DE19651443A1 - Selbstverstärkende, pharmakologisch kontrollierbare Expressionssysteme - Google Patents

Selbstverstärkende, pharmakologisch kontrollierbare Expressionssysteme

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DE19651443A1
DE19651443A1 DE19651443A DE19651443A DE19651443A1 DE 19651443 A1 DE19651443 A1 DE 19651443A1 DE 19651443 A DE19651443 A DE 19651443A DE 19651443 A DE19651443 A DE 19651443A DE 19651443 A1 DE19651443 A1 DE 19651443A1
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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Nukleinsäurekonstrukt das ein selbstverstärkendes Expressionssystem darstellt, welches aus
  • a) mindestens einer Bindesequenz für einen Transkriptionsfaktor
  • b) mindestens einer Promotorsequenz
  • c) mindestens einem Strukturgen für einen Wirkstoff
  • d) mindestens einem Gen für einen Transkriptionsfaktor, welcher an die Komponente a) bindet,
besteht, wobei die Komponente a) und b) eine Aktivierungssequenz darstellen zur Expression sowohl der Komponente c) wie auch der Komponente d), sowie die Verwendung des Nukleinsäurekonstrukts zur Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung von Krankheiten.
A) Einleitung
Trotz aller weiterführenden Ansätze in der Gentherapie, zeigen die bisherigen präklinischen und klinischen Untersuchungsergebnisse, daß derzeit folgende grundsätzliche Probleme noch nicht ausreichend gelöst sind:
  • - die Expression des in vitro oder in vivo in die Zielzelle eingeführten Transgenes ist zu gering und/oder durch intrazelluläre Abschaltungsvorgänge zu kurzfristig und
  • - die Expression ist nicht ausreichend steuerbar.
Erste Ansätze zur externen Kontrolle der Expression eines Transgenes haben Rivera et al. (Nature Med. 2, 1028 (1996), Belshaw et al. (PNAS USA 93, 4604 (1996) und Ho et al. (Nature 382, 822 (1996)) ausgearbeitet. Das Prinzip dieses Ansatzes ist es, daß nach Zugabe des Wirkstoffes Rapamycin dieser zu einer Kopplung zweier Untereinheiten führt, wobei das Kopplungsprodukt als Transkriptionsfaktor wirkt. Die erste Untereinheit stellt ein Fusionsprotein eines DNA-bindenden Proteins mit dem (auch Rapamycin bindenden) FK506 bindenden Protein (FKBP) dar. Die zweite Untereinheit stellt ein Fusionsprotein eines (ebenfalls an Rapamycin bindenden) Protein FRAP mit der Aktivierungssequenz des Transkriptionsfaktors NF-KB dar.
Der über die Kopplung dieser beiden Untereinheiten mit Rapamycin funktionsfähige Transkriptionsfaktor aktiviert seinerseits im Transgen die Aktivierungssequenz für das Strukturgen.
Der Vorteil dieses Ansatzes ist, daß durch Gabe bzw. Entzug des Wirkstoffes Rapamycin die Expression eines Strukturgenes an- bzw. abgeschaltet werden kann. Durch diesen Ansatz wird jedoch das Problem einer mangelhaften Expression eines Strukturgenes nicht gelöst.
B) Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist nunmehr ein selbstverstärkendes Expressionssystem, welches zu einer erhöhten Transkriptionsrate eines Strukturgenes führt und hierdurch die intrazellulären Prozesse zur Abschaltung der Transkriptionsfähigkeit des Strukturgenes kompensieren kann. Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung die Kombination eines sich selbstverstärkenden Expressionssystems mit einem pharmakologisch kontrollierbaren Promotormodul.
1) Das selbstverstärkende Expressionssystem
Das erfindungsgemäße selbstverstärkende Expressionssystem besteht in der einfachsten Form aus folgenden Komponenten:
  • a) mindestens einer Bindesequenz für den Transkriptionsfaktor d)
  • b) mindestens einer Promotorsequenz
  • c) mindestens einem Strukturgen für einen Wirkstoff
  • d) mindestens einem Gen für einen Transkriptionsfaktor, welcher an die Bindesequenz a) bindet und hierdurch die Promotorsequenz b) aktiviert.
Entsprechend der Erfindung stellen die Komponenten a) und b) eine Aktivierungssequenz für die Transkription des Strukturgenes wie auch für die Expression des Transkriptionsfaktors dar.
Die Komponenten können in ihrer einfachsten Form erfindungsgemäß wie folgt angeordnet sein:
Schema 1)
Die Bindesequenzen a) und a') können gleich oder unterschiedlich sein. Beide müssen jedoch den Transkriptionsfaktor d) binden können.
Die Promotorsequenzen [Komponenten b) und b')] können gleich oder unterschiedlich sein. Durch geringe Aktivierung der Promotorsequenzen b) und b') erfolgt eine geringe Expression des Strukturgenes [Komponente c)] wie auch des Genes für den Transkriptionsfaktor d) [Komponente d)]. Der Transkriptionsfaktor d) wiederum bindet an die Bindesequenzen [Komponenten a) und a')], über welche wiederum die Promotorsequenzen b) und b') aktiviert werden, welche eine verstärkte Expression sowohl des Strukturgenes als auch des Genes für den Transkriptionsfaktor d) bewirken, wodurch die Expression beider wiederum verstärkt wird.
Die Anordnung der Komponenten entsprechend Schema 1) kann entsprechend der Erfindung ergänzt werden um die Einfügung eines nuklearen Exportsignals (NES) am 3' Ende des Strukturgenes und eines nuklearen Exportfaktors (NEF), dessen Expression unter der Kontrolle eines zusätzlichen Promotors (Komponente b''') steht, wobei diese Promotorsequenz [Komponente b''')] gleich oder unterschiedlich zu den Aktivierungssequenzen [Komponenten a) und b) und/oder a') und b')] sein kann.
Schema 2)
Das nukleare Exportsignal (NES) ist eine Nukleotidsequenz, die den Transport einer mit ihr verknüpften premessenger RNA durch die Kernmembran behindert und somit alleine für sich ein nukleares Retentionssignal (NRS) darstellt. Falls das NRS jedoch eine Bindestruktur darstellt für ein Exportprotein genannt nuklearer Exportfaktor, gewinnt das NRS die Funktion eines NES, da dieser nukleare Exportfaktor (NEF) den Transport der ein NES enthaltende premessenger oder messenger RNA aus dem Zellkern in das Zytoplasma vermittelt. Eine das NES enthaltende premessenger oder messenger RNA wird somit durch Bindung an den NEF aus dem Zellkern ausgeschleust (Fischer et al., Cell 82, 475 (1995)).
Entsprechend der Erfindung können die Komponenten c) und d) auch über eine internal ribosome entry site (IRES) statt über die Komponenten a') und b') miteinander verbunden sein. Derartige IRES führen zur Expression zweier über die IRES miteinander verbundenen DNA-Sequenzen.
Die Verbindung über eine IRES kann beispielsweise nach folgendem Schema erfolgen:
Schema 3)
Durch diese Anordnung ist gleichermaßen gewährleistet, daß bei einer bereits geringen Aktivierung der Promotorsequenz b) gleichzeitig mit der Expression des Strukturgens [Komponente c)] über die IRES-Sequenz auch das Gen für den Transkriptionsfaktor [Komponente d)] exprimiert wird und dieser an die Bindesequenz a) bindet, welche zu einer verstärkten Aktivierung der Promotorsequenz b), zu einer verstärkten Expression des Strukturgens c) und, wiederum über die IRES-Sequenz, auch zu einer verstärkten Expression des Genes für den Transkriptionsfaktor d) führt.
Die erfindungsgemäße Anordnung der einzelnen Komponenten nach den Schemata 1-3 stellt somit ein sich selbstverstärkendes Expressionssystem nach folgenden Reaktionsschema dar:
Schema 4)
Dieses sich selbstverstärkende Expressionssystem kann erweitert werden
  • - durch die Aneinanderreihung mehrerer gleicher oder unterschiedlicher Sequenzen für Strukturgene [Komponente c), c'), c'')], welche jeweils miteinander durch gleiche oder unterschiedliche IRES-Sequenzen oder Binde- a) und Promotorsequenzen b') und b'') verbunden sind beispielsweise gemäß nachfolgendem Schema 5):
    Schema 5)
  • - und/oder durch die Aneinanderreihung mehrerer gleicher oder unterschiedlicher Gene für den Transkriptionsfaktor d) [Komponenten d), d'), d'')], die jeweils miteinander durch gleiche oder unterschiedliche IRES- Sequenzen oder Bindesequenzen a) und Promotorsequenzen b') und b'') verbunden sind, beispielsweise gemäß nachfolgendem Schema 6):
    Schema 6)
Die Bindesequenz a) soll vorzugsweise in allen Aktivierungssequenzen gleich sein und an diese sollen alle gleichen oder ungleichen Transkriptionsfaktoren [Komponenten d), d'), d'')] binden. Bei ungleichen Bindesequenzen [z. B. Komponenten a) und a')] sollen alle gleichen oder ungleichen Transkriptionsfaktoren [Komponenten d), d'), d'')] an alle Bindesequenzen binden.
Bei einer Aneinanderreihung von Genen für unterschiedliche Transkriptionsfaktoren sind somit die Aktivierungssequenzen [Komponenten a) und b) und/oder. a') und b')] vorzugsweise so zu gestalten oder auszuwählen, daß sie Bindesequenzen enthalten, an welche alle Transkriptionsfaktoren d), d') und d'') binden.
Gleichermaßen wie das selbstverstärkende Expressionssystem nach Schema 2) kann die Anordnung der Komponenten nach Schema 3) entsprechend der Erfindung durch die Einfügung eines nuklearen Exportsignals (NES) am 3' Ende des Strukturgens [Komponente c)] und eines nuklearen Exportfaktors (NEF) ergänzt werden gemäß nachfolgendem Schema 7.
Schema 7)
Auch hier ist die Expression des NEF über eine weitere Promotorsequenz [Komponente b''')] gesondert zu aktivieren. Diese Promotorsequenz kann gleich oder ungleich den Komponenten a) und b) sein.
2) Das pharmakologisch kontrollierbare Promotormodul
Das erfindungsgemäße pharmakologisch kontrollierbare Promotormodul besteht in seiner einfachsten Form aus folgenden Komponenten:
  • e) mindestens einer Promotorsequenz
  • f) mindestens einem Gen, welches für ein Fusionsprotein f) aus einer Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors und einem eine Kopplungssubstanz [Komponente j)] bindenden Protein A kodiert
  • g) mindestens einer weiteren Promotorsequenz [gleich oder ungleich der Komponente e)] oder einer IRES
  • h) mindestens einem Gen, welches für ein Fusionsprotein h) aus einer DNA bindenden Domäne und einem eine Kopplungssubstanz [Komponente j)] bindenden Protein B kodiert
  • i) mindestens einer Aktivierungssequenz mit einer Bindestelle für das Fusionsprotein h)
  • j) eine Kopplungssubstanz j), welche sowohl eine Bindestelle A) für das Protein A im Fusionsprotein f) [Expressionsprodukt der Komponente f)] als auch eine Bindestelle B) für das Protein B) im Fusionsprotein h) [Expressionsprodukt der Komponente h)] hat.
Die Anordnung der Komponenten e-i) kann beispielsweise nach folgendem Schema erfolgen:
Schema 8)
Durch diese Anordnung ist gewährleistet, daß bei Aktivierung der Promotorsequenzen e) und g) die Fusionsproteine f) und h) [Komponenten f) und h)] exprimiert werden. Bei Anwesenheit der Kopplungssubstanz [Komponente j)] werden beide Fusionsproteine miteinander verbunden zu einem funktionsfähigen Transkriptionsfaktor für die Aktivierung der Aktivierungssequenz [Komponente i)].
Die erfindungsgemäße Anordnung der einzelnen Komponenten stellt somit ein bei Anwesenheit der Kopplungssubstanz [Komponente j)] funktionsfähiges, bei Abwesenheit nicht funktionsfähiges und damit durch die Zugabe einer Kopplungssubstanz [Komponente j)] kontrollierbares Promotormodul dar. Die Funktion wird durch folgendes Schema beispielhaft verdeutlicht:
Schema 9)
3) Selbstverstärkendes, pharmakologisch kontrollierbares Expressionssystem
Entsprechend der Erfindung wird das selbstverstärkende Expressionssystem mit dem pharmakologisch kontrollierbaren Promotormodul kombiniert. Diese Kombination kann beispielsweise so erfolgen, daß das pharmakologisch kontrollierbare Promotormodul [Komponenten e) bis i)] an die Stelle der Promotorsequenz (Komponente b) und/oder b')) in das selbstverstärkende Expressionssystem (siehe Schema 1, 2, 3 oder 7) eingesetzt werden. Die Konstruktion diese kombinierten Nukleotidsequenz wird an folgenden Schema beispielhaft verdeutlicht:
Schema 10)
Durch diese Kombination erfolgt die Transkription eines Strukturgens nur dann, wenn durch die Anwesenheit der Kopplungssubstanz [Komponente j)] die Fusionsproteine f) und h) [Expressionsprodukte der Komponenten f) und h)] zu einem Transkriptionsfaktor verknüpft werden.
Alternativ oder zusätzlich hierzu kann entsprechend der Erfindung das pharmakologisch kontrollierbare Promotormodul auch an die Stelle der Gene für den Transkriptionsfaktor [Komponente d)] und der Bindesequenz für den Transkriptionsfaktor d) [Komponente a)] und der Promotorsequenz b) [Komponente b)] in das selbstverstärkende Expressionssystem eingesetzt werden. Hierbei sollte die Bindestelle für die Komponente h) am 5' Ende mindestens einer der Promotorsequenzen e) und g) angefügt sein. Die Konstruktion dieser kombinierten Nukleotidsequenz wird an folgendem Schema beispielhaft verdeutlicht:
Schema 11)
Eine weitere erfindungsgemäße Alternative für die Kombination des selbstverstärkenden Expressionssystems mit dem pharmakologisch kontrollierbaren Promotormodul ist, die Promotorsequenz (Komponente b''')) für den nuklearen Exportfaktor (siehe Schema 2 oder 7) durch ein pharmakologisch kontrollierbares Promotormodul gemäß Schema 8) zu ersetzen. Die Konstruktion dieser Nukleotidsequenz ist im Schema 12) beispielhaft verdeutlicht.
Schema 12)
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte bestehen bevorzugterweise aus DNS. Unter dem Begriff "Nukleinsäurekonstrukte" werden künstliche Gebilde aus Nukleinsäure verstanden, die in den Zielzellen transkribiert werden können. Sie sind bevorzugt in einen Vektor eingefügt, wobei Plasmidvektoren oder virale Vektoren besonders bevorzugt sind.
Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kann ein Strukturgen [Komponente c)] je nach Wahl der Promotorsequenz unspezifisch, zellspezifisch oder virusspezifisch oder unter bestimmten metabolischen Bedingungen oder auch Zellzyklus-spezifisch exprimiert werden, wobei es sich bei dem Strukturgen bevorzugt um ein Gen handelt, das seinerseits für einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff oder aber für ein Enzym kodiert, welches eine inaktive Vorstufe eines Pharmakons in ein aktives Pharmakon spaltet. Das Strukturgen kann so gewählt sein, daß dieses Enzym als Fusionsprotein mit einem Liganden exprimiert wird und dieser Ligand an die Oberfläche von Zellen, zum Beispiel proliferierende Endothelzellen oder Tumorzellen bindet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Zellen von Hefen oder Säugern, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt enthalten. In besonders bevorzugter Ausführungsform werden die Nukleinsäurekonstrukte in Zellinien eingebracht, die dann nach Transfektion durch Gabe oder Verabreichung einer Kopplungssubstanz [Komponenten j)] zur Expression des Strukturgenes verwendet werden können. Derartige Zellen können zur Bereitstellung eines Heilmittels für Patienten benutzt werden. Sie können aber auch Patienten zur Behandlung einer Erkrankung verabreicht werden. Alternativ können die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte, eingefügt in einen nichtviralen oder viralen Vektor, Patienten lokal verabreicht oder parenteral injiziert werden. Damit die verabreichten Zellen oder Nukleinsäurekonstrukte das Strukturgen exprimieren, ist den Patienten zusätzlich die Kopplungssubstanz [Komponente j)] zu verabreichen, da diese in den transfizierten Zellen zur Kopplung des Fusionsproteins f) mit dem Fusionsprotein h) (siehe Schema 9) und damit zur Bildung eines spezifischen Transkriptionsfaktors führt. Die Expression des Strukturgenes durch die transfizierten Zellen währt demzufolge nur so lange, wie die Kopplungssubstanz im Körper vorhanden ist. Durch Gabe der Kopplungssubstanz läßt sich somit die Expressionsdauer und -stärke kontrollieren.
Eine bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes besteht somit in der Behandlung einer Erkrankung, wobei die Bereitstellung des Heilmittels die Einführung eines Nukleinsäurekonstruktes in eine Zielzelle und dessen unspezifische, virus- oder zielzellspezifische und/oder Zellzyklus­ spezifische Expression durch Gabe einer Kopplungssubstanz umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kommen in dieser Form nicht in der Natur vor, d. h. das Strukturgen für den Wirkstoff oder für ein Enzym oder für ein Ligand-Enzym-Fusionsprotein ist nicht natürlicherweise kombiniert mit Nukleinsäuresequenzen, so daß ein selbstverstärkendes Expressionssystem gebildet wird und dieses ist nicht natürlicherweise kombiniert mit einem pharmakologisch kontrollierbaren Promotormodul.
Bevorzugte Strukturgene, welche in ein selbstverstärkendes pharmakologisch kontrollierbares Expressionssystem eingebaut werden, kodieren für einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff. Dieses sind Proteine und Glykoproteine, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cytokine, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren für Cytokine oder Wachstumsfaktoren, Antikörper oder Antikörperfragmente, antiproliferativ oder zytostatisch wirkende Proteine, Angiogeneseinhibitoren, Thrombose induzierende Proteine, Gerinnungshemmer, Blutplasmaproteine, Komplement aktivierende Proteine, Hüllsubstanzen von Viren und Bakterien, Hormone, kreislaufwirksame Peptide, Neuropeptide, Enzyme und Mediatoren und Fusionsproteine aus mindestens zwei dieser Proteine oder Glykoproteine.
C) Nähere Beschreibung der Komponenten des selbstverstärkenden, pharmakologisch kontrollierbaren Expressionssystems 1) Aktivierungssequenzen und Transkriptionsfaktoren für selbstverstärkende Expressionssysteme
Im Sinne der Erfindung bindet der Transkriptionsfaktor d) [Genprodukt der Komponente d)], spezifisch an die zugehörige Bindesequenz a) [Komponente a)], welche ihrerseits die 3' benachbarte Promotorsequenz b) (bzw. b' oder b'') aktiviert.
Komponenten a) und b) stellen demzufolge eine Aktivierungssequenz dar, welche eine Bindesequenz für den zugehörigen Transkriptionsfaktor d) enthält.
Andererseits muß der Transkriptionsfaktor d) eine Bindedomäne spezifisch für die korrespondierende Bindesequenz der Aktivatorsequenz [Komponente a)] wie auch eine Transaktivierungsdomäne enthalten. Ein zusätzliches nukleares Lokalisationssignal (NLS) fördert die Interaktion mit der Aktivierungssequenz a).
Nukleinsäurekonstrukte, die diese Voraussetzung erfüllen, sind beispielsweise:
Möglichkeit A)
  • - eine Aktivierungssequenz bestehend aus der Komponente a)
    • - mit mindestens einer Bindesequenz [Nukleotidsequenz: 5'- CGGACAACTGTT-GACCG-3'] für das Gal4-Protein (Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) und (an deren 3' Ende) einer Komponente b), welche darstellt
    • - den basalen Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, New York; Cold Spring Harbor Laboratory) oder
    • - den Promotor von c-fos (Das et al., Nature 374, 657 (1995)) und (an dessen 3' Ende) die saure Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV1-VP16 (Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)) oder
    • - den U2 sn RNA-Promotor und (an dessen 3' Ende) die TAD von HSV1-VP16 oder mindestens eine Sequenz der Aktivierungsdomäne von Oct-2 (Aminosäuren 438 bis 479; Tanaka et al., Mol. Cell Biol. 14, 6046 (1994); Das et al., Nature 374, 657 (1995)) oder
    • - den Promotor von HSV TK (Papavassiliou et al., J. Biol. Chem. 265, 9402 (1990); Park et al., Molec. Endocrinol. 7, 319 (1993)) oder
    • - einen anderen unspezifischen, zellspezifischen, virusspezifischen oder zellzyklusspezifischen oder metabolisch aktivierbaren Promotor
  • - das Gen für den zugehörigen Transkriptionsfaktor d) [Komponente d)] mit
    • - der cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4-Proteins (Aminosäuren 1 bis 147; Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)), an deren 3' Ende
    • - das nukleare Lokalisations-Signal (NLS) von SV40 (SV40 Large T; Aminosäuren 126 bis 132: PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) und an dessen 3' Ende
    • - die saure Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16 (Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)) angefügt sind
Möglichkeit B)
  • - eine Aktivierungssequenz bestehend aus der Komponente a)
    • - mit mindestens einer Bindesequenz [Nukleotidsequenz 5'- TACTGTATGTACA-TACAGTA-3'] für das LexA Protein [LexA-Operator; Brent et al., Nature 612, 312 (1984)] und (an deren 3' Ende) einer Komponente b), welche darstellt
    • - den basalen Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, New York; Cold Spring Harbor Laboratory) oder ein anderer Promotor (siehe Möglichkeit A)
  • - das Gen für den zugehörigen Transkriptionsfaktor d) [Komponente d)] mit
    • - der cDNA für die DNA-Bindedomäne des LexA-Proteins (Aminosäuren 1 bis 81; Kim et al., Science 255, 203 (1992)) oder das ganze LexA-Protein (Aminosäuren 1 bis 202; Brent et al., Cell 43, 729 (1985)), an deren 3' Ende
    • - das nukleare Lokalisations-Signal (NLS) von SV40 (SV40 Large T; Aminosäuren 126 bis 132: PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) und an dessen 3' Ende
    • - die sauren Transaktivierungsdomänen (TAD) von HSV-1 VP16 (Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)) angefügt sind
Möglichkeit C)
  • - eine Aktivierungssequenz bestehend aus der Komponente a)
    • - mit mindestens einer Lac-Operator-Bindesequenz (Nukleotidsequenz: 5'- GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3') für das lac I Repressorprotein (Fuerst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989); Simons et al., PNAS USA 81, 1624 (1984)) und (an deren 3' Ende) einer Komponente b), welche darstellt
    • - den basalen Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed) DNA Tumor Viruses (Gold Spring Harbor New York, N.Y., Gold Spring Harbor Laboratory) oder einen anderen Promotor (siehe Möglichkeit A)
  • - das Gen für den zugehörigen Transkriptionsfaktor d) [Komponente d)] mit
    • - der cDNA für das lac Repressor (lac 1) Protein (Brown et al., Cell 49, 603 (1987); Fuerst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989)) an deren 3' Ende
    • - das nukleare Lokalisationssignal (NLS) von SV40 (SV40 large T; Aminosäuren: 126-132; PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) und an dessen 3' Ende
    • - die saure Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16 (Aminosäuren: 406-488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)) angefügt sind.
Möglichkeit D)
  • - eine Aktivierungssequenz bestehend aus der Komponente a)
    • - mit mindestens einer Tetrazyklin-Operator-(tet O)-Bindesequenz (Nukleotidsequenz: 5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAG- AGAAAAGTGAAAG-3') für das Tetracyclin-Repressor-(tet R)-Protein und (an deren 3' Ende) einer Komponente b), welche darstellt
    • - den basalen Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed.) DNA Tumor Viruses (Gold Spring Harbor New York, N.Y., Gold Spring Harbor Laboratory) oder ein anderer Promotor (siehe Möglichkeit A)
  • - das Gen für den zugehörigen Transkriptionsfaktor d) [Komponente d)] mit
    • - der cDNA für das Tetracyclin-Repressor(tet R)-Protein (Gossen et al., PNAS USA 89, 5547 (1992); Dingermann et al., EMBO J. 11,1487 (1992)) an deren 3' Ende
    • - das nukleare Lokalisationssignal (NLS) von SV40 (SV40 large T; Aminosäuren 126-132; PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) und an dessen 3' Ende
    • - die saure Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16 (Aminosäuren: 406-488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)) angefügt sind
Möglichkeit E)
  • - eine Aktivierungssequenz bestehend aus der Komponente a)
    • - mit mindestens einer Bindesequenz [Nukleotidsequenz 5'- TAATGATGGGCG-3'] für das ZFHD-1 Protein (Pomerantz et al., Science 267, 93 (1995)) und (an dessen 3' Ende) einer Komponente b), welche darstellt
    • - den basalen Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Gold Spring Harbor New York, New York, Gold Spring Harbor Laboratory) oder einen anderen Promotor (siehe Möglichkeit A)
  • - das Gen für den zugehörigen Transkriptionsfaktor d) [Komponente d)] mit
    • - der cDNA für das ZFHD1-Protein (Pomerantz et al., Science 267; 93(1995)) an deren 3' Ende
    • - das nukleare Lokalisations-Signal (NLS) von SV40 (SV40 large T; Aminosäuren 126 bis 132: PKKKRRV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) und an dessen 3' Ende
    • - die sauren Transaktivierungsdomänen (TAD) von HSV-1 VP16 (Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (19959) angefügt sind
2) Pharmakologisch kontrollierbare Promotormodule
Entsprechend der Erfindung sind folgende Gene spezifische Bestandteile der pharmakologisch kontrollierbaren Promotormodule (siehe auch Schema 8 und 9):
  • - für das Fusionsprotein f) [Komponente f)]:
    • - das Gen für die Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors und
    • - mindestens ein Gen für ein die Kopplungssubstanz j) bindendes Protein A, ggf.
    • - ergänzt um ein nukleares Lokalisations-Signal (NLS)
  • - für das Fusionsprotein h) [Komponente h)]:
    • - mindestens ein Gen für ein die Kopplungssubstanz j) bindendes Protein B und
    • - das Gen für ein an die DNA der Aktivierungssequenz [Komponente i)] bindendes Protein
  • - die Kopplungssubstanz
    • - die Komponente j) mit mindestens einer Bindestelle für das Protein A und für das Protein B
  • - und die Aktivierungssequenz bestehend aus einer Bindestelle für das Fusionsprotein h) [Komponente h)] und einem Promotorelement
    • - die Komponente i).
Die Wahl der Kopplungssubstanz [Komponente j)] bestimmt zwangsläufig die Art der die Komponente j) bindenden Proteine A bzw. B in den Komponenten f) und h).
Hierbei können die Komponente j) bindenden Proteine A und B in den Komponenten f) und h) gleich oder ungleich sein. Gleiche Komponenten f) und h) sind insbesondere dann einsetzbar, wenn die Kopplungssubstanz [Komponente j)] mehrere gleiche Bindestellen aufweist. Im Sinne der Erfindung werden jedoch in den Komponenten f) und h) ungleiche, die Komponente j) bindenden Proteine A und B bevorzugt.
Das heißt, die Kopplungssubstanz [Komponente j)] wird vom Fusionsprotein f) [Komponente f)] an einer anderen Stelle gebunden als vom Fusionsprotein h) [Komponente h)], so daß die Fusionsproteine f) und h) nicht miteinander um die Bindung an die Kopplungssubstanz konkurrieren.
Es können Kopplungssubstanzen verwendet werden, für welche bereits zelluläre Proteine bekannt sind, welche an die jeweilige Kopplungssubstanz binden können und deren Gene im pharmakologisch kontrollierbaren Promotor in den Komponenten f) und h) Verwendung finden.
Es ist jedoch auch ein besonderer Gegenstand dieser Erfindung, monoklonale und hiervon abgeleitete rekombinante Antikörper oder deren Fragmente zu verwenden, welche an die Kopplungssubstanz j) binden. Die Einfügung dieser monoklonalen Antikörper, insbesondere deren rekombinante Fv-Fragmente in die Fusionsproteine f) und h) [Komponenten f) und h)], stellt ein besonderes Merkmal dieser Erfindung dar. Hierbei sind in den Fusionsproteinen [Komponenten f) und h)] bevorzugt rek. Fv-Fragmente einzusetzen, welche unterschiedliche Bindungsstellen (Epitope der Bindestellen A bzw. B) auf der Kopplungssubstanz [Komponente j)] erkennen.
Im Sinne der Erfindung können murine wie auch humane monoklonale Antikörper verwendet werden. Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form einzusetzen. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991) und Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) dargestellten Weise. Antikörperfragmente werden entsprechend dem Stand der Technik hergestellt, beispielsweise in der von Winter et al., Nature 349, 293 (1993); Hoogenboom et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36,19 (1993); Girol, Mol. Immunol. 28, 1379 (1991) und Huston et al., Int. Rev. Immunol. 10,195 (1993) beschriebenen Weise.
Rekombinante Antikörperfragmente werden direkt aus existierenden Hybridomen hergestellt oder werden mit Hilfe der "phage display"-Technologie (Smith, Science 228, 1315 (1985)) aus Bibliotheken muriner bzw. humaner Antikörperfragmente isoliert (Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433 (1994)). Diese Antikörperfragmente werden dann auf genetischer Ebene direkt für die Fusion mit anderen Proteinen oder Peptiden [mit der Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors (Komponente f) oder mit dem DNA bindenden Protein (Komponente h)] eingesetzt.
Zur Herstellung von rekombinanten Antikörperfragmenten aus Hybridomen wird die genetische Information, die für die antigenbindenden Domänen (VH, VL) der Antikörper kodiert, durch Isolierung der mRNA, die reverse Transkription der RNA in cDNA und die anschließende Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (Saiki et al., Science 230, 1350 (1985)) und Oligonukleotiden komplementär zu den 5'- bzw. 3' Enden der variablen Fragmente (Orlandi et al., 1989) gewonnen. Die VH- und VL-Fragmente werden dann in bakterielle Expressionsvektoren z. B. in Form von Fv-Fragmenten (Skerra & Plückthun, Science 240, 1038 (1988)), einzelkettigen Fv-Fragmenten (scFv) (Bird et al., Science 242, 423 (1988); Huston et al., PNAS- USA 85, 5879 (1988)) oder als Fab-Fragmente (Better et al., Science 240, 1041 (1988)) kloniert.
Neue Antikörperfragmente können mittels der "phage display"-Technologie auch direkt aus Antikörperbibliotheken (Immunbibliotheken, naive Bibliotheken) murinen oder humanen Ursprungs isoliert werden. Beim "phage display" von Antikörperfragmenten werden die antigenbindenden Domänen als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein g3P filamentöser Bakteriophagen entweder in das Phagengenom (McCafferty et al., Nature 348, 552 (1990)) oder in Phagemid- Vektoren (Breitling et al., Gene 104, 147 (1991)) in Form von scFv-Fragmenten (McCafferty et al., Nature 348, 552 (1990)) oder als Fab-Fragmente (Hoogenboom et al., Nucl. Acid Res. 19, 4133 (1991); Barbas et al., PNAS USA 88, 7978 (1991)) kloniert. Antigenbindende Phagen werden an antigenbeladenen Plastikgefäßen (panning) (Marks et al., J. Mol. Bio. 222, 581 (1991)), an antigenkonjugierten, paramagnetischen "beads" (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992)) oder durch Bindung an Zelloberflächen (Marks et al., Bio/Technol. 11, 1145 (1993)) selektioniert.
Immunbibliotheken werden hergestellt durch PCR-Amplifikation der variablen Antikörperfragmente aus B-Lymphozyten immunisierter Tiere (Sastry et al., PNAS- USA 86, 5728 (1989); Ward et al., Nature 341, 544 (1989); Clackson et al., Nature 352, 624 (1991)) oder Patienten (Mullinax et al., PNAS-USA 87, 8095 (1990); Barbas et al., PNAS-USA 88, 7978 (1991)). Dazu werden Kombinationen von Oligonukleotiden, die spezifisch sind für murine (Orlandi et al., PNA-USA 86, 3833 (1989); Sastry et al., PNAS-USA 86, 5728 (1989)) oder humane Immunglobulingene (Larrick et al., BBRC 160, 1250 (1989)) bzw. für die humanen Immunglobulin- Genfamilien (Marks et al., Eur. J. Immunol. 21, 985 (1991)), verwendet.
Unter Verwendung nichtimmunisierter Spender als Quelle der Immunglobulingene lassen sich naive Bibliotheken herstellen (Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Alternativ können Immunglobulin-Keimbahngene zur Herstellung semisynthetischer Antikörperrepertoires eingesetzt werden, wobei die Komplementarität-bestimmende Region 3 der variablen Fragmente durch PCR mit Hilfe degenerierter Primer ergänzt wird (Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1992); Barbas et al., PNAS-USA 89, 4457 (1992); Nissim et al., EMBO J. 13, 692 (1994); Griffiths et al., EMBO J. 13, 3245 (1994)). Diese sogenannte "single pot"-Bibliotheken haben gegenüber Immunbibliotheken den Vorteil, daß Antikörperfragmente gegen eine Vielzahl von Antigenen aus einer einzigen Bibliothek isoliert werden können (Nissim et al., EMBO J. 13, 692 (1994)).
Die Affinität von Antikörperfragmenten kann mittels der "phage display"-Technologie weiter erhöht werden, wobei neue Bibliotheken von bereits existierenden Antikörperfragmenten durch zufällige (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992); Gram et al., PNAS-USA 89, 3576 (1992)), kodonbasierende (Glaser et al., J. Immunol. 149, 3903 (1992)) oder gezielte Mutagenese (Balint & Larrick, Gene 137, 109 (19939), durch "chain shuffling" einzelner Domänen mit Fragmenten aus naiven Repertoires (Marks et al., Bio/Technol. 10, 779 (1992)) oder unter Zuhilfenahme von bakteriellen Mutatorstämmen (Low et al., J. Mol. Biol. 260, 359 (1996)) hergestellt werden und durch Reselektion unter stringenten Bedingungen (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992)) Antikörperfragmente mit verbesserten Eigenschaften isoliert werden. Zusätzlich können murine Antikörperfragmente durch stufenweisen Austausch einer der variablen Domänen gegen ein humanes Repertoire und anschließende Selektion mit dem ursprünglichen Antigen ("guided selection") (Jespers et al., Bio/Technol. 12, 889 (1994)) humanisiert werden. Alternativ erfolgt die Humanisierung muriner Antikörper durch zielgerichteten Austausch der hypervariablen Regionen humaner Antikörper durch die korrespondierenden Regionen des originalen murinen Antikörpers (Jones et al., Nature 321, 522 (1987)).
Um funktionsfähig zu sein, hat die Kopplungssubstanz [Komponente j)] in die Zelle einzudringen. Im Sinne der Erfindung zählen somit zu den Kopplungssubstanzen grundsätzlich alle Substanzen, welche in eine Zelle eindringen können. Im Sinne dieser Erfindung werden besonders solche Kopplungssubstanzen bevorzugt, welche unabhängig von der Gentherapie bereits als Arzneimittel verwendet werden.
Beispielsweise zählen hierzu folgende Kopplungssubstanzen [Komponente j)] mit den zugehörigen, an die jeweilige Kopplungssubstanz bindenden Proteinen, deren Gene in die Komponente f) bzw. h) zur Expression der Fusionsproteine f) und h) einzufügen sind:
  • - Kopplungssubstanz: Rapamycin oder Rapamycin-Analoga, wie L685818 (Becker et al., J. Biol. Chem. 268, 11335 (1993)) mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - das FK506 bindende Protein (FKBP; Bierer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9231, 1990))
    • - das an den Rapamycin-FKBP-Komplex bindende FKBP-Rapamycin assoziiertes Protein, oder dessen an den Rapamycin-FKBP-Komplex bindende Teilsequenz (FRAP; Brown et al., Nature 369, 756 (1994); Chiu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12574 (1994); Sabatini et al., Cell 78, 35 (1994); Sabers et al., J. Biol. Chem. 270, 815 (1995)).
    • - Statt Gene für das FKBP und das FRAP können Gene für rek. Fv verwendet werden, welche an Rapamycin binden und/oder die Bindung von FKBP bzw. von FRAP an Rapamycin inhibieren.
  • - Kopplungssubstanz: Dimere (FK1012) von FK506 (Spencer et al., Science 262, 1019 (1993); Pruschy et al., Chem. Biol. 1, 163 (1994)) mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - das FK506 bindende Protein (FKBP, s. o.)
    • - Calcineurin (Lin et al., Cell 66, 807 (1991)) oder dessen an den FK506 Komplex bindende Teilsequenz (Clipstone et al., J. Biol. Chem. 269, 26431 (1994))
    • - statt des Genes für Calcineurin kann das Gen für ein rek. Fv eingefügt werden, welches die Bindung von FKS06 an Calcineurin inhibiert (Ho et al., Nature 382, 822 (1996)).
  • - Kopplungssubstanz: Dimere von Cyclosporin A (Belshaw et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4604 (1996)) mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - Cyclophilin (Belshaw et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4604 (1996))
    • - Calcineurin oder dessen an den Cyclosporin A/Cyclophilin Komplex bindende Teilsequenz (s. o.)
    • - statt des Genes für Cyclophilin kann das Gen für ein rek. Fv eingefügt werden, welches die Bindung von Cyclosporin A an Cyclophilin inhibiert.
  • - Kopplungssubstanz: Monomere von Cyclosporin A mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - Cyclophilin
    • - Gen für einen rek. Fv, welcher an Cyclosporin A im Cyclophilin/Cyclosporin A-Komplex bindet (Cacalano et al., Molec. Immunol. 29, 107 (1992)) alternativ zu Cyclophilin können Gene für unterschiedliche rek. Fv verwendet werden, welche an unterschiedliche Epitope von Cyclosporin A binden (Vix et al., Proteins 15, 339 (1993)), Cacalano et al., Mol. Immunol. 29, 107 (1992); Rauffer et al., Molec. Immunol. 31, 913 (1994))
  • - Kopplungssubstanz: Methotrexat mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Methotrexate (Pimm et al., Brit. J. Cancer 61, 508 (1990); Kato et al., J. Immunol. Methods 67, 321 (1984))
    • - Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen die Pteridinegruppe (Cot et al., Hybridoma 6, 87 (1987))
    • - Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen die Benzene-Gruppe (Cot et al., Hybridoma 6, 87 (1987))
    • - Dihydrofolatreductase (Masters et al., Gene 21, 59 (1983); Swift et al., Mol. Gen. Genetics 181, 441 (1981); Goldsmith et al., Mol. Cell Biol. 6, 878 (1986))
  • - Kopplungssubstanz: Gentamycin mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Gentamycin (Sierra- Madero et al., J. Clin. Microbiol. 26, 1904 (1988))
  • - Kopplungssubstanz: Ceftazidim mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Ceftazidim (Shimizu et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 98, 392 (1992))
  • - Kopplungssubstanz: Cephalexin mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen die acyl Seitenkette an der C-7 Position des Cephem (Nagakura et al., Int. Arch. Allergy Applied Immunol. 93, 126 (1990))
  • - Kopplungssubstanz: Folsäure mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - Folsäure bindendes Protein (Ratnam et al., Biochem. 28, 8249 (1989); Elwood, J. Biol. Chem. 264, 14893 (1989); Sadasivan et al., Biochem. Biophys. Acta 1131, 91 (1992))
    • - Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Folsäure (Rayburn et al., Clin. Chem. 30, 1007 (1984))
  • - Kopplungssubstanz: Retinoinsäure mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - Retinoinsäure bindende Domäne des zelluläre Retinoinsäure-bindenden Proteins (Stoner et al., Cancer Res. 49, 1497 (1989); Eller et al., Clin. Res. 39, 560A (1991))
    • - Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Retinoinsäure (Twal et al., Developm. Biiol. 168, 225 (1995); Zhou et al., J. Immunol. Methods 138, 211 (1991))
  • - Kopplungssubstanz: Penicillin mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Amoxicillin (Mayorga et al., Toxicol. 97, 225 (1995); Int. Arch. Allergy Applied Immunol. 99, 443 (1992))
    • - Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen die Benzylpenicilloyl- Gruppe (de Haan et al., Int. Arch. Allergy Applied Immunol. 76, 42 (1985); Fukushima et al., Clin. Exp. Immun. 68, 427 (1987))
    • - Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Penicillin (Sierra- Madero et al., J. Clin. Microbiol. 26, 1904 (1988))
    • - das Penicillin-bindende Protein (Popham et al., J. Bacteriol. 177, 326 (1995); J. Bacteriol. 176, 7197 (1994))
  • - Kopplungssubstanz: 4-Hydroxy-Tamoxifen oder Tamoxifen mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - Östrogen-bindende Domäne des Östrogenrezeptor-Proteins (Spreafico et al., Eur. J. Pharmacol. 227, 353 (1992); Green et al., Nature 320 (134 (1986))
    • - Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen den Östrogen- Rezeptor-Ostrogen- bzw. 4-Hydroxy-Tamoxifen-Komplex (Giambiagi et al., J. Steroid Biochem. 30, 213 (1988); Biochem. Biophys. Acta 883, 559 (1986); Katzenellenbogen et al., Biochem. 26, 2364 (1987); Tate et al., Breast Cancer Res. Treatm. 3, 267 (1983))
  • - Kopplungssubstanz: Tetrazyklin mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - das Tetrazyklin-Repressor-Protein (Gossen et al., PNAS USA 89, 5547 (1992))
    • - Antikörper und Antikörperfragmente gegen Tetrazyklin
  • - Kopplungssubstanz: Konjugat aus Tetrazyklin- und Isopropyl-β-D- thiogalactoside mit folgenden bindenden Proteinen (und deren Gene):
    • - das Tetrazyklin-Repressor-Protein (Gossen et al., PNAS USA 89, 5547 (1992))
    • - das lac-Repressor-(lac I)-Protein (Brow et al., Cell 49, 603 (1987))
Entsprechend der Erfindung sind die Gene für die die Kopplungssubtanz [Komponente j)] bindenden Proteine A und B
  • - im Fusionsprotein f) [Komponente f), Protein A] mit dem Gen für die Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors und
  • - im Fusionsprotein h) [Komponente h), Protein B] mit dem Gen für ein DNA bindendes Protein verbunden; wobei dieses DNA bindende Protein so ausgewählt sein muß, daß es spezifisch
  • - an die Aktivierungssequenz [Komponente i)] bindet (siehe Schema 8 und 9).
Als Nukleotidsequenz für die Aktivierungsdomäne in der Komponente f) kann im Sinne der Erfindung beispielsweise verwendet werden:
  • - Herpes Virus VP16 Transaktivierungsdomäne (Greaves et al., J. Virol. 64, 2716 (1990); 65, 6705 (1991))
  • - Die p65 Subeinheit des NF-xB Transkriptionsfaktors (Schmitz et al., EMBO J. 10, 3805 (1991))
  • - die Oct-2 N-terminale glutaminreiche Domäne direkt oder indirekt (z. B. über das Gal4 Bindeprotein) verbunden mit der Oct-2 G-terminalen prolinreichen Oct-2 Domäne (Tanaka et al., Mol. Cell Biol. 14, 6046 (1994))
Als Nukleotidsequenz für das DNA bindende Protein im Fusionsprotein h) [Komponente h)] und als zugehörige Aktivierungssequenz [Komponente i)] kann beispielsweise verwendet werden:
Möglichkeit F)
  • - Nukleotidsequenz für das DNA bindende Protein im Fusionsprotein h):
    • - die cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4-Proteins (Aminosäuren 1 bis 147; Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) an deren 3' Ende
    • - das nukleare Lokalisations-Signal (NLS) von SV40 (SV40 Large T; Aminosäuren 126 bis 132: PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) und an dessen 3' Ende
    • - die saure Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16 (Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5,190 (1995)) angefügt sind
  • - die zugehörige Aktivierungssequenz [Komponente i)]:
    • - mindestens eine Bindesequenz [Nukleotidsequenz 5'- CGGACAACTGTTCACCG-3'] für das Gal4-Protein (Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1989)) an deren 3' Ende
    • - der basale Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed), DNA Tumor Viruses (Gold Spring Harbor New York, New York; Gold Spring Harbor Laboratory) oder
    • - der Promotor von c-fos (Das et al., Nature 374, 657 (1995)) und (an dessen 3' Ende) die saure Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV1-VP16 (Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)) oder
    • - der U2 sn RNA-Promotor und (an dessen 3' Ende) die TAD von HSV1-VP16 oder mindestens eine Sequenz der Aktivierungsdomäne von Oct-2 (Aminosäuren 438 bis 479; Tanaka et al., Mol. Cell Biol. 14, 6046 (1994); Das et al., Nature 374, 657 (1995)) oder
    • - der Promotor von HSV (Papavassiliou et al., J. Biol. Chem. 265, 9402 (1990); Park et al., Molec. Endocrinol. 7, 319 (1993)) oder
    • - jeder andere unspezifisch, zellspezifisch, virusspezifisch und/oder zellzyklusspezifisch aktivierbare Promotor angefügt ist
Möglichkeit G)
  • - Nukleotidsequenz für das DNA bindende Protein im Fusionsprotein h):
    • - die cDNA für die DNA-Bindedomäne des LexA-Proteins (Aminosäuren 1 bis 81; Kim et al., Science 255, 203 (1992)) oder das ganze LexA-Protein (Aminosäuren 1 bis 202; Brent et al., Cell 43, 729 (1985)), an dessen 3' Ende
    • - das nukleare Lokalisations-Signal (NLS) von SV40 (SV40 Large T; Aminosäuren 126 bis 132: PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) und an dessen 3' Ende
    • - die sauren Transaktivierungsdomänen (TAD) von HSV-1 VP16 (Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes. Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)) angefügt sind
  • - die zugehörige Aktivierungssequenz [Komponente i)]:
    • - die Bindesequenz [Nukleotidsequenz 5'-TACTGTATGTACATACA-GTA-3'] für das LexA Protein (LexA-Operator, Brent et al., Nature 612, 312 (1984)] an dessen 3' Ende
    • - der basale Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed), DNA Tumor Viruses (Gold Spring Harbor New York, New York; Gold Spring Harbor Laboratory) oder ein anderer Promotor (siehe Möglichkeit F) angefügt ist.
Möglichkeit H)
  • - Nukleotidsequenz für das DNA-bindende Protein im Fusionsprotein h):
    • - die cDNA für das lac Repressor (lac I) Protein (Brown et al., Cell 49, 603 (1987); Fuerst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989)) an deren 3' Ende
    • - das nukleare Lokalisationssignal (NLS) von SV40 (SV40 large T; Aminosäuren: 126-132; PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) und an dessen 3' Ende
    • - die saure Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16 (Aminosäuren: 406-488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)) angefügt sind.
  • - die zugehörige Aktivierungssequenz [Komponente i)]:
    • - mit mindestens einer Lac-Operator-Bindesequenz (Nukleotidsequenz: 5'- GAATTGTGAGCGCTCACAATTG-3') für das lac 1 Repressorprotein (Fuerst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989); Simons et al., PNAS USA 81, 1624 (1984)) an deren 3' Ende
    • - der basale Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed) DNA Tumor Viruses (Gold Spring Harbor New York, N.Y., Gold Spring Harbor Laboratory) oder ein anderer Promotor (siehe Möglichkeit F) angefügt ist.
Möglichkeit I)
  • - Nukleotidsequenz für das DNA-bindende Protein im Fusionsprotein h):
    • - die cDNA für das Tetracyclin-Repressor(tet R)-Protein (Gossen et al., PNAS USA 89, 5547 (1992); Dingermann et al., EMBO J. 11, 1487 (1992)) an deren 3' Ende
    • - das nukleare Lokalisationssignal (NLS) von SV40 (SV40 large T; Aminosäuren 126-132; PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) und an dessen 3' Ende
    • - die saure Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16 (Aminosäuren: 405-488; Triebenzberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)) angefügt sind.
  • - die zugehörige Aktivierungssequenz [Komponente i)]:
    • - mit mindestens einer Tetrazyklin-Operator-(tet O)-Bindesequenz (Nukleotidsequenz: 5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATA­ GAGAAAAGTGAAAG-3') für das Tetracyclin-Repressor-(tet R)-Protein, an deren 3' Ende
    • - der basale Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed.) DNA Tumor Viruses (Gold Spring Harbor New York, N.Y., Gold Spring Harbor Laboratory) oder ein anderer Promotor (siehe Möglichkeit F) angefügt ist.
Möglichkeit J)
  • - Nukleotidsequenz für das DNA bindende Protein im Fusionsprotein h):
    • - die cDNA für das ZFHD1-Protein (Pomerantz et al., Science 267, 93 (1995)) an dessen 3' Ende
    • - das nukleare Lokalisations-Signal (NLS) von SV40 (SV40 Large T; Aminosäuren 126 bis 132: PKKKRRV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) und an dessen 3' Ende
    • - die sauren Transaktivierungsdomänen (TAD) von HSV-1 VP16 (Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)) angefügt sind
  • - die zugehörige Aktivierungssequenz [Komponente i)]:
    • - mindestens eine Bindesequenz [Nukleotidsequenz 5'-TAATGATGGGCG-3'] für das ZFHD-1 Protein (Pomerantz et al., Science 267, 93 (1995)), an dessen 3' Ende
    • - der basale Promotor von SV40, DNA Tumor Viruses oder ein anderer Promotor angefügt ist.
3) Promotorsequenzen
Im Sinne der Erfindung sind als Promotorsequenzen [Komponenten b), e), g) und i)] Nukleotidsequenzen zu verwenden, welche nach Bindung von Trankriptionsfaktoren die Transkription eines am 3' Ende benachbart gelegenen Strukturgenes aktivieren. Die Wahl der Promotorsequenzen richtet sich nach der zu behandelnden Erkrankung und der zu transduzierenden Zielzelle. So kann die Promotorsequenz uneingeschränkt, zielzellspezifisch, unter bestimmten metabolischen Bedingungen, Zellzyklus-spezifisch oder virusspezifisch aktivierbar sein. Des weiteren können in den Komponenten b), e) und/oder g) und in Komponente i) gleiche oder unterschiedliche Promotorsequenzen eingesetzt werden. Zusätzlich zu den in den Möglichkeiten A) bis J) bereits aufgeführten Promotorsequenzen gehören hierzu beispielsweise:
  • - uneingeschränkt aktivierbare Promotoren und Aktivatorsequenzen
    • - der Promotor der RNA-Polymerase III
    • - der Promotor der RNA-Polymerase II
    • - der CMV-Promotor und -Enhancer
    • - der SV40 Promotor
  • - virale Promotor- und Aktivatorsequenzen wie beispielsweise
    • - HBV
    • - HCV
    • - HSV
    • - HPV
    • - EBV
    • - HTLV
    • - HIV
      Bei Verwendung des HIV-Promotors ist die gesamte LTR-Sequenz einschließlich der TAR-Sequenz (Position <-453 bis< +80, Rosen et al., Cell 41, 813 (1985) als virusspezifischer Promotor einzusetzen.
  • - Metabolisch aktivierbare Promotor- oder Enhancersequenzen, wie beispielsweise der durch Hypoxie induzierbare Enhancer oder Promotor.
  • - Zellzyklus-spezifisch aktivierbare Promotoren, wie beispielsweise der Promotor des cdc25C Gens, des Cyclin A Gens, des cdc2 Gens, des B-myb Gens, des DHFR-Gens oder des E2F-1 Gens.
  • - Tetrazyklin aktivierbare Promotoren, wie beispielsweise der Tetrazyklin- Operator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor.
  • - Chimäre Promotoren.
    Ein chimärer Promotor stellt die Kombination einer stromaufwärts gelegenen zellspezifisch, metabolisch oder virusspezifisch aktivierbaren Aktivatorsequenz mit einem stromabwärts gelegenen Promotormodul dar, welches die Transkriptionsfaktoren der Familien CDF und CHF oder E2F und CHF binden und hierdurch die Aktivierung der stromaufwärts gelegenen Aktivatorsequenz in G0- und G1-Phase des Zellzyklus hemmen kann.
  • - Hybride Promotoren, beispielsweise in der Form, daß die TATA-Box eines Promotors mutiert ist, wobei diese Mutation durch eine korrespondierende Mutation im Gen eines TATA-Bindungsproteins kompensiert wird und dieses TATA-Bindungsprotein unter der Kontrolle eines weiteren Promotors steht.
  • - Zellspezifisch aktivierbare Promotoren.
    Hierzu zählen bevorzugt Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine bevorzugt in ausgewählten Zellen kodieren.
Zum Beispiel sind im Sinne der Erfindung in folgenden Zellen Promotoren für folgende Proteine bevorzugt zu verwenden:
  • - Promotor- oder Aktivatorsequenzen aktiviert in Endothelzellen
    • - Hirn-spezifischer, endothelialer Glucose-1-Transporter
    • - Endoglin
    • - VEGF-Rezeptor-1 (flt-1)
    • - VEGF-Rezeptor-2 (flk-1, KDR)
    • - til-1 oder til-2
    • - B61-Rezeptor (Eck-Rezeptor)
    • - B61
    • - Endothelin, im speziellen
      • - Endothelin B
      • - Endothelin-1
    • - Endothelin-Rezeptoren, insbesondere der Endothelin B-Rezeptor
    • - Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren
    • - von Willebrand Faktor
    • - IL-1α, IL-1β
    • - IL-1-Rezeptor
    • - Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM-1)
    • - synthetische Aktivatorsequenzen
      Als Alternative zu natürlichen endothelspezifischen Promotoren lassen sich auch synthetische Aktivatorsequenzen verwenden, die aus oligomerisierten Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, die preferentiell oder selektiv in Endothelzellen aktiv sind, bestehen. Ein Beispiel hierfür ist der Transkriptionsfaktor GATA-2, dessen Bindestelle im Endothelin-1 Gen 5'- TTATCT-3' ist.
  • - Promotoren oder Aktivatorsequenzen, aktiviert in Zellen in Nachbarschaft aktivierter Endothelzellen
    • - VEGF
      Die genregulatorischen Sequenzen für das VEGF-Gen sind
      • - die 5' flankierende Region oder
      • - die 3' flankierende Region oder
      • - das c-Src-Gen oder
      • - das v-Scr-Gen
    • - Steroid-Hormonrezeptoren und deren Promotorelemente (Truss und Beato, Endocr. Rev. 14, 459 (1993)), insbesondere der Maus-Mammatumor-Virus- Promotor
  • - Promotoren oder Aktivatorsequenzen aktiviert in Muskelzellen, inbesondere glatten Muskelzellen
    • - Tropomyosin
    • - α-Actin
    • - α-Myosin
    • - Rezeptor für PDGF
    • - Rezeptor für FGF
    • - MRF-4
    • - Phosphofructokinase A
    • - Phosphoglyceratemutase
    • - Troponin C
    • - Myogenin
    • - Rezeptoren für Endothelin A
    • - Desmin
    • - VEGF
      Die genregulatorischen Sequenzen für das VEGF-Gen sind bereits im Abschnitt "Promotoren aktiviert in Zellen in Nachbarschaft aktivierter Endothelzellen" aufgeführt worden (s. o.).
    • - "artifizielle" Promotoren
      Faktoren der Helix-Loop-Helix (HLH)-Familie (MyoD, Myf-5, Myogenen, MRF4 sind als muskelspezifische Transkriptionsaktivatoren beschrieben. Des weiteren gehören zu den muskelspezifischen Transkriptionsaktivatoren das Zinkfingerprotein GATA-4.
      Die HLH-Proteine sowie GATA-4 zeigen muskelspezifische Transkription nicht nur mit Promotoren von muskelspezifischen Genen, sondern auch im heterologen Kontext, so auch mit artifiziellen Promotoren. Derartige artifizielle Promotoren sind beispielsweise:
      • - multiple Kopien der (DNA) Bindestelle für muskelspezifische HLH-Proteine wie der E-Box (Myo D) (z. B. 4× AGCAGGTGTTGGGAGGC)
      • - multiple Kopien der DNA Bindungsstelle für GATA-4 des α-Myosin-Heavy Chain Genes (z. B. 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATA­ GAGG3')
  • - Promotoren und Aktivatorsequenzen, aktiviert in Gliazellen
    Hierzu zählen im besonderen die genregulatorischen Sequenzen bzw. Elemente aus Genen, die beispielsweise für folgende Proteine kodieren:
    • - das Schwannzell-spezifische Protein Periaxin
    • - Glutaminsynthetase
    • - das Gliazell-spezifische Protein (Glial fibrillary acidc protein = GFAP)
    • - das Gliazellprotein S100b
    • - IL-6 (GNTF)
    • - 5-HT-Rezeptoren
    • - TNFα
    • - IL-10
    • - Insulin-like Growth Factor Receptor I and II
    • - VEGF
      Die genregulatorischen Sequenzen für das VEGF-Gen sind bereits oben aufgeführt worden.
  • - Promotoren und Aktivatorsequenzen aktiviert in blutbildenden Zellen
    Zu solchen genregulatorischen Sequenzen gehören Promotorsequenzen für Gene eines Cytokins oder seines Rezeptors, die in blutbildenden Zellen oder in benachbarten Zellen, wie beispielsweise dem Stroma, exprimiert sind. Hierzu gehören Promotorsequenzen für beispielsweise folgende Cytokine und ihre Rezeptoren:
    • - Stem Cell Factor-Receptor
    • - Stem Cell Factor
    • - IL-1α
    • - IL-1-Rezeptor
    • - IL-3
    • - IL-3-Rezeptor (α-subunit)
    • - IL-3-Rezeptor (β-subunit)
    • - IL-6
    • - IL-6-Rezeptor
    • - GM-CSF
    • - GM-CSF-Rezeptor (α-Kette)
    • - Interferon Regulatory Factor 1 (IRF-1)
      Der Promotor von IRF-1 wird durch IL-6 gleichermaßen aktiviert wie durch IFNγ oder IFNβ.
    • - Erythropoietin
    • - Erythropoietin-Rezeptor
  • - Promotoren und Aktivatorsequenzen aktiviert in Lymphozyten und/oder Makrophagen
    Hierzu gehören beispielsweise die Promotor- und Aktivatorsequenzen der Gene für Cytokine, Cytokinrezeptoren und Adhäsionsmoleküle und Rezeptoren für das Fc-Fragment von Antikörpern.
    Hierzu gehören beispielsweise:
    • - IL-1-Rezeptor
    • - IL-1α
    • - IL-1β
    • - IL-2
    • - IL-2-Rezeptor
    • - IL-3
    • - IL-3-Rezeptor (Π-subunit)
    • - IL-3-Rezeptor (β-subunit)
    • - IL-4
    • - IL-4-Rezeptor
    • - IL-5
    • - IL-6
    • - Interferon Regulatory Factor 1 (IRF-1)
      (Der Promotor von IRF-1 wird durch IL-6 gleichermaßen aktiviert wie durch IFN- oder IFNβ.
    • - IFN-Responsive Promotor
    • - IL-7
    • - IL-8
    • - IL-10
    • - IL-11
    • - IFN-
    • - GM-CSF
    • - GM-CSF-Rezeptor (α-Kette)
    • - IL-13
    • - LIF
    • - Makrophagen-Colony Stimulating Factor (M-CSF)-Rezeptor
    • - Typ I und II Makrophagen Scavenger Rezeptoren
    • - MAC-1 (Leukozytenfunktionsantigen)
    • - LFA-1α (Leukozytenfunktionsantigen)
    • - p150,95 (Leukozytenfunktionsantigen)
  • - Promotor- und Aktivatorsequenzen aktiviert in Synovialzellen
    Hierzu gehören die Promotorsequenzen für Matrix-Metalloproteinasen (MMP), beispielsweise für
    • - MMP-1 (interstitielle Kollagenase)
    • - MMP-3 (Stromelysin/Transin)
      Hierzu gehören des weiteren die Promotorsequenzen für Tissue inhibitors of Metalloproteinasen (TIMP), beispielsweise.
    • - TIMP-1
    • - TIMP-2
    • - TIMP-3
  • - Promotoren und Aktivatorsequenzen aktiviert in Leukämiezellen
    Hierzu gehören beispielsweise Promotoren für
    • - c-myc
    • - HSP-70
    • - bcl-1/cyclin D-1
    • - bcl-2
    • - IL-6
    • - Il-10
    • - NFα,TNFβ
    • - HOX-11
    • - BCR-Abl
    • - E2A-PBX-1
    • - PML-RARA
      (Promyelocytic Leukemia - Retinoic Acid Receptor)
    • - c-myc
      c-myc-Proteine binden an und aktivieren Multimere der als Myc E-Box bezeichneten Nukleotidsequenz (5'- GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3')
  • - Promotoren oder Aktivatorsequenzen für Tumorzellen
    Als Promotor- oder Aktivatorsequenz ist eine genregulatorische Nukleotidsequenz vorgesehen, mit der Transkriptionsfaktoren, gebildet oder aktiv in Tumorzellen, interagieren.
    Im Sinne dieser Erfindung zählen zu den bevorzugten Promotoren oder Aktivatorsequenzen genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente aus Genen, die besonders in Krebszellen oder Sarkomzellen gebildete Proteine kodieren. So wird bei kleinzelligen Bronchialkarzinomen bevorzugt der Promotor des N- CAM-Proteins, bei Ovarialkarzinomen der Promotor des "Hepatitis growth factor"-Rezeptors oder des L-Plastin und bei Pankreaskarzinomen der Promotor des L-Plastins oder des polymorphen epithelialen Mucins (PEM) verwendet.
4) Nukleare Exportsignale und nukleare Exportfaktoren
Bei den nuklearen Exportsignalen (NES) im Sinne der Erfindung handelt es sich bevorzugterweise um die Rev-Responsive Element (RRE)-Sequenz von Retroviren. Bei HIV-1 ist diese RRE eine 243 Nukleotide (Nukleotide 7362-7595; Muesing et al., Nature 313, 450 (1985)) umfassende Sequenz im env-Gen (Malim et al., Nature 338, 254 (1989); Kjems et al., PNAS 88, 683 (1991)). Das nukleare Exportsignal (NES) im Sinne der Erfindung kann jedoch auch jede homologe und/oder funktionell ähnliche (analoge) Nukleotidsequenz sein, so beispielsweise das RRE-equivalente Element des HBV-Virus (Huang et al., Mol. Cell Biol. 13, 7476 (1993)).
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten ist der nukleare Exportfaktor (NEF) eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein kodiert, welches an die mRNA des NRS bindet und den Transport der ein NRS enthaltende premessenger RNA oder messenger RNA aus dem Zellkern in das Zytoplasma (oder aus dem Zytoplasma in den Zellkern) vermittelt. Im besonderen wird im Sinne der Erfindung das rev-Gen von Retroviren, speziell vom HIV-1 oder HIV-2 Virus (Daly et al., Nature 342, 816 (1989); Emerman et al., Cell 57, 1155(1989); Felber et al., PNAS 86,1495 (1989); Fischer et al., EMBO J. 13, 4105 (1994)) verwendet.
Das rev-Protein des rev-Genes von Retroviren bindet mit seiner N-terminalen Domäne (Zapp et al., Nature 342, 7154 (1989); Malim et al., Cell 65, 241 (1991)) an das RRE in der pre-mRNA (Iwai et al., Nucl. Acids Rex. 20, 6465 (1992)). Durch die Bindung zwischen dem RRE und dem rev-Protein wird der Transport von "nonspliced" premessenger RNA, aber auch jeder weiteren RNA, die ein RRE enthält, vom Zellkern in das Zytoplasma ermöglicht (Fischer et al., EMBO J. 13, 4105 (1994); Fischer et al., Cell 82, 475 (1995) und damit die Translation erheblich verstärkt.
Im Sinne der Erfindung können als NEF auch Nukleotidsequenzen verwendet werden, die Proteine kodieren, die homolog und funktionell ähnlich dem rev-Protein von HIV-1 sind (Bogerd et al., Cell 82, 485 (1995)), wie beispielsweise das rev-Gen des Visna-Maedi Virus (VMV; Tiley et al., J. Virol. 65, 3877 (1991)) oder das rev- Gen des Caprine arthritis encephalitis Virus (CAEV; Tiley et al., J. Virol. 65, 3877 (1991)).
Im Sinne der Erfindung können jedoch auch solche Gene eingesetzt werden, die Proteine kodieren, die zwar nur eine geringe oder keine Homologie zum rev-Protein besitzen, jedoch funktionell ähnlich dem rev-Protein von HIV-1 sind.
Hierzu zählen z. B. das rev-Gen des HTLV-1 (Cullen, Microbiol. Rev. 56, 375 (1992)), das rev-Gen des Virus der infektiösen Anämie des Pferdes (EIAV) und des Immundefizienzvirus der Katze (FIV) (Manusco et al., J. Virol. 68, 1988 (1994)).
In einer alternativen Ausführungsform kann es sich bei den NEF auch um Nukleotidsequenzen für Proteine handeln, welche eine Ausschleusung von RNA aus dem Kern bewirken, auch ohne daß diese durch ein NRS im Kern zurückgehalten wird. Hierzu zählen beispielsweise der Transkriptionsfaktor TFIIIA (Gaddat et al., Cell 60, 619 (1990); Drew et al., Gene 159, 215 (1995)) oder das heterogene nukleare Ribonukleoprotein A1 (hnRNPA1-Protein; Pinol-Roma et al., Nature 355, 730 (1992)).
Des weiteren gehören zu den nuklearen Transportproteinen im erweiterten Sinne das "heat shock protein 70" (hsc70; Mandell et al., J. Cell Biol. 111, 1775 (1990)) oder der Proteinkinaseinhibitor CPKI (Fantozzi et al., J. Biol. Chem. 269, 2676 (1994); Wen et al., J. Biol. Chem. 269, 32214 (1994)).
Gemeinsam ist dem NEF und seinen homologen and analogen Proteinen eine mehr aminoterminal gelegene Domäne für die Bindung des monomeren Proteins an die RNA des NRS (J. Virol. 64, 881 (1990); Kjems et al., EMBO J. 11, 1119 (1992)) und eine meist Leucin-reiche Domäne (Ausnahme hiervon hnRNPA1), welche für die Transportfunktion des NEF notwendig ist (Wen et al., Cell 82, 463 (1995); Fischer et al., Cell 82, 475 (1995); Malim et al., J. Virol. 65, 4248 (1991); Venkatesh et al., Virol. 178, 327 (1990)).
Im Sinne dieser Erfindung steht die Expression des NEF-Genes unter der Kontrolle einer stromaufwärts am 5'-Ende des NEF-Genes gelegenen Promotorsequenz [Komponente b''')] (siehe Schema 2 und 7 und wie bereits unter B3) beschrieben) oder des pharmakologisch kontrollierbaren Promotormoduls (siehe Schema 8 und 9).
5) Internal Ribosome Entry Site (IRES)
Eine Internal Ribosome Entry Site ermöglicht die Expression zweier über eine IRES miteinander verbundener DNA-Sequenzen.
Derartige IRES wurden beispielsweise von Montford und Smith (TIG 11, 179 (1995); Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19, 4485 (1991); Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293 (1992); Dirks et al., Gene 128, 247 (1993); Pelletier und Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) und Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994)) beschrieben.
So kann beispielsweise die cDNA der IRES-Sequenz des Poliovirus (Position <140 bis < 630 des 5' UTR (Pelletier und Sonenberg, Nature 334, 320 (1988)) zur Verknüpfung der DNA der Komponente c) mit der DNA der Komponente d) verwendet werden.
6) Strukturgene
Im Sinne der Erfindung kodieren die Strukturgene [Komponente c)] für einen Wirkstoff zur Prophylaxe und/oder Therapie einer Erkrankung. Strukturgene und Promotorsequenzen sind im Hinblick auf die Art der Therapie der Erkrankung und unter Berücksichtigung der zu transduzierenden Zielzelle auszuwählen.
Beispielsweise sind bei folgenden Erkrankungen folgende Kombinationen von Promotorsequenzen (Beispiele siehe Abschnitt C3) und Strukturgenen zu wählen:
  • a) Therapie von Tumoren
  • - Zielzellen:
    • - proliferierende Endothelzellen oder
    • - der Endothelzelle benachbarte Stromazellen und Muskelzellen oder
    • - Tumorzellen oder Leukämiezellen
  • - Promotoren:
    • - endothelzellspezifisch und Zellzyklus-spezifisch oder
    • - zellunspezifisch oder muskelzellspezifisch und Zellzyklus-spezifisch oder
    • - tumorzellspezifisch
  • - Strukturgene für Inhibitoren der Zellproliferation, zum Beispiel für
    • - das Retinoblastomprotein (pRb = p110) oder die verwandten p107 und p130 Protein
    • - das p53 Protein
    • - da p21 (WAF-1) Protein
    • - da p16 Protein
    • - andere cdk-Inhibitoren
    • - das GADD45 Protein
    • - das bak Protein.
    • - Das Retinoblastomprotein (pRb/p110) und die verwandten p107 und p130 Proteine werden durch Phosphorylierung inaktiviert. Bevorzugt sind solche Gene dieser Zellzyklusinhibitoren zu verwenden, welche Mutationen für die Inaktivierungsstellen der exprimierten Proteine aufweisen, ohne daß diese hierdurch in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. Beispiele für diese Mutationen wurden beschrieben für das p110.
      In analoger Weise wird die DNA-Sequenz für das p107 Protein oder das p130 Protein mutiert.
    • - Das Protein p53 wird in der Zelle inaktiviert entweder durch Bindung an spezielle Proteine, wie beispielsweise MDM2 oder durch Oligomerisierung des p53 über das dephosphorylierte C-terminale Serin 392. Bevorzugt wird somit eine DNA-Sequenz für ein p53 Protein verwendet, welches C-terminal verkürzt ist um das Serin 392.
  • - Strukturgene für Gerinnung induzierende Faktoren und Angiogeneseinhibitoren, zum Beispiel:
    • - Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1)
    • - PAI-2
    • - PAI-3
    • - Angiostatin
    • - Interferone
      • - IFNα
      • - IFNβ
      • - IFN
    • - Platelet factor 4
    • - IL-12
    • - TIMP-1
    • - TIMP-2
    • - TIMP-3
    • - Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
    • - Tissue Factor (TF) und dessen gerinnungsaktive Fragmente.
  • - Strukturgene für zytostatische und zytotoxische Proteine, zum Beispiel für
    • - Perforin
    • - Granzym
    • - IL-2
    • - IL-4
    • - IL-12
    • - Interferone, wie beispielsweise
      • - IFN-α
      • - IFNβ
      • - IFN
    • - TNF
    • - TNFα
    • - TNFβ
    • - Oncostatin M
    • - Sphingomyelinase
    • - Magainin und Magainin-Derivate
  • - Strukturgene für zytostatische oder zytotoxische Antikörper und für Fusionsproteine zwischen antigenbindenden Antikörperfragmenten mit zytostatischen, zytotoxischen oder entzündungserregenden Proteinen oder Enzymen
    • - Zu den zytostatischen oder zytotoxischen Antikörpern gehören solche gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.
    • - Des weiteren gehören hierzu zytostatische oder zytotoxische Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt. Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen:
      • - Sialyl Lewis
      • - Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden
      • - von Onkogenen exprimierte Proteine
      • - Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1
      • - Blutgruppenantigene und deren Vorläufer
      • - Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
      • - Antigene auf Heat Shock Proteinen
    • - Des weiteren gehören hierzu gehören Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr. . Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991)). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise folgende monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente geeignet:
      Zellen Membranantigen
      AML CD13
      CD15
      CD33
      CAMAL
      Sialosyl-Le
      B-CLL CD5
      CD1c
      CD23
      Idiotypen und Isotypen der Membranimmun-globuline
      T-CLL CD33
      M38
      IL-2-Rezeptoren
      T-Zell-Rezeptoren
      ALL CALLA
      CD19
      Non-Hodgkin-Lymphoma
Die Humanisierung muriner Antikörper, die Herstellung und Optimierung der Gene für Fab und rek. Fv Fragmente erfolgt analog der bereits beschriebenen Methodik zur Herstellung von rek. Fv (siehe Abschnitt C2). Die Fusion der rek. Fv-Fragmente mit Genen für zytostatische, zytotoxische oder entzündungserregende Proteinen oder Enzymen erfolgt entsprechend dem dem Fachmann bekannten Stand der Technik.
  • - Strukturgene für Fusionsproteine von Zielzell-bindenden Liganden mit zytostatischen und zytotoxischen Proteinen.
    • - Hierzu gehören alle Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Endothelzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu IL-1 oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Endothelzellen binden, wie beispielsweise PDGF, bFGF, VEGF, TGFβ (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)).
    • - Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle, welche an aktivierte und/oder proliferierende Endothelzellen binden. Derartige Adhäsionsmoleküle, wie beispielsweise Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 oder Vitronectin wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483 (1992), Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cancer Metast. Rev. 11, 353 (1992), Varner et al., Cell Adh. Commun. 3, 367 (1995)).
    • - Hierzu gehören des weiteren Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren von Tumor- oder Leukämiezellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Leukämiezellen oder Tumorzellen binden.
      Derartige Wachstumsfaktoren wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Cross et al., Cell 64, 271 (1991), Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994), Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3 (1995), Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)).
    • - Die Fusion der Gene dieser an die Zielzelle bindenden Liganden mit zytostatischen, zytotoxischen oder entzündungserregenden Proteinen oder Enzymen erfolgt entsprechend dem Stand der Technik mit den dem Fachmann bekannten Methoden.
  • - Strukturgene für Induktoren von Entzündungen, zum Beispiel für
    • - RANTES (MCP-2)
    • - monocyte chemotactic and activating factor (MCAF)
    • - IL-8
    • - macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1Π, -β)
    • - neutrophil activating protein-2 (NAP-2)
    • - IL-3
    • - IL-5
    • - human leukemia inhibitory factor (LIF)
    • - IL-7
    • - IL-11
    • - IL-13
    • - GM-CSF
    • - G-CSF
    • - M-CSF
    • - Cobra venum factor (CVF) oder Teilsequenzen vom CVF, welchem dem menschlichen Komplementfaktor C3b funktionell entsprechen, d. h. welche an den Komplementfaktor B binden können und nach Spaltung durch den Faktor D eine C3 Konvertase darstellen
    • - der menschliche Komplementfaktor C3 oder seine Teilsequenz C3b
    • - Spaltprodukte des menschlichen Komplementfaktors C3, welche funktionell und strukturell dem CVF ähneln.
    • - Bakterielle Proteine, welche Komplement aktivieren oder Entzündungen auslösen, wie beispielsweise Porine von Salmonella typhi murium, "clumping" Faktoren von Staphylococcus aureus, Moduline besonders von gram-negativen Bakterien, "Major outer membrane protein" von Legionellen oder von Haemophilus influenza Typ B oder von Klebsiellen oder M- Moleküle von Streptokokken Gruppe G.
  • - Strukturgene für Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika, zum Beispiel für Enzyme, welche inaktive Vorsubstanzen (Prodrugs) in aktive Zytostatika (Drugs) spalten.
    Derartige Substanzen und die jeweils zugehörigen Prodrugs und Drugs sind bereits von Deonarain et al. und Harris et al. übersichtlich beschrieben worden. Beispielsweise ist die DNA-Sequenz eines der folgenden Enzyme zu verwenden:
    • - Herpes Simplex Virus thymidinkinase
    • - Varizella Zoster Virus Thymidinkinase
    • - bakterielle Nitroreduktase
    • - bakterielle β-Glucuronidase
    • - pflanzliche β-Glucuronidase aus Secale cereale
    • - humane β-Glucuronidase
    • - humane Carboxy peptidase (CB) zum Beispiel
      • - CB-A der Mastzelle
      • - CB-B des Pankreas
      • - bakterielle Carboxy peptidase
    • - bakterielle β-Laktamase
    • - bakterielle Cytosine deaminase
    • - humane Catalase bzw. Peroxidase
    • - Phosphatase, im besonderen
      • - humane alkalische Phosphatase
      • - humane saure Prostataphosphatase
      • - Typ 5 saure Phosphatase
    • - Oxidase, im besonderen
      • - humane Lysyloxidase
      • - humane saure D-aminooxidase
    • - Peroxidase, im besonderen
      • - humane Gluthation Peroxidase
      • - humane Eosinophilen Peroxidase
      • - humane Schilddrüsen Peroxidase
  • b) Therapie von Autoimmunerkrankungen und Entzündungen
  • - Zielzellen:
    • - proliferierende Endothelzellen oder
    • - Makrophagen und/oder Lymphozyten oder
    • - Synovialzellen
  • - Promotoren:
    • - endothelzellspezifisch und Zellzyklus-spezifisch oder
    • - makropohagen- und/oder lymphozytenspezifisch und/oder Zellzyklus­ spezifisch
    • - synovialzellspezifisch und/oder Zellzyklus-spezifisch
  • - Strukturgene für die Therapie von Allergien, zum Beispiel für
    • - IFNβ
    • - IFNγ
    • - IL-10
    • - Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen IL-4
    • - lösliche IL-4-Rezeptoren
    • - IL-12
    • - TGFβ
  • - Strukturgene für die Verhinderung der Abstoßung von transplantierten Organen, zum Beispiel für
    • - IL-10
    • - TGFβ
    • - lösliche IL-1-Rezeptoren
    • - lösliche IL-2-Rezeptoren
    • - IL-1-Rezeptorantagonisten
    • - lösliche IL-6-Rezeptoren:
    • - immunsuppressive Antikörper oder deren VH und VL enthaltende Fragmente oder deren über einen Linker verbundene VH- und VL-Fragmente, hergestellt beispielsweise entsprechend der von Marasco et al. beschriebenen Methodik. Immunsuppressive Antikörper sind beispielsweise Antikörper
      • - spezifisch für den T-Zell-Rezeptor oder seinen CD3-Komplex
      • - gegen CD4 oder CD8 des weiteren
      • - gegen den IL-2-Rezeptor, IL-1-Rezeptor oder IL-4-Rezeptor oder
      • - gegen die Adhäsionsmoleküle CD2, LFA-1, CD28 oder CD40.
  • - Strukturgene für die Therapie von Antikörper-mediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel für
    • - TGFβ
    • - IFNα
    • - IFNβ
    • - IFN
    • - IL-12
    • - lösliche IL-4-Rezeptoren
    • - lösliche IL-6-Rezeptoren
    • - immunsuppressive Antikörper oder dessen VH und VL-enthaltende Fragmente
  • - Strukturgene für die Therapie von Zell-mediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel für
    • - IL-6
    • - IL-9
    • - IL-10
    • - IL-13
    • - TNFα
    • - IL-4
    • - TNFβ
    • - einen immunsuppressiven Antikörper oder dessen VH- und VL-enthaltende Fragmente
  • - Strukturgene für Inhibitoren der Zellproliferation, zytostatische oder zytotoxische Proteine und Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika
    Beispiele für Gene kodierend für derartige Proteine sind bereits im Abschnitt "Strukturgene für die Therapie von Tumoren" aufgeführt.
    In gleicher Form wie dort bereits beschrieben, können im Sinne der Erfindung Strukturgene verwendet werden, welche für Fusionsproteine aus Antikörpern bzw. Fab oder rek. Fv-Fragmenten dieser Antikörper oder anderen Liganden spezifisch für die Zielzelle und den o.a. Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, zytostatischen oder zytotoxischen Proteinen und Enzymen kodieren.
  • - Strukturgene für die Therapie der Arthritis
    Im Sinne der Erfindung werden Strukturgene ausgewählt, deren exprimiertes Protein die Entzündung beispielsweise im Gelenk direkt oder indirekt hemmt und/oder die Rekonstitution von extrazellulärer Matrix (Knorpel, Bindegewebe) im Gelenk fördert.
    Hierzu gehören zum Beispiel
    • - IL-1-Rezeptorantagonist;
      IL-1-RA inhibiert die Bindung von IL-1α,β
    • - löslicher IL-1-Rezeptor;
      löslicher IL-1-Rezeptor bindet und inaktiviert IL-1
    • - IL-6;
      IL-6 erhöht die Sekretion von TIMP und Superoxiden und vermindert die Sekretion von IL-1 und TNFα durch Synovialzellen und Chondrozyten
    • - löslicher TNF-Rezeptor
      Löslicher TNF-Rezeptor bindet und inaktiviert TNF.
    • - IL-4;
      IL-4 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1, TNFα und MMP
    • - IL-10;
      IL-10 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1, TNFΠ und MMP und erhöht die Sekretion von TIMP
    • - Insulin-like growth factor
      IGF-1 stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.
    • - TGFβ
      im speziellen TGFβ1 und TGFβ2
      TGFβ stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.
    • - Superoxiddismutase
    • - TIMP
      im speziellen
      • - TIMP-1
      • - TIMP-2
      • - TIMP-3
  • c) Therapie der mangelhaften Bildung von Zellen des Blutes
  • - Zielzellen:
    • - proliferierende, unreife Zellen des blutbildenden Systems oder
    • - Stromazellen benachbart den blutbildenden Zellen
  • - Promotoren:
    • - spezifisch für blutbildende Zellen und/oder Zellzyklus-spezifisch
    • - zellunspezifisch
  • - Strukturgene für die Therapie der Anämie, zum Beispiel für
    • - Erythropoietin
  • - Strukturgene für die Therapie der Leukopenie, zum Beispiel für
    • - G-CSF
    • - GM-CSF
  • - Strukturgene für die Therapie der Thrombozytopenie, zum Beispiel für
    • - IL-3
    • - Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
    • - IL-11
    • - Thrombopoietin
  • d) Therapie von Schäden des Nervensystems
  • - Zielzellen:
    • - Gliazellen oder
    • - proliferierende Endothelzellen
  • - Promotoren:
    • - Gliazell-spezifisch oder
    • - Endothelzell-spezifisch und Zellzyklus-spezifisch oder
    • - unspezifisch und Zellzyklus-spezifisch
  • - Strukturgene für neuronale Wachstumsfaktoren, zum Beispiel
    • - FGF
    • - Nerve growth factor (NGF)
    • - Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
    • - Neurotrophin-3 (NT-3)
    • - Neurotrophin-4 (NT-4)
    • - Ciliary neurotrophic factor (CNTF)
  • - Strukturgene für Enzyme, zum Beispiel für
    • - Tyrosinhydroxylase
    • - Dopadecarboxylase
  • - Strukturgene für Cytokine und deren Inhibitoren, welche die neurotoxische Wirkung von TNFα inhibieren oder neutralisieren, zum Beispiel für
    • - TGFβ
    • - lösliche TNF-Rezeptoren
    • - IL-10;
      IL-10 inhibiert die Bildung von IFN gamma, TNFα, IL-2 und IL-4
    • - lösliche IL-1-Rezeptoren
    • - IL-1-Rezeptor I
    • - IL-1-Rezeptor II
      Lösliche IL-1-Rezeptoren neutralisieren die Aktivität von IL-1
    • - IL-1-Rezeptor-Antagonist
    • - lösliche IL-6-Rezeptoren
  • e) Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems
  • - Zielzellen:
    • - Endothelzellen oder
    • - proliferierende Endothelzellen oder
    • - somatische Zellen in Nachbarschaft von Endothelzellen und glatte Muskelzellen oder
    • - Makrophagen
  • - Promotoren:
    • - zellunspezifisch oder
    • - zellunspezifisch und Zellzyklus-spezifisch oder
    • - spezifisch für Endothelzellen, glatte Muskelzellen oder Makrophagen oder
    • - spezifisch für Endothelzellen, glatte Muskelzellen oder Makrophagen und Zellzyklus-spezifisch
  • - Strukturgene für die Inhibition der Gerinnung oder für die Förderung der Fibrinolyse, zum Beispiel für
    • - Tissue Plasminogen Activator (tPA)
    • - Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA)
    • - Hybride von tPA und uPA
    • - Protein C
    • - Hirudin
    • - Serin Proteinase Inhibitoren (Serpine), wie beispielsweise
      • - C-1S-Inhibitor
      • - α1-Antitrypsin
      • - Antithrombin III
    • - Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
  • - Strukturgene für die Förderung der Gerinnung, zum Beispiel für
    • - F VIII
    • - F IX
    • - von Willebrand factor
    • - F XIII
    • - PAI-1
    • - PAI-2
  • - Strukturgene für Angiogenesefaktoren, zum Beispiel für
    • - VEGF
    • - FGF
  • - Strukturgene für die Blutdrucksenkung, zum Beispiel für
    • - Kallikrein
    • - Endothelzell "nitric oxide synthase"
  • - Strukturgene für die Inhibition der Proliferation von glatten Muskelzellen nach Verletzungen der Endothelschicht, zum Beispiel für
    • - ein antiproliferatives, zytostatisches oder zytotoxisches Protein oder für ein Enzym zur Aufspaltung von Vorstufen von Zytostatika in Zytostatika wie bereits oben (unter Tumor) aufgeführt und Fusionsproteine dieser Wirkstoffe mit Antikörper oder Antikörperfragmenten spezifisch für Muskelzellen
  • - Strukturgene für weitere Blutplasmaproteine, zum Beispiel für
    • - Albumin
    • - C1-Inaktivator
    • - Serum Cholinesterase
    • - Transferrin
    • - α1-Antritrypsin
  • f) Therapie von Stoffwechselerkrankungen und Erbschäden
  • - Zielzellen:
    • - Endothelzeller
    • - Muskelzellen
    • - Leberzellen
    • - Bronchialepithelzellen
    • - Stromazellen oder
    • - Makrophagen
  • - Promotoren:
    • - nicht zielzellspezifisch oder
    • - zielzellspezifisch
  • - Strukturgene, beispielsweise für:
    • - den "transmembranen conductance regulator" (CFTCR) bei der zystischen Fibrose
    • - das Gen der Fanconi Anaemie
    • - Uroporphyrinogen III Synthetase
    • - Iduronate-2-Sulfatase (Mucopolysaccharidose Type II)
    • - β-Glucuronidase (mucopolysaccharidosis VIII)
    • - Glucocerebrosidase (Gaucher disease)
    • - Phenylalanin Hydroxylase < ;L 31535 00070 552 001000280000000200012000285913142400040 0002019651443 00004 31416IT<- Dystrophin (Duchenne Typ Muskeldystrophie)
    • - Insulin Rezeptor
    • - menschliches Wachstumshormon
    • - Surfactant SP-A und SP-B assoziiertes Protein
    • - LDL Rezeptor
    • - Apolipoprotein B mRNA editing Protein
    • - Adenosindeaminase
  • g) Impfungen
  • - Zielzellen:
    • - Muskelzellen oder
    • - Makrophagen
  • - Promotoren:
    • - nicht zielzellspezifisch oder
    • - zielzellspezifisch oder
    • - zielzellspezifisch und Zellzyklus-spezifisch
  • - Strukturgene für die Prophylaxe von Infektionserkrankungen Die Möglichkeiten, auf konventionellem Wege wirkungsvolle Impfstoffe herzustellen, sind beschränkt (Brown, Int. J. Technol. Assessm. Health Gare 10, 161 (1994), Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992), Arnon et al., FASEB J. 6, 3265 (1992)).
    Demzufolge wurde die Technologie der DNA-Vakzine entwickelt. Diese DNA- Vakzinen werfen jedoch Fragen zur Wirksamkeitsstärke auf (Fynan et al., Int. J. Immunopharm. 17, 79 (1995); Donnelly et al., Immunol. 2, 20 (1994)).
    Gemäß dieser Erfindung ist über das selbstverstärkende Expressionssystem eine größere Wirksamkeit der DNA-Vakzine gewährleistet.
    Als Wirksubstanz ist die DNA eines vom Infektionserreger gebildeten Proteins auszuwählen, welches durch Auslösung einer Immunreaktion, d. h. durch Antikörperbindung und/oder durch zytotoxische T-Lymphozyten zur Neutralisierung und/oder zur Abtötung des Erregers führt. Derartige sogenannte Neutralisationsantigene werden als Impfantigene bereits angewandt (siehe Übersicht bei Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)). Beispiele für DNA-Sequenzen, die Neutralisationsantigene kodieren, sind durch die folgenden Arbeiten zugänglich:
    • - Influenza A-Virus-Antigen
      (Ulmer et al., Science 259,1745 (1993), Robinson et al., Vaccine 11, 957 (1993), Fynan et al., Int. J. Immunopharmac. 17, 79 (1995))
    • - HIV-Antigene
      (Wang et al., PNAS USA 90, 4156 (1993))
    • - Tollwut-Virus-Antigen
      (Donnelly et al., Immunol. 2/1, 20 (1994))
    • - HSV (Herpes Simplex Virus)-Antigen
      (Fleckenstein et al., Nature 274, 57 (1978))
    • - RSV (Respiratory Syncytial Virus)-Antigen
      (Du et al., Bio/Tech. 12, 813 (1994), Hall, Science 265, 1393 (1993))
    • - Parainfluenza-Virus-Antigen
      (Du et al., Bio/Techn. 12, 813 (1994))
    • - Rotavirus-Antigen
      (Albert et al., J. Clin. Microbiol. 25, 183 (1987), Anderson et al., J. Infect. Dis. 153, 823 (1986), Battaglia et al., J. Infect. Dis. 155, 140 (1987), Chanock et al., J. Infect. Dis. 148, 49 (1983), Dyall-Smith et al., J. Virol. 38, 1099 (1981), Glass et al., Science 265, 1389 (1994))
    • - VZV (Varizella Zoster Virus)-Antigen
      (Straus et al., Ann. Intern. Med. 109, 438 (1988), Gershon, Pediatr. Infect. Dis. 2, 171 (1991), Kinchington et al., J. Virol. 64, 4540 (1990))
    • - CMV (Cytomegalo-Virus)-Antigen
      (Plotkin, Science 265, 1383 (1994))
    • - Masern-Virus-Antigen
      (Katz und Kellin, Science 265, 1391 (1994))
    • - HPV (Humanes Papillomvirus)-Antigen
      (Tindl und Frazer, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 186, 217 (1994))
    • - HBV (Hepatitis B-Virus)-Antigen
      (Valenzuela et al., Nature 280, 815 (1979), Heerman et al., J. Virol. 52, 396 (1984))
    • - HCV (Hepatitis C-Virus)-Antigen
      (Cerny et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol. 189, 169 (1994), Esteban et al., Progr. Liver Dis. 10, 253 (1992), Jung et al., Eur. J. Clin. Invest. 24, 641 (1994))
    • - HDV (Hepatitis D-Virus)-Antigen
      (Iwarson, Scand. J. Infect. Dis. 24, 129 (1992), Consolo et al., Nephron. 61, 251 (1992))
    • - HEV (Hepatitis E-Virus)-Antigen
      (Iwarson, Scand. J. Infect. Dis. 24, 129 (1992), Consolo et al., Nephron. 61, 251 (1992))
    • - HAV (Hepatitis A-Virus)-Antigen
      (d'Hondt, Vaccine 10, 48 (1992), Andre, J. Infect. Dis. 171, 33 (1995), Lemon et al., Vaccine 10, 40 (1992), Melnick et al., Vaccine 10, 24 (1992), Flehmig, Baillieres Clin. Gastroenterol. 4, 707 (1990))
    • - Vibrio Cholera-Antigen
      (Levine und Kaper, Vaccine 11, 207 (1993))
    • - Borrelia Burgdorferi-Antigen
      (Schaible et al., Immunol. Letters 36, 219 (1993), Wallich et al., Lab. Med. 17, 669 (1993))
    • - Helicobacter pylori-Antigen
      (Crabtree et al., Lancet 338, 332 (1991), Blaser, J. Infect. Dis. 161, 626 (1990), Cover und Blaser, J. Biol. Chem. 267, 10 570 (1993), Cover et al., Infect. Immunol. 58, 603 (1990), Dunn et al., J. Biol. Chem. 265, 9464 (1990), Dunn et al., Infect. Immunol. 60,1946 (1992), Lage et al., Acta Gastroenterol. Belg. 56 (suppl.), 61 (1993), Mobley et al., Scand. J. Gastroint. 26 (suppl. 187), 39 (1991))
    • - Malaria-Antigen
      (Nussenzweig und Long, Science 265, 1381 (1994), Maurice, Science 267, 320 (1995), Enders et al., Vaccines 10, 920 (1992), Knapp et al., Infect. Imm. 60, 2397 (1992))
      Zu derartigen Wirksubstanzen im Sinne der Erfindung gehört jedoch auch die DNA eines Antiidiotyp-Antikörpers oder seiner Antigen-bindenden Fragmente, dessen Antigenbindungsstrukturen (die "complementary determining regions") Kopien der Protein- oder Kohlenhydratstruktur des Neutralisationsantigens des Infektionserregers darstellen.
      Derartige Antiidiotyp-Antikörper können besonders Kohlenhydratantigene bei bakteriellen Infektionserregern ersetzen.
      Derartige antiidiotypische Antikörper und ihre Spaltprodukte wurden von Hawkins et al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) und Westerink und Apicella (Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993)) übersichtlich beschrieben.
  • - Strukturgene für "Tumorvakzinen"
    Hierzu gehören Antigene auf Tumorzellen. Derartige Antigene wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol 43, Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt.
    Weitere Beispiele stellen die Gene für bzw. folgende Antigene dar:
    • - Sialyl Lewis
    • - Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden
    • - von Onkogenen exprimierte Proteine
    • - Blutgruppenantigene und deren Vorläufer
    • - Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
    • - Antigene auf Heat Shock Proteinen.
  • h) die Therapie von chronischen Infektionserkrankungen
  • - Zielzelle:
    • - Leberzelle
    • - Lymphozyt und/oder Makrophage
    • - Epithelzelle
    • - Endothelzelle
  • - Promotoren:
    • - virusspezifisch
    • - zellspezifisch
    • - virusspezifisch oder zellspezifisch und zellzyklusspezifisch
  • - Strukturgene, beispielsweise für
    • - ein Protein, welches zytostatische oder zytotoxische Wirkungen aufweist.
    • - ein Enzym, welches eine Vorstufe einer antiviralen oder zytotoxischen Substanz in die aktive Substanz spaltet.
  • - Strukturgen für antivirale Proteine
    • - antiviral wirksame Cytokine und Wachstumsfaktoren. Hierzu zählen beispielsweise
      • - IFNα
      • - IFNβ
      • - IFN-
      • - TNFβ
      • - TNFα
      • - Il-1
      • - TGFβ
    • - Antikörper einer Spezifität, die das jeweilige Virus inaktiviert oder dessen VH und VL enthaltende Fragmente oder dessen über einen Linker verbundene VH und VL Fragmente herstellt wie bereits im Abschnitt C2) beschrieben.
      Antikörper gegen Virusantigen sind beispielsweise:
      • - anti HBV
      • - anti HCV
      • - anti HSV
      • - anti HPV
      • - anti HIV
      • - anti EBV
      • - anti HTLV
      • - Anti Coxackie Virus
      • - anti Hantaan Virus
    • - ein Rev bindendes Protein. Diese Proteine binden an die Rev-RNA und inhibieren Rev-abhängige posttranskriptionelle Stufen der Retrovirus- Genexpression. Beispiele für Rev-bindende Proteine sind:
      • - RBP9-27
      • - RBP1-8U
      • - RBP1-8D
      • - Pseudogene von RBP1-8
    • - für Ribozyme, welche die mRNA von Genen für Zellzykluskontrollproteine oder die mRNA von Viren verdauen. Ribozyme katalytisch für HIV wurden beispielsweise von Christoffersen et al., J. Med. Chem. 38, 2033 (1995) übersichtlich beschrieben.
  • - Strukturgene für antibakterielle Proteine
    Zu den antibakteriellen Proteinen gehören beispielsweise Antikörper, die bakterielle Toxine neutralisieren oder Bakterien opsonieren. Beispielsweise gehören hierzu Antikörper gegen
    • - Meningokokken C oder B
    • - E. coli
    • - Borrelia
    • - Pseudomonas
    • - Helicobacter pylori
    • - Staphylococcus aureus
7) Kombination gleicher oder unterschiedlicher Strukturgene
Gegenstand der Erfindung ist des weiteren ein selbstverstärkendes ggf. pharmakologisch kontrollierbares Expressionssystem, in welchem eine Kombination der DNA-Sequenzen von zwei gleichen oder zwei unterschiedlichen Strukturgenen [Komponente c) und c')] vorliegt. Zur Expression beider DNA-Sequenzen ist vorzugsweise die cDNA einer "internal ribosome entry site" (IRES) als regulatorisches Element zwischen beiden Strukturgenen geschaltet.
Beispiele für derartige IRES Sequenzen sind bereits im Abschnitt C5) beschrieben worden.
Im Sinne der Erfindung sind bevorzugte Kombinationen von Strukturgenen beispielsweise für
  • - die Therapie von Tumoren
    • - unterschiedliche, antiproliferative, zytostatische, zytotoxische, entzündungserregende Proteine oder
    • - gleiche Enzyme für die Spaltung der Vorstufe eines Zytostatikums
  • - die Therapie von Autoimmunerkrankungen
    • - unterschiedliche Cytokine oder Rezeptoren mit synergistischer Wirkung zur Hemmung der zellulären und/oder humoralen Immunreaktion oder
    • - unterschiedliche oder gleiche TIMPs
  • - die Therapie von mangelhafter Bildung von Zellen des Blutes
    • - unterschiedliche, hierarchisch aufeinanderfolgende Cytokine, wie beispielsweise
      IL-1, IL-3, IL-6 oder GM-CSF und Erythropoietin, G-CSF oder Thrombopoietin
  • - die Therapie von Nervenzellschäden
    • - ein neuronaler Wachstumsfaktor und ein Cytokin oder der Inhibitor eines Cytokines
  • - die Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems
    • - ein Antithrombotikum und ein Fibrinolytikum (tPA oder uPA) oder
    • - ein antiproliferatives, zytostatisches oder zytotoxisches Protein (oder Enzym) und ein Antithrombotikum oder ein Fibrinolytikum
  • - Impfungen
    • - ein Antigen und ein immunstimulierendes Cytokin, wie beispielsweise
      • - IL-1α
      • - IL-1β
      • - IL-2
      • - GM-CSF
      • - IL-3 oder
      • - IL-4 Rezeptor
    • - unterschiedliche Antigene
      • - eines Infektionserregers oder unterschiedlicher Infektionserreger oder
      • - eines Tumortypes oder unterschiedlicher Tumortypen
  • - Therapie von viralen Infektionserkrankungen
    • - ein antivirales Protein und ein zytostatisches oder zytotoxisches Protein
    • - Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene eines Virus oder mehrere Viren
  • - Therapie von bakteriellen Infektionserkrankungen
    • - Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene und/oder Toxine eines Keimes
Einfügung von Signalsequenzen und Transmembrandomänen
  • - Zur Erleichterung der Sekretion des Expressionsproduktes des Strukturgenes kann die ggf. in der DNA-Sequenz des Strukturgenes enthaltende homologe Signalsequenz ersetzt werden durch eine heterologe, die extrazelluläre Ausschleusung verbessernde Signalsequenz.
    So kann beispielsweise die Signalsequenz für das Immunglobulin (DNA Position <63 bis< 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) oder die Signalsequenz für das CEA (DNA-Position <33 bis <134; Schrewe et al., Mol. Cell Biol. 10, 2738 (1990); Berling et al., Cancer Res. 50, 6534 (1990)) oder die Signalsequenz des humanen Respiratory Syncytial Virus Glycoproteins (cDNA der Aminosäuren <38 bis <50 oder 48 bis 65; Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996)) eingefügt werden.
  • - Zur Verankerung des Wirkstoffes in die Zellmembran der den Wirkstoff bildenden transduzierten Zelle kann alternativ oder zusätzlich zur Signalsequenz eine Sequenz für eine Transmembrandomäne eingeführt werden.
    So kann beispielsweise die Transmembransequenz des menschlichen Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors oder die DNA-Sequenz für die Signal- und Transmembranregion des menschlichen Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Glykoproteins G oder die DNA-Sequenz für die Signal- und Transmembranregion der Influenzavirus-Neuraminidase zwischen der Promotorsequenz und der Sequenz des Strukturgens eingefügt werden.
  • - Zur Verstärkung der Translation kann am 3' Ende der Promotorsequenz und unmittelbar am 5, Ende des Startsignals (ATG) der Signal- bzw. Transmembransequenz die Nukleotidsequenz GCCACC oder GCCGCC eingefügt werden.
  • - Zur Verankerung des Wirkstoffes in die Zellmembran der den Wirkstoff bildenden transduzierten Zellen kann jedoch auch die Nukleotidsequenz für einen Glykophospholipid-Anker eingefügt werden.
    Die Einfügung eines Glykophospholipid-Ankers erfolgt am 3' Ende der Nukleotidsequenz für das Strukturgen und kann zusätzlich zur Einfügung einer Signalsequenz erfolgen.
    Glykophospholipid-Anker sind beispielsweise für das CEA, für das N-CAM und für weitere Membranproteine, wie beispielsweise Thy-1, beschrieben worden.
    Eine Übersicht über Glycophospholipid verankerte Membranproteine wurde von Ferguson et al. publiziert.
  • - Eine weitere Möglichkeit der Verankerung von Wirkstoffen an die Zellmembran entsprechend der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer DNA- Sequenz für ein Ligand-Wirkstoff-Fusionsprotein. Die Spezifität des Liganden dieses Fusionsproteins ist gerichtet gegen eine Membranstruktur auf der Zellmembran der gewählten Zielzelle.
    Zu den Liganden, welche an die Oberfläche von Zellen binden, gehören beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Strukturen auf der Oberfläche von beispielsweise
    • - Endothelzellen. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF- Rezeptoren
    • - oder von Muskelzellen, wie
      • - Antikörper gegen Actin oder
      • - Antikörper gegen Angiotensin II-Rezeptoren oder
      • - Antikörper gegen Rezeptoren für Wachstumsfaktoren wie beispielsweise gegen
        • - EGF-Rezeptoren
        • - oder gegen PDGF-Rezeptoren
        • - oder gegen FGF-Rezeptoren
        • - oder Antikörper gegen Endothelin A-Rezeptoren
    Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form einzusetzen. Fab und rek. Fv-Fragmente und deren Fusionsprodukte werden, wie unter B) bereits beschrieben, hergestellt.
    Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirkstoffe, wie beispielsweise Cytokine oder Adhäsionsmoleküle, Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen oder Mediatoren, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der jeweiligen ausgewählten Zelle binden. Beispielsweise gehören hierzu Liganden für Endothelzellen, wie IL-1, PDGF, bFGF, VEGF, TGGβ (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)) oder Kinin und Derivate oder Analoga von Kinin. Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle. Derartige Adhäsionsmoleküle, wie beispielsweise Slex, LFA-1, MAC-1, LeCAM-1, VLA-4 oder Vitronectin und Derivate oder Analoga von Vitronectin, wurden bereits für Endothelzellen beschrieben (Übersichten bei Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483 (1992); Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990); Honn et al., Cancer Metast. Rev. 11, 353 (1992); Varner et al., Cell Adh. Commun. 3, 367 (1995)).
    Zu den Liganden gehören auch Antikörper oder deren Fragmente, welche gerichtet sind gegen tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene auf der Tumorzellmembran. Derartige Antikörper wurden bereits im Abschnitt C6a) beschrieben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts zur Herstellung eines Heilmittels zur lokalen (z. B. auf die Haut, nasal, oral, gastrointestinal, intrabronchial, intravesikal, intravaginal, intrauterin, subkutan, intramuskulär, periartikulär, intrartikulär, in den Liquor, intrperitoneal, intrpleural) oder systemischen (intravenös intrarterielle, intraportal, intracardial) Verabreichung zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumoren, Leukämien, Autoimmunerkrankungen, Entzündungen, Schäden des Nervensystem, Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufes, Stoffwechselerkrankungen und Erbschäden, viralen oder bakteriellen Infektionserkrankungen, der mangelhaften Bildung von Zellen des Blutes und zur Impfung gegen virale, bakterielle oder parasitäre Infektionen und gegen Tumoren.
Die Erfindung wird an folgenden Beispielen näher erläutert.
9) Beispiele zur Erläuterung der Erfindung
  • 1. Konstruktion eines selbstverstärkenden Expressionssystems
    Zur zellzyklusspezifischen und zellspezifischen Expression von β- Glucuronidase wird ein selbstverstärkendes Expressionssystem nach folgendem Schema hergestellt.
    Schema 13)
Die DNA-Sequenzen der Einzelkomponenten werden in Richtung 5' zu 3' wie folgt zusammengefügt:
  • - Komponente a):
    • - die Bindesequenz [Nukleotidsequenz: 5'-CGGACAACTGTTGACCG-3'] für das Gal4-Protein (Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990))
  • - Komponente b):
    • - die Promotorsequenz des cdc25G Genes [Nukleinsäuren: -290 bis +121; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995); Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995); EMBO J. 14, 4514 (1995))
  • - Komponente c):
    • - die Sequenz GCCACC (Kodak, J. Cell Biol. 108, 229 (1989))
    • - die cDNA für das Signalpeptid des Immunglobulins [Nukleotidsequenz <63 bis< 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988))
    • - die cDNA der humanen β-Glucuronidase [Nukleotidsequenz <93 bis< 1982; Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1987))
  • - Komponente a'):
    • - die Bindesequenz für das Gal4-Protein (Chasman an Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990))
  • - Komponente b'):
    • - die Promotorsequenz des VEGF Rezeptor-Genes [Nukleinsäuren -1195 bis + < 100; Morishita et al., J. Biol. Chem. 270, 27948 (1995))
  • - Komponente d):
    • - die cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4-Proteins [Aminosäuren 1 bis 147; Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990))
    • - die cDNA für das nukleare Lokalisations-Signal (NLS) von SV40 (SV40 large T; Aminosäuren 126 bis 132: PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991))
    • - die cDNA der sauren Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16 [Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5,190 (1995))
Die Verknüpfung der einzelnen Bestandteile des Konstruktes erfolgt über geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-Amplifikation an den Termini der verschiedenen Elemente mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe von den dem Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen Enzymen und DNA- Ligasen. Diese Enzyme sind käuflich zu erwerben.
Mit dem beschriebenen Plasmid werden in Kultur gehaltene menschliche Nabelschnurendothelzellen und Fibroblasten (Wi-38) mit der dem Fachmann bekannten Methode (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) transfiziert und die Menge an β-Glucuronidase, produziert von den Endothelzellen, mit Hilfe von 4- Methylumbelliferyl-β-glucuronid als Substrat gemessen.
Zur Überprüfung der Zellzyklusspezifität werden Endothelzellen durch Entzug von Methionin über 48 Stunden in G0/G1 synchronisiert (Nettelbeck et al., Publikation in Vorbereitung). Der DNA-Gehalt der Zellen wird nach Anfärbung mit Hoechst 33258 im Fluoreszenzaktivierungs-Cell Sorter bestimmt (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)).
Folgende Ergebnisse werden erzielt:
In transfizierten Fibroblasten kann keine Zunahme der β-Glucuronidase im Vergleich zu nichttransfizierten Fibroblasten ermittelt werden.
Transfizierte Endothelzellen exprimieren deutlich mehr β-Glucuronidase als nichttransfizierte Endothelzellen.
Proliferierende Endothelzellen (DNA < 2S) sekretieren deutlich mehr β- Glucuronidase als in G0/G1 synchronisierte Endothelzellen (DNA = 2S).
Das beschriebene selbstverstärkende Expressionssystem führt zu einer zellspezifischen, zellzyklusabhängigen Expression des Strukturgenes β-Glucuronidase.
Die Stärke der Expression durch das erfindungsgemäße selbstverstärkende Expressionssystem wird nun mit zwei sich nicht selbstverstärkenden Expressionssystemen verglichen. Diese werden nach folgendem Schema hergestellt:
Schema 14)
Schema 15)
Die Bestandteile der Komponenten b), b') und c) sind hierbei gleich, wie bereits für das Schema 13) beschrieben.
Die Verknüpfung der einzelnen Bestandteile des Konstruktes erfolgt über geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-Amplifikation an den Termini der verschiedenen Elemente mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe von den dem Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen Enzymen und DNA- Ligasen. Diese Enzyme sind käuflich zu erwerben.
Das so hergestellte Nukleotidkonstrukt wird in pUC18/19 oder Bluescript­ abgeleiteten Plasmidvektoren einkloniert.
Mit dem beschriebenen Plasmiden werden in Kultur gehaltene menschliche Nabelschnurendothelzellen mit der dem Fachmann bekannten Methode (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) transfiziert und die Menge an β-Glucuronidase, produziert von den Endothelzellen, mit Hilfe von 4-Methylumbelliferyl-β-glucuronid als Substrat gemessen.
Folgende Ergebnisse werden erzielt:
mit dem Plasmid enthaltend das Nukleotidsäurekonstrukt nach Schema 14) und 15) transfizierte proliferierende Endothelzellen exprimieren deutlich weniger β- Glucuronidase als proliferierende Endothelzellen transfiziert mit dem Plasmid enthaltend das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt nach Schema 13).
Das beschriebene selbstverstärkende Expressionssystem führt zu einer deutlich verstärkten Expression des Strukturgenes β-Glucuronidase.
2. Konstruktion eines selbstverstärkenden, pharmakologisch kontrollierbaren Expressionssystems
Zur zellzyklusspezifischen und pharmakologisch kontrollierbaren Expression von β- Glucuronidase wird ein selbstverstärkendes, pharmakologisch kontrollierbares Expressionssystem entsprechend dem Aufbau nach Schema 11) wie folgt hergestellt:
Schema 16)
Die DNA-Sequenzen der Einzelkomponenten werden von Richtung 5' zur 3' wie folgt zusammengefügt:
  • - Komponente i):
    • - die Bindesequenz [Nukleotidsequenz: 5'-CGGACAACTGTTGACCG-3'] für das Gal4-Protein (Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990))
    • - der basale Promotor von SV40 [Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, N.Y., Gold Spring Harbor Laboratory)
  • - Komponente c):
    • - die Sequenz GCCACC (Kodak, J. Cell Biol. 108, 229 (1989))
    • - die cDNA für das Signalpeptid des Immunglobulins [Nukleotidsequenz <63 bis <107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988))
    • - die cDNA der humanen β-Glucuronidase [Nukleotidsequenz <93 bis <­ 1982; Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1987))
  • - Komponente e):
    • - die Bindesequenz für das Gal-Protein (Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990))
    • - die Promotorsequenz des cdc2sG Genes [Nukleinsäuren -290 bis +121; Lucibello et al., EMBO J. 14,132 (1995); Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995); EMBO J. 14, 4514 (1995))
  • - Komponente f):
    • - die cDNA der Aktivierungsdomäne des Herpes Virus VP16 (Greaves et al., J. Virol. 64, 2716 (1990); 65, 6705 (1991))
    • - die cDNA des rekombinanten Fv (A) anti Cyclosporin A (Protein A)
  • - Komponente g):
    • - entspricht Komponente e)
  • - Komponente h):
    • - die cDNA des rekombinanten Fv (B) anti Cyclosporin A (Protein B)
    • - die cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4-Proteins [Aminosäuren 1 bis 147; Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990))
    • - die cDNA für das nukleare Lokalisations-Signal (NLS) von SV40 [SV40 large T; Aminosäuren 126 bis 132: PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991))
    • - die cDNA der sauren Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16 [Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1998); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)).
Antikörper gegen Cyclosporin A werden gemäß Cacalano et al., Mol. Immunol. 29, 107 (1992)) hergestellt. Hierzu wird Cyclosporin A mit Hilfe von 4-benzoylbenzolsäure und UV-Licht an bovines Serumalbumin gekoppelt. Das Kopplungsprodukt wird Balb/c Mäusen mehrfach subkutan verabreicht. 14 Tage nach der letzten Immunisierung werden die Milzzellen gewonnen. Aus diesen Zellen wird die mRNA unter Zuhilfenahme des mRNA-Extraktionskits (Firma Pharmacia) extrahiert. Diese mRNA wird dann durch reverse Transkription unter Zuhilfenahme eines cDNA-Synthese-Kits und "random" Hexaoligonukleotiden (Firma Pharmacia) in cDNA umgeschrieben. Diese cDNA dient als Ausgangsmaterial, um mit Hilfe von spezifischen Primern (Clackson et al., Nature 352, 624 (1991); Sastry et al., PNAS USA 86, 5728 (1989); Ward et al., Nature 341, 544 (1989); Orlandi et al., PNAS USA 86, 3833 (1989)) die variable schwere Kette bzw. die variable leichte Kette der Immunglobuline mittels Polymerasekettenreaktion (Saiki et al., Science 230,1350 (1985)) zu amplifizieren.
Durch die Primer werden gleichzeitig Restriktionsschnittstellen eingeführt, um die Fragmente in den bakteriellen Expressionsvektor pHENIS (der sich von pHEN1 ableitet; Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res. 19, 4133 (1991); siehe Abb. 1) zu klonieren. Er enthält eine pelB-Signalsequenz für die periplasmatische Sekretion, ein myc-tag für die Detektion mit dem monoklonalen Antikörper 9E10, ein Histidin­ tag für die Reinigung mittels immobilisierter Metallaffinitätschromatographie (IMAC) sowie eine Klonierungsregion für die schwere und leichte Kette und eine kurze Sequenz, die für einen 14 Aminosäure-langen Glycin-Serin-Linker kodiert. Ferner erfolgt die Fusion mit dem Gen3-Protein (g3P) für das "display" an der Oberfläche von Bakteriophagen. Die schwere und leichte Kette wird mit den entsprechenden Restriktionsenzymen (VH mit Sfil und Shol; VL mit ApaL1 und Notl) verdaut und nacheinander in den Vektor kloniert. Dadurch entsteht ein rekombinantes einzelkettiges Fv-Fragment bestehend aus der variablen schweren Kette und leichten Kette, die durch eine kurze Peptidsequenz kovalent verbunden sind.
Entsprechend der "phage display" von Antikörperfragmenten werden die antigenbindenden Domänen als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein g3P filamentöser Bakteriophagen in Phagemid-Vektoren (Breitling et al., Gene 104,147 (1991)) in Form von scFv-Fragmenten (McGafferty et al., Nature 348, 552 (1990)) kloniert. Antigenbindende Phagen werden an Cyclosporin A beladenen Plastikgefäßen (panning) (Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)) selektioniert.
An Cyclosporin A bindende Phagen werden kloniert, vermehrt, erneut an Cyclosporin A beladenen Plastikgefäßen selektioniert. Nach vierfacher Selektionierung werden zwei Klone (Protein A und B) ausgewählt, welche sich nicht gegenseitig in ihrer Bindung am Cyclosporin A inhibieren.
Die murinen rek. Fv (Protein A und B) werden durch zielgerichteten Austausch der hypervariablen Regionen humaner Antikörper durch die korrespondierenden Regionen des vorliegenden murinen rek. Fv (Jones et al., Nature 321, 522 (1987)) humanisiert.
Die Verknüpfung des Konstruktes erfolgt über geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-Amplifikation an den Termini der verschiedenen Elemente mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen Enzymen und DNA-Ligasen. Diese Enzyme sind käuflich zu erwerben.
Das so hergestellte Nukleotidkonstrukt wird in pUC 18/19 oder Bluescript­ abgeleiteten Plasmidvektoren einkloniert.
Mit dem beschriebenen Plasmid werden in Kultur gehaltene menschliche Nabelschnurendothelzellen mit der dem Fachmann bekannten Methode (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) transfiziert und die Menge an β-Glucuronidase, produziert von Endothelzellen mit und ohne Zugabe von Cyclosporin A (0.01 bis 1.0 µg/ml Kulturmedium) mit Hilfe von 4-Methylumbelliferyl-β-glucuronid als Substrat gemessen.
Zur Überprüfung der Zellzyklusspezifität werden Endothelzellen durch Entzug von Methionin über 48 Stunden in G0/G1 synchronisiert (Nettelbeck et al., Publikation in Vorbereitung). Der DNA-Gehalt der Zellen wird nach Anfärbung mit Hoechst 33258 im Fluoreszenzaktivierungs-Cell Sorter bestimmt (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)).
Folgende Ergebnisse werden erzielt:
Ohne Zugabe von Cyclosporin A kann in transfizierten Endothelzellen keine Zunahme der β-Glucuronidase im Vergleich zu nichttransfizierten Fibroblasten ermittelt werden.
Nach Zugabe von Cyclosporin A exprimieren transfizierte Endothelzellen deutlich mehr β-Glucuronidase als nichttransfizierte Endothelzellen.
Proliferierende Endothelzellen (DNA < 2S) sekretieren deutlich mehr β- Glucuronidase als in G0/G1 synchronisierte Endothelzellen (DNA = 2S).
Das beschriebene selbstverstärkende Expressionssystem führt zu einer zellzyklusabhängigen, durch die Zugabe von Cyclosporin A kontrollierbaren Expression des Strukturgenes β-Glucuronidase.
Die Stärke der Expression durch das erfindungsgemäße selbstverstärkende, pharmakologisch kontrollierbare Expressionssystem ist stärker als mit dem nicht selbstverstärkenden Expressionssystemen hergestellt entsprechend Schema 14) im Beispiel 1).

Claims (25)

1. Nukleinsäurekonstrukt dadurch gekennzeichnet, daß es ein selbstverstärkendes Expressionssystem darstellt, welches aus
  • a) mindestens einer Bindesequenz für einen Transkriptionsfaktor d)
  • b) mindestens einer Promotorsequenz
  • c) mindestens einem Strukturgen für einen Wirkstoff
  • d) mindestens einem Gen für einen Transkriptionsfaktor, welcher an die Komponente a) bindet,
besteht, wobei die Komponenten a) und b) eine Aktivierungssequenz darstellen zur Expression sowohl der Komponente c) wie auch der Komponente d).
2. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, dadurch charakterisiert, daß an das 5' Ende des Strukturgenes [Komponente c)] wie auch des Transkriptionsfaktors [Komponente d)] jeweils eine Aktivierungssequenz [Komponenten a) und b) und Komponenten a') und b')] angefügt ist.
3. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 2, bei welchem die Komponenten a) und a') gleich und die Komponenten b) und b') ungleich sind.
4. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, dadurch charakterisiert, daß eine Aktivierungssequenz [Komponenten a) und b)] die Expression des Strukturgenes [Komponente c)] und über eine internal ribosomal entry site (IRES) auch die Expression des Transkriptionsfaktors [Komponente d)] aktiviert.
5. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1-4, bei welchem das Strukturgen [Komponente c)] ergänzt ist um ein nukleares Exportsignal und zusätzlich eine Nukleinsäuresequenz eingefügt ist, welche aus einer Promotorsequenz [Komponente b''')] und dem Gen für einen nuklearen Exportfaktor besteht.
6. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1-5, bei welchem mehrere gleiche oder unterschiedliche Strukturgene [Komponenten c), c'), c'')] durch eine IRES-Sequenz oder durch eine Aktivierungssequenz [Komponenten a) und b'); Komponenten a) und b'')] miteinander verbunden sind.
7. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1-6, bei welchem mehrere gleiche oder unterschiedliche Transkriptionsfaktoren [Komponenten d), d') und d'')] durch eine IRES-Sequenz oder durch eine Aktivatorsequenz [Komponenten a) und b'); Komponenten a) und b'')] miteinander verbunden sind.
8. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7, bei welchem die Transkriptionsfaktoren [Komponenten d), d'), d'')] ungleich sind und die Komponente a) Bindesequenzen für diese Transkriptionsfaktoren enthält.
9. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1-8, in welches ein pharmakologisch kontrollierbares Promotormodul eingefügt ist, welches aus den Komponenten
  • e) einer Promotorsequenz
  • f) einem Gen für ein Fusionsprotein, bestehend aus
    • - der Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors und
    • - einem eine Kopplungssubstanz bindenden Protein (A)
  • g) einer weiteren Promotorsequenz
  • h) einem Gen für ein Fusionsprotein, bestehend aus
    • - einem DNA-bindenden Protein und
    • - einem eine Kopplungssubstanz bindenden Protein (B)
  • i) einer Aktivierungssequenz mit Bindestelle für die Komponente h) und
  • j) einer Kopplungssubstanz mit Bindestelle für das Protein A der Komponente f) und für das Protein B der Komponente h).
10. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, bei welchem das pharmakologisch kontrollierbare Promotormodul anstelle der Komponenten b), b'), b'') oder b''') eingefügt ist.
11. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, bei welchem das pharmakologisch kontrollierbare Promotormodul so eingefügt ist, daß
  • - die Komponente i) die Komponenten a) und b) ersetzt
  • - die Komponenten e), f), g) und h) die Komponente d) und die zugehörige Komponenten a) und b) oder die zugehörige IRES ersetzen
  • - und
  • - die Komponenten e) und g) stromaufwärts ergänzt sind um eine Bindestelle für die Komponente h).
12. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1-11, bei welchem
die Komponente a) mindestens eine Bindesequenz
  • - für das Gal4-Protein
  • - für das LexA-Protein
  • - für das Lac I-Repressorprotein
  • - für das Tetracyclin-Repressorprotein oder
  • - für das ZFHD-1 Protein enthält,
    und die Komponente b)
  • - der basale Promotor von c-fos in Kombination mit der Transaktivierungsdomäne von HSV-1 VP16
  • - der U2 sn RNA Promotor in Kombination mit der Transaktivierungsdomäne von HSV-1 VP16 oder mindestens einer Sequenz der Aktivierungsdomäne von Oct-2
  • - der Promotor von HSV TK oder
  • - ein anderer unspezifischer, zellspezifischer, virusspezifischer, zellzyklusspezifischer oder metabolisch aktivierbarer Promotor ist und die Komponente d) eine cDNA enthält für
  • - die DNA-Bindedomäne des Gal4-Proteins
  • - die DNA-Bindedomäne das LexA-Proteins,
  • - das Lac I-Repressorprotein,
  • - das Tetracyclin-Repressorprotein oder
  • - für das ZFHD1-Protein
  • - und mit dieser cDNA ein nukleares Lokalisationssignal und eine Transaktivierungsdomäne verknüpft ist.
13. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 12, bei welchem die Komponente d) das nukleare Lokalisationssignal von SV40 und die saure Transaktivierungsdomäne von HSV-1 VP16 enthält.
14. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1-13, bei welchem die Komponenten des pharmakologisch kontrollierbaren Promotormoduls folgende Nukleinsäuresequenzen enthalten:
Komponente e)
  • - einen unspezifisch, zellspezifisch, virusspezifisch, zellzyklusspezifisch und/oder metabolisch aktivierbaren Promotor
    Komponente f)
  • - die Herpes Virus VP16 Transaktivierungsdomäne
  • - die p65 Subeinheit des NF-kB Transkriptionsfaktors oder
  • - die Oct-2 N-terminale glutaminreiche Domäne direkt oder indirekt verbunden mit der Oct-2 C-terminalen prolinreichen Oct-2 Domäne.
    Komponente g)
  • - eine weitere Promotorsequenz gleich oder ungleich der Komponente e)
    Komponente h)
  • - die DNA-Bindedomäne des Gal4-Proteins
  • - die DNA-Bindedomäne das LexA-Proteins,
  • - das Lac I-Repressorprotein,
  • - das Tetracyclin-Repressorprotein oder
  • - das ZFHD1-Protein
  • - und mit dieser cDNA ein nukleares Lokalisationssignal und eine Transaktivierungsdomäne verknüpft ist.
    Komponente i)
    mindestens eine Bindesequenz für
  • - das Gal4-Protein
  • - das LexA-Protein
  • - das Lac I-Repressorprotein,
  • - das Tetracyclin-Repressorprotein oder
  • - das ZFHD1-Protein
    verbunden mit
  • - dem basalen Promotor von SV40
  • - dem Promotor von c-fos in Kombination mit der Transaktivierungsdomäne von HSV-1 VP16
  • - dem U2 sn RNA Promotor in Kombination mit der Transaktivierungsdomäne von HSV-1 VP16 oder mindestens einer Sequenz der Aktivierungsdomäne von Oct-2
  • - dem Promotor von HSV TK oder
  • - einem anderen unspezifisch, zellspezifisch, virusspezifisch, zellzyklusspezifisch oder metabolisch aktivierbaren Promotor.
15. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 14, bei welchem in der Komponente h) das nukleare Lokalisationssignal von SV40 und die saure Transaktivierungsdomäne von HSV-1 VP16 enthalten ist.
16. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1-14,
  • - bei welchem die Komponente j) eine Substanz ist, welche durch eine Zellmembran in die Zelle eindringen kann und
  • - in den Komponenten f) oder h) mindestens eine der die Kopplungsstruktur [Komponente j)] bindenden Proteine A und B ein rekombinanter Antikörper oder ein rekombinantes Antikörperfragment ist.
17. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 16), bei welchem
  • - die Komponente j) ein Arzneimittel und
  • - mindestens eines der die Kopplungssubstanz [Komponente j)] bindenden Proteine A und B ein einzelkettiges Fv-Fragment ist, bestehend aus der variablen Kette und der leichten Kette, die durch eine kurze Peptidsequenz kovalent verbunden sind.
18. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1-16, bei welchem die Komponente j) Rapamycin, FK506, Cyclosporin A, Methotrexat, Folsäure, Retinoinsäure, Penicillin, 4-Hydroxy-Tamoxifen, Tamoxifen, Tetrazyklin oder ein Tetrazyklin-isopropyl-β-D- thiogalactosidkonjugat ist und mindestens eines der die Kopplungssubstanz [Komponente j)] bindenden Proteine A und B die Bindungsdomäne eines in der Natur vorkommenden Bindeproteins für die jeweilige Komponente j) darstellt.
19. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 bis 18), in welchem die
  • - unspezifischen Promotorsequenzen ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend RNA-Polymerase III, RNA Polymerase II, CMV-Promotor und Enhancer, SV40-Promotor
  • - die viralen Promotor- und Aktivatorsequenzen ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, HIV
  • - die zellzyklusspezifisch aktivierbaren Promotorsequenzen ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend cdc2sG, Cyclin A, cdc2, bmyb, DHFR, E2F-1
  • - die zellspezifisch aktivierbaren Promotoren ausgewählt sind aus einer Gruppe aktiviert in Endothelzellen, Muskelzellen, Gliazellen, blutbildenden Zellen, Lymphozyten, Makrophagen, Synovialzellen, Leukämiezellen oder Tumorzellen
20. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 bis 19, bei welchem
  • - das nukleare Exportsignal (Synonym: nukleares Retentionssignal) und der korrespondierende nukleare Exportfaktor ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend rev-responsive Element/rev Protein von Retroviren im besonderen von HIV-1, HIV-2, HTLV-1, FIV des weiteren von HBV.
21. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1-20, bei welchem das Strukturgen [Komponente c)] ausgesucht ist aus einer Gruppe umfassend Inhibitoren der Zellproliferation, zytostatische oder zytotoxische Proteine, Enzyme für die Spaltung von Prodrugs in Wirkstoffe, zytostatische, zytotoxische, antivirale, antibakterielle, antitoxische, antitumorale oder immunsuppressive Antikörper, Fusionsproteine zwischen Antikörperfragmenten und zytostatischen, zytotoxischen oder entzündungserregenden Proteinen oder Enzymen, Cytokine, Wachstumsfaktoren, Hormone, Fusionsproteine zwischen Cytokine, Wachstumsfaktoren oder Hormonen und zytostatischen oder zytotoxischen Proteinen, Rezeptoren für Cytokine und Wachstumsfaktoren, Cytokinantagonisten, Induktoren von Entzündungen, Gerinnung induzierende Faktoren, Inhibitoren der Gerinnung, Fibrinolyse­ induzierende Proteine, Angiogeneseinhibitoren, Angiogenesefaktoren, blutdrucksenkende Peptide, Blutplasmaproteine, Insulinrezeptor, LDL-Rezeptor, Enzyme deren Fehlen Stoffwechselerkrankungen oder Immunsuppression bewirken, virale Antigene, bakterielle Antigene, parasitäre Antigene, Tumorantigene oder antiidiotyp Antikörper für diese Antigene
22. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1-21, in welchem mehrere gleiche oder verschiedene Strukturgene [Komponenten c), c'), c'')] enthalten sind, welche miteinander über eine IRES-Sequenz oder über eine Aktivierungssequenz bestehend aus Komponenten a) und b) verbunden sind.
23. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1-22, eingefügt in ein Plasmid oder einen viralen Vektor.
24. Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1-23 zur Herstellung eines Heilmittels zur lokalen (z. B. auf die Haut, nasal, oral, gastrointestinal, intrabronchial, intravesikal, intravaginal, intrauterin, subkutan, intramuskulär, intradermal, periartikulär, intrartikulär, in den Liquor, in das Hirn, in die Leber, in die Niere, in den Darm, in die Zunge, intraperitoneal, intrapleural) oder systemischen (z. B. intravenös, intrarteriell, intraportal, intracardial) Verabreichung zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumoren, Leukämien, Autoimmunerkrankungen, Entzündungen, Schäden des Nervensystem, Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufes, Stoffwechselerkrankungen und Erbschäden, viralen oder bakteriellen Infektionserkrankungen, der mangelhaften Bildung von Zellen des Blutes und zur Impfung gegen virale, bakterielle oder parasitäre Infektionen und gegen Tumoren.
25. Verwendung eines Nukleinsäurekonstruktes nach Anspruch 1-23 zur Einfügung in eine Zelle und die Verabreichung dieser Zelle als Heilmittel zur lokalen oder systemischen Erkrankung.
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