen möglicher Interaktionen zweier applizierter Substanzen auf das Messergebnis entfallen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den postmitotisch exprimierten endogenen Zellbestandteilen um Proteine, Kohlenhydrate und/oder Lipide einschließlich ihrer Modifikationen, wie beispielsweise Phosphorylierungen, Glykosylierungen, Polysyalilierungen und enzymatische Spaltungen. Besonders bevorzugt sind die Calcium-bindenden Proteine, insbesondere Calbindin, Parvalbumin, Calretinin, MRP8, MRP14 sowie die Familie der 5100 calcium-bindenden Proteine, insbesondere S100B (oder beta) und andere, ganz besonders bevorzugt ist Calretinin.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem endogenen Zellbestandteil um Calretinin oder Calbindin. Bevorzugt ist es durch die Detektion von diesem Protein auf der Aminosäure- bzw. auf der Nukleinsäureebene möglich, die adulte Neurogenese schnell und sicher zu bestimmen. Neben Parvalbumin, Calbindin gehört Calretinin zu den Calcium-bindenden Proteinen, die in verschiedenen Neuronentypen nachgewiesen werden können. Calretinin ist ein Calcium-Bindungsprotein, welches in bestimmten Typen von Nervenzellen, insbesondere Interneuronen exprimiert wird. Es findet sich jedoch auch als transient exprimiertes Molekül in reifenden Körnerzellen des Hippocampus. Calbindin ist ein Calciumbindungsprotein, das in der Produktion, Stabilisierung und Aufrechterhaltung der Zytoskelettelemente involviert ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Nervenzellen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Körnerzellen von Hippocampus (Gyrus dentatus), Riechhirn (Bulbus olfactorius, Wände der Seitenventrikel und rostraler Migrationsstrom) und Kleinhirn, Projektionsneurone (insbesondere auch Pyramidenzellen) des Cortex und subcorticaler Hirnabschnitte, Principalzellen im Hippocampus (Gyrus dentatus, Hilus, CA3, CA2 und CA1) und Riechhirn, Interneurone in Hippocampus, Hirnrinde, Riechhirn und subcorticalen Hirnabschnitten. Die Gruppe umfaßt auch neurosekretorische Nervenzellen des Hypothalamus, Purkinjezellen des Kleinhirns und sensorische Nervenzellen der Sinnesorgane und nachgeschalteten Zentren. Im Sinne der Erfindung ist ein Neuron (eine Nervenzelle) jede Zelle, die zu einem Aktionspotential fähig ist. Die genannten Zellen können Bestandteil einer Probe für das erfindungsgemäße Verfahren sein. Durch die Analyse der Probe mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, Aussagen über die adulte Neurogenese innerhalb der Probe zu generieren.

Eine Probe im Sinne der Erfindung ist die Bezeichnung für ein durch Probenentnahme entnommenes biologisches Gut oder eine Teilmenge bzw. eine kleine Menge eines solchen, dessen Beschaffenheit chemisch, biologisch, klinisch oder ähnlich geprüft werden kann, insbesondere um aus dieser Probe Erkenntnisse zur adulten Neurogenese zu gewinnen; die Probe kann zum Beispiel eine Ansammlung von Zellen sein oder ein Stück eines Hirns. Die Probenentnahme oder -gewinnung erfolgt insbesondere so, dass die entnommene Teilmenge einem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Die durch die Untersuchung bzw. aus der Probe ermittelten Merkmale können der Beurteilung der adulten Neurogenese in der durch die Probe erfassten Menge, die Rückschlüsse auf die Gesamtmenge zulässt, verwendet werden. Für die Untersuchung können die Proben durch Mischen, Zerteilen, Separieren, Vorfraktionieren, Zerkleinern, Zugabe von Enzymen oder Markern bzw. anders vorbehandelt werden. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten der Vorbehandlung der Proben bekannt. Selbstverständlich kann es auch vorgesehen sein, dass die Probe so entnommen wird, dass sie keinem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Eine Probe sind vor allem biologische Materialien, die Strukturen umfassen, die mit der Weiterleitung bzw. Speicherung von Informationen auf biologischer Grundlage geeignet sind. Hierzu gehören beispielsweise das ZNS bzw. Teile davon, der Hippocampus (mit seinen Unterabschnitten plus angrenzenden Arealen, insbesondere Subiculum, Parasubiculum) das Rückenmark und das verlängerte Mark, inklusive des Hirnstammes, der Neokortex und subcorticale Hirnabschnitte, das Striatum, das Kleinhirn und andere. Es kann sich aber in bestimmten Fällen weiterhin um Flüssigkeiten, Zellansammlung bzw. Gewebe handeln, die z.B. vorzugsweise Körnerzellen umfassen; aber auch um Strukturen, die Nervenzellen (nach obiger Definition und Liste von Beispielen) enthält. Die Probe kann demgemäß zahlreiche andere Materialien umfassen, wie zum Beispiel Blut, Lymphe, Gehirnflüssigkeit und viele andere mehr. Es ist aber auch möglich, dass die Probe nur Teile der Nervenzellen insbesondere beispielsweise das Soma oder die Fortsätze (Neuriten, Neuropil) enthält.

Neuronen im Sinne der Erfindung sind alle Nervenzellen, die als hoch differenzierte Zellen zum Empfang, zur Bearbeitung und zur Weiterleitung nervöser Erregungen befähigt sind. Diese Zellen kommen beispielsweise im zentralen, peripheren und autonomen Nervensystem und in den Sinnesorganen vor und können eine Teilmenge der Probe sein.

Bei den Nervenzellen kann es sich beispielsweise um Nervenzellen aus Tieren oder Menschen handeln, bevorzugt sind insbesondere Körnerzellen, Pyramidenzellen und Interneurone im Hippocampus und Interneurone im Riechhirn.

Die Zellen können aus verschiedenen Geweben entnommen werden. Das Zentrale Nervensystem wird im Sinne der Erfindung in Gehirn und Rückenmark eingeteilt. Das Nervensystem teilt man ein in periphere, zentrales und autonomes Nervensystem. Neokortex und Striatum sind Teile des Gehirns. Wichtige Regionen mit adulter Neurogenese sind der Hippocampus und Riechhirn (Ventrikelwand, einschließlich den darunterliegenden Basalganglien, den Riechkolben und die dazwischenliegende Migrationsstrecke des rostralen Migrationspfads). Aber selbstverständlich können auch Nervenzellen aus anderen Regionen, in denen eine Neubildung von Nervenzellen beschrieben wird, eingesetzt werden.

Im Sinne der Erfindung sind Nervenzellen (Neurone) insbesondere Zellen, die im ZNS und dort insbesondere im Hippocampus und Riechhirn vorkommen. Diese Neuronen müssen jedoch im Sinne der Erfindung nicht ausschließ1ich im ZNS vorkommen.

Im Sinne der Erfindung sind Neurone bzw. Nervenzellen insbesondere solche, die aus Stamm- und Vorläuferzellen des erwachsenen Gehirns physiologischerweise oder nach Stimulation hervorgehen. Diese Zellen finden sich im gesamten Gehirn, bilden aber physiologischerweise nur im Hippocampus und Riechhirn neue Nervenzellen. Stamm- oder Vorläuferzellen sind undifferenzierte Zellen, die zur Selbsterneuerung fähig sind und aus denen ausreifende Zellen einer oder mehrerer Typen hervorgehen können. Im Rahmen dieser Differenzierung findet sich zwischen dem Stadium der Stamm- oder Vorläuferzellen und dem der ausgereiften Neurone ein intermediäres Stadium, das beispielsweise anhand der Expression von Calretinin identifizierbar ist.

Im Sinne der Erfindung erfolgt insbesondere die Bestimmung der Modulation der adulten Neurogenese durch verschiedene pharmakologische Substanzen im Hinblick auf neurologische und psychiatrische Erkrankungen umfassend Demenz, Temporallappenepilepsie oder Depressionen.

Die Modifikation bzw. die Veränderung gegenüber der adulten Neurogenese gegenüber einem Normalwert kann im Sinne der Erfindung mit allen vom Gehirn ausgehenden oder von diesem geprägten Krankheiten assoziiert sein. Beispielsweise kann die Modifikation der Neurogenese mit einer Demenz assoziiert sein.

Eine Demenz im Sinne der Erfindung ist der Verlust erworbener intellektueller Fähigkeiten, insbesondere des Gedächtnisses und Personlichkeitsveränderungen beispielsweise als Folge einer hirnorganischen Erkrankung. Demenz im Sinne der Erfindung ist weiterhin der Rückgang kognitiver Leistungen im Alter. Demenz im Sinne der Erfindung sind aber auch Merkfähigkeits- und Gedächtnisstörungen, Orientierungsstörungen, wahnhafte Zustände oder der Verlust der Persönlichkeit.

Auch angeborene Minderungen der kognitiven Leistungsfähigkeit, sofern sie mit einer Störung der Nervenzellneubildung im erwachsenen Gehirn assoziierbar ist, gehören zu den neuropsychiatrischen Erkrankungen im Sinne der Erfindung.

Demenz ist insbesondere in höherem Alter die häufigste Ursache von Pflegebedürftigkeit in den Industrieländern. Die Diagnose der Demenz erfolgt erfindungemäß bevorzugt anhand klinischer Kriterien differentialdiagnostisch, weiterhin können (i) internistische, (ii) neurologische und/oder (iii) psychiatrische Krankheitsbilder berücksichtigt werden, die die Demenz begleiten oder die Demenz-artige oder Demenz-assoziierte Erkrankungen im Sinne der Erfindung sind, werden im Folgenden aufgeführt, wobei dem Fachmann bekannt ist, dass bei einer Demenz die internistischen, (ii) neurologischen und/oder (iii) psychiatrischen Krankheitsbilder das klinische oder medizinische Bild einer Demenz dominieren oder aber völlig abwesend sein können; die internistischen (ii) neurologischen und (iii) psychiatrischen Krankheitsbilder können durch die erfindungsgemäße Lehre je nach Krankheitsverlauf selbstverständlich mit erfasst sein.
zu (i): chronisch obstruktive Lungenerkrankungen, chronische Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen, rezidi vierende Asystolien, Hypothyreose, Hyperthyreose, Hypoparathyreoidismus, Hyperparathyreoidismus, chronische Urämie, Leberzirrhose, Folsäuremangel, Vitamin-B₆-Mangel, Vitamin-Bl2-Mangel, Intoxikationen durch Industriegifte z.B. Kohlenmonoxid, Quecksilber, Blei, Perchloräthylen, Intoxikationen durch Medikamente z.B. Psychopharmaka, Anticholinergika, Antihypertonika, Antikonvulsiva, Betablocker, Digoxin, Immunvaskulitis, Exsikkose, Elektrolytstörungen – Hyponatriämie und Hypernatriämie –, rheologisch bedingte Hirndurchblutungsstörungen z.B. bei Polyzythämie und multiplem Myelom;
zu (ii): chronisch subdurales Hämatom, Hirntumoren, Parkinson Krankheit, Hydrocephalus aresorptivus, Chorea Huntington, Multiple Sklerose, chronischer Alkoholismus, infektiöse Erkrankungen wie Meningoenzephalitiden, Lues, Hirnabszess, Creutzfeldt-Jakob Krankheit oder einem Demenzkomplex mit Lewy Körperchen und
zu (iii): Depression, Oligophrenie oder Schizophrenie.

Durch die Offenbarung der vorliegenden Erfindung, kann der Fachmann die adulte Neurogenese im Zusammenhang mit verschiedenen Erkrankungen. bestimmen. Die Klassifikation dieser Krankheiten kann auf mehrere Arten erfolgen. Dem Fachmann ist bekannt, dass er die genannten Krankheiten auch anders klassifizieren kann, z.B. in affektive Erkrankungen, insbesondere die Majordepression und bipolare Störungen, posttraumatische Streßerkrankungen, psychotische Krankheitsbilder insbesondere die Schizophrenie in ihren Ausprägungsformen; Autismus, Persönlichkeitsstörungen, Zwangserkrankungen, Hyperaktivitätssyndrome und Aufmerksamkeitsstörungen. Aber auch Prionenerkrankungen in ihrer erworbenen oder familiären Form sind eine Demenz im Sinne der Erfindung.

Wichtige Demenzformen im Sinne der Erfindung sind die primär kortikal-degenerative Form vom Alzheimer Typ und die angeborenen (insbesondere zum Beispiel CADASIL) oder erworbenen vaskulären Formen der Demenz mit den Begleitsymptomen: Depression, Schlafstörung, Sprach- und Bewegungsstörungen, Harn- und Stuhlinkontinenz sowie chronische Obstipation. Es kann vorgesehen sein, dass die erfindungsgemäße Therapie in einem ganzheitlichen Konzept eingebettet ist, dessen Ziel die Aktivierung des Patienten, die Verbesserung seiner kognitiven Leistungsfähigkeit und die Kompensation seiner gestörten sozialen Integration ist.

Eine Demenz im Sinne der Erfindung kann z.B. nach DSM IV definiert werden; dem Fachmann ist diese Einteilung aus Standardwerken im Detail bekannt, es wird daher im Folgenden nur auf einzelne Beispiele verwiesen:
Unter 300 = Organische und psychotische Störungen, Wahn und Autismus
über 300 = Neurosen, und (fast) alles andere

Interpretatioa der 2. Stelle (300-319):

0 = nicht organisch, neurotisch, reaktiv in der Genese
1 = (vermuteter) leichter organischer Verursachungsfaktor

Interpretation der 3. Stelle:

290 = Alzheimer
291-2 = Substanzentzug oder -intoxikation mit Delir, Wahn, organischen Störungen
293 = Störungen aufgrund eines medizinischen Krankheitsfaktors
294 = andere Demenzen
295 = Schizophrenien und schizoaffektive Störung
296 = Affektive Störungen (nicht neurotisch)
297 = Wahn
298 = reaktive und atypische Psychosen
299 = Autismus und andere Entwicklungsstörungen (nicht näher bezeichnet)
300 = Neurosen (im klassischen Sinn)
301 = Persönlichkeitsstörungen
302 = Sexualstörungen (ohne medizinschen Krankheitsfaktor)
303 = Alkoholabhänigkeit und -intoxikation
304 = Abhängigkeit von psychotropen Substanzen
305 = Substanzmißbrauch und -intoxikation
307 = spezielle Entwicklungs- und Schlafstörungen
308-9 = Anpassungs- und Belastungsstörungen
310 = organisch bedingte Persönlichkeitsstörungen
311 = depressive Störungen (nicht näher bezeichnet)
312 = Störungen der Impulskontrolle, Monomanien
314 = Aufmerksamkeitsstörungen und Hyperaktivität
315 = Sprach-, Rechen- und Motorikstörungen bei Kindern
316 = körperliche Zustände bei denen psychische Faktoren eine Rolle spielen
317-9 = Oligophrenien

Spezielle Codieruagen (Auswahl):

332-3 = Neuroleptikanebenwirkungen und -folgen
347 = Narkolepsie
607-25 = sexuelle Funktionsstörungen aufgrund eines medizinischen Krankheitsfaktors
780 = Schlafstörungen aufgrund eines medizinischen Krankheitsfaktors
780.09 = Delir (nicht näher bezeichnet)
780.9 = altersbedingter kognitiver Abbau
787 = Enkopresis mit Verstopfung und Überlaufinkontinenz

Besonders bevorzugt ist neben dementieller Entwicklung (Kognitiver Abbau) im Rahmen des Alterns (Nachlassen der geistigen Leistungsfähigkeit, kombiniert mit schneller Ermüdbarkeit, fortschreitenden Störungen des Gedächtnisses und der Orientierung, etc.) insbesondere die Demenz in der Form von Alzheimer. Alzheimer im Sinne der Erfindung ist eine multifaktorielle, familäre oder erworbene senile, zumeist im 5. bis 6. Lebensjahrzehnt klinische manifest werdende Form der Demenz, pathologisch gekennzeichnet durch eine fortschreitende Großhirnrindenatrophie mit senilen Plaques, Degeneration von Neurofibrillen und kongophiler Angiopathie. Alzheimer ist im Sinne der Erfindung unter Umständen mit verwaschenen Herdsymptomen (Aphasie, Apraxie) kombiniert.

Im Sinne der Erfindung wird der Begriff Depression sehr weit definiert. Dieser Begriff ist nicht an typische altersbedingte oder endogene bzw. exogene Faktoren gebunden. Bevorzugt ist die Majordepression, die nicht zwingend eine erkennbare körperliche Erkrankung als Ursache haben muss oder mit einem äußeren seelischen Anlass begründbar ist. Jede Form der traurigen Verstimmung, des Gefühls der Hoffnungslosigkeit und inneren Leere, der Willens-, Denk- und Antriebshemmung, die gegebenenfalls auch körperlich empfunden werden können, beispielsweise als Schwäche oder Herzangst, sind endogene Depressionen im Sinne der Erfindung. Verminderte Konzentration und Aufmerksamkeit sowie vermindertes Selbstwertgefühl und Selbstvertrauen, Gefühle von Schuld und Wertlosigkeit wie auch negative und pessimistische Zukunftsperspektiven und Suizidgedanken, -pläne und/oder -handlungen, wie auch Schlafstörungen und verminderter Appetit sind im Sinne der Erfindung Symptome, bevorzugt Zusatzsymptome zu Depressionserkrankungen. Kernsymptome sind bevorzugt eine depressive Stimmung in dem Sinne, wie sie dem durchschnittlichen Fachmann bekannt ist, der Verlust von Interesse und Freude sowie die erhöhte Ermüdbarkeit. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die nähere Charakterisierung von Demenz bzw. Depressionen durch die Bestimmung der Modifikation der adulten Neurogenese beschränkt, sämtliche neurologischen oder psychiatrischen Erkrankungen können mit einer Veränderung der Neurogenese einhergehen.

Im Sinne der Erfindung kann die adulte Neurogenese im Zusammenhang mit der Diagnose oder Therapie folgender Erkrankungen bestimmt werden: neurodegenerative Erkrankungen insbesondere der Morbus Parkinson und andere Bewegungsstörungen, Morbus Alzheimer und andere demenzielle Syndrome, Tumorerkrankungen des Gehirns, insbesondere Glioblastoma multiforme, Gangliogliome und Neurocytome, Suchterkrankungen, insbesondere Alkohol, Cannabis und Opiatmißbrauch, Entzündungserkrankungen des Gehirns, insbesondere Multiple Sklerose, und die Folgen von Minderdurchblutung (Ischämie, Schlaganfall, Bluthochdruck) und Hirnverletzungen. Dem Fachmann sind weitere neurologische Erkrankungen bekannt.

Bevorzugt ist weiterhin eine genauere Analyse der Temporallappenepilepsie durch die erfindungsgemäße Bestimmung der adulten Neurogenese. Die Temporallappenepilepsie ist eine partielle Epilepsie mit Lokalisation der neuronalen Entladung im Lobus temporalis oder Teilen davon. Sie zeigt fokale und sekundär oder primär generalisierte Symptome motorischer oder sensorischer Art, mit oder ohne Aura, insbesondere auch psychomotoriche Anfälle, wie sie dem Fachmann bekannt sind.

Bei der Epilepsie im Sinne der Erfindung kann es sich bevorzugt um eine der folgenden Epilepsien handeln, um die adversive, akinetische, audiogene, audiotive, corticalis, cursiva, diffuse, diurna, emotionelle, fokale, fotogene, generalisierte, genuine, halluzinatorische, hereditäre, idiopathische, laryngealis, limbische, major, menstrualis, metabolische, minor, musikogene, myoklonische, nocturna, nonconvulsiva, partialis, partialis continua, propulsiva, psychogene, psychomotorische, salivatorische, senilis, sensorische, symptomatische, tarda, traumatica, versive, visuelle, zentrenzephale, zerebellare Epilepsie.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Nervenzellen Körnerzell-Neuronen, insbesondere im erwachsenen Hippocampus eines Säugers.

Eine bevorzugte Methode basiert z. B. darauf, Calretinin in den interessierenden Zellen anzufärben und ihre Zahl zu bestimmen. Diese kann als direktes Maß für die Zahl der neugebildeten Nervenzellen genommen werden. In der bevorzugten Form handelt es sich um einen immunhistochemischen Nachweis im Gewebeschnitt am Hirngewebe von Mäusen, die die Testsubstanzen, deren Wirkung auf die Neubildung von Nervenzellen untersucht werden soll, verabreicht bekommen haben. Die gefärbten Schnitte werden am Lichtmikroskop ausgewertet. Die Zellen, die Calretinin enthalten, werden dabei gezählt. Dies erfolgt nach Regeln, wie sie dem Fachmann bekannt sind und die eine Auswertung von Stichproben erlauben. Man erhält als Ergebnis die Zahl der Calretinin-positiven Zellen pro Hippocampus. Diese korreliert direkt mit der Zahl neuer Nervenzellen. Ein Mehr an Calretinin wäre dann gleichbedeutend mit einem Mehr an Nervenzellneubildung.

Hieraus ergibt sich, dass die Untersuchung nicht allein immunhistochemisch erfolgen muss, sondern zum Beispiel auch proteinbiochemisch (Western Blot, HPLC) an homogenisierten Proben des Hirngewebes.

Auch kann die Methode dahingehend modifiziert werden, dass Calretinin in Zellen nicht immunhistochemisch mit Antikörpern gegen Calretinin sichtbar gemacht wird, sondern z. B. ein transgenes Tiermodell genutzt wird, in dem das grün fluoreszierende Protein GFP oder ein ähnliches Reportergen unter regulatorischen Genabschnitten des Calretiningens exprimiert wird. Calretinin-positive Zellen wären damit im Gewebe direkt sichtbar. Sie können wiederum mikroskopisch analysiert und quantifiziert werden oder aber beispielsweise mit Hilfe von fluoreszenzaktivierten Zellsortern oder Magnetseparation aus dem Gewebe extrahiert werden und so weiter untersucht werden. Für diese bevorzugte Variante der Methode werden geeignete regulatorische Sequenzen des Calretiningens („Calretinin-Promotor"), insbesondere solche, die für die nervenzellspezifische Calretininexpression verantwortlich sind, identifziert und in einem gentechnischen Konstrukt (Vektor) so mit dem Reportergen verbunden, dass bei Aktivierung der regulatorischen Elemente die Information für das Reportergen abgelesen wird und das dem Reportergen entsprechende Reporterprotein von der Zelle gebildet wird. Dieses Protein verteilt sich in der Zelle und kann dort nachgewiesen werden. Das Reportergen GFP oder die ihm verwandten rot-fluoresziierenden Reportergene beispielsweise lassen die exprimierenden Zellen bei Bestrahlung mit Licht geeigneter Wellenlänge grün (bzw. rot) aufleuchten. Es ist somit kein antikörpervermittelter Schritt notwendig, um die Calretinin-exprimierenden Zellen sichtbar zu machen. Um dies nutzen zu können, muss mit Hilfe des Vektorkonstruktes ein transgenes Tiere, bevorzugt eine transgene Maus, produziert werden, die dann untersucht werden kann.

Mit geeigneten radiologischen oder nuklearmedizinischen Methoden könnte die Zahl der Calretinin-positiven Zellen auch am lebenden Organismus bestimmt werden, was Langzeituntersuchungen im Zeitverlauf möglich machen würde. In jedem Fall entspräche der nachgewiesene Wert der Calretininexpression dem Ausmaß der ablaufenden Nervenzellneubildung. Während die mikroskopische Untersuchung am Hirnschnitt gleichzeitig qualitative und quantitative Aussagen zulässt, sind mit biochemischen oder bildgeberischen Verfahren insbesondere quantitative Aussagen möglich.

Der Nachweis von Calretinin kann in Mehrfachmarkierungen mit dem Nachweis anderer Marker kombiniert werden, so dass Aussagen über Untergruppen von Calretinin-positiven Zellen möglich sind. Besonders bevorzugt ist die Kombination mit MRP8, MRP14, Parvalbumin, 5100 und/oder Calbindin. Die Marker MRP8, MRP14, Parvalbumin und/oder 5100 können auch isoliert zur Detektion der adulten Neurogenese verwendet werden.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung transient postmitotisch exprimierter endogener Zellbestandteile zur Bestimmung der adulten Neurogenese. Bevorzugt wird hierbei die adulte Neurogenese in einem ausgewachsenen Gehirn anhand der Calretinin-Expression bestimmt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung eines die adulte Neurogenese modifizierenden Mittels, wobei die adulte Neurogenese gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in Gegenwart und/oder in Abwesenheit des Mittels durchgeführt und die Modifikation der Neurogenese detektiert wird und die Modifikation einen Hinweis auf ein Neurogenese-modifizierendes Mittel ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst dieses Verfahren weiterhin die Formulierung des identifizierten Mittels oder eines Derivates oder eines Homologen hiervon mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Die Erfindung betrifft auch ein Mittel zur Modifikation der adulten Neurogenese, erhältlich durch

a) in-Kontakt-bringen eines Mittel-Kandidaten mit Nervenzellen,
b) Bestimmung der adulten Neurogenese,
c) Abgleich der bestimmten Neurogenese mit einer Standard-Neurogenese und
d) gegebenenfalls Vergleich, ob das Mittel die adulte Neurogenese modifiziert.

Mittel oder pharmazeutische Zusammensetzungen, die vorliegend synonym verwendet werden können, sind erfindungsgemäß Stoffe und Zubereitungen aus Stoffen, die dazu bestimmt sind, durch Anwendung am oder im menschlichen oder tierischen Körper die adulte Neurogenese zu modifizieren. Medizinische Hilfsstoffe sind erfindungsgemäß solche Stoffe, die zur Produktion als aktive Ingredienzien von Arzneimitteln eingesetzt werden. Pharmazeutischtechnische Hilfsstoffe dienen der geeigneten Formulierung des Arzneimittels oder der pharmazeutischen Zusammensetzung und können sogar, sofern sie nur während des Herstellungsverfahrens benötigt werden, anschließend entfernt werden oder können als pharmazeutisch verträgliche Träger Teil der pharmazeutischen Zusammensetzung sein. Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann bekannt.

Die Arzneimittelformulierung oder Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzung erfolgt gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel. Beispiele für geeignete pharma zeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie z.B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Detergenzien, sterile Lösungen, etc. Arzneimittel oder pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Träger umfassen, können mittels bekannter konventioneller Methoden formuliert werden. Diese Arzneimittel oder pharmazeutischen Zusammensetzungen können einem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden, beispielsweise in einem Bereich von 1 μg bis 10 g an Molekülen pro Tag und Patient (Mensch oder Tier). Bevorzugt werden dabei Dosen von 1 mg bis 1 g. Bevorzugt wird eine Verabreichung von möglichst wenigen und niedrigen Dosen und weiter bevorzugt eine einmalige Dosis, beispielsweise auch eines radioaktivmarkierten Moleküls für die Diagnose oder die Untersuchung einer Zivilisationskrankheit.

Die Verabreichung kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, beispielsweise intravenös, intraperitoneal, intrarektal, intragastrointestinal, intranodal, intramuskulär, lokal, aber auch subkutan, intradermal oder auf der Haut oder über die Schleimhäute. Die Verabreichung von Nukleinsäuren – wie z.B. Antisense-Konstrukten – kann auch in Form von Gen-Therapie geschehen, beispielsweise virale Vektoren. Die Art der Dosierung und des Verabreichungsweges kann vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt werden. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie z.B. der Größe, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten, aber auch von dem speziellen Mittel, welches verabreicht wird, der Dauer und Art der Verabreichung und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen oder das Arzneimittel umfasst insbesondere das gefundene Mittel, dessen Stimulatoren oder -Agonisten, -Inhibitoren oder -Antagonisten, Erkennungsmoleküle gegen dieses, oder/und diese kodierende Nukleinsäuremoleküle in einer geeigneten Lösung oder Verabreichungsform enthält. Diese können entweder alleine mit den entsprechenden unter Arzneimitteln oder pharmazeutischen Zusammensetzungen beschriebenen Hilfsstoffen verwendet werden.

Die pharmazeutische Zusammensetzung oder das Arzneimittel kann selbstverständlich auch eine Kombination von zwei oder mehreren der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Arzneimittel sein sowie eine Kombination mit anderen Arzneimitteln, die auf eine geeignete Weise zeitlich gemeinsam oder getrennt verabreicht beziehungsweise angewandt werden. Die Herstellung oder pharmazeutische Zusammensetzungen der Arzneimittel erfolgen nach an sich bekannten Methoden.

Bevorzugt ist es, das Mittel als Diagnose-, Prophylaxe, Therapie-, Nachbehandlungs- und/oder Verlaufskontrollmittel einzusetzen, z. B. um die Behandlung der Modifikation der adulten Neurogenese zu verfolgen.

Die Erfindung betrifft auch einen Bioassay und einen Kit, die Erkennungsmoleküle umfassen, mit denen transient post mitotische exprimierte endogene Zellbestandteile, wie Calbindin, MRP8, MRP14 und/oder Parvalbumin, bevorzugt Calretinin, bestimmt und detektiert werden können. Bei den Erkennungsmolekülen im Kit oder Bioassay kann es sich beispielsweise um Antikörper, um Antisense-Konstrukte, um Chelatoren, um spezifisch wechselwirkende Lipide und Kohlenhydrate bzw. um Lektine, Helix-Bündel-Proteine, Fusionsproteine, und/oder Lipocaline handeln, deren Wechselwirkung mit den transient postmitotisch exprimierten endogenen Zellbestandteilen, bevorzugt Calretinin, so bestimmbar ist, dass eine Aussage über die adulte Neurogenese möglich ist. Weiterhin bevorzugt sind MRP8, MRP14 oder Parvalbumin. Antikörper im Sinne der Erfindung sind neben vollständigen Antikörpern single chain Antikörperfragmente, Multibodies, Fab-Fragmente, Fusionsproteine z.B. aus einem Antikörperfragment mit Peptiden oder Proteinen und/oder einem Immunglobulin der Isotypen IgG, IgM, IgA, IgE, IgD und/oder deren Subklassen. Hierbei kann es sich murine, chimärisierte, humanisierte, humane, partiell humane Antikörper oder Antikörperfragment handeln.

Der Bioassay wie auch der Kit können weitere chemische Reagenzien umfassen, die zur Detektion der endogenen Zellbestandteile erforderlich sind, bevorzugt kann es sich z.B. um Antikörper oder deren Fragmente handeln, die eine immunologische bzw. histologische Detektion der adulten Neurogenese ermöglichen. Im Sinne der Erfindung wird unter Bioassay sowohl ein Verfahren als auch eine Anordnung oder Vorrichtung, umfassend Biokomponenten oder Reagenzien zur Bestimmung der adulten Neurogenese, verstanden; diese Doppelbedeutung des Begriffs Assay ist dem Fachmann bekannt. Der Kit kann Informationen zum Kombinieren der Inhalte des Kits und/oder zur Bereitstellung einer Formulierung des Kits haben. Bei dieser Information kann es sich beispielsweise um einen Beipackzettel handeln oder um eine Information, die auf einer Homepage zur Verfügung gestellt wird. Kit und Assay können weiterhin Hilfs- oder Trägerstoffe, Enzyme, Markersubstanzen aber auch Aufbewahrungsbehältnisse, Objektträger, optische Instrumente, Injektionsvorrichtungen, Mikrotome und/oder andere Vorrichtungsteile umfassen, die eine biologische, chemische und/oder physikalische Bestimmung der adulten Neurogenese ermöglichen oder unterstützen.

Im Folgenden soll die Erfindung anhand eines Beispieles näher erläutert werden, ohne auf dieses Beispiel beschränkt zu sein.

Um den Zeitpunkt der Calretinin-Expression zu bestimmen, wurden 24 sechs Wochen alte C57BL76 Mäuse von der Fa. Charles River bezogen und in 6 Gruppen eingeteilt. Die Tiere erhielten eine einzelne Injektion mit Bromodesoxyuridin (BrdU) und wurden 4 Stunden, 1 Tag, 3 Tage, 1 Woche, 2.5 Wochen oder 4 Wochen später getötet und das Hirngewebe entnommen.
Weitere 69 C57BL/6 Mäuse wurden in vier Gruppen eingeteilt: Läufer (LAUF), reizreich lebend (REIZ), mit experimentell ausgelösten Anfällen (ANF) und Kontrollen (KTR). LAUF Tiere lebten zu zweit oder dritt in Käfigen normaler Größe mit unbegrenztem Zugang zu einem Laufrad. Acht Mäuse wurden in einer reizreichen Umgebung gehalten, vgl. frühere Publikationen (Van Praag et al., 1999). Am Tag vor der BrdU-Injektion (Tag 0) erhielten ANF Tiere eine systemische Injektion von Kainsäure (KA, Fa. Sigma) in einer Dosis von 30 mg/kg Körpergewicht in 0.1M Phosphatpuffer. Während der ersten sieben Tage erhielten alle Tiere eine tägliche Injektion von 50mg/kg Körpergewicht BrdU in steriler physiologischer Kochsalzlösung. Alle Tiere lebten vier Wochen nach der letzten BrdU-Injektion weiterhin unter den experimentellen Bedingungen ihrer Gruppe und wurden dann untersucht.
Die Tiere wurden mit einer Überdosis Ketamin tief betäubt und durch das Herz mit einer 4-prozentigen Paraformaldehydlösung perfundiert. Die Gehirne wurden entnommen, im Fixans für weitere 24 Stunden gelagert und dann in eine 30% Sucrose-Lösung überführt. Vierzig Mikrometer dicke Gewebeschnitter wurden von einem trockeneisgekühlten Kupferblock mit einem Leica SM200R Schlittenmikrotom in koronarer Orientierung geschnitten. Für die BrdU-Immunhistochemie wurden die Schnitte mit 2N Salzsäure (HCl) für 30 Minuten bei 37°C behandelt und danach in 0.1M Borsäurepuffer (pH 8.5) neutralisiert.
Um die Zahl der Zellen, die BrdU markiert waren und Calretinin exprimierten, zu bestimmen, wurden Schnitte mit der Peroxidase-Methode (ABC System, Vectastain, Vector Laboratories) mit biotinyliertem Esel anti-Ratte und anti- Kaninchen Antikörper und nickel-verstärktem Diaminobenzidin als Farbstoff. Dreifachmarkierungen mittels Immunfluoreszenz wurden nach früher beschriebenen Standardprotokollen durchgeführt (Kempermann et al., 2003). Als Primärantikörper wurden benutzt: Ratte anti-BrdU (1:500, Harlan Seralab), Maus anti-NeuN (1:100; Chemicon), Maus anti-Calretinin (1:250; Swant), Ziege anti-Calretinin (1:250; Chemicon), Kaninchen anti-Calretinin (1:250; Swant), Maus anti-Calbindin (1:250; Swant), Ziege anti-Doublecortin (1:200; Santa Cruz Biotech), Ziege anti-EAAT (1:250; Chemicon), Kaninchen anti-Prox-1 (1:5000; Geschenk von Dr. Samuel Pleasure, San Francisco), Kaninchen anti-Ki67 (1:500; Novocastra).
Als sekundäre Fluoreszenzantikörper wurden benutzt: anti-Ratte Rhodamin X, anti-Maus FITC, anti-Maus CY5, anti-Kaninchen CY5, anti-Kaninchen FITC, anti-Ziege CY5 (alle 1:250; Jackson Laboratories, vertrieben von Dianova). Fluoreszierende Schnitte wurden in Polyvinylalkohol mit Diazobicyclo-Oktan als Bleichschutz aufgezogen.
Von allen Tieren wurden Serien mit jedem sechsten Hirnschnitt (240μm entfernt) für BrdU und Calretinin mit der Peroxidasemethode gefärbt. Positive Zellen wurden mit einem 40 × Objektiv (Leica) in der rostro-kaudalen Ausdehnung der Körnerzellschicht gezählt. Wie vorbeschrieben wurde die klassische optische Dissektormethode insoweit modifiziert, dass Zellen, die in der obersten Schärfeebene als im Fokus erschienen, nicht gezählt wurden (Kempermann et al., 2003). Die erhaltenen Zahlen wurden mit 6 multipliziert, um die geschätzte Gesamtzahl der BrdU- oder calretininpositiven Zellen pro Körnerzellschicht zu erhalten.
Eins-in-zwölf-Serien von Hirnschnitten jedes Tieres jeder Gruppe wurden dreifachgefärbt für BrdU, neuronalen Marker NeuN und Calretinin (oder andere Kombinationen; siehe oben und im Folgenden). Fluoreszenzsignale wurden mit einem spektralen konfokalen Mikroskop (Leica TCS SP2) detektiert. Alle Analysen wurden im sequentiellen Detektionsmodus durchgeführt, um eine Kreuzdetektion zwischen den Kanälen zu vermeiden.
Für jedes Tier und jede Kombination von Phänotypen wurden 50 BrdU-markierte Zellen innerhalb der Körnerzellschicht auf Koexpression der verschiedenen Marker hin untersucht. Die relativen Zahlen wurden auf die absoluten BrdU-positiven Zellen pro Körnerzellschicht bezogen, um die absoluten Zahl BrdU-markierter Zellen je Phänotyp zu erhalten. Entsprechend wurde für Kombinationen anderer Marker außer BrdU verfahren.
Alle numerischen Analysen wurden mit Statview 5.0.1 für Macintosh durchgeführt. Für alle Vergleiche wurde eine Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von einem Fisher post-hoc-Test, wenn zulässig.
Ergebnisse:
Vier Wochen nach der BrdU-Injektion exprimierten ca. 6% der BrdU-markierten Zellen in der Körnerzellschicht Calretinin. Es ist bekannt, dass ca: 60 bis 70% der BrdU-markierten Zellen zu diesem Zeitpunkt ein anderes calciumbindendes Protein, Calbindin, enthalten (Kempermann et al., 1997a). Calretinin-positive Zellen fanden sich in der subgranulären Zone der Körnerzellschicht. Morphologisch zeigten sie keine auffälligen Unterschiede zu den benachbarten calbindinpositiven Zellen. Zu diesem Zeitpunkt waren alle calretinin-positiven Zellen auch positiv für neuronalen Marker NeuN. Auch calbindin-positive Zellen waren NeuN-positiv. Es ließen sich also (basierend auf dem neuronalen Marker NeuN) zwei Populationen von neugebildeten, BrdU-markierten Neuronen identifizieren: eine Gruppe calretininpositiver Zellen, und eine Gruppe calbindinpositiver Zellen.
Wenn die Calretininexpression zu verschiedenen Zeitpunkten nach der BrdU-Injektion untersucht wure, konnte festgestellt werden, dass Calretinin schon einen Tag nach der BrdU-Injektion in den BrdU-positiven Zellen gefunden werden kann. Das Maximum wurde mit über 75% der BrdU-positiven Zellen etwa eine Woche nach der Injektion erreicht. Umgerechnet auf absolute Werte bedeutet dies, dass, da die Zahl der BrdU-positiven Zellen erst steigt und dann wieder sinkt, die Zahl der BrdU/Calretinin-doppelpositiven Zellen ihren Höchststand drei Tage nach der Injektion erreichte. Sechs Wochen nach der Injektion konnten keine doppelmarkierten Zellen mehr gefunden werden. Diese Befunde zeigen, dass Calretinin transient in BrdU-markierten Zellen exprimiert wird.
Doublecortin ist ein anderer Schlusselmarker, der transient während adulter hippocampaler Neurogenese exprimiert wird (Kempermann et al., 2003). Am Tag 1 nach der BrdU-Injektion wurde fanden ein großer Prozentsatz BrdU-positiver Zellen gefunden, die gleichzeitig auch calretinin- und doublecortinpositiv waren. Eine solche Überlappung gab es nicht nach vier Wochen.
Der Anstieg in der absoluten Zahl BrdU-positiver calretinin-positiver Zellen über die ersten Tage nach der BrdU-Injektion war parallel zu einem Anstieg der BrdU/NeuN-doppelpositiven Zellen. Während diese jedoch nach zweieinhalb Wochen eine stabile Zahl erreichten, sank die Zahl der BrdU/Calretinin-doppelpositiven Zellen wieder ab. Aus dem Befund, dass nach vier Wochen alle calretininpositiven Zellen NeuN exprimierten, während zu frühen Zeitpunkten eine Überschneidung zwischen Calretinin und Doublecortin bestand, kann gefolgert werden, dass Calretinin transient während frühere Entwicklungstufen in neugeborenen Nervenzellen exprimiert wird.
Körnerzellen sind glutamaterg und exprimieren deshalb den Exzitatorische Aminosäuren Transporter (EEAT). Sie werden auch durch die Expression des Transkriptionsfaktors Prox-1 charakterisiert (Pleasure et al., 2000). Es konnte gezeigt werden, dass bereits eine Woche nach BrdU alle BrdU-positiven calretininexprimierenden Zellen positiv für Prox-1 waren und EAAT exprimierten. Diese Befunde belegen, dass es sich bei den calretinin-positiven Zellen um junge Körnerzellen handelt.
Es wurden einzelne calretinin-positive Zellen gefunden, die auch positiv für Calbindin waren, und es wurden einige wenige Zellen mit dieser Koexpression gefunden. Dies spricht für einen schnellen Wechsel zwischen den beiden calcium-bindenden Proteinen während der Ausreifung der Körnerzellen.
Es waren Zellen identifizierbar, die sich akut im Zellzyklus befanden mit einem Antikörper gegen Ki67, einem Protein, das während der gesamten Zellteilung exprimiert wird. Wir untersuchten Hunderte von calretinin-positiven Zellen und fanden keine einzige, die Ki67-positiv war. Daraus folgern wir, dass die Calretininexpression den Zeitpunkt während der Reifung der neuen Körnerzellen markiert, in dem die Zellen den Zellzyklus verlassen haben.
Schließlich wurde untersucht, ob Stimuli, von denen bekannt ist, dass sie adulte hippocampale Neurogenese induzieren, in entsprechender Weise auf die einfach zu bestimmende Zahl der calretinin-positiven Zellen wirkt. Gewählt wurden freiwillige körperliche Aktivität (LAUF), reizreiche Umgebung (REIZ), experimentell induzierte Anfälle (ANF) und mit Kontrollen (KTR) verglichen. REIZ hat keinen oder nur einen geringen Effekt auf die Zellteilungsaktivität, sondern fördert primär das Überleben neugeborener Zellen (Kempermann et al., 1997b). LAUF dagegen stimuliert robust die Zellteilungsaktivität (Van Praag et al., 1999). Kainsäure induzierte Anfälle wie in ANF gehören zu den stärksten Stimulatoren der Zellteilungsaktivität im Gyrus dentatus (Parent et al., 1997).
In allen drei Paradigmen war die Nettoneurogenese vier Wochen nach BrdU erhöht und diese Erhöhung spiegelte sich in der absoluten Zahl calretinin-positiver Zellen innerhalb der Körnerzellschicht wieder. REIZ zeigte dabei keinen signifikanten (aber deskriptiv erkennbaren) Anstieg, der mit dem primär überlebensfördernden Effekt vereinbar ist. In ANF war der Anstieg in CR-positiven Zellen etwa fünfzehnfach. LAUF rangierte zwischen diesen Extremen.
Zusammengenommen zeigen diese Befunde, dass die Zahl der calretininexprimierenden Zellen im Gyrus dentatus der Maus als Surrogatmarker für die ablaufende adulte Neurogenese genommen werden kann, da Calretinin transient in im Erwachsenenalter geborenen Körnerzellen exprimiert wird, und zwar etwa ab dem Zeitpunkt, da die Zellen den Zellzyklus verlassen haben, bis ca. zwei bis vier Wochen später.
Quellenverzeichnis

Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., and Gage, F. H. (2003). Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development 130, 391-399.
Kempermann, G., Kuhn, H. G., and Gage, F. H. (1997a). Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proc Natl Acad Sci USA 94, 10409-10414. Kempermann, G., Kuhn, H. G., and Gage, F. H. (1997b). More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature 386, 493-495.
Parent, J. M., Yu, T. W., Leibowitz, R. T., Geschwind, D. H., Sloviter, R. S., and Lowenstein, D. H. (1997). Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci 17, 3727-3738.
Pleasure, S. J., Collins, A. E., and Lowenstein, D. H. (2000). Unique expression patterns of cell fate molecules delineate sequential stages of dentate gyrus development. J Neurosci 20, 6095-6105.
Van Praag, H., Kempermann, G., and Gage, F. H. (1999). Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nat Neurosci 2, 26.6-270.

Claims

Verfahren zur Bestimmung einer adulten Neurogenese dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einer Nervenzelle transient postmitotisch exprimierte endogene Zellbestandteile bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellbestandteile ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Calbindin, MRP8, MRP14, Parvalbumin, 5100 und/oder Calretinin.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Zellbestandteil Calretinin ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nervenzellen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend adendritische Nervenzellen, apolare Nervenzellen, bipolare Nervenzellen, multipolare Nervenzellen, polyneuritische Nervenzellen, pseudounipolare Nervenzellen, unipolare Nervenzellen, neurosekretorische Nervenzellen, präganglionäre Nervenzellen, postganglionäre Nervenzellen, amakrine Zellen, Horizontalzellen, Bipolarzellen, Golgizellen, Purkinjezellen, Motoneurone, Haar-, Pyramiden- und/oder Korbzellen, insbesondere Körnerzellen und/oder Interneurone.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Nervenzellen Neuronen, insbesonder Körnerzellen, des Hippocampus sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellbestandteile invasiv und/oder nicht-invasiv bestimmt werden.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die invasive Bestimmung eine histologische und/oder eine immunhistochemische Bestimmung umfasst und die nicht-invasive Bestimmung eine Kernspintomographie, Computertomographie, SPELT und/oder Positronenemissionstomographie umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es in Ab- und/oder Anwesenheit von Mitteln durchgeführt wird, deren Einfluss auf die adulte Neurogenese getestet werden soll.
Verfahren zur Identifizierung eines die adulte Neurogenese modifizierenden Mittels, dadurch gekennzeichnet, dass die adulte Neurogenese gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8 in Gegenwart und/oder in Abwesenheit des Mittels durchgeführt und die Modifikation der Neurogenese detektiert wird und die Modifikation ein Hinweis auf ein Neurogenese modifizierendes Mittel ist.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es weiterhin die Formulierung des identifizierenden Mittels oder eines Derivates oder eines Homologen hiervon mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Mittel, dass die adulte Neurogenese modifiziert, erhältlich durch a) in-Kontakt-bringen eines Mittel-Kandidaten mit Nervenzellen, b) Bestimmung der adulten Neurogenese gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, c) Abgleich der bestimmten adulten Neurogenese mit einer Standard-Neurogenese und d) gegebenenfalls Vergleich, ob das Mittel die adulte Neurogenese modifiziert.
Verwendung von transient postmitotisch exprimierten endogenen Zellbestandteilen zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Neubildung von Nervenzellen im peripheren, zentralen und/oder autonomen Nervensystem, insbesondere im Hippocampus und/oder Riechhirn.
Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Neubildung von Nervenzellen in einem adulten Gehirn nach der Geburt bestimmt wird.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der transient postmitotisch exprimierte endogene Zellbestandteil MRP8, MRP14, Parvalbumin, 5100 und/oder Calretinin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12-14, dadurch gekennzeichnet, dass zum Nachweis von Calbindin, MRP8, MRP14, Parvalbumin, S100 und/oder bevorzugt Calretinin ein transgenes Tiermodell benutzt wird, in dem regulatorische Abschnitte des Calbindin-, MRP8-, MRP14-, S100- und/oder Calretiningens die Expression eines Reportergens steuern.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12-15, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis Calbindin-, MRP8-, MRP14-, Parvalbumin-, S100- und/oder bevorzugt Calretinin-positiver Zellen durch Isolation der Zellen über die Expression des Reportergens bevorzugt im fluoreszenaktivierten Zellsorter (FACS) und/oder mit Magnetseparation erfolgt.
Bioassay zur Bestimmung der adulten Neurogenese, dadurch gekennzeichnet, dass er Erkennungsmoleküle umfasst, die mit Calretinin Calbindin, MRP8, MRP14, S100 und/oder Parvalbumin spezifisch und nachweisbar wechselwirken.
Bioassay nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsmoleküle Antikörper, Lektine, Chelatoren und/oder Anti-Sensekonstrukte sind.
Kit, umfassend einen Bioassay nach Anspruch 17 oder 18 gegebenenfalls mit einer Information zum Kombinieren der Inhalte des Kits.
Verwendung des Kits nach Anspruch 19 zur Bestimmung der adulten Neurogenese.