DE1926072C

DE1926072C - Verfahren zur biochemischen Herstel lung von cyclischem Adenosin-3,5-monophosphat

Info

Publication number: DE1926072C
Authority: DE
Inventors: Jiro Noda; Yokotsuka Tamotsu; Saito Nobuo; Nagareyama; Ishiyama (Japan)
Original assignee: Kikkoman Shoyu KK
Current assignee: Kikkoman Corp
Publication date: 1972-06-22

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biochemischen Herstellung von cyclischem Adenosin-3',5'-monophosphat, nachstehend kurzer mit 3',5'-cyclischer Adenykäure oder A-3',5'-MP bezeichnet.

A-3',5'-MP ist bekannt Tür seine Teilnahme an verschiedenen chemischen Reaktionen in lebenden Zellen und für seine aktive Rolle bei der Bildung verschiedener Hormone. Deshalb wird es als biochemisches Reagenz geschätzt. Die Herstellung dieser Säure auf chemischem Wege verläuft über viele komplizierte Synthesestufen und konnte bisher nicht durch ein einfacheres Verfahren abgelöst werden, überraschenderweise wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß die Mikroorganismen Corynebacterium murisepticum ATTC 21 374, Arthrobacter ATCC 21 375 und Microbacterium ATCC 21 376 bei ihrer Züchtung cyclisches A-3',5'-MP erzeugen können.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur biochemischen Herstellung von cyclischem Adenosin-3',5'-monophosphat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man unter Einhaltung üblicher Züchtungsbedingungen Corynebact-irium murisepticum ATCC 21 374, Arthrobacter ATCC 21 375 oder Microbacterium ATCC 21 376 in Gegenwart von Adenosin, Adenin, Inosin, Hypoxanthin, S-Amino^imidazolcarboxamid - ribosid, 5 - Amino - 4 - imidazolcarboxamid, Succinyladenosin oder Succinyladenin im Nährmedium züchtet.

Das Nährmedium weist vorzugsweise einen Gehalt von 0,1 bis 3,0 Gewichts-/ Volumprozent an den vorgenannten Verbindungen Adenosin, Adenin, Inosin, Hypoxanthin, 5 - Amino - 4 - imidazolcarboxamidribosid, 5-Amino-4-imidazolcarboxamid, Succinyladenosin oder Succinyladenin auf.

Aus dem Folgenden gehen die mykologischen Eigenschaften der obengenannten Stämme hervor:

I. Morphologische Eigenschaften: (Züchtung in
Nähragar und Nährbrühe bei 37 bzw. 3O⁰C)

Microbacterium. ATCC 21 376
Form und Anordnung:
keulenförmige oder geschwungene Zellen wurden im Gesichtsfeld des Mikroskops beobachtet; gelegentlich wurden eckige und palisadenähnliche Anordnungen beobachtet, die durch Zerreißteilung entstanden.
Zellengröße (Alter: 16 Stunden, 30 C):

0,4 bis 0,7 · 1,5 bis 3 Mikron
Gram-Färbung: +
Sporenfärbung: (Sporenbildung)

Geißeln:
Beweglichkeit: -

Corynebacterium murisepticum, ATCC 21 374

Form und Anordnung:

Ruten, zuerst längliche Zellen, verzweigte Zellen und V-förmige Zeilen wurden beobachtet; nach 2 oder 3 Tagen zeigten die Kulturen kokkoide Formen. Zellengröße (Alter: 16 Stunden):

0,5 bis 0,8· 1,5 bis 4 Mikron Gram-Färbung; + Sporenfdrbung: (Sporenbildung)

Geißeln: -

Beweglichkeit: -Säurefestigkeit: -

40 Arthrobacter, ATCC 21

Form und Anordnung:

Ruten, zuerst längliche Zellen, verzweigte Zellen, V-förmige Zellen wurden beobachtet. Nach 1> oder 4 Tagen zeigten die Kulturen kokkotde Formen. Zellengröße (Alter: 16 Stunden):

0,5 bis 0,8 · 2 bis 5 Mikron Gram-Färbung: verschieden Sporenfärbung: (Sporenbildung)

Geißeln:

Beweglichkeit: — Säurefestigkeit: —

II. Züchtungseigenschaften 1. Schrägge&telltes Agar-Nährmedium (schlag-

gestelltes	Bouillon-Agar, 30^cC. 48	ATCC 21374	Stunden)
	ATcr 21 37b	mäßig faden förmig glänzend und feucht Milchweiß butterartig	ATCC 21 375
Wachstum.. Form Glanz Farbe Konsistenz	mäßig stachelig glänzend und feucht Gelb butterartig	mäßig fadenförmig glänzend und feucht Milchweiß butterartig

2. Agar-Kolonien (Bouillon-Agar, 3O⁰C, 48 Stunden)

	ATCC 21 376	ATCC 21 374	ATCC 21375
Form	rund	rund	rund
Oberfläche R.and	glatt ganz konvex undurch sichtig	glatt ganz kissen- förmig undurch sichtig	glatt ganz kissen- förmig undurch sichtig
Oberflächenprofil Optische Eigen schaften

3. Nährbrühe: (Bouillon-Brühe, 30⁰C, 7 Tage)

Oberflächenwachstum ..
Trübung ....

Wachstumsmenge

Sediment

ATCC 21 376

ringförmig mäßig trüb

mäßig spärlich, klebrig

ATCC

21

ringförmig leicht trüb

mäßig klebrig

ATCC

21

ringförmig leicht trnb

mäßig klebrig

4. Schräggestellter Kartoflel-Agar (30⁰C, 3 Tage)

Wachstum

Farbe

ATCC 21376

mäßig OeIb

ATCC 21374

mäßig Milchweiß

ATCC 21375

kein Wachstum

5. Optimale Wachstumstemperatur

6. Thermische Widerstandsfähigkeit bei Erwärmen in 10%iger Magermilch, 15 Minuten bei 72°C und

Minuten bei 7O⁰C

ATCC 21 376	ATCC 21 374	ATCC 21 375
37° C	37^GC	37⁰C

ATCC 21 376

ATCC 21 374

ATCC 21 375

III. Physiologische Eigenschaften:

ATCC 21 376

ATCC 21 374

ATCC 21 375

1. Katalase-Reaktion (3O⁰C, schräg-

gestellte Bouillon)

2. Reduktion von Nitrat (Züchtung

bei30°C)

3. Indol-Bildung (30⁰C, 5 Tage) ....

4. Schwefelwasserstoff-Bildung (30⁰C,

5 Tage)

5. Verwertung von Cilrat

6. Voges-Proskauer-Reaktion (30⁰C,

5 Tage)

7. Methylrot-Test

8. Verflüssigung von Gelatine (3O⁰C,

5 Tage)

9. Zersetzung von Cellulose

10. Urease-Reaktion

11. Reduktion von Methylenblau ....

12. Wirkung au* Lackmus-Milch ....

13. Pigmentbildung

14. Pathogenität

15. Verflüssigung von Stärke .

wird reduziert, sauer und peptonisiert

gelbes Pigment

wird reduziert, alkalisch und peptonisiert

16. Verwertve von Zuckern

	ATCC Säurebild	21 376 Gasbild	ATCC Säurebild	21 374 Gasbild	ATCC Säurebild	21375 Gasbild
Glucose	₊		₊
Glycerin		I I I I I I I		I I I I I I I	I I + I + I I
Xylose	+	-	-	-	-
Saccharose			+	—	—
Stärke	+				...
Fructose	±
Galactose	+		±	«.
Mannose
Arabinose
Maltose	_
Trehalose


Dextrin
Inulin .,,....,.....,.,,	_—

AtCC 21 376

ATCC 21 374

ATCC 21 375

17. Verwertung von Nitraten

18, Verwertung von Ammoniumsalzen

Nach den Bestimmungsmethoden in Bcrgeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, ist der oben beschriebene Stamm Microbacterium ATCC 21 376 pleomorph katalase-positiv, gram-positiv aerob und gehört deshalb zur Klasse Eubacteriales, Bei weiterer Untersuchung stellte sich heraus, daß der Stamm ATCC 21 376 in 10%iger Magermilch bis zu einer Temperatur von 72° C für 15 Minuten und bei 7O⁰C für 30 Minuten hitzebeständig ist, wodurch er sich von allen Gattungen Listeria, Erysipelothrix, Cellulomonas, Arthrobacter und Corynebacterium, Unterfamilie Corynebacteriaceae unterscheidet; er gehört aber zur Gattung Microbacterium dieser Familie.

Der Stamm ATCC 21 375 sollte zur Gattung Arthrobacter gehören, da seine Gram-Reaktion unterschiedlich ist. Zu dieser Gattung gehörende Organismen werden gemäß ihrer Fähigkeit, Nitrate, ammoniakalischen Stickstoff und Citrate zu verwerten, im wesentlichen in zwei Gruppen eingeteilt; dieser Stamm jedoch verwertet Nitrate und ammoniakalischen Stickstoff, aber keine Citrate, und gehört deshalb keiner der beiden vorgenannten Gruppen an. Infolgedi.isen gehört dieser Stamm zur Gattung Arthrobacter.

Stamm ATCC 21 374 katalase-positiv, nicht beweglich, unfähig Cellulose zu verwerten, gram-positiv und weist in 10%iger Magermilch keine Hitzebeständigkeit auf; also gehört er zur Gattung Corynebacterium. Außerdem ist der Stamm nicht beweglich, bildet Nitrit aus Nitrat und erzeugt Säure aus Glucose, Lactose, Saccharose und Mannit. Deshalb wurde die zusätzliche Bezeichnung »murisepticum« gewählt.

Zur erfindungsgemäßen Herstellung von cyclischem A-3',5'-MP werden Adenosin, Adenin, Inosin, Hypoxanthin, 5 - Amino - 4 - imidazolcarboxamid - ribosid, 5 - Amino - 4 - imidazolcarboxamid, Succinyladenosin oder Succinyiadenin oder ein Gemisch dieser Verbindungen, festes oder flüssiges Material mit einer oder mehrerer der genannten Verbindungen oder fermentierte Maische der genannten Verbindungen einem Nährmedium zugesetzt, das assimilierbare Kohlenstoffqueüen, Stickstoffquellen und anorganisches Phosphat und gegebenenfalls andere anorganische Salze und Bestandteile enthält. Der Mikroorganismus wird in dem Nährmedium bei einem pH-Wert zwischen 5 und 9 bei 20 bis 40' C so lange gezüchtet, bis man die bestmögliche Ausbeute an cycliscliem Y-3',5'-MP erhält, z. B. 10 bis 80 Stunden lang. Andernfalls wird ein erfindungsgemäß verwendeter Stamm von Mikroorganismen zuerst dem Medium eingeimpft und in diesem Medium bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 9 bei 20 bis 40⁰C für eine geeignete Zeitdauer, z.B. 10 bis 40 Stunden, gezüchtet. Nach der Züchtung werden Adenosin, Adenin, Inosin, Hypoxanthin, 5-Amino-4-imidazolcarboxamid-ribosid, 5-Amino-4-imidazolcarboxamid, Succinyladenosin oder Succinyladenin oder ein Oe* misch dieser Verbindungen der Oärmaische in einem Betrag von 0,1 bis 3,0 Gewichtsprozent (Gew./Vol.), bezogen auf das Gesamtvolumen des Mediums, zugesstzt. Die Züchtung wird weiter durchgeführt, bis die Menge der im Nährmedium gebildeten Substanz ein Maximum, z. B. nach 10 bis 80 Stunden, erreicht.

Das genannte Medium enthält Kohlenhydrate, wie Glucose, Stärkehydrolysate oder Glycerin als Kohlenstoftquellen, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Harnstoff, Aminosäuren, Protein- oder Peptidhydrolysate und Zellextrakte, z.B: Maisquellwasser und Hefeextrakt, als Stickstoffquellen, Kaliumdihydrogenphosphat oder Nntriumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenpbospbnt oder Ammoniumphosphat als anorganische Phoa phatquellen, sowie gegebenenfalls andere anorganische Salze, z, B. Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Eisen(III) - sulfat oder Eisen(II) - sulfat, Eisen(III)-chlorid oder Eisen(II)-chlorid, Zinksulfat oder Zinkchlorid, Kobaltsulfat oder Kobaltchlorid. Die Züchtung wird nach irgendeiner geeigneten Methode, z. B. unter Schütteln, unter Rühren, aerob durchgeführt.

Wenn die Bildung von cyclischem A-3',5'-MP im Nährmedium ihr Maximum erreicht, wird die Züchtung beendet und die Säure aus der Gärmaische isoliert und gereinigt. Bei der Isolierung und Reinigung der Säure können Aktivkohle, ein Anionenharzaustauscher ,.id ein cyclisches A-3',5'-MP nicht lösendes Lösungsmittel verwendet werden. Zum Beispiel wird die Gärmaische nach Entfernung der Zellen mit Aktivkohle zur Adsorption des in der Fermentationsflüssigkeit enthaltenen cyclischen A-3',5'-MP behandelt, worauf die Aktivkohle mit Ammoniak-Äthanol-Lösung oder Ammoniak-Aceton-Lösung zur Elution der genannten Säure gewaschen wird. Das erhaltene Eluat wird unter vermindertem Druck eingedampft, um überschüssiges Ammoniak und Äthanol zu entfernen, und mit einem Anionenaustauscherharz, wie einem stark basischen Anionenaustauscher mit quartären Ammoniumgruppen in der Chloridform oder Formiatform, weiterbehandeh und mit einem geeigneten Lösungsmittel. 7. B. mit verdünnter Salzsäure oder calciumchloridhaitiger verdünnter Salzsäure für den Anionenaustauscher in der Chloridform bzw. mit verdünnter Ameisensäure oder Natriumformiat enthaltender verdünnter Ameisensäure für den Anionenaustauscher in der Formiatform, zur Elution des cyclischen A-3',5'-MP gewaschen. Das Eluat wird wieder an Aktivkohle adsorbiert, mit Ammoniak-Äthanol-Lösung oder Ammoniak-Aceton-Lösung gewaschen, unter vermindertem Druck eingedampft, um überschüssiges Ammoniak und Äthanol zu entfernen, an einem Kationenaustauscherharz, z. B. einem stark sauren Kationenaustauscher mit Sulfonsäureresten, in der H ⁺-Form adsorbiert und schließlich mit verdünnter Salzsäure eluiert. Das so erhaltene Eluat wird unter vermindertem Druck eingedampft, in dsr Kälte stehengelassen oder mit einem Lösungsmittel, wie Äthanol oder Aceion, welche cyclisches A-3',5'-MP nicht lösen, versetzt, wodurch man die Säure in kristalliner Form erhält.

Gemäß einer anderen Verfahrensweise wird das in der Gärmaische gebildete cyclische A-3'.5'-MP

j5 nach Entfernung der Zellen aus der Brühe an Akti. kohle adsorbiert und mit Ammoniak-Äthanol-Lösung oder Ammoniak-Aceton-Lösung eluierf. Das Eluat wird nach Efitferming von Überschüssigem Ammoniak und Äthanol, z, B. durch Eindampfen unter ver* mindertem Druck, mit Salzsäure angesäuert und mit einem organischen Lösungsmittel, wie Alkohol oder Aceton, versetzt, wodurch man rohes cyclisches A-3',5'-MP erhält. Das so erhaltene rohe cyclische A-3',5'-MP kann mittels eines Anionenaustauscher* harzes oder eines Kationenaustaüscherharzes, wie erwähnt, gereinigt werden. Das erhaltene rohe cyclische A-3 ',5 '-M P wird in Wasser gelöst, mit Salzsäure oder Phosphorsäure angesäuert, mit einem Ent far-

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bungsharz (vgl, Ullmatins Bneyeloeadte der tech* nisehen Cheitiig, Bd, 8 [1957]» S, 813) entfärbt und mit Äthanol, Aceton oder anderen da» cyclische A'3',5'-MP flieht lösenden Lösungsmitteln versetzt, woduföh man eyetlsehes Α4\5'·ΜΡ Sn kristalliner Form erhält,

ÖernäÖ eitlem weiteren Trenn* und Reinlgungs* rtrfahrcn wird die Öärmaische flach Entfernung der Zellen direkt mit einem Anionen- oder Kationenaustauscherharz zur Adsorption des cyclischen A-3.5-MP behandelt. Nach der Behandlung des erhaltenen Eluats mit Aktivkohle oder einem Entfarbungsharz erhält man cyclische« A-.V,5'-MP in kristalliner Form durch Zugabe eines nicht lösend wirkenden Lösungsmittels.

Das nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Produkt ergab in bezug auf Elementaranalyse, R ibose- oder Phosphorgehalt und UV-Spektrum und IR-Spektrum die gleichen Ergebnisse wie eine authentische Probe von cyclischen! A-3.5-MP

Das Verfahren der Erfindung ist ein Einstufenverfahren. Bisher konnte cyclische» A-3'.3'-MP nur in einem komplizierten Mehrstufenverfahren auf chemischem Wege hergestellt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel I

Microbacterium ATCC 21 376 wurde einem schräggestellten Nährmedium, das 0.5% Ammoniumsulfat, 0,5% Kaliumdihydrogenphosphat, 0.05% Magnesiumsulfat. 1,0% Aminosäuren aus Casein. 0,3% Hefeextrakt. 1.0% Glucose und 10% Agar-Agar enthielt und dessen pH-Wert mit 3 n-Kalila«ge auf 7.0 eingestellt wurde, eingeimpft und darauf gezüchtet.

Getrennt davon wurden je 40 ml eines Nährme» drerns. das 0,01% Zmksuhat. 5.0% Ohtcose, 0.5% Harnstoff, 0.5% Ammonramsulfat, 1.0% Kalromdihydrogenphosphat. 1,0% Dikariurepphat, 1.0% Polypepton. 0.1 ml pro Liter MaisqueH-wasser. 0.3% Inosin und 1.0% Magrttsiumsulfet enthielt und dessen pH-Wert mit 3 e-Ral9aege aaf 8,0 eingestellt wurde, in SOtKml-SchütteauKurflaachen abgefüllt. Nach 12mieutigem Aatoklavieren bei 115° C wurde die oben erhaltene Anzuchtkufter Oermatsche eingeimpft and 32 Stunden unter Schütteln bei 30⁰C gezüchtet. Es badeten steh 3,1 mg pro Milliliter cycfoches A-3\5'-MP in der Oätwaeche.

Die erhaltene Gärmaische wurde znr Entfernung der Zellen Astigr und der Obetstaod wurde mit konzentrierter Salzsäure auf de« pH-Wert 2,0 eingestellt und dann mit Aktivkohle zur Adsorption des cyclischen A-3\5'-MP behandelt. Die an der Aktivkohle adsorbierte Säure wurde mit einer l,4%igen Ammoniak-Äthanol-Lösung duiert, und das Etaat wurde zur Entfernung des Ammoniaks und des Äthanols unter vermindertem Druck eingedampft Dann wurde das dabei erhaltene Eluat bei einem pH-Wert von 8,0 an einem stark basisdien Anioöeö- * in der Forrxriatform (Korngröße 044 eingeengt. Die erhaltene Lösung wurde mit ver* dünntet Sälüsaufe auf elften pH-Wert vcm 2,0 ginge» stellt und an einem stark säuren Katlöfienaustausöner In der H⁺'Form (Korngröße 0,14 Ws 0,074 mm)

chfomaiögfaphieft, IeI der Blatten mit 0,1 n*Sala· saure erhielt man eine Fraktion mit eyeliwhem Μ'4'ΉΡ, Die Fraktion wufd§ unter vefffilndeitem BriMfc eingeengt und def Rückstand in einem Kühlraum bei 2 oder 3"C stehengelassen. Man erhielt aus

to 300 ml Gärmaische 920 mg kristallines cyclische« A-3.5-MP

Beispiel 2 Corynebacterium murisepticum ATCC 21 374

i) w»ude einem schräggestellten Nährmedium, das 0.3% Ammoniumsulfat. 0.5% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,005% Magnesiumsulfat, 1% Aminosäuren aus Casein. 0.3% Hefeextrakt. 1.0% Glucose und 2,0% Agar-Agar enthielt und mit 3 η-Kalilauge auf den

w pH-Wert von 7.0 eingestellt wurde, eingeimpft und darauf gezüchtet.

Getrennt davon wurden je 30 ml eines Nähr· tnediuirs, das 3,0% Glucose, 0,3% Ammoniumchlorid, 1.0% Dikaliumhydrogenphosphat, 1.0% Katiunv

i) dihydrogenphosphat, 1,0% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt und 0,0027% Zinksulfat enthielt und dessen iH-Wert mit 3 η-Kalilauge auf 8,0 emgertellt wurde. 5TOmI-^huttelkulturflaschen abgefüllt. Nach lOminutigem Autoklavieren dieses Nährmediums bei 115" C und nach Zusatz von 3% getrennt sterilisiertem Catciumcarbonat wurde die Anzuchtkultur dieser Gärmaische eingeimpft und 10 Stunden unter Schottern bei 30° C gezüchtet. Dann wurden 60 mg Inosin ragesetzt, und die Züchtung wurde bei derselben

Temperatur unter Schütteln 70 Stunden fortgesetzt wobei cycise A-3\5'-MP in einer Menge von 21 mg/ml gebildet wurde.

Die erhaltene Gfirmaische wurde zur Entfernung der ZeBen ru, der überstand wurde mit

Φ 3 n-8aJaa«re auf den pH-Wert 4.0 eingestellt und rar Adsorption des darm enthaltenen cyclischen A-3\5'-MP mit Aktivkohle behandelt Die an der Aktivkohle adsorbierte Säure wurde mit «net l,4%igen Aamoaiak-AtiMkBot-Ldsaag eruiert. Das

4$ Eleat werde zur EntfenMBg BbeischftMigen Ammo» staks as einem schwach snuien tCattoMsaustaescbcr β oer ti -roon cBroBimS)_triipnicn βοα <wnn enter vermndertem Discs. etagedaiQpfl. Noch Zusatz voe Alkohol zum Rückstand erhielt matt 830 mg kri-

so s^uliniescTsicK^^A^'^lliPaelxn

Beispiel 3

Microbacterium ATCC 21 376 wurde einem schräggestellten Nahrffledhim, das 0\5% Ammonramsutfat,

bis 0,074 mm) chromatographiert. Bei der Elution mit einem Gemisch aus 0,1 n-Anwäsensäure und 0,1 n-Natriumformrat wurde eioe Fraktion mit cydischem Α-3%5'-ΜΊ> erhalten,

Die erhaltene FraktiOB Winde Wieder an Aktivkohle adsorbiert; öle Aktivkohle wurde mit Wasser n und mit einer t,4%ipB Ammoniak-Äthanol-Lösung flach der oben beschriebenen Methode ehäert Das Eloat wurde unter vermindertem Druck ^ygip,,g

sulfat, 1,0% Ammosäuren aas Casern, 0,3% Hefeextrakt, 1,0% Glucose und 2,0% Agar-Agar entbM und dessen pH-Wert mit 3 n-RahfäUge und 1,0 &üge^lellt wurde, emgennpft und darauf geznditöL

Getrenöt davoo wtttdett je 40 ml eines Nährmedroms, das 4,0% Glycerin, (. 0,5% Kafioiadihyd'ogerJpBosp^at, 0,5%

xantlriti uwi 0j002/% Snksaifet eät6ielt nod dteseo pH-Wert mit t n^Kahiaege anf f,0 eägg«äft WBide, m 500-mi-Sdschen ab^efelL Nach Jti Aatoklavierefj des NahftifedHHns bei

115° C und Zusatz von 3% getrennt sterilisiertem Caiciutnearbonat wurde die oben erhaltene Ansucht' kultur durch Suspension eingeimpft und uflter Schiit* teln 30 Stunden bei 3O⁰C gezüchtet, wobei cyclische* A*3',5'*MP in einer Menge Vöfi 1,5 mg/ftit gebildet wurde.

Die erhaltene Öärniaische wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und auf dieselbe Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Man erhielt 350 mg cyclische* A-.V.5-MP aus 500 ml Gärmaische. to

Beispiel 4

Arihrobacter AT(V 21 .175 wurde auf einem schräggestellten Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 2 bei W Γ 24 Stunden gezüchtet. Die erhaltene Anzuchtkultur wurde in 50O-ml-Schüttelkulturflaschen in je 40 ml Nährmedium eingeimpft, das 5.0% Glucose. 0.5% Ammoniumsulfat. 1% Dikaliumhydrogenphosphat. 0.5% Harnstoff. 1.0% Kaliumdihydrogenphosphat. 1.0% Polypepton. 1.0% Magnesiumsulfat. 0.5% Hefeextrakt. 0.2% 5-Amino-4-imida?olcarboxamid-ribosid und 0.001% Kobaltsulfat enthielt, dessen pH-Wert mit 3 η-Kalilauge auf 7.0 eingestellt wurde, das 12 Minuten bei 115 C autoklaviert und mit 3% getrennt sterilisiertem CaI-ciumcarbonat versetzt worden war. Man züchtete 40 Stunden bei 30" Γ unter Schütteln und erhielt 1.8 mg/ml cyclische« A-3'.5'-MP.

Die erhaltene Gärmaische wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und auf die gleiche Weise. wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Man erhielt 415 mg cyclische* A-3'.5'-MP aus 500 ml Garmaische.

Beispiel 5

Arthrobacter ATCC 21 375 wurde in einem schräg· J5 gestellten Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 2 bei 30° C 24 Stunden angeiüchtet. Die erhaltene Anzuchtkultur wurde in ftO-ml-SchUttelkulturflaschen in je 40 ml Nihrmedium eingeimpft, das 5% Glucose. 0.5% Ammonium- sulfat. 1% Dikaliumhydrogcnphosphat, 0.5% Harnstoff. 1% Kaliumdihydrogenphosphat, 1% Polypepton. 0.5% Magnesiumsulfat. 0.5% Hefeextrakt. 02% 5*Amino-4-imtdazolcarbo*amid und 0.001% Kobaltsulfat enthielt, mit 3 n-KaKtaoge auf den pH-Wert 7,0 eingestellt und autoklaviert wurde, und bei 30° C 72 Stunden unter Schütteln gezüchtet. Es bildeten sHi 1,4 mg/ml cycsc A-3'.5'-M P im Nährmedhim. Die Garmaische wurde auf die gleiche Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt Man erhielt 332 mg cyclischen A-3',5'-MP aus 500 ml Garmaische.

Beispiel 6

Corynebacterhim murisepticum ATGC 21374, wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel 5 in einem Anzuchtnähnnedium angezüchtet und ic ein Nährmedium eingeimpft, das die gleiche Zusammensetzung wie hn Beispiel 4 hatte, mit einer Ausnahme, daß ah Stelle von 5-Ammo^imidazoIcarboxamidribosid 0,2% Succinyladenosiri zugesetzt wurden. Bei 30° C wurde 40 Stunden Unter Schütteln gezüchtet Es bildeten sich 1,2 mg/ml cycfiscfieVA>3^5'-MP. Die Garmaische wurde zur Entfernung def Zeilen zentrifugiert und wie im Beispiel 1 behandelt; ma* erhielt 180 mg cyclische« A'3',5''MP aus SÖÖfti OMrmaische.

Beispiel 1

Midrobactorium ATCC 21 376 wurde müh dem gleichen Anzucht verfahren wie Im Beispiel 4 angeaitehfef und in ein Nähmedium eingeimpft, das dt« gleiche Zusammensetzung wie im Beispiel 5 hatte, mit einer Ausnahme, daß an Stelle von VAmino-4-imiJazolcarboxamid 0.2% Succinyladenin zugesetzt wurden. Nach 70stUndigem Züchten unter Schütteln bei 30C wurden 0,7mg/ml cyclisches A-3.5-MP erzeugt. Die Gärmaische wurde zur Entfernung dei Zellen zentrifugiert und wie im Beispiel I behandelt; man erhielt 121 mg cyclisches A-3.5-MP aus 500 ml Gärmeische.

Beispiel 8

Microbacterium ATCC 21 376 wurde in demselben Anzuchtmedium wie im Beispiel 5 angezüchtet, in ein Nährmedium eingeimpft, das dieselben Bestandteile wie im Beispiel 6 hatte, mit der Ausnahme, daO an Stelle von Succinyladenosin 0,2% Adenosin zugesetzt wurden, und unter Schuttein 40 Stunden bei 30°C gezüchtet. Man erhielt 2,0 mg/ml cyclisches A-3'.5'-MP. Die Gärmaische wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und wie im Beispiel 2 behandelt: man erhielt 750 mg cyclisches A-3'.5'-MP aus 500 ml Gärmaische.

Beispiel 9

Microbacterium ATCC 2t 376 wurde m gleichen Teilen Anzuchtnährmedium wie im Beispiel 4 gezüchtet, in ein Nährmedium eir geimpft, das die gleiche Zusammensetzung wie hn Beispiel 5 hatte, mit der Ausnahme, daß an Stelh von 5-Ammo-4-rmidazolcarboxamid 0.1% Adenin zugesetzt wurde, und unter Schütteln 70 Stunden bei 3(TC gezechtet. Man erhielt U mg/ml cyclisches A-3\5'-MP. Die Gärmaische wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und aaf die gleiche Weise wie im Beispiel I behandelt. Man erhielt 230 mg cyclisches A-3'.5'-MP aus 500 ml Girmatsche

Claims

Patentae:

1. Verfahren zur biochemischen Herste, ung von cyclische« Adenosin - 3'4'- fBcmophosphat, dadurch gekennzeichnet, daß man unter Einhaltung üblrcfier Züchfmigsbedmgtmgen Corynebacterium murisepticum ATCC 21 374, Arthrobacter ATCC 21 375 oder Microbacterium ATCC 21 376 in Gegenwart von Adenosin, Adenin, Inösin, Hypoxanthm, S-Amino^imidazolcarboxamid-ribosid, S-Äiümo^-nnidazoIcarboxafflid, Succmyfadenosin öder Succmyladenm im Nahrmedium züchtet

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gefcennzeichnet, daß der Gehalt des Nährmediums an Adenosin, Adeäin, Isosra^ HypGxanthin, 5-Amino-4-imidazolcaiboxamid-nT3ösM,5-Amino-4-imid-; azolearboxainid, Succinyladenosm öder SuccmyladeninO,! bis 3,0 Gewichts/Vohiinprozent beträgt