DE1493643C - Verfahren zur Spaltung von D,L-alpha-Methyl-beta-(3,4-dihydroxyphenyl)-alanin in seine optischen Antipoden - Google Patents

Description

D,L - a - Methyl - β - (3,4 - dihydroxyphenyl) - alanin

zeichnet sich durch seine günstigen Wirkungen auf

den Blutdruck aus. Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, diese Verbindungen synthetisch herzustellen. Bei den Synthesen fällt das Produkt in Form eines Racemates an, welches zweckmäßig in seine optischen Antipoden getrennt wird, da die genannte nützliche biologische Wirkung nur der L-Form zukommt. Würde man auf die Trennung des Racemates verzichten, so würde bei der Verabreichung des Produktes die nicht aktive D-Form als Ballast mitgeschleppt, was um so ungünstiger ist, als das Produkt ohnehin in verhältnismäßig hohen Dosen verabfolgt werden muß.

Erfindungsgemäß ist es möglich, das Racemat des α -Methyl -ß -(3,4- dihydroxyphenyl) -alanins in seine optischen Antipoden zu spalten, indem man auf Derivate der allgemeinen Formel .

20

CH₃

CH₂-C- COOR"
NH
CO

R'

wobei R Wasserstoff oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet und wobei, zwei Alkylreste R auch zu einer Alkylenkette verbunden sein können, oder Acylreste mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, die durch eine Carboxyl- oder Carboalkoxygruppe substituiert sein können, R' Wasserstoff oder einen Alkylrest mit 1 bis 17 Kohlenstoffatomen ist, der durch eine Carboxyl- oder Carboalkoxygruppe substituiert sein kann, und R" Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, im wäßrigen Medium Bakterien des Stammes Schyzomycetes von Naegel i (1857) (NRRL-B-3050 oder NRRL-B-3051, hinterlegt bei der ARS Culturcollection, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, USA) bzw. daraus hergestellte Extrakte einwirken läßt, dabei entstandenes freies L- bzw. D-Amin vom bleibenden D- bzw. L-Acylamin in an sich bekannter Weise trennt und gegebenenfalls vorhandene Acyl-, Alkyl- bzw. Alkylengruppen R, R' oder R" abspaltet.

Für die Acylierung des Stickstoffes sind besonders die Reste der Bernsteinsäure und der Buttersäure geeignet. Man kann das erfindungsgemäße Verfahren jedoch auch unter anderem mit Essigsäure-, Stearinsäure-, Adipinsäure-, Sebazinsäure- oder Pivalinsäurederivaten durchführen.

Es ist bekannt, daß man stereospezifische Spaltungen von Derivaten der natürlich vorkommenden α-Aminosäuren mit tierischen oder pflanzlichen Enzymen durchführen kann (vgl. J. P. Greenstein und M. W i η i t z, »Chemistry of the Aminoacids«, Vol. 1, S.715; John Wiley an Sons, Inc. 1961, N.Y. und London).

Alle derartigen Spaltungsversuche sind im vorliegenden Fall jedoch fehlgeschlagen, was auf die zusätzliche und unnatürliche Substitution des a-C-Atoms durch die Methylgruppe zurückzuführen ist. Es war deshalb nicht vorherzusehen, daß durch ein spezifisches Verfahren Mikroorganismen aufzufinden sind, welche Enzyme bilden, die Derivate des a-Methylj3-(3,4-dihydroxyphenyl)-alanin stereoselektiv spalten.

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Bakterien -werden nach folgender Methode gefunden: Man gibt in sterile Nährlösungen, die 1 % einer der vorstehenden Formel entsprechenden Dialkoxyacylamin-Verbindung und neben notwendigen Salzen eine anorganische Stickstoffquelle enthalten, Erdproben verschiedenster Herkunft zu und bebrütet sie auf Schüttelmaschinen bei 28° C.

In verschiedenen Zeitabständen nimmt man Proben, in denen man chromatographisch die etwa vorhandene entacylierte Aminoverbindung nachweist. Nach mehreren Tagen lassen sich in einzelnen Kulturen tatsächlich solche Aminoverbindungen nachweisen. Diejenigen Kulturen, bei denen dies der Fall ist, enthalten Mikroorganismen, die zur Durchführung einer Spaltung fähig sind.

Diese Mikroorganismen reichert man zweckmäßig in der Weise an, daß man mehrere Passagen in der gleichen Nährlösung durchlaufen läßt. In diesen Nährlösungen können sich nämlich nur solche Mikroorganismen vermehren, die zu einer Spaltung geeignet sind, denn nur diese Stämme können sich die zu ihrer Vermehrung notwendige Kohlenstoffquelle durch die Spaltung beschaffen. Sie verwenden zum Aufbau ihrer Zellsubstanz und zur Atmung nur den Acylrest — CO — R'; die verbleibende Alkoxy verbindung wird, wie verschiedene Versuche gezeigt haben, im Gegensatz zu den entsprechenden 3,4-Dialkoxyphenyl-alaninverbindungen praktisch nicht angegriffen.

Die angereicherten Kulturen, in denen sich durch die mehrmalige Auslese vorwiegend Bakterien desselben Stammes befinden, werden auf Agarnährböden ausgestrichen. Nach der Bebrüturig werden aus den sich entwickelnden Kolonien einzelne typisch aussehende auf Schrägröhrchen abgeimpft.

Die so gefundenen Bakterien werden dann in einem präparativen Spaltungsversuch eingesetzt, wobei festgestellt wird, ob die Spaltung stereoselektiv verläuft. Zwei der isolierten Stämme aus der Klasse der Schyzomyceten von Naegeli (1857) erwiesen sich als für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Sie wurden bei der ARS Culturcollection, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt unter den Nummern NRRL B-3O5O und NRRL B-3051.

Die Spaltung der N-Acylverbindungen geht, wenn man die Bakterien ohne zusätzliche Kohlenstoffquelle wachsen läßt, auch wenn man mit einer Reinkultur massiv beimpft, relativ langsam vor sich. Es empfiehlt sich daher, zur Beschleunigung der Spaltung zusätzlich zum Anwachsen der Bakterien eine Kohlenstoffquelle, z. B. 0,1 bis 0,5 Glukose oder Glycerin, zuzusetzen. Noch schneller geht die Spaltung, wenn man die Bakterien ohne Zusatz der zu spaltenden Verbindung in einer komplexen Nährlösung etwa 24 Stunden anwachsen läßt und dann erst die zu spaltende Verbindung zugibt. Um die Aufarbeitung nach der Spaltung in diesem Fall zu erleichtern, kann man auch die Bakterien nach der Wachstumsphase abschleudern, mit Wasser waschen und nun die zu spaltende Verbindung zu der wäßrigen Bakteriensuspension zugeben.

Die letztere Arbeitsweise empfiehlt sich besonders, wenn man mit den freien 3,4-Dihydroxyverbindungen arbeitet. Diese sind bei neutralen bis alkalischen Bedingungen autoxydabel.

Da die Isolierung von Mikroorganismen nach der oben beschriebenen Methode mehrere Wochen in Anspruch nimmt, würden diese Verbindungen vollständig oxydiert sein. Man kann jedoch die mit dem O-alkylierten Verbindungen isolierten Mikro-Organismen auch zur Spaltung der freien 3,4-Dihydroxyverbindungen verwenden. Man läßt zweckmäßigerweise die Bakterien vorwachsen und gibt dann zu der dichten gewaschenen und ungewaschenen Bakteriensuspension unter Stickstoff oder unter gleichzeitiger Ansäuerung auf pH 3 bis 5 oder unter Stickstoff mit gleichzeitiger Ansäuerung die zu spaltende Verbindung zu. Zweckmäßigerweise verwendet man zur Spaltung Verbindungen, die am Stickstoff und an den beiden Sauerstoffatomen am Phenylrest dieselben Substituenten, z. B. Succinyl oder Butyryl usw., tragen.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß die verwendeten Mikroorganismen in den obengenannten Acylaminoverbindungen nur die eine optische Antipode spalten. Die Trennung der gespaltenen einen optischen Antipode von der nicht gespaltenen anderen optischen Antipode kann nach allgemein üblichen Methoden, z. B. durch Extraktion mit Lösungsmitteln, erfolgen.

In den folgenden Beispielen wurde die gespaltene optische Antipode jeweils aus analytischen Gründen als N-Acetylderivat isoliert.

Beispiel 1

Eine wäßrige Nährlösung, die 1% D,L-N-Succinyl· α - methyl - β - (3,4 - dimethoxyphenyl) - alanin, 0,2% KH₂PO₄, 0,2% (NHJ₂SO₄ und Spuren von MgSO₄, FeSO₄ und CaCO₃ enthält, wird mit KOH auf pH 6,0 eingestellt, steril durch Glasfilter G 5 filtriert und je 50 ecm davon in 200er-Erlenmeyerkolben steril abgefüllt. Insgesamt wurden 81 Kolben eingesetzt und diese mit 81 Erdproben verschiedenster Herkunft, zum Teil aus der näheren Umgebung Wuppertals, zum Teil aus Südamerika und zum Teil aus Afrika, beimpft, indem man je Kolben eine Spatelspitze der entsprechenden Erde dazugab. Die Kolben bebrüteten wir auf einer Rundschüttelmaschine bei 28° C. Am 7. und 12. Tag nahmen wir Proben. Diese wurden chromatographisch auf die Anwesenheit von D,L-a-Methyl-,S-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin untersucht. Zu diesem Zweck wurden je 10 μ der Proben auf Chromatographiepapier (Schleicher und Schüll 2043 a oder Whatman I) aufgetragen, 5 Stunden absteigend im System n-Butanol (4), Eisessig (1), Wasser (1) entwickelt und mit Ninhydrin abgefärbt. Für a-Methyl-/9-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin wurde ein R_F-Wert von 0,57 bis 0,59 gefunden.

Am 7. Tag waren bei zwei Proben geringe Mengen der freien Aminoverbindung nachweisbar. Am 12. Tag entstanden auf den Chromatogrammen bei zwei Proben kräftig gefärbte Flecken, bei zwei anderen Proben schwach gefärbte Flecken, die dem «-Methyl-/S-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin zugeordnet werden konnten. Bei allen anderen Proben war keine Abspaltung der Bernsteinsäure aufgetreten.

Zur weiteren Anreicherung der Bakterien, die die Spaltung durchführen können, führten wir insgesamt sechs Passagen im selben Nährmedium durch. Wir beimpften dazu mit je 0,1 ecm der älteren Kultur die jeweilige Nachkultur. In Abständen von 1 bis 3 Tagen nahmen wir Proben zum chromatographischen Nachweis der Spaltung. Sobald in einer Kultur eine Spaltung nachzuweisen war, wurde sofort eine neue Nachkultur angelegt. Dies war bei den ersten Passagen nach 1 bis 3 Tagen, bei den letzten Passagen nach 14 bis 20 Tagen der Fall.

Eine Spaltung fand nur in zwei von den vier Kulturen statt, und zwar in den beiden, die in der ersten Anreicherungskultur am 12. Tag kräftig gefärbte Flecke auf dem Chromatogramm zeigten.

Parallel zu den Anreicherungspassagen wurden Proben auf Platten mit Standard-Agar Merck ausgestrichen. Anfangs fanden wir Gemische von verschiedensten Bakterien, nach mehreren Passagen wurde das Bild einheitlicher. Einzelne typisch aussehende Bakterienkolonien wurden abgeimpft und danach in Reinkultur erneut chromatographisch auf ihre Fähigkeit zur Succinylabspaltung geprüft. Von den beiden Erden, deren erste Anreicherungskulturen am 12. Tag kräftig gefärbte Flecke auf dem Chromatogramm zeigten, wurde der Stamm NRRL B-3050 isoliert.

In einem weiteren . Ansatz in derselben Nährlösung wurden diese beiden Stämme auf ihre Fähigkeit zur stereoselektiven Spaltung von D,L-N-Succinyl - α - methyl - β - (3,4 - dimethoxyphenyl) - alanin geprüft.

Je 100 ecm der obengenannten Nährlösung wurden in 1-L-Erlenmeyerkolben mit einer öse der auf Standard-Merck-Agar vorgezogenen Bakterienkultur des Stammes NRRL B-3050 beimpft und 16 Tage auf der Rundschüttelmaschine bei 28° C bebrütet. Hierauf wurden die Bakteriensuspensionen 5 Minuten bei 20 000 xg zentrifugiert, der überstand auf pH 1 bis 2 angesäuert und mit Essigsäureäthylester 4mal ausgeschüttelt.

Die organische Phase enthält die ungespaltene Succinylverbindung, die nach dem Abdampfen des Lösungsmittels in Form eines kristallinen Rückstandes erhalten wurden.

Die wäßrige Phase wurde neutralisiert und gefriergetrocknet. Der Rückstand, der die gewünschte Aminosäure neben anorganischen Salzen enthält, wurde mit 8 ml Pyridin und 8 ml Essigsäureanhydrid 20 Stunden bei 37° C inkubiert. Hierauf wurden die überschüssigen Mengen an Pyridin und Essigsäureanhydrid im Vakuum entfernt, der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen, auf pH 7 bis 7,5 gestellt, filtriert und mit Essigester ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wurde mit konz. HCl auf pH 1 bis 2 eingestellt und mit Essigsäureäthylester 4mal ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft, wobei L-N-Acetyl-a-methyl-/?-(3,4-dimethoxy-phenyl)-alanin als kristalliner Rückstand erhalten wurde. Die Ausbeuten und spezifischen Drehungen wurden in der Tabelle 1 zusammengefaßt.

• Tabelle

Menge (mg)

Ausbeute in % der

DL-N-Succinyl-

verbindung

Reinheit der Isomeren in %*)

Zurückgewonnene N-Succinylverbindung

Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat) 202'

Zurückgewonnene N-Succinylverbindung Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat)

*) Die optischen Dreh werte der reinen Substanzen betragen:

D-N-Succinyl-a-methyl-/J-(3,4-dimethoxyphenyl)-analin, [d]l^! = —48,1°; c L-N-Acetyl-a-methyl-/9-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin, [α]" = +56°; c ~ 60

24
71

16

- 1% in Methanol.
1% in Methanol.

-10,7

+ 24,7
+ 2,0

-3,0

61

72

Beispiel 2

Eine wäßrige Nährlösung, die 1% D,L-N-Succinyl-α - methyl - β - (3,4 - dimethoxyphenyl) - alanin, 0,2% KH₂PO₄, 0,2% (NHJ₂SO₄, 0,1% Glycerin, Spuren von MgSO₄ und CaCO-, enthält, wird mit KOH auf pH 7,0 eingestellt, steril filtriert und 100 ecm

1-1-Erlenmeyerkolben abgefüllt. Dieser Erlenmeyerkolben wird mit einer Impföse des Stammes NRRL B-3050 beimpft und 10 Tage auf der Rundschüttelmaschine bei 28° C bebrütet. Die Aufarbeitung wurde wie im Beispiel 1 beschrieben vorgenommen. Das Ergebnis zeigt die Tabelle 2.

Tabelle

	Menge (mg)	Ausbeute in % der DL-N-Succinyl- verbindung	[a]f in Methanol c= ~1	Reinheit der Isomeren in %
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetyl- derivat)	323 .488	32 59	-40,7 + 20,5	92 68

Beispiel 3

Eine wäßrige Nährlösung, die 1% D,L-N-Succinyl-α - methyl - β- (3,4 - dimethoxyphenyl) - alanin, 0,2% KH₂PO₄, 0,2% (NHJ₂SO₄, 0,2% Glycerin, Spuren von MgSO₄, FeSO₄ und CaCO₃ enthält, wird mit KOH auf pH 7,0 eingestellt, steril filtriert und 100 ecm in 1-1-Erlenmeyerkolben abgefüllt. Dieser Erlenmeyerkolben wird mit einer Impföse des Stammes NRRL B-3051 beimpft und 17 Tage auf der Rundschüttelmaschine bei 28° C bebrütet. Die Aufarbeitung erfolgt nach Beispiel 1. Das Ergebnis zeigt die Tabelle 3. 40

Tabelle

	Menge (mg)	Ausbeute in % der DL-N-Succinyl- verbindung	[a]& in Methanol c = ~1	Reinheit der Isomeren in%
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetyl- derivat)	246 338	25 41	-43,1 ' +15,8	95 64

Beispiel 4

Eine wäßrige Nährlösung, die 1% D,L-N-Succinyl-α - methyl - β - (3,4 - dimethoxyphenyl) - alanin, 0,2% KH₂PO₄, 0,2% (NHJ₂SO₄, Spuren von MgSO₄, FeSO₄ und CaCO₃ enthält, wird mit KOH auf pH 7,0 eingestellt, steril filtriert und 100 ecm in 1-1-Erlenmeyerkolben abgefüllt. Dieser Erlenmeyerkolben wird mit einer Impföse des Stammes NRRL B-3051 beimpft 23 Tage auf der Rundschüttelmaschine bei 28° C bebrütet. Die Aufarbeitung erfolgte nach Beispiel 1. Das Ergebnis zeigt die Tabelle 4.

Tabelle

Menge (mg) Ausbeute in % der

DL-N-Succinyl-

verbindung

Reinheit

der Isomeren

in %

Zurückgewonnene N-Succinylverbindung

Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat)

474 152 47
18

-9,5

+ 21,7

60
69

Beispiel 5

Zweimal 100 ecm einer wäßrigen Nährlösung, die 0,15% Lab Lemco, 0,15% Bacteriocym, 0,4% Caseinhydrolysat, 0,1 % Glukose, 0,1 % NaCl, 0,37% K₂HPO₄ und 0,13% KH₂PO₄ enthält, werden in 1-1-Erlenmeyerkolben 20 Minuten bei 120° C sterilisiert, mit je einer öse des Stammes NRRL B-3050 beimpft und 48 Stunden bei 28° C auf der Rundschüttelmaschine bebrütet. Danach werden die Bakterien bei 10 000 xg abgeschleudert, dreimal mit je 25 ecm steri-

IO lern destilliertem Wasser gewaschen, mit 25 ecm sterilem destilliertem Wasser aufgenommen und dann mit ·50 ecm 2%iger DjL-N-Succinyl-a-methyl-jS-ß^-dimethoxyphenyl)-alanin-Lösung und 25 ecm Phosphatpufferlösung pH 8,0 nach Sörensen (8fach konzentriert) gemischt und weiter auf der Rundschüttelmaschine bei 28° C bebrütet. Nach 48 bzw. 72 Stunden werden die Kolben geerntet und nach Beispiel 1 aufgearbeitet. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle 5:

Tabelle

	Inkubationszeit	Menge	Ausbeute in %	[α] ? in Methanol	Reinheit
	Stunden	(mg)	der	c = ~1	der Isomeren
			DL-N-Succinyl-		in % ■
	48	560	verbindung	-9,4	60
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung...			56
Ausbeute an Aminosäure (isoliert als	48	388		+ 9,2	58
N-Acetylderivat)	72	. 494	42	-21,3	72
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung...			49
Ausbeute an Aminosäure (isoliert als	72	467		+ 15 '	63
N-Acetylderivat)		56

Beispiel 6

Zweimal 100 ecm einer wäßrigen Nährlösung, die 0,15% Lab Lemco, 0,15% Bacteriocym, 0,4% Caseinhydrolysat, 0,1 % Glukose, 0,1 % NaCl, 0,37% K₂HPO₄ und 0,13 % KH₂ P O₄ enthält, werden in 1-1-Erlenmeyerkolben 20 Minuten bei 120° C sterilisiert, mit je einer öse des Stammes NRRL B-3050 beimpft und 48 Stunden bei 28° C auf der Rundschüttelmaschine bebrütet. Danach werden die Bakterien bei lOOOOxg abgeschleudert, dreimal mit je 25 ecm sterilem destilliertem Wasser gewaschen, mit 25 ecm sterilem destilliertem Wasser aufgenommen und dann mit 50 ecm 2%igerD,L-N-Succinyl-a-methyl-/?-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin-Lösung und 25 ecm Phosphatpufferlösung pH 6,0 nach Sörensen (8fach konzentriert) gemischt und weiter auf der Rundschüttelmaschine bei 28⁰C bebrütet. Nach 48 bzw. 72 Stunden werden die Kolben geerntet und nach Beispiel 1 aufgearbeitet. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle 6:

Tabelle

	Inkubationszeit Stunden	Menge (mg)	Ausbeute in % der DL-N-Succinyl- verbindung	[α]" in Methanol e = ~1	Reinheit der Isomeren in %
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung... Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat)	48 48 72 72	407 348 260 498	41 42 26 60	-23,0 + 10,0 -42,3 + 15,2	74,0 59 94 64
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung... Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat)

Beispiel 7

Zweimal 100 ecm einer wäßrigen Nährlösung, die 0,15% Lab Lemco, 0,15% Bacteriocym, 0,4% Caseinhydrolysat, 0,1 % Glukose, 0,1% NaCl, 0,37% K₂HPO₄ und 0,13% KH₂PO₄ enthält, werden in 1-1-Erlenmeyerkolben 20 Minuten bei 120° C sterilisiert, mit je einer öse des Stammes NRRL B-3051 beimpft und 48 Stunden bei 28⁰C auf der Rundschüttelmaschine bebrütet. Danach werden die Bakterien bei 10 000 xg abgeschleudert, dreimal mit je 25 ecm sterilem destilliertem Wasser gewaschen, mit 25 ecm sterilem destilliertem Wasser aufgenommen und dann mit 50 ecm 2%iger D,L-N-Succinyl-a-methyl-/3-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin-Lösung und 25 ecm Phosphatpufferlösung pH 8,0 nach Sörensen (8fach konzentriert) gemischt und weiter auf der Rundschüttelmaschine bei 28° C bebrütet. Nach 48 bzw. 72 Stunden werden die Kolben geerntet und nach Beispiel 1 aufgearbeitet. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle 7:

209 632/84

Tabelle

io

Inkubationszeit Stunden

Menge (mg)

Ausbeute in %

der

DL-N-Succinylverbindung

[α]? in Methanol

Reinheit der Isomeren

Zurückgewonnene N-Succinylverbindung...
Ausbeute an Aminosäure (isoliert als

N-Acetylderivat)

Zurückgewonnene N-Succinylverbindung...
Ausbeute an Aminosäure (isoliert als

N-Acetylderivat)

48

48

72

72 539

329
459

370

54

40
46

45

-11,1.

+ 11,0
-17,4

+ 15,2

62

60
68

64

Beispiel 8

Zweimal 100 ecm einer wäßrigen Nährlösung, die 0,15% Lab Lemco, 0,15% Bacteriocym, 0,4% Caseinhydrolysat, 0,1 % Glukose, 0,1 % NaCl, 0,27% K₂HPO₄ und 0,13% KH₂PO₄ enthält, werden in 1-1-Erlenmeyerkolben 20 Minuten bei 120°C sterilisiert, mit je einer öse des Stammes NRRL B-3051 beimpft und 48 Stunden bei 28° C auf der Rundschüttelmaschine bebrütet. Danach werden die Bakterien bei 10 000 xg abgeschleudert, dreimal mit je 25 ecm sterilem destilliertem Wasser gewaschen, mit 25 ecm sterilem destilliertem Wasser aufgenommen und dann mit 50 ecm 2%iger D,L-N-Succinyl-a-methyl-/?-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin-Lösung und 25 ecm Phosphatpufferlösung pH 6,0 nach Sörensen (8fach konzentriert) gemischt und weiter auf der Rundschüttelmaschine bei 28° C bebrütet. Nach 48 bzw. 72 Stunden werden die Kolben geerntet und nach Beispiel 1 aufgearbeitet. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 8:

Tabelle

	Inkubationszeit Stunden	Menge (mg)	Ausbeute in % der DL-N-Succinyl- verbindung	[α]!? in Methanol c= ~I	Reinheit der Isomeren in % -
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung... Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat)	48 48 72 72	450 365 ■ 392 421	45 44 39 51	-13,3 + 9,2 -28,7 + 14,9	64 58 80 63
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung... Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat)

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Spaltung von D,L-a-Methyljö-(3,4-dihydroxyphenyl)-alanin in seine optischen Antipoden, dadurch gekennzeichnet, daß man auf Derivate der allgemeinen Formel

   CH₃
   CH₂-C- COOR"

   NH
   CO
   R'

   55

   60

   wobei R Wasserstoff oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, wobei zwei Alkylreste R auch zu einer Alkylenkette verbunden sein können, oder Acylreste mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, die durch eine Carboxyl- oder Carboalkoxygruppe substituiert sein können, R' Wasserstoff oder einen Alkylrest mit 1 bis 17 Kohlenstoffatomen ist, der durch eine Carboxyl- oder Carboalkoxygruppe substituiert sein kann, und R" Wasserstoff öder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, im wäßrigen Medium Bakterien des Stammes Schyzomycetes von N a e g e 1 i (1857) (NRRL-B-3O5O oder NRRL-B-3051, hinterlegt bei der ARS Culturcollection, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, USA) bzw. daraus hergestellte Extrakte einwirken läßt, dabei entstandenes freies l- bzw. D-Amin vom bleibenden D- bzw. L-Acylamin in an sich bekannter Weise trennt und gegebenenfalls vorhandene Acyl-Alkyl- bzw. Alkylengruppen, R, R' oder R" abspaltet.