DE1092906B

DE1092906B - Verfahren zur Herstellung von 12a-Hydroxylverbindungen der Tetracyclinreihe

Info

Publication number: DE1092906B
Application number: DEA31505A
Authority: DE
Inventors: Chester Eric Holmlund; Arthur Green; Anthony Joseph Shay
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1958-03-05
Filing date: 1959-03-04
Publication date: 1960-11-17

Description

Verfahren zur Herstellung von 12 a-Hydroxylverbindungen der Tetracyclinreihe Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von 12 a-Hydroxylverbindungen der Tetracyclinreihe.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Hydroxylgruppe in die 12a-Stellung eines 12 a-Desoxytetracyclins eingeführt, indem man diese Verbindung der Einwirkung eines Stamms oder mehrerer solcher Stämme von Mikroorganismen der Klasse Fungi Imperfecti unterwirft.
12 a-Desoxy tetracycline sind neue Verbindungen der Tetracyclinreihe. 12 a-Desoxytetracyclin beispielsweise wird durch chemische Reduktion von Tetracyclin mit metallischem Zink in einer wäßrigen Lösung von Ammoniak hergestellt. Das wäßrige Ammoniak wird vorzugsweise als 10- bis 20°/oige Lösung verwendet. Die Verwendung von wäßrigem Ammoniak als Lösungsmittel hat sich als notwendig erwiesen, da andere Lösungsmittel, z. B. ein schwach saures Medium, entweder die Reduktion von Tetracyclin zu dem 12a-Desoxytetracyclin nicht fördert oder aber zur Bildung weiterer unerwünschter Reduktionsprodukte Anlaß gibt. Die Umsetzung kann bei Temperaturen zwischen etwa 10 und 50°C durchgeführt werden, wird aber vorzugsweise bei etwa Zimmertemperatur, z. B. zwischen etwa 20 und 25°C, durchgeführt. Die Reaktionszeit ist nicht besonders kritisch und liegt im allgemeinen zwischen 1 und 4 Stunden. Eine Konzentration von etwa 4°/0 (Gewicht/Volumen) des Tetracyclinantibiotikums in dem wäßrigen Ammoniak reicht für die Reaktion aus. Das für die Umsetzung verwendete Zink liegt vorzugsweise in feinverteilter Form z. B. als Zinkstaub vor und wird in einem Verhältnis von wenigstens 2 Gewichtsteilen je Gewichtsteil des Tetracyclinantibiotikums eingesetzt. Mengenverhältnisse von mehr als etwa 4 Gewichtsteilen Metall sind im allgemeinen nicht erforderlich.
In gleicher Weise erhält man 6-Desmethyl-12a-desoxytetracyclin durch chemische Reduktion von 6-Desmethyltetracyclin; 7-Chlor-6-desmethyl-12a-desoxytetracyclin durch chemische Reduktion von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin; 6,12a-Didesoxytetracyclin durch Reduktion von 6-Desoxytetracyclin und 6-Desmethyl-6,12a-didesoxytetracyclin durch Reduktion von 6-Desmethyl-6-desoxy-tetracyclin.
Die 12a-Desoxytetracycline sind wertvolle Zwischenprodukte für die Herstellung von 12 a-Desoxyanhydrotetracyclinen. 12a-Desoxyanhydrotetracyclin kann z. B. durch Behandlung von 12 a-Desoxytetracyclin mit einem Dehydratisierungsmittel, z. B. einer beliebigen starken Mineralsäure oder einer organischen Säure, wie Eisessig, bei einer Temperatur zwischen etwa 0 und 100°C hergestellt werden. Das erhaltene 12 a-Desoxyanhydrotetracyclin ist biologisch aktiv und weist eine Wirksamkeit gegen eine Anzahl grampositiver und gramnegativer Mikroorganismen, insbesondere gegenüber manchen tetracyclinresistenten Stämmen von Bakterien auf.
Zu den Species der Klasse Fungi Imperfecti, die sich als für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet erwiesen haben, gehören unter anderen Myrothecium roridum, Hormodendrum hordei, Hormodendrum pallidum, Curvularia lunata (NRRL 2380), Curvularia lunata (QM 34B), Curvularia pallescens (NRRL 2381) und Botrytis cinerea (ATCC 12481) (j. C. Gilman, »A Manual of Soil Fungi, 2. Auflage, 1957, S. 300, 330, 338 und 398, Iowa State College Press, Ames Iowa).
Diese Mikroorganismen sind handelsüblich. Man kann. sie aber auch aus natürlichen Quellen gewinnen, wobei die dem Mikrobiologen geläufigen Arbeitsweisen angewendet werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das zu oxydierende 12a-Desoxytetracyclin der Einwirkung eines oder mehrerer Stämme von Fungi Imperfecti unterworfen. Dies wird zweckmäßigerweise dadurch erreicht, daß der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Nährmedium in inniger Berührung mit dem zu oxydierenden 12a-Desoxytetracyclin gezüchtet und die Züchtung so lange geführt wird, bis die gewünschte Hydroxylierung der 12a-Stellung eingetreten ist. Das Verfahren kann aber auch in der Weise durchgeführt werden, daß man zunächst den Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, dann die Zellen abtrennt und schließlich das mit dem 12 a-Desoxytetracyclin versetzte zeltfreie Filtrat eine zur Erzielung des gewünschten Hydroxylierunggrades ausreichende Zeit belüftet.
Das 12a-Desoxytetracyclin kann dem Nährmedium als Suspension in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, oder als Lösung in einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Propylenglykol oder Dimethylformamid, zugesetzt werden. Im allgemeinen ist es zweckmäßig, wenn das 12a-Desoxytetracyclin in feinverteilter Form vorliegt, um einen möglichst guten Kontakt mit dem oxydierend wirkenden Kulturmedium zu erreichen und einen vollständigen Ablauf der Reaktion zu gewährleisten.
Die Fermentationsbedingungen sind im allgemeinen die gleichen wie diejenigen, die bei den bekannten Verfahren der fermentativen Herstellung von Tetracyclin angewendet werden. Das Fermentationsmedium enthält die üblichen Nähr- und Mineralstoffe. Zu geeigneten Nährstoffen, welche die notwendigen Substanzen liefern, gehören unter anderem Stärke, Dextrose, Rohrzucker, Glukose, Melasse, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Hefe, Fleischextrakte, Pepton, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Maisquellwasser und Fischmehl. Als anorganische Salze sind beispielsweise verwendbar: Calciumcarbonat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und die verschiedenen Spurenelemente, wie Mangan, Kobalt, Zink, Kupfer und Eisen.
Die anderen Fermentationsbedingungen, wie Wasserstoffionenkonzentration, Temperatur, Zeit, Belüftungsgeschwindigkeit, Herstellung der erforderlichen Impfmenge, Sterilisation und Beimpfung, sind die üblicherweise angewendeten und können ähnlich denjenigen ausgewählt werden, die für die Herstellung von Tetracyclin in der USA.-Patentschrift 2 734 018 beschrieben sind.

Im folgenden werden Beispiele für geeignete wäßrige Nährmedien angegeben, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Hydroxylierung von 12 a-Desoxytetracyclinen verwendet werden können.

Medium Nr. 1

Maisquellwasser ..................... 20 g/1

Rohrzucker ......................... 30 g/1

CaCO3 ............................. 7 g/1

(NH,)2S04 ......................... 2 g/1

Medium Nr.2

Maismehl ........................... 20 g/1

Casein-Hydrolysat ................... 10 g/1

Cerelose (Maiszucker) ................. 10 g/1

Hefeextrakt ........................ 2 g/1

K2 H P 04 ........................... 1 g/1

Ca C 03 ............................. 5 g/1

Leitungswasser wird bis zu einem Gesamtvolumen von 1 1 zugesetzt, der pH-Wert auf 6,5 bis 7,0 eingestellt und die Lösung im Autoklav behandelt.

Wie oben erwähnt, eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren vor allem für die Oxydation von 12a-Desoxytetracyclin, die Erfindung soll jedoch nicht auf die Hydroxylierung dieses speziellen 12a-Desoxytetracyclins beschränkt werden. Vielmehr können auch die anderen 12a-Desoxytetracycline, nämlich die aus 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin, 6-Desoxytetracyclin, 6-Desmethyltetracyclin und 6-Desmethyl-6-desoxytetracyclin erhaltenen in der gleichen Weise in 12a-Stellung oxydiert werden. Die beschriebene Hydroxylierung wurde ferner mit Erfolg auf 12a-Desoxydesdimethylaminotetracyclin angewendet, wobei Desdimethylaminotetracyclin gebildet wurde. Das als Ausgangsstoff verwendete 12 a-Desoxydesdimethylaminotetracyclin kann durch Behandlung von Tetracyclin mit metallischem Zink in einem schwach sauren Medium, z. B. Eisessig, in wenigstens 72 Stunden hergestellt werden. Dabei wird die Hydroxylgruppe in 12a-Stellung und die Dimethylaminogruppe in 4-Stellung des Tetracyclingerüsts entfernt. Die gebildete Verbindung kann als 12 a-Desoxydesdimethylaminotetracyclin bezeichnet werden. Diese Reaktion ist für Chlortetracyclin als Ausgangsstoff und 12a-Desoxydesdimethylaminochlortetracyclin als Endprodukt in Journ. Amer. Chem. Soc., Bd. 76, 1954, S. 3575, beschrieben.
Das 12 a-Desoxytetracyclin kann erfindungsgemäß nach folgender Arbeitsweise oxydiert werden: Ein steriles Kulturmedium, z. B. das oben angegebene Medium Nr. 1, wird zunächst beimpft, indem man eine kleine Menge der Sporensuspension oder des vegetativen Wachstums eines Stamms von Fungi Imperfecti, z. B. von Curvularia lunata, einführt. Das beimpfte Nährmedium wird dann 48 Stunden auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung bei 28°C bebrütet. Ein aliquoter Anteil wird dann entnommen und in einen das Medium Nr. 2 enthaltenden Fermentationskolben eingebracht. Der beimpfte Fermentationskolben wird auf einer Rundschüttelvorrichtung wenigstens 20 Stunden bebrütet, ehe man das 12 a-Desoxytetracyclin zugibt, das in Form einer wäßrigen Suspensionslösung mit einem Gehalt von 10 bis 20 mg/ml eingesetzt wird. Das Bewegen und die Belüftung des Nährmediums wird etwa 2 bis 72 Stunden oder so lange fortgesetzt, bis die Oxydation vollständig ist. Die Oxydation kann sowohl in der Fermentationsflüssigkeit in der beschriebenen Weise als auch durch Zugabe des 12a-Desoxytetracyclins zu der durch Filtrieren derselben erhaltenen zeltfreien Flüssigkeit durchgeführt werden, wobei die Bebrütung eine gewisse Zeit weitergeführt wird, bis die Oxydation vollständig ist.
Nach dem Ende der Oxydation kann das Tetracyclin aus der Fermentationsflüssigkeit oder aus der zeltfreien Flüssigkeit auf beliebige Weise gewonnen werden. Zur Gewinnung von Tatracyclin aus Fermentationsflüssigkeiten geeignete Verfahren wurden in größerer Anzahl bereits beschrieben und können zur Gewinnung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Tetracyclins angewandt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Für die Herstellung der Ausgangsverbindungen wird Schutz im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht beansprucht. Beispiel 1 Etwa 50 ml eines Kulturmediums mit der als Medium Nr. 1 beschriebenen Zusammensetzung werden20 Minuten bei 150°C in einem 500-ml-Kolben sterilisiert. Das Medium wird dann mit etwa 2 ml einer wäßrigen Suspension von Curvulaxia Lunata (NRRL 2380 [vegetatives Wachstum]) beimpft. Das Gemisch wird 48 Stunden auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung bei 28°C bebrütet. Danach wird ein 40/, ausmachender aliquoter Anteil entnommen und in einen 500-ml-Kolben eingebracht, der 50 ml eines Mediums mit der als Medium Nr. 2 beschriebenen Zusammensetzung enthält. Der beimpfte Fermentationskolben wird 24 Stunden auf einer Rundschüttelvorrichtung bebrütet. Danach werden 2 ml einer 0,25°/oigen Lösung von 12a-Desoxytetracyclin in den Fermentationskolben gegeben. Nach 1stündiger Fermentation ergibt die Prüfung der Fermentationsflüssigkeit einen Gehalt von 31,9 y/ml Tetracyclin, wohingegen die Prüfung einer Probe vor Beginn einen Gehalt von 2,5 y/ml ergab.
Ausbeute 46 °/o. Das Tetracyclin konnte praktisch quantitativ als kristallines Material isoliert werden. Beispiel 2 Es wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, gearbeitet, nur daß eine durch 48stündige Vergärung erhaltene Fermentationsfiüssigkeit filtriert wird. 6 ml der zellfreien Flüssigkeit werden zusammen mit 3,8 ml eines mit einem pH-Wert von 3,8 hergestellten Natriumcitrat-Phosphat-Puffers und 0,2 ml einer 2,5°/oigen Lösung von 12a-Desoxytetracyclin in einen 250-ml-Kolben gegeben. Der Kolben wird auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung bei 28°C 2 Stunden bebrütet. Die antibakterielle Wirksamkeit steigt von einem Anfangswert von 12 y/ml auf 186 y/ml.
Beispiel 3 Die im Beispiell beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, nur daß das Medium mit einer Kultur. von Myrothecium roridum beimpft wird. Nach 24stündiger Fermentation wird 1 ml einer 0,25°/oigen Lösung von 12a-Desoxytetracyclin in den Fermentationskolben eingeführt. Der Kolben wird 72 Stunden bei 28°C auf einer Rundschüttelvorrichtung bebrütet. Danach beträgt die als Tetracyclin gemessene antibakterielle Aktivität 34,1 y/ml. Die ursprüngliche antibakterielle Aktivität beträgt 2,6 -y/ml.
Beispiel 4 Die im vorhergehenden Beispiel beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, nur daß eine Kultur von Hormodendrum hordei verwendet wird. Die Du(chführung der Fermentation und die Zugabe des 12a-Desoxytetracyclins erfolgen wie im Beispie13 angegeben. Nach 72stündiger Fermentation liegt die antibakterielle Aktivität gemessen als Tetracyclin bei 17,3 y/ml.
Beispiel 5 Die im vorhergehenden Beispiel beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß eine Kultur von Hormodendrum pallidum verwendet wird. Die Durchführung der Fermentation und die Zugabe des 12 a-Desoxytetracyclins erfolgen wie im Beispiel 3 beschrieben. Nach 72stündiger Fermentation beträgt die antibakterielle Aktivität, bestimmt als Tetracyclin, 23,0 y/ml. Beispiel 6 Die im Beispie12 beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, nur daß eine Kultur von Curvularia pallescens (NRRL 2381) verwendet wird. 12a-Desoxytetracyclin wird wie im Beispie12 beschrieben zu der zellfreien Flüssigkeit gegeben. Nach 2stündiger Bebrütung beträgt die antibakterielle Wirksamkeit, bestimmt als Tetracyclin, 93,8 -y/ml.
Beispiel 7 Die im vorhergehenden Beispiel beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß eine Kultur von Botrytis cinerea (ATCC 12481) verwendet wird. Das 12a-Desoxytetracyclin wird, wie im Beispiel 2 angegeben, der zellfreien Flüssigkeit zugesetzt. Nach 2stündiger Bebrütung beträgt die antibakterielle Aktivität, bestimmt als Tetracyclin, 185 y/ml.
Beispiel 8 5 ml einer Lösung von 12a-Desoxydesdimethylaminotetracyclin in Methanol mit einer Konzentration von 1 mg/ml, die durch 72stündige Behandlung von Tetracyclin mit metallischem Zink in Eisessig hergestellt worden war, werden zu 2 ml eines auf einen pH-Wert von 3,8 eingestellten Natriumcitrat-Phosphat-Puffers und 3,0 ml eines Gärmaischefiltrats gegeben, das durch Fermentation einer Kultur von Curvularia lunata (NRRL 2380) hergestellt worden war. Der Kolben wird 2 Stunden bei 28°C auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung geschüttelt. Die Hydroxylierung ,des Ausgangsmaterials in 12a-Stellung ergibt sich durch eine Abnahme der Absorption bei 465 m#t in m/10-Natriumboratlösung zu erkennen, die für die 12 a-Desoxydesdimethylaminoverbindung charakteristisch ist und durch die Zunahme der antibakteriellen Aktivität, wie sie durch die turbidimetrische Prüfung mit Hilfe von Micrococcus pyogenes bestimmt wird.

Zeit

Optische Dichte bei 465 mA y/ml als Desdimethyl-

Minuten in m/10 Natriumboratlösung

arninotetracyclin

0 0,442 50,3

30 0,291 121,0

120 0,152 149,0

Außerdem zeigt auch die Papierchromatographie die erfolgte Hydroxylierung in 12a-Stellung an.
Beispiel 9 Eine wäßrige Suspension von Curvularia lunata (NRRL 2380) von einem Kartoffeldextrose-Schrägagar wird in vier sterile 500-ml-Kolben überimpft, die jeweils 50 ml eines Mediums mit der als Medium Nr. 1 beschriebenen Zusammensetzung enthalten. Die Kolben werden dann 48 Stunden auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung bei 28°C bebrütet. Danach wird eine 40/, ausmachende Menge zur Beimpfung zu einer Reihe von Kolben gegeben, die jeweils 50 ml eines Mediums mit der als Medium Nr.2 beschriebenen Zusammensetzung enthalten. Diese beimpften Fermentationskolben werden 44 Stunden bei 28°C auf einer Rundschüttelvorrichtung bebrütet. Danach wird das Mycel von der Gärmaische durch Filtrieren durch Seitz-Filterkissen abgetrennt, 1044m1 einer derartigen zellfreien Flüssigkeit werden mit 66 ml einer Suspension von 850 mg 12a-Desoxytetracyclin versetzt. Läßt man das Reaktionsgemisch etwa 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, dann steigt die antibakterielle Aktivität (als Tetracychn) auf etwa das 10fache. Die Reaktionsgeschwindigkeit kann durch Belüftung des Reaktionsgemischs, z. B. mittels Durchleiten von Luft oder durch Rühren des das Reaktionsgemisch enthaltenden Kolbens auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung gesteigert werden. Das Reaktionsgemisch wird dann auf einen pH-Wert von 8,5 bis 8,6 eingestellt und mehrmals mit Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte werden auf ein geringes Volumen eingeengt, und das rohe Tetracyclin wird durch Zugabe von 10 Volumina Petrol äther gefällt. Das Tetracyclin wird von dem Hauptteil der Verunreinigungen durch Verteilungschromatographie und anschließende Kristallisation befreit. Das erhaltene kristalline Tetracyclin wird durch Infrarot- und Ultraviolettbestimmungen, Papierchromatographie und auf Grund der mikrobiologischen Aktivität identifiziert.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von 12 a-Hydroxylverbindungen der Tetracyclinreihe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein 12 a-Desoxytetracyclin der Einwirkung eines Stamms oder mehrerer solcher Stämme von Mikroorganismen der Klasse Fungi Imperfecti unterwirft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium unter aeroben Bedingungen mit Hilfe dieses Mikroorganismus in inniger Berührung mit dem 12a-Desoxytetracyclin vergärt bzw. zunächst ein Nährmedium unter aeroben Bedingungen mit Hilfe des Mikroorganismus vergärt, das fermentierte Medium filtriert, das 12 a-Desoxytetracyclin zu dem zellfreien Filtrat zusetzt und die Fermentation unter aeroben Bedingungen weiterführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daB das 12a-Desoxytetracyclin in feinverteilter Form vorliegt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daB man als Mikroorganismus einen Organismus des Stammes Myrotecium, Hormodendrum, Curvularia, Botrytis, wie Myrothecium roridum, Hormodendrum Kordei, Hormodendrum pallidum, Curvularia lunata, Curvularia pallescens oder Botrytis cinerea, verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daB man 12 a-Desoxytetracyclin bzw. 12 a-Desoxydesdimethylaminotetracyclin alsAusgangsstoffe verwendet.