DE1921886C

DE1921886C - Verfahren zum Zuchten von Mikro

Info

Publication number: DE1921886C
Application number: DE19691921886
Authority: DE
Priority date: 1968-05-02
Filing date: 1969-04-29
Publication date: 1973-06-07

Description

tarMischungen zur Anwendung gelag Auf Grund der hohen Flüchtigkeit dieser n,cd_;

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Züchten von Mikroorganismen in einem Medium, das aliphatische Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquellen enthält.

In den letzten Jahren nahm das Interesse für Zellen von Mikroorganismen als Proteinquellen in Tierfutter- und Nahrungsindustrien zu, und insbesondere war für Ausgangsmaterialien bei der Herstellung von Würzen, welche z. B. Nucleinsäuicbausteine wie Inosinsäure und Aminosäuren u. dgl. enthalten, die Lieferung von billigen Zellen von Mikroorganismen strak »efragt.

Es war bisher allgemein bekannt, daß die Zellen von einigen Mikroorganismen, z. B. Hefe, und bestimmten Bakterien in hohen Ausbeuten durch Züchten der Mikroorganismen in einem Medium, das geradkettige paraffinische Kohlenwasserstoffe mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen als Hauptkohlenstoffquellen enthielt, hergestellt werden können.

Bei diesen früheren Untersuchungen wurden lediglich niedrige Ausbeuten, beispielsweise von 25%, selbst als Maximum, an Zellen bei Verwendung von Methan als niedriger Kohlenwasserstoff in dem Kulturmedium, erhalten. Im Gegensatz dazu wurden bei Verwendung von geradkeUigen paraffinischen Kohlenwasserstoffen mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen als Hauptkohlenstoffquellen hohe Ausbeuten, beispielsweise nahezu 100% an Zellen erhalten.

Aus der britischen Patentschrift 1 106 646 ist auch ein aerobes Verfahren zum Züchten von Mikroorganismen unter Verwendung eines Nährmediums, das als Hauptkohlenstoffquelle aliphatische Kohlenwasserstoffe mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen enthält, bekannt.

Die Verwertung von niederen acyclischen Kohlenwasserstoffen geradkettiger oder verzweigtkettiger paraffinischer oder olefinischer Art mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist bei diesem bekannten Verfahren in technisch vorteilhafter Weise aber auch nicht möglich, wie aus den Vergleichsversuchen zur britischen Patentschrift 1 106 646 hervorgeht.

Aufgabe der Erfindung ist nun die Verwertung niederer acyclischcr Kohlenwasserstoffe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen bei der Züchtung von Mikroorganismen in technisch vorteilhafter Weise.
Ausgehend von der Züchtung von Mikroorganismen &£ d ,.«deren
der hohen löslichkeit
den Mikroorganismen

egenüb der Kultur leicht assimiliert werden.

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JVllKrOOIgilliiaiiiuo vr . _,

genden taxonomischen Eigenschaften:

A Morphologische Eigenschaften

Während der Anfangsstufe (d. h. während der ersten Stunden) des Wachstums: Stäbchen, 0,4 bis 0,6 · 5 bis 20 Mikron, schlanke oder fadenartige Formen und verzweigte Formen, unbeweglich. Gram-positiv. Nicht säurebeständig. Sudanophile Körner werden beobachtet (sudanophilic granulars).

Später (nach 48 bis 72 Stunden):

Bruch in kurze Stäbe, Länge 5 Mikron oder weniger.

B Kultureigenschaften

(1) Agar — Kolonien
Nähragarkolonien:

Rund bis rosettenartig, gerunzelt bis faltig, ansteigend bis konvex, ganzrandig bis wellenförmig, opalisierend, blaß-gelblich, orange, Medium unverändert.

Glutamat-Glucose-Agar-Kolonien: Rund, glatt, gepolstert, ganzrandig, opalisierend, blaß-organge, Medium unverändert.

(2) Schräg-Agar
Nährschräg-Agar:

Wachstum mäßig, Fadenform, flach, glatt bis runzelig, opalisierend, blaß gelblich-braun, Medium unverändert.

Glutamat-Glucose-Schrägagar: Wachstum mäßig, Fadenform, flach bis ansteigend, glatt, glänzend, blaß-orange, Medium unverändert.

(?) Brühe

Nährbrühe:

membranartig bis häutchenartig, klar bis schwachtrüb, körnige Ausfällung.

Glutamat-Glucosebrühe:

membranartig, klar bis schwach-trüb, körnige

Ausfällung.

{j ι Nährgelatineansatz:

Keine Verflüssigung, Oberflächenwachstum.

C Physiologische Eigenschaften

: Wirkung auf Milch:

unverändert, Lackmus reduziert, Bromkresolpurpur alkalisch.

ι Wirkung auf Nitrat:

Nitrit wird nicht aus Nitralbrühe gebildet, jedoch wird es in einer Succiiial-Nilral-Brühe gebildet. ' V) Nitratatmung:
iiegativ

■■-) lndolerzeugung:
negativ

; 5) Zuckerspaltung

Nach der Hugh und Leifsonschen Methode wird Säure aerob erzeugt, jedoch kein Gas aus Glucose. Anearob wird aus Glucose weder Säure noch Gas erzeugt. Weder Säure noch Gas wird aus Glycerin, Xylose, Succrose, Lactose und Stärke gebildet.

(6) Hydrolyse von Stärke:
negativ

(7) Assimilation von Kohlenhydraten:

Glucose, Gluconat, Citrat, Succinat, Glycerin, Rhamnose, Fructose, Saccharose, Lactose, Raffinose, Inosit, Mannit werden verwendet. Jedoch werden Arabinose, Xylose nicht verwendet.

(8) Katalase:
positiv

(9) Wachstumstemperatur

Optimale Temperatur 25 bis 30^C, wachstumsspärlich bei 37°C.

(10) Verhältnis zu Natriumchlorid:

Wachstum bei 5%. Wachstumsspärlich bei 7% und kein Wachstum bei 10%.

Das aus der vorstehenden Prüfung erhaltene Ergebnis zeigt, daß der Mikroorganismus, der gemäß der Erfindung eingesetzt werdin soll, Corynebacterium hydrocarboclastus, beschrieben von Hiroshi I i ζ u k a und Kazuo Komagate in »Journal of General Microbiology«, 10 (3), S. 207 (1964), sehr ähnlich ist. Jedoch besitzen die von I i ζ u k a und anderen beschriebenen Mikroorganismen ein Kohlenwasserstoffassimilationsvermögen lediglich gegenüber den geradkettigen paraffinischen Kohlenwasserstoffen mit mehr als 10 Kohlenstoffatomen und assimilieren niedere Kohlenwasserstoffe mit weniger als 10 Kohlenstoffatomen nicht. Im Gegensatz dazu kann der Mikroorganismus gemäß der Erfindung sowohl höhere Kohlenwasserstoffe als auch niedere Kohlenwasserstoffe assimilieren. Insbesondere kann er Äthan, Propan, Butan, Pentan od. dgl. und selbst Wasserstoff assimilieren. In dieser Hinsicht ist der Mikroorganismus gemäß der Erfindung mit den genannten Mikroorganismen nicht identisch und wird als Corynebacterium hydrocarboclastus (JTB 271) ATCC 21385 bezeichnet. Die Erfidnung wird nachstehend an Hand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

In einen 500-ml-Schüttelkolben wurden 20 ml eines Züchtungsmediums, wie nachstehend angegeben, eingebracht. Nach Sterilisieren durch Autoklavbehandlung bei 110⁰C während 10 Minuten und Kühlen wurde etwa 1 mg eines Mikroorganismus Corynebacterium hydrocarboclastus (JTB 271) ATCC 21 385 in das Medium eingeimpft, und 50 mg n-Pentan wurden darübergegossen, und der Kolben wurde dicht verschlossen. In dem Kolben verdampfte n-Pentan, wobei der leere Raum des Kolbens mit dem Dampf von n-Pentan gefüllt wurde. Der Kolben mit Inhalt wurde dann bei 3O⁰C während 40 Stunden geschüttelt. Das sich ergebende Züchtungsmedium wurde zentrifugiert, und die erhaltenen Zellen des Mikroorganismus wurden mit Wasser gewaschen. Nach Zentrifugieren wurden die Zellen erneut mit destilliertem Wasser gewaschen und nochmals zentrifugiert und unter verringertem Druck getrocknet, wobei 42,5 mg der Mikroorganismen erhalten wurden.

Zusammensetzung des Züchtungsmediums

NaNO₃ 12 g

Na₂HPO₄-12H₂O 4 g

KH₂PO₄ 0,6 g

MgSO₄-7H₂O 0,5 g

FeSO₄-7H₂O 30 mg

CaCl₂ 60 mg

CuSO₄-5H₂O 15 μg

Na₂B₄O, · 10H₂O 30 μg

MnCl₂-4H₂O 60 μ_δ

ZnSO₄ · 7H₂O 150 μg

Na₂MoO₄ · 2H₂O 30 μg

Hefeextrakt 100 mg

destilliertes Wasser 11

pH 7,0

Die Zusammensetzung der erhaltenen getrockneten Mikroorganismen war wie folgt:

Wasser 7,0%

Protein 41,0%

Kohlenhydrate 40,2%

Fett 3,0%

Asche 8,8%

Beispiel 2

In gleicher Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, wurden 50 ml des nachslehemi angegebenen Züchtungsmediums verwendet. Etwa 1 mg von Corynebacterium hydrocarboclastus (JTB 271) ATCC 21 385 wurde auf das Züchtungsmedium geimpft, und der Kolben wurde mit einem Hahn versehenen Stopfen dicht verschlossen, worauf der Druck in dem Kolben etwa um 150 mm Hg unterhalb Atmosphärendruck reduziert wurde. In den Kolben mit verringertemDruck wurde eine Mischung aus niederen Kohlenwasserstoffen (2% C₂H₆, 3% C₃H_e, 45% C₄H₈, 5% C₄H₁₀, 45% C₆H₁₂, jeweils ausgedrückt als Volumprozent), die als Nebenprodukt

Dei der Herstellung von Äthylen mittels Naphthacrakkung erhalten worden war, eingeführt, bis der Druck in dem Kolben die Höhe von atmosphärischem Druck erreichte. Es waren etwa 250 mg der Mischung von niederen Kohlenwasserstoffen erforderlich. Dann wurde der Kolben mit Inhalt unter A η wendung einer gebräuchlichen Schüttelarbeitsweise dem Züchtungsverfahren unterworfen. Während der Züchtung wurde der Hahn bisweilen geöffnet, um Luft zwecks Zuführung von Sauerstoff in den Kolben einzuführen. Es wurden dabei 175 mg der getrockneten Mikroorganismen erhalten.

Zusammensetzung des Züchtungsmediums

NaNO₃ 12 g

K₄HPO₄ 2,5 g

MgSO₄-TH₂O Ig

Wasser 11

pH 7,0 bis 7,4

Vergleichsversuche
zur britischeti Patentschrift 1 106 646

Versuch A

In einen 500-ml-Schüttelkplben wurden 20 ml des unten angegebenen Züchtungsmediums eingebracht. Nach der Sterilisation im Autoklav bei 110⁰C während 10 Minuten und anschließendem Abkühlen wurde 1 mg des Mikroorganismus Corynebacterium hydrocarboclastus (JTB 271) ATCC 21 385 in das Züchtungsmedium eingeimpft und 50 mg n-Pentan zugegeben. Der Kolben wurde dicht verschlossen. Im Kolben verdampfte das n-Pentan, und der freie Raum des Kolbens füllte sich mit n-Pentandampf. Der Kolben wurde bei 30⁰C 40 Stunden lang geschüttelt. Das sich ergebende Züchtungsmedium wurde zentrifugiert und die erhaltenen Zellen des Mikroorganismus mit Wasser gewaschen. Nach dem Zentrifugieren wurden die Zellen nochmals mit destilliertem Wasser gewaschen und abermals zentrifugiert. Anschließend wurde unter verringertem Druck getrocknet, wobei 49,0 mg des Mikroorganismus erhalten wurden. Die gleiche Arbeitsweise wurde unter Verwendung der nachstehenden Mikroorganismen, die unter den Registriernummern ATCC Nr. 15 522, 15 524, 15525, 15526, 15 528, 15 529 und 15 530 eingetragen sind, an Stelle des (JTB 271) ATCC 21 385 gemäß der Erfindung wiederholt, wobei jeweils 21,4, 17,5, 18,1, 19,2, 16,2, 21,4 bzw. 17,5 mg der entsprechenden Mikroorganismen erhalten wurden.

Zusammensetzung des Züchtungsmediums

NaNO₃ 12 g

Na₂HPO₄-UH₂0 4 g

KH₈PO₄ 0,6 g

MgSO₄ -7H₂O 0,5 g

FeSO₄-7H₂O 30 g

CaCl₂ 60 g

CuSO₄ · 5H₂O 15 μg

ίο Na₂B₄O₇ · 10H₂O 30 μg

MnCl₂ · 4H₂O 60 μg

ZnSO₄ · 7H₂O 150 μg

Na₂MoO₄ · 2H₂O 30 μg

Hefeextrakt 100 mg

destilliertes Wasser 11

pH 7,0

Versuch B

Entsprechend der Arbeitsweise des Versuchs A

«ο wurden 50 ml des Züchtungsmediums des Versuchs A angewendet. Ungefähr 1 mg Corynebacterium hydrocarboclastus (JTB 271) ATCC 21 385 wurden in das Züchtungsmedium eingeimpft und der Kolben mit einem Hahnstopfen dicht verschlossen. Anschließend wurde der Druck im Kolben um etwa 130 mm Hg unter Atmosphärendruck verringert. In den unter verringertem Druck stehenden Kolben wurde η-Butan eingeführt, bis der Druck im Kolben Atmosphärendruck erreichte. Hierzu waren 254 mg η-Butan erforderlich.

Der Kolben wurde dann 60 Stunden lang bei 30⁰C gehalten. Während des Züchtern wurde der Hahn einige Male geöffnet, um Luft zum Zwecke der Sauerstoffzufuhr in den Kolben einzuführen. Mit dieser Arbeitsweise wurden 75 mg trockener Mikroorganismen erhalten.

Die gleiche Arbeitsweise wurde unter Verwendung der nachstehenden Mikroorganismen, die unter den Registriernummern ATCC Nr. 15 522, 15 524, 15 525, 15 526, 15 528, 15 529 und 15 530 eingetragen sind, an Stelle des (JTB 271) ATCC 21 385 gemäß der Erfindung wiederholt.

Die erhaltene Menge an Mikroorganismen war jeweils im wesentlichen gleich der eingeimpften Menge, und ein Wachstum konnte nicht festgestellt werden.

Aus den in den vorstehenden Versuchen A und B erhaltenen Ergebnissen ist klar ersichtlich, daß der gemäß der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangende Mikroorganismus Corynebacterium hydrocarboclastus (JTB 271) ATCC 21 385 den zum Vergleich eingesetzten Mikroorganismen überlegen ist.

Claims

K»n R<>dineungen in einem Nährmedium, unter ^aeroben. ^B£ftoffauelle aliphatische Kohlen-

Patentanspruch:

Verfahren zum Züchten von Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das als Hauptkohlenstoffquelle aliphatische Kohlenwasserstoffe enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium hydrocarboclastus (JTB 271) ATCC 21 385 einsetzt und in einem Medium, das niedere acyclische Kohlenwasserstoffe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen als aliphatische Kohlenwasserstoffe enthält, züchtet.