CZ397797A3

CZ397797A3 - Samozesilující farmakologicky regulovatelné expresní systémy

Info

Publication number: CZ397797A3
Application number: CZ973977A
Authority: CZ
Inventors: Rolf Prof. Dr. Müller; Hans Harald Prof. Dr. Sedlacek
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 1996-12-11
Filing date: 1997-12-09
Publication date: 1998-06-17
Also published as: EP0848061A2; HU9702377D0; US20030008398A1; US6482618B2; TR199701579A2; KR19980064289A; HUP9702377A2; HUP9702377A3; US6383785B1; PL323657A1; AU738344B2; US20020151049A1; MX9710007A; CN1191898A; JPH11176A; DE19651443A1; TR199701579A3; BR9705527A; RU2197993C2; CA2224334A1

Description

Samozesilující farmakologicky regulovatelné expresní systémy

Oblast techniky

Vynález se týká samozesilujícího konstruktu nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň jednu regulační sekvenci spojenou s alespoň jedním strukturálním genem a alespoň jedním genem pro proteinový transkripční faktor.

Dosavadní stav techniky

Navzdory jednotlivým prvním pokusům o genovou léčbu, naznačují výsledky preklinického a klinického výzkumu, že zůstávají nevyřešeny dva základní problémy. Jedním je nedostatečná transgenní exprese v cílových buňkách in vitro nebo in vivo kvůli intracelulárním vypínacím pochodům. Druhým je inadekvátní regulace transgenní exprese.

Při pokusu napravit tyto nedostatky dosavadního stavu techniky Rivera et al., (Nátuře Med., 2, 1028, 1996), Belshaw et al., (PNAS USA, 93, 4604, 1996) a Ho et al., (Nátuře, 382, 822, 1996) vyvinuli první techniky pro externí regulaci transgenní exprese. Tyto přístupy jsou založeny na přidání rapamycinu jako aktivní sloučeniny, která spojuje dohromady dvě podjednotky. Výsledný spojený produkt působí jako transkripční faktor. První podjednotku tvoří fúzní protein tvořený mezi proteinem vázajícím DNA a proteinem vázajícím FK506 (FKBP), tento protein váže také rapamycin. Druhá podjednotka je fúzní protein, který je tvořen mezi proteinem FRAP, který se také váže k rapamycinu a aktivační sekvencí proteinového transkripčního faktoru NF-kB.

Funkční proteinový transkripční faktor, který je tvořen spojením těchto dvou podjednotek postupně s rapamycinem,

aktivuje sekvenci v transgenu pro aktivaci strukturálního genu.

Výhodou tohoto externího přístupu je, že exprese strukturálního genu může být zapnuta nebo vypnuta přidáním nebo odstraněním aktivní sloučeniny rapamycinu. Avšak tento přístup neřeší problém inadekvátni exprese strukturálního genu. V souladu s tím zůstává potřeba postupu pro zvýšení transgenní exprese.

Podstata vynálezu

Vynález uspokojuje nevyplněné potřeby oboru poskytnutím konstruktů nukleové kyseliny, přípravků obsahujících konstrukty a způsoby jejich použití pro dosažení vysoké transgenní exprese. Vynález toto uskuteční tak, že včlení do samotného konstruktu nukleové kyseliny systém pozitivní zpětné vazby. Výsledný systém je v textu nazýván „samozesilující expresní systém”.

V jednom provedení vynálezu je poskytnut konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje:

alespoň jeden první strukturální gen, který kóduje aktivní sloučeninu, alespoň jeden druhý strukturální gen, který kóduje proteinový transkripčni faktor, a alespoň jednu aktivační sekvenci složenou z alespoň jedné sekvence, která váže proteinový transkripčni faktor, a alespoň jedné promotorové sekvence, kde každá aktivační sekvence aktivuje expresi strukturálního genu a expresi proteinového transkripčního faktoru.

V dalším provedení vynálezu je poskytnut konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje:

• ·

alespoň	jeden první strukturální	gen, který	kóduje
aktivní	sloučeninu,
alespoň	jeden druhý strukturální	gen, který	K o d u j e
proteinový transkripční faktor, a
alespoň	jednu aktivační sekvenci	složenou z	alespoň
j edné	sekvence, která váže prot	einový trans	kripční

faktor, a alespoň jednoho farmakologického modulu, • který obsahuje v sériovém uspořádáni alespoň jeden promotor, alespoň jeden gen fúzního proteinu kódující aktivační doménu proteinového transkripčního faktoru a kódující proteinovou spojovací látku, alespoň jeden promotor, alespoň jeden gen fúzního proteinu kódující protein vázající DNA a kódující druhou proteinovou spojovací látku a alespoň jednu aktivační sekvenci, která obsahuje místo pro protein vázající DNA, kde každá aktivační sekvence aktivuje expresi strukturálního genu a expresi proteinového transkripčního faktoru.

V ještě dalším provedení vynálezu je poskytnut konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje: jeden první sloučeninu, alespoň aktivní strukturální gen, který kóduje jeden druhý alespoň alespoň aktivační doménu proteinového jeden první fúzní gen, který kóduj e protein, který obsahuje transkripčního faktoru, a sekvenci, která váže spojovací látku, alespoň jeden třetí strukturální gen, který kóduje alespoň jeden druhý fúzní protein, který obsahuje protein, který váže spojovací látku a protein vázající DNA, alespoň jednu aktivační sekvenci složenou z alespoň jedné sekvence, která váže druhý fúzní protein spojený • · ···· ·· · · • · · · · · • · · · · · • ·· ···· · • · · · · · ♦ · · «···· ·· ·· ♦· ·· s prvním fúzním proteinem spojovací látkou, a alespoň jedné promotorové sekvence, kde každá aktivační sekvence aktivuje expresi alespoň jednoho z uvedených strukturálních genů.

Další provedení budou odborníkovi snadno zjevná při čtení specifikace a připojených patentových nároků.

Samozesilující expresní systém

Ve svém nejjednodušším provedení zahrnuje nový samozesilující expresní systém následující složky:

a) alespoň jednu sekvenci a) a/nebo a') pro vazbu proteinového transkripčního faktoru d),

b) alespoň jednu promotorovou sekvenci b) a/nebo b') ,

c) alespoň jeden strukturální gen c) kódující aktivní sloučeninu, a

d) alespoň jeden gen kódující proteinový transkripční faktor d), který se váže ke složce a).

Podle vynálezu složky a) a/nebo a') a b) a/nebo b') tvoří sekvenci pro aktivaci transkripce strukturálního genu

c) a pro aktivaci exprese proteinového transkripčního faktoru d).

Ve výhodné podobě podle vynálezu mohou být složky uspořádány tak, jak je zobrazeno na obr. 1.

Vazebné sekvence a) a a') mohou být totožné nebo odlišné a vážou transkripční faktor d).

Promotorové sekvence (složky b) a b')) mohou být totožné nebo odlišné. Aktivace promotorových sekvencí b) a b') na nízké úrovni má za následek nízkou hladinu exprese strukturálního genu (složka c)) a genu pro proteinový transkripční faktor d) (složka d) ) . Proteinový transkripční faktor d) tím vytvořený se postupně váže na vazebné sekvence (složky a) a a') ) . Tato vazba opět aktivuje promotorové • · • · · · sekvence b) a b') , vyvolává zvýšenou expresi strukturálního genu a genu pro proteinový transkripční faktor d) . Tato zvýšená exprese sama má za následek vyšší množství proteinového transkripčniho faktoru d) , který vyvolává zpětnou vazbu a dále stimuluje tento systém.

Podle vynálezu může být uspořádáni složek, jak zobrazeno na obr. 1., doplněno (tj . „připojeno na konec v protisměru čtení) geny kódujícími jaderný exportní signál (nuclear export signál - NES) a jaderný exportní faktor (nuclear export factor - NEF) na 3' konci strukturálního genu. Exprese NEF je regulována přidatným promotorem (složka b') . Tato přidatná promotorové sekvence může být totožná s jakoukoliv částí aktivačních sekvenci nebo se od nich může lišit (složky a) a b) a/nebo a') a b') ) , jak je ukázáno na obr. 2.

Jaderný exportní signál (NES) je nukleotidová sekvence, která brání transportu pre-messenger RNA, která je s ní spojena, přes jadernou membránu. Proto tedy NES tvoří samostatně jaderný retenční signál (NRS). Avšak, když se NRS váže na exportní protein, nazývaný zde „jaderný exportní faktor nebo „NEF, získává NRS funkci NES. Je to proto, že jaderný exportní faktor (NEF) zprostředkovává transport pre-messenger nebo messenger RNA obsahující NES ven z buněčného jádra a do cytoplazmy. Následkem toho je pre-messenger nebo messenger RNA obsahující NES vylučována ven z buněčného jádra tak, že je navázána k NEF, jak popsáno Fischerem et al., Cell, 82, 475, 1995.

Podle vynálezu mohou být také složky c) a d) spojeny k sobě navzájem (tj. „vzájemně spojeny) vnitřním ribozomálním vstupním místem (internal ribosome entry sítě - IRES) místo vazby se složkami a') a b') . Taková místa IRES vedou k

expresi dvou sekvencí DNA, které jsou spojeny k sobě navzájem prostřednictvím IRES.

Vazba prostřednictvím IRES může být například provedena tak, jak zobrazeno na obr. 4.

Toto uspořádání také zaručuje, že když je promotorové sekvence b) vystavena nízké úrovni aktivace, je gen pro proteinový transkripční faktor (složka d) ) také exprimován, prostřednictvím sekvence IRES. Tato exprese nastává, když je exprimován strukturální gen (složka c)). Kromě toho se proteinový transkripční faktor váže k vazebné sekvenci a) , která zesiluje aktivaci promotorové sekvence b), zesiluje expresi strukturálního genu c) a ještě jednou cestou sekvence IRES také zesiluje expresi genu proteinového zobrazeno na obrázcích ukázáno na obr.

vazebnou totožnými nebo dohromady. odlišnými sekvencemi IRES, nebo sekvencí promotorovou sekvencí b')

Reprezentativní uspořádání je promotorovou sekvencí zobrazeno na obrázku 5. Samozesilujici expresní systém může být také rozšířen spojením několika totožných nebo odlišných genů pro proteinové transkripční faktory d) (slož a d)) dohromady. Jeden reprezentativní příklad je obrázku 6, který ukazuje vazbu sekvencemi IRES.

IRES tytéž

Volitelně jsou sekvence

Vazebná sekvence a) sekvence.

aktivačních sekvencích.

je nejlépe jednoho

Všechny proteinové ve všech faktory d), by se měly vázat k této vazebné • 9 • ·

sekvenci. Když vazebné sekvence nejsou stejného typu (např. když složka a není tatáž jako složka a'), pak by se proteinové transkripční faktory (složky d) , d') a d) ) měly vázat ke všem vazebným sekvencím. Aktivační sekvence jsou nejlépe navrženy nebo vybrány tak, že jsou rozeznávány všemi produkty proteinových transkripčních faktorů d) , d') a d) .

Způsobem podobným, jako je ukázán na obrázku 2, mohou být složky obrázku 3 doplněny geny kódujícími jaderný exportní signál (NES) a jaderný exportní faktor. Toto uspořádání s genem NES na 3' konci strukturálního genu (složka c) ) a genem NEF je ukázáno na obrázku 7. V tomto posledním příkladu je NEF aktivován samostatně cestou přidatné promotorové sekvence složkou b') . Sekvence složky b^ř může být totožná nebo odlišná od složek a) a b) .

Farmakologicky regulovatelný promotorový modul

Ve své nej jednodušší formě obsahuje nový farmakologicky regulovatelný promotorový modul („farmakologicky regulovaci modul) následující složky:

e) alespoň jednu promotorovou sekvenci,

f) alespoň jeden gen kódující fúzní protein f), který obsahuje aktivační doménu proteinového transkripčniho faktoru a protein A vázající spojovací látku (složku j),

g) alespoň jednu další promotorovou sekvenci (totožnou nebo netotožnou se složkou e)) nebo alespoň jedno IRES,

h) alespoň jeden gen kódující fúzní protein h), který obsahuje doménu vázající DNA a protein B vázající spojovací látku (složku j),

i) alespoň jednu aktivační sekvenci mající místo pro vazbu fúzního proteinu h), a

j) alespoň jednu spojovací látku j), která obsahuje obě místa, místo A) pro vazbu proteinu A ve fúzním proteinu f) • ·

• · • · • · • · • · • · (expresní produkt složky f) ) a místo B) pro vazbu proteinu B) ve fúzním proteinu h) (expresní produkt složky h) ) .

Složky e) až i) mohou být uspořádány sériově jako například podle schématu ukázaném na obrázku 8. Toto uspořádání zajistí, že jsou exprimovány fúzni proteiny f) a

h) (složky f) a h)), když jsou aktivovány promotorové sekvence e) a g) . Když je přítomná spojovací látka (složka j)), tyto dva fúzni proteiny jsou spojeny k sobě navzájem („vzájemně spojeny) tak, že tvoří funkční proteinový transkripční faktor pro aktivaci aktivační sekvence (složka

i) ) . V tomto provedeni vynálezu promotorovy modul, který je složen z jednotlivých složek, funguje v přítomnosti spojovací látky, jako je složka j). Modul se stane funkční po přidání spojovací látky složky j). Obrázek 9 ukazuje příklad tohoto provedení.

Samozesilující, farmakologicky regulovatelný expresní systém

Samozesilující expresní systém se může kombinovat s farmakologicky regulovatelným promotorovým modulem. Tato kombinace je například uskutečněna vložením farmakologicky regulovatelného promotorového modulu (složky e) až i) ) do samozesilujícího expresního systému (viz obr. 1, 2, 3 nebo

7) na místo promotorové sekvence (složka b) a/nebo b')) . Konstrukce této kombinované nukleotidové sekvence je ukázána jako příklad na obr. 10. V tomto příkladu je strukturální gen přepisován pouze tehdy, když jsou fúzni proteiny f) a h) (expresní produkty složek f) a h) ) spojeny spojovací látkou složkou j) tak, aby se vytvořil proteinový transkripční faktor.

Alternativně, nebo kromě toho, může být farmakologicky regulovatelný promotorový modul vložen do samozesilujícího expresního systému v místě genu pro proteinový transkripční ♦ ·· · · ·· ··· · · · ·· • · · · · · • · · · · · • · · ····4 • · · 9 99

9 99 ···· faktor (složka d)), sekvence pro vazbu proteinového transkripčního faktoru d) (složka a)) a promotorové sekvence b) (složka b) ) . V tomto případě by mělo být připojeno k jedné z promotorových sekvencí e) a g) místo vázající složku

h), alespoň svým 5' koncem. Příklad konstrukce této kombinované nukleotidové sekvence je uveden na obrázku 11.

Samozesilující systém může být s farmakologicky regulovatelným promotorovým modulem kombinován stejně tak i jinými způsoby. Například obrázek 8 ukazuje, že promotorové sekvence (složka b') ) NEF (viz obrázek 2 nebo 7) může být nahrazena farmakologicky regulovatelným promotorovým modulem. Jeden způsob konstrukce této nukleotidové sekvence je ukázán na obrázku 12.

Konstrukty vynálezu jsou výhodně složeny z DNA. Termín „konstrukt nukleové kyseliny označuje umělou strukturu obsahující nukleovou kyselinu, která může být transkribována v cílové buňce. Konstrukt nukleové kyseliny je výhodně vložen do vektoru. V tomto kontextu je zejména žádoucí plazmidový nebo virový vektor.

V závislosti na výběru promotorové sekvence může být nový konstrukt nukleové kyseliny použit pro nespecifickou expresi strukturálního genu (složka c) ) . Alternativně je exprese dále regulována buněčnou a virovou specifitou, definovaným stavem nebo stavem buněčného cyklu. Strukturální gen výhodně kóduje farmakologicky aktivní sloučeninu nebo enzym, který štěpí inaktivní prekurzor léku tak, že tvoří aktivní lék. Strukturální gen může být dále navržen tak, že exprimuje fúzní protein enzym - ligand. V tomto případě se ligand může vázat na buněčný povrch. V této souvislosti je nejvíce preferovaný ligand, který se váže na povrch proliferující endotelové nebo nádorové buňky.

·· ··· ·

Předkládaný vynález se také týká buněk, zejména kvasinek nebo savčích buněk, které obsahují nový konstrukt nukleové kyseliny. V zejména žádoucím provedení je konstrukt nukleové kyseliny zaveden do buněčné linie, která je transfekována přidáváním nebo podáváním spojovací látky (složka j)). Přidávání spojovací látky stimuluje expresi strukturálního genu. Buňky, které obsahují tyto rekombinantní produkty, mohou být použity k přípravě farmaceutického přípravku. Avšak tyto buňky mohou být také podávány pacientovi jako léčebné agens nebo farmaceutický přípravek k léčbě nemoci. Alternativně může být nový konstrukt nukleové kyseliny začleněn do vektoru a podáván pacientovi přímo lokálně nebo parenterálně. Při použití je konstrukt navržen pro konkrétní nemoc tak, že konstrukt exprimuje jeden nebo více proteinů nebo nukleovou kyselinu, která zabraňuje nebo zlepšuje jeden nebo více příznaků nemoci. Množství konstruktu nukleové kyseliny, který má být použit v této souvislosti, je určeno způsobem podávání, stavem pacienta a povahou nemoci, jak je odborníkovi známa.

V případě přímého podávání pacientovi může být dodatečně podávána spojovací látka (složka j)), aby se exprimoval strukturální gen. Spojovací látka způsobí tvorbu kompletního proteinového transkripčního faktoru spojením fúzního proteinu f) s fúzním proteinem h) v transfekovaných buňkách, jak je ukázáno na obrázku 9. Následkem toho transfekované buňky exprimují strukturální gen pouze pokud je spojovací látka přítomná v těle. Trvání a intenzita exprese může být ovládána podáváním spojovací látky.

Výhodné použití nového konstruktu nukleové kyseliny tedy spočívá v léčení nemoci poskytnutím léku, obsahujícího zavedení konstruktu nukleové kyseliny do cílové buňky a expresi konstruktu nukleové kyseliny způsobem nespecifickým, • φ φφ ····

specifickým pro určitý virus nebo cílovou buňku a/nebo pro fázi buněčného cyklu, prostřednictvím podávání spojovací látky.

Konstrukty nukleové kyseliny vynálezu mohou být použity pro přípravu farmaceutického přípravku prostřednictvím syntézy v buňce. V této souvislosti je buňka transformována konstruktem nukleové kyseliny podle vynálezu. Transformovaná buňka je poté pěstována v tkáňové kultuře, aby se získal buněčný kmen, a tím se vytvořily mnohonásobné kopie konstruktu DNA. Pro zvýšení počtu kopií konstruktu DNA v každé buňce je výhodně používána genová amplifikace. Po pěstování transformované buňky v tkáňové kultuře, aby se získaly mnohonásobné kopie konstruktu DNA, je konstrukt DNA z pěstovaných buněk purifikován. Jako buňka pro pěstování v tkáňové kultuře, aby se získaly mnohonásobné kopie konstruktu DNA, se preferuje E. coli. Purifikovaná DNA se používá jako složka ve farmaceutickém přípravku po smísení s dalšími látkami, jako je pufr, soli, nebo jiné excipienty, jak jsou známy v oboru.

Nové konstrukty nukleové kyseliny se v této formě nevyskytují v přírodě, tj. strukturální gen pro aktivní sloučeninu nebo pro enzym nebo pro fúzní protein ligand/enzym není přirozeně kombinován s novými sekvencemi nukleové kyseliny, aby se vytvořil samozesilující expresní systém. Tento systém také není přirozeně kombinován s farmakologicky regulovatelným promotorovým modulem.

Preferované strukturální geny, které jsou inkorporovány do samozesilujíčího farmakologicky regulovatelného expresního systému, kódují farmakologicky aktivní sloučeniny. Tyto aktivní sloučeniny jsou proteiny a glykoproteiny, které jsou vybrány ze skupiny obsahující cytokiny, růstové faktory, receptory cytokinů nebo růstových • 9 9999 faktorů, protilátky nebo protilátkové fragmenty, proteiny mající antíproliferační nebo cytostatický účinek, inhibitory angiogeneze, proteiny vyvolávající trombózu, inhibitory koagulace, proteiny krevní plazmy, proteiny aktivující komplement, látky virových a bakteriálních obalů, hormony, peptidy mající účinek na krevní oběh, neuropeptidy, enzymy a mediátory a fúzní proteiny, které obsahují alespoň dva tyto proteiny nebo glykoproteiny.

Detailní popis složek samozesilujícího farmakologicky regulovatelného expresního systému

1) Aktivační sekvence a proteinové transkripční faktory pro samozesilující expresní systémy

Ve smyslu vynálezu se proteinový transkripční faktor d) (genový produkt složky d) ) váže specificky k příslušné vazebné sekvenci a) (složka a)), která aktivuje 3'-sousedící promotorovou sekvenci b) (nebo b' nebo b) .

Složky a) a b) tedy tvoří aktivační sekvenci, která obsahuje sekvenci pro vazbu příslušného proteinového transkripčního faktoru a) .

Na druhé straně musí proteinový transkripční faktor d) obsahovat vazebnou doménu, která je specifická pro odpovídající vazebnou sekvencí aktivátorové sekvence (složka a)), a také transaktivační doménu. Přídatný jaderný lokalizační signál (nuclear localization signál - NLS) podporuje interakci s aktivační sekvencí a).

Příklady konstruktů nukleové kyseliny, které splňují tyto nezbytné předpoklady, jsou:

Provedeni A), obsahující:

1. aktivační sekvenci obsahující složku a) mající alespoň jednu sekvenci (např. nukleotidová sekvence: 5'-CGGACAACTGTT-GACCG-3') pro vazbu proteinu Gal 4 (Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916, 1990) a, na jejím 3' konci, složku b), která obsahuje:

- bazální promotor SV40 (nukleové kyseliny 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, 1980, New York, Cold Spring Harbor Laboratory),

- promotor c-fos (Das et al., Nátuře, 374, 657, 1995) a, na jeho 3' konci, kyselou transaktivační doménu (TAD) VP16 HSV-1 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al., Genes Developm., 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190, 1995),

- promotor U2 sn RNA a (na jeho 3' konci) TAD VP16 HSV-1 nebo alespoň sekvenci aktivační domény Oct-2 (aminokyseliny 438 až 479, Tanaka et al., Mol·. Cell Biol·., 14, 6046, 1994, Das et al., Nátuře, 374, 657, 1995) nebo

- promotor TK HSV (Papavassiliou et al., J. Biol. Chem., 265, 9402, 1992, Park et al., Molec. Endocrinol., 7, 319, 1993 nebo jiný promotor aktivovatelný nespecificky, způsobem specifickým pro určitou buňku či virus nebo pro fázi buněčného cyklu nebo metabolicky, a

2. gen pro příslušný proteinový transkripčni faktor d) (složka d)) obsahující

- cDNA pro doménu proteinu Gal4 vázající DNA (aminokyseliny 1 až 147, Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916, 1990), k jejímuž 3' konci je připojen jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126 až 132, např. PKKKRKV, Dingwall et al., TIBS, 16, 478, 1991), k

···· ·· ·· • · · · · • · · · · • · ··· · · • · · · · ·· ·· ·· jehož 3' konci je připojena kyselá transaktivačni doména (TAD) VP16 HSV-1 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al., Genes Developm., 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190, 1995).

Provedeni Β), obsahující:

1. aktivační sekvenci obsahující složku a) obsahující alespoň jednu sekvenci (např. nukleotidové sekvence: 5'-TACTGTATGTACA-TACAGTA-3') pro vazbu proteinu

LexA (operátor LexA,	Brent	et al., Nátuře, 612,	312,	1984)
a, na jejím 3' konci,	složku	b), která obsahuje:
- bazální promotor SV40
(nukleové kyseliny	48 až	5191, Tooze (ed.),	DNA	Tumor
Viruses (Cold Spring	Harbor	New York, 1980, New	York,	Cold

Spring Harbor Laboratory), nebo jiný promotor (viz Provedení A) , a

2. gen pro přičleněný proteinový transkripční faktor d) (složka d)) obsahující

- cDNA pro doménu proteinu LexA vázající DNA (aminokyseliny 1 až 81, Kim et al., Science, 255, 203, 1992) nebo celý protein LexA (aminokyseliny 1 až 202, Brent et al., Cell, 43, 729, 1985), k jemuž 3' konci je připojen jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126 až 132, např. PKKKRKV, Dingwall et al., TIBS, 16, 478, 1991), k jehož 3' konci je připojena kyselá transaktivačni doména (TAD) VP16 HSV-1 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al., Genes Developm., 2, 718, 1988,

Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190, 1995).

Provedení C), obsahující:

1. aktivační sekvenci obsahující složku a)

- obsahující alespoň jednu sekvenci pro operátor lac (např.

nukleotidová sekvence: 5'-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3') pro vazbu represorového proteinu lac I (Fuerst et al., PNAS USA, 86, 2549, 1989, Simons et al., PNAS USA, 81, 1624, 1984) a, na jejím 3' konci, složku b) , která obsahuje:

- bazální promotor SV40 (nukleové kyseliny 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, 1980, New York, Cold Spring Harbor Laboratory), nebo jiný promotor (viz Provedení A) , a

- cDNA pro represorový protein lac (lac I) (Brown et al·., Cell, 49, 603, 1987, Fuerst et al., PNAS USA, 86, 2549, 1989), k jemuž 3' konci je připojen jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126 až 132, např. PKKKRKV, Dingwall et al., TIBS, 16, 478, 1991), k jehož 3' konci je připojena kyselá transaktivační doména (TAD) VP16 HSV-1 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al., Genes Developm., 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190, 1995).

Provedení D), obsahující:

1. aktivační sekvenci obsahující složku a) obsahující alespoň jednu sekvenci tetracyklinového operátoru (tet O) (např. nukleotidová sekvence: 5'TCGAGTTTACCAC-TCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3') pro vazbu tetracyklinového represorového proteinu (tet R) a, na jejím 3' konci, složku b), která obsahuje:

·· ····

- bazálni promotor SV40 (nukleové kyseliny 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, 1980, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory), nebo jiný promotor (viz Provedení A), a

2. gen pro přičleněný proteinový transkripční faktor d) (složka d) ) obsahující cDNA pro tetracyklinový represorový protein (tet R) (Gossen et al., PNAS USA, 89, 5547, 1992, Dingermann et al., EMBO J., 11, 1487, 1992) a na jejím 3' konci jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126 až 132, např. PKKKRKV, Dingwall et al., TIBS, 16, 478, 1991), a na jeho 3' konci kyselou transaktivační doménu (TAD) VP16 HSV-1 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al., Genes Developm., 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190, 1995).

Provedení Ε), obsahující:

1. aktivační sekvenci obsahující složku a) obsahující alespoň jednu sekvenci (např. nukleotidová sekvence: 5'-TAATGATGGGCG-3') pro vazbu proteinu ZFHD-1 (Pomerantz et al., Science, 267, 93, 1995) a, na jejím 3' konci, složku b), která obsahuje:

- bazálni promotor SV40 (nukleové kyseliny 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, 1980, New York, Cold Spring Harbor Laboratory), nebo jiný promotor (viz Provedení A) , a

- cDNA pro protein ZFHD-1 (Pomerantz et al., Science, 267, 93, 1995) a na jejím 3' konci jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126 až 132, např.

	17	• «· ·· ·· · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · ··· ** ··	• tet ·· • ♦ · · · - * A · ·
• · ·· • · ·· ·«	• · · 9 · · ··
PKKKRKV, Dingwall et	al., TIBS,	16, 478, 1991),	a na	jeho 3'
konci kyselou	transaktivační	doménu (TAD)	VP16	HSV-1
(aminokyseliny	406	až 488,	Triezenberg et	al.,	Genes
Developm., 2,	718,	1988, Triezenberg, Curr.	Opin	Gen.

Developm., 5, 190, 1995).

2) Farmakologicky regulovatelné promotorové moduly

Podle vynálezu jsou následující geny specifické složky

farmakologicky regulovatelných	promotorových modulů (viz
rovněž	obr.	8 a 9) :
-- pro	fúzní	protein f)	(složka	f) ) :
gen	pro	aktivační	doménu	proteinového transkripčního

faktoru, a

- alespoň jeden gen pro protein A, který váže spojovací látku j) na příslušném místě

- doplněný o jaderný lokalizační signál (NLS)

- pro fúzní protein h) (složka h)):

- alespoň jeden gen pro protein B, který váže spojovací látku j) a

- gen pro protein, který se váže k DNA aktivační sekvence (složka i))

- pro spojovací látku

- složka j) mající alespoň jedno místo pro vazbu proteinu A a pro vazbu proteinu B a aktivační sekvence obsahující místo pro vazbu fúzního proteinu h) (složka h)) a promotorovy prvek

- pro složku i).

Výběr spojovací látky (složka j)) nevyhnutelně určuje povahu proteinů A a B vázajících složku j) ve složkách f) a »· ·* • · · · · · · ·· ·· ····

• · • ·	• · ·· • ··· · · * * *
• · · ·· ·*	·· ··
A a	B vázající
nebo	netotožné.

• · · • ··· · • · ··» *·

h) . V této souvislosti mohou být proteiny složku j) ve složkách f) a h) totožné

Totožné proteiny A a B vázající složku j) mohou být použity zejména, když spojovací látka (složka j)) má několik totožných vazebných míst. Avšak ve smyslu vynálezu jsou výhodné ve složkách f) a h) odlišné proteiny A a B vázající složku j).

To znamená, že spojovací látka (složka j)) je vázána fúzním proteinem f) (složka f)) v místě, které je odlišné od toho, ve kterém je vázána fúzním proteinem h) (složka h) ) , takže fúzní proteiny f) a h) spolu navzájem nesoutěží o vazbu ke spojovací látce.

Pro vazbu ke konkrétním buněčným proteinům, jejichž geny mohou být použity ve složkách f) a h) farmakologicky regulovatelného promotoru, mohou být použity spojovací látky, ktere jsou jiz známy.

Avšak tento vynález se monoklonálních protilátek a nich odvozených, nebo jejich také týká konkrétně použití rekombinantních protilátek z fragmentů, které se vážou ke spojovací látce j). Vložení těchto monoklonálních protilátek, zejména jejich rekombinantních fragmentů Fv, do fúzních proteinů f) a h) (složky f) a h)) tvoří konkrétní charakteristický rys tohoto vynálezu. V této souvislosti jsou nejlépe použity ve fúzních proteinech (složky f) a h) ) rekombinantní fragmenty Fv, které rozpoznávají na spojovací látce (složka j)) odlišná vazebná místa (epitopy vazebných míst A a B) .

Ve smyslu vynálezu mohou být použity jak myší tak lidské monoklonální protilátky. Myší monoklonální protilátky jsou použity nejlépe v humanizované formě. Humanizace se provádí způsobem popsaným Winterem et al. (Nátuře, 349, 293,

1991) a Hoogenboomsem et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol., • · · · · · • ·

1993). Protilátkové fragmenty jsou připraveny v se stavem techniky například způsobem popsaným

349, 293, 1991, Hoogenboomem et

36, 19, souladu

Winterem

Immunol., 10, 195, 1993.

Hemobiol., 36, 19, 1993, Girolem,

Fragmenty rekombinantních protilátek jsou připraveny hybridomů nebo jsou izolovány z lidských protilátkových fragmentů Rev. Immunol., 12, 433, 1994) za přímo z existujících knihoven myších nebo (Winter et al., Annu.

použití

Science, technologie fágové expozice (phage-display) (Smith, 228, 1315, 1985). Poté jsou tyto protilátkové fúzi s fragmenty použity přímo na genetické úrovni pro jinými proteiny nebo peptidy (s aktivační doménou proteinového proteinem transkripčního faktoru vázajícím DNA (složka h)).

nebo

Pro přípravu fragmentů je získána genetická hybridomů kóduje protilátkové domény (VH izolací mRNA, reverzní transkripcí amplifikací cDNA prostřednictvím reakce (Saiki et al., Science, 230, rekombinantní protilátky informace - sekvence, která

RNA do cDNA, antigen, a poté řetězové oligonukleotidů, které variabilních fragmentů jsou komplementární k polymerázové

1350, 1985) a za použití

5' a 3' koncům (Orlandi et al., PNAS klonovány do ve formě

1989) . Fragmenty VH a VL jsou poté bakteriálních expresních vektorů, například fragmentů Fv (Skerra & Plúckthun, Science, 240, 1038, 1988), jednořetězcových fragmentů Fv (scFv) (Bird et al., Science, 242, 423, 1988), Huston et al., PNAS-USA, 85, 5879, 1988) nebo jako fragmenty Fab (Better et al., Science, 240, 1041,

Technika fágové expozice může být také použita při izolaci nových protilátkových fragmentů přímo z protilátkových knihoven („imunní nebo „naivní knihovny) myšího nebo lidského původu.

Ve fágové expozici protilátkových fragmentů jsou klonovány domény vázaj ící antigen jako fúzované proteiny s obalovými proteinem g3P vláknitých bakteriofágů, buď do fágového genomu (McCafferty et al., Nátuře, 348, 552, 1990) nebo do fagemidových vektorů (Breitling et al., Gene, 104, 147, 1991), ve formě fragmentů scFv (McCafferty et al., Nátuře, 348, 552, 1990) nebo jako fragmenty Fab (Hoogenboom et al., Nucl. Acid Res., 19, 4133,

1991, Barbas et al·., PNAS USA, 88, 7978, 1991). Fágy vázající antigen se selektuji v plastických nádobách povlečených antigenem (tzv. rýžování) (Marks et al., J. Mol. Biol., 222, 581, 1991), na paramagnetických kuličkách konjugovaných s antigenem (Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226, 889, 1992) nebo navázáním na buněčné povrchy (Marks et al., Bio/Technol., 11, 1145, 1993).

„Imunní knihovny jsou připraveny tak, že se variabilní protilátkové fragmenty z B lymfocytů imunizovaných zvířat (Sastry et al., PNAS-USA, 86, 5728, 1989, Ward et al.,

Nátuře, 341, 544, 1989, Clackson et al., Nátuře, 352, 624,

1991) nebo pacientů (Mullinax et al., PNAS USA, 87, 8095,

1990, Barbas et al., PNAS USA, 88, 7978, 1991) podrobí amplifikaci metodou PCR. Za tímto účelem se použijí kombinace oligonukleotidů, které jsou specifické pro myší (Orlandi et al. , PNAS USA, 86, 3833, 1989, Sastry et al. ,

PNAS USA, 86, 5728, 1989) nebo lidské imunoglobulinové geny (Larrick et al., BBRC, 160, 1250, 1989) nebo pro rodiny lidských imunoglobulinových genů (Marks et al., Eur. J. Immunol., 21, 985, 1991).

„Nativní knihovny se připraví například použitím neimunizovaných dárců jako zdroje imunoglobulinových genů (Marks et al., J. Mol. Biol., 222, 581, 1991). Alternativně mohou být k přípravě repertoárů semisyntetických protilátek použity geny zárodečné linie imunoglobulinů tak, že oblast 3 variabilních fragmentů určující komplementaritu je amplifikována metodou PCR za použití degenerovaných primerů (Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol., 227, 381, 1992, Barbas et al., PNAS USA, 89, 4457, 1992, Nissim et al., EMBO J., 13, 692, 1994, Griffiths et al., EMBO J., 13, 3245, 1994). Při srovnání s imunními knihovnami mají tyto knihovny výhodu, že z jedné knihovny mohou být izolovány protilátkové fragmenty proti velkému počtu antigenů (Nissim et al., EMBO J., 13, 692, 1994) .

Technika fágové expozice může být použita ještě dále pro zvýšení afinity protilátkových fragmentů s novými knihovnami, které jsou připraveny z již existujících protilátkových fragmentů náhodnou mutagenezí (Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226, 889, 1992, Gram et al., PNAS USA, 89, 3576, 1992), mutagenezí založenou na kodonu (Glaser et al., J. Immunol., 149, 3903, 1992) nebo místně cílenou mutagenezí (Balint & Larrick, Gene, 137, 109, 1993), záměnou řetězců jednotlivých domén za řetězce fragmentů z naivních repertoárů (Marks et al., Bio/Technol., 10, 779, 1992) nebo použitím bakteriálních mutátorových kmenů (Low et al., J. Mol. Biol., 26, 359, 1996) a protilátkových fragmentů se zlepšenými vlastnostmi při izolaci novou selekcí za stringentních podmínek (Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226, 889, 1992). Kromě toho myší protilátkové fragmenty mohou být humanizovány postupným nahrazováním jedné z variabilních domén lidským repertoárem, a poté výběrem s původním antigenem (řízený výběr) (Jespers et al., Bio/Technol., 12,

889, 1994). Alternativně jsou myší protilátky humanizovány specifickou náhradou hypervariabilních oblasti lidských protilátek odpovídajícími oblastmi původní myší protilátky (Jones et al., Nátuře, 321, 522, 1987).

Proto tedy ve smyslu vynálezu spojovací látky zahrnují v zásadě všechny látky, které jsou schopny proniknout do buňky. Ve smyslu tohoto vynálezu zvláštní výhodnost mají ty spojovací látky, které jsou již používány jako léčiva nezávisle na genové terapii.

Například tyto spojovací látky zahrnují následující spojovací látky (složka j) ) spolu s přičleněnými proteiny, které se vážou ke konkrétní spojovací látce a jejichž geny mají být vloženy do složek f) a h) , aby se exprimovaly fúzní proteiny f) a h):

spojovací látka: rapamycin nebo jeho analogy, jako L685818 (Becker et al., J. Biol. Chem., 268, 11335, 1993), spolu s následujícími vazebnými proteiny (a jejich geny),

- protein vázající FK506 (FKBP, Bierer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87, 9231, 1990)

- spojený protein FKBP/rapamycin, který se váže na komplex FKBP/rapamycin, nebo jeho částečná sekvence, která se váže na komplex FKBP/rapamycin (FRAP, Brown et al., Nátuře, 369, 756, 1994, Chiu et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91, 12574, 1994, Sabatini et al., Cell, 78, 35, 1994, Sabers et al., J. Biol. Chem., 270, 815, 1995).

- místo použití genů pro FKBP a FRAP mohou být použity geny pro rekombinantní fragment Fv, který se váže k rapamycinu a/nebo inhibuje vazbu FKBP nebo FRAP k rapamycinu.

-- spojovací látka: dimery (FK1012) FK506 (Spencer et al., Science, 262, 1019, 1993, Pruschy et al., Chem. Biol., 1,

163, 1994) spolu s následujícími vazebnými proteiny (a jejich geny):

- protein vázající FK506 (FKBP, viz výše),

- kalcineurin (Lín et al., Cell, 66, 807, 1991) nebo jeho částečná sekvence, která se váže ke komplexu FK506 (Clipstone et al., J. Biol. Chem., 269, 26431, 1994), a

- gen pro rekombinantní fragment Fv, který inhibuje vazbu FK506 ke kalcineurinu (Ho et al., Narure, 382, 822, 1996) a může být vložen na místo kalcineurinovéno genu.

-- spojovací látka: dimery cyklosporinu A (Belshaw et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93, 4604, 1996) spolu s následujícími vazebnými proteiny (a jejich geny):

- cyklofilin (Belshaw et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93, 4604, 1996),

- kalcineurin nebo jeho částečná sekvence, která se váže ke komplexu cyklosporin A/cyklofilin (viz výše), a

- gen pro rekombinantní fragment Fv, který inhibuje vazbu cyklosporinu A k cyklofilinu, může být vložen místo genu pro cyklofilin.

spojovací látka: monomery cyklosporinu A spolu s následujícími vazebnými proteiny (a jejich geny):

- cyklofilin gen pro rekombinantní fragment Fv, který se váže k cyklosporinu A v komplexu cyklofilin/cyklosporin A (Cacalano et al., Molec. Immunol., 29, 107, 1992),

- jako alternativa k cyklofilinu mohou být použity geny pro odlišné rekombinantní fragmenty Fv, které se vážou k různým epitopům cyklosporinu A (Vix et al., Proteins, 15, 339, 1993, Cacalano et al., Molec. Immunol., 29, 107, 1992, Raufer et al., Molec. Immunol., 31, 913, 1994).

spojovací látka: metotrexát vazebnými proteiny (a spolu s následuj ícím protilátky nebo jejich geny) : protilátkové (rekombinantni metotrexátu fragmenty Fv) proti

Cancer, 61, 508, 1990, Kato et al., (Pimm et

J. Immunol. Methods, 67, protilátky nebo protilátkové fragmenty (rekombinantni fragmenty Fv) proti pteridinové

Hybridoma, 6, 87, 1987), skupině protilátky nebo protilátkové fragmenty (rekombinantni fragmenty Fv) proti Hybridoma, 6, 87, 1987), benzenové skupině et

- dihydrofolátreduktáza (Masters et

59, 1983,

Swift et al., Mol. Gen.

Genetics, 181, 441,

1981, et al., Mol. Cell Biol., spojovací látka: vazebnými proteiny (a protilátky nebo gentamycin spolu s jejich geny) : protilátkové fragmenty gentamycinu (Sierra-Madero et al., J.

následuj icirni (rekombinantni

Clin. Microbiol., 26, ceftazidim spolu s následujícími jejich geny) : protilátkové spojovací látka:

vazebnými proteiny (a protilátky nebo protilátkové fragmenty (rekombinantni fragmenty Fv) proti ceftazidimu (Shimizu et al., Int. Arch.

Allergy Immunol., 98, 392, 1992.

spojovací látka: cefalexin spolu s následujícími vazebnými proteiny (a jejich geny):

protilátky nebo protilátkové fragmenty (rekombinantní fragmenty Ev) proti acylovému postrannímu řetězci v pozici

C7 cefemu (Nagakura et al., Int. Arch. Allergy Applied

Imuunol., 93, 126, 1990).

— spojovací látka: kyselina listová spolu s následujícími vazebnými proteiny (a jejich geny):

protein vázající kyselinu listovou (Ratnam et al., Biochem., 28, 8249, 1989, Elwood, J. Biol. Chem., 264, 14893, 1989, Sadasivan et al., Biochem. Biophys. Acta, 1131, 91, 1992) protilátky nebo protilátkové fragmenty (rekombinantní fragmenty Fv) proti kyselině listové (Rayburn et al., Clin. Chem., 30, 1007, 1984) .

— spojovací látka: kyselina retinová spolu s následujícími vazebnými proteiny (a jejich geny):

doména vázající kyselinu retinovou buněčného proteinu vázajícího kyselinu retinovou (Stoner et al., Cancer Res., 49, 1497, 1989, Eller et al., Clin. Res., 39, 560A, 1991, a protilátky nebo protilátkové fragmenty (rekombinantní fragmenty Fv) proti kyselině retinové (Twal et al·., Developm. Biol., 168, 225, 1995, Zhou et al., J. Immunol. Methods, 138, 211, 1991.

spojovací látka: penicilín spolu s následujícími vazebnými proteiny (a jejich geny):

protilátky nebo protilátkové fragmenty (rekombinantní fragmenty Fv) proti amoxicilinu (Mayorga et al., Toxicol., 97, 225, 1995, Mayorga et al., Int. Arch. Allergy Applied Immunol., 99, 443, 1992) protilátky nebo protilátkové fragmenty (rekombinantni fragmenty Fv) proti benzylpeniciloylové skupině (de Haan et al., Int. Arch. Allergy Applied Immunol., 76, 42, 1985,

Fukushima et al., Clin. Exp. Immunol., 68, 427, 1987) protilátky nebo protilátkové fragmenty (rekombinantni fragmenty Fv) proti penicilinu (Sierra-Madero et al., J. Clin. Microbiol., 26, 1904, 1988) a

- protein vázající penicilín (Popham et al., J. Bacteriol., 177, 326, 1995, J. Bacteriol., 176, 7197, 1994).

- spojovací látka: 4-hydroxytamoxifen nebo tamcxifen spolu s následujícími vazebnými proteiny (a jejich geny):

- doména vázající estrogen proteinu estrogenového receptoru (Spreafico et al., Eur. J. Pharmacol., 227, 353, 1992, Green et al., Nátuře, 320, 134, 1986), a protilátky nebo protilátkové fragmenty (rekombinantni fragmenty Fv) proti komplexu estrogenový receptor/estrogen nebo 4-hydroxytamoxifen (Giambiagi et al., J. Steroid Biochem., 30, 213, 1988, Biochim. Biophys. Acta, 883, 559, 1986, Katzenellenbogen et al., Biochem., 26, 2364, 1987, Tate et al., Breast Cancer Res. Treatm., 3, 267, 1983).

spojovací látka: tetracyklin spolu s následujícími vazebnými proteiny (a jejich geny):

- tetracyklinový represorový protein (Gossen et al., PNAS USA, 89, 5547, 1992), a

- protilátky a protilátkové fragmenty proti tetracyklinu.

- spojovací látka: konjugát tetracyklinu a isopropyl-p-Dthiogalaktosid spolu s následujícími vazebnými proteiny (a jej ich geny) :

- protein represoru lac (lac I) (Brow et al., Cell, 49, 603, 1987) .

Podle vynálezu jsou geny pro proteiny A a B vázající spojovací látku (složka j) spojeny

- ve fúzní protein f) (složka f) , protein A) s genem pro aktivační doménu proteinového transkripčního faktoru, a

- ve fúzní protein h) (složka n) , protein B) s genem pro protein vázající DNA, a tento protein vázající DNA je vybrán tak, že se váže specificky

- s aktivační sekvencí (složka i) (viz obr. 8 a 9) . V tomto kontextu je „přirozeně se vyskytující protein protein, který se nachází v přírodě. Tedy vazebná doména, která pochází z „přirozeně se vyskytujícího proteinu je odlišná od vazebné domény, která byla navržena člověkem. Přirozeně se vyskytující protein se nachází a izoluje z přírody.

Informační sekvence nukleové kyseliny pro „vazebnou doménu může být užita odděleně nebo kombinována s dalšími informačními sekvencemi, aby se vytvořila vazebná doména přirozeně se vyskytujícího proteinu.

Ve smyslu vynálezu může být například použito následujících nukleotidových sekvencí pro aktivační doménu ve složce f) :

- transaktivační doména VP16 herpes viru (Greaves et al., J. Virol., 64, 2716, 1990, 65, 6705, 1991),

- podjednotka p65 proteinového transkripčního faktoru NF-kB (Schmitz et al., EMBO J., 10, 3805, 1991), a

- doména Oct-2 N-koncové části bohaté na glutamin, která je přímo nebo nepřímo (např. prostřednictvím proteinu vázajícího Gal-4) spojena s C-koncovou částí domény Oct-2 « « · · · · bohatou na prolin (Tanaka et al., Mol. Cell Biol., 14, 6046,

1994) .

Následující může být použito například jako nukleotidová sekvence pro protein vázající DNA ve fúzním proteinu h) (složka h)) a jako připojená aktivační sekvence (složka i)) :

Provedení F), obsahující

1. nukleotidovou sekvenci proteinu vázajícího DNA ve fúzním proteinu h), obsahující:

- cDNA pro doménu vázající DNA proteinu Gal4 (aminokyseliny 1 až 147, Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916,

1990, a na jejím 3' konci jaderný lokalizační signál (NLS)

SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny Dingwall et al·., TIBS, 16, 478, připojena kyselá transaktivační (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et Developm., 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr.

126 až 132, např. PKKKRKV, 1991) , k jehož doména (TAD)

3' konci je

VP16 al.,

Opin.

HSV-1

Genes

Gen.

Developm., 5, 190, 1995), a

2. připojenou aktivační sekvenci (složka i)), obsahující: alespoň jednu sekvenci (např. nukleotidovou sekvenci

5'-CGGACAACTGTTCACCG-3') pro vazbu proteinu Gal4 (Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916, 1989) a, na jejím 3' konci,

- bazální promotor SV40 (nukleové kyseliny 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory), nebo

- promotor c-fos (Das et al., Nátuře, 374, 657, 1995) a, na jeho 3' konci, kyselou transaktivační doménu (TAD) VP16 HSV-1 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al., Genes Developm., 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190, 1995), nebo

- promotor U2 sn RNA a, na jeho 3' konci, TAD VP16 HSV-1 nebo alespoň sekvenci aktivační domény Oct-2 (aminokyseliny 438 až 479, Tanaka et al., Mol. Cell Biol., 14, 6046, 1994, Das et al., Nátuře, 374, 657, 1995) nebo

- promotor HSV (Papavassiliou et al., J. Biol. Chem., 265, 9402, 1990, Park et al., Molec. Endocrinol., 7, 319, 1993 nebo jakýkoliv jiný promotor, který může být aktivován nespecificky, způsobem specifickým pro určitou buňku či virus a/nebo pro fázi buněčného cyklu.

Provedení G), obsahující:

- cDNA pro doménu proteinu LexA vázající DNA (aminokyseliny 1 až 81, Kim et al·., Science, 255, 203, 1992) nebo celý protein LexA (aminokyseliny 1 až 202, Brent et al., Cell, 43, 729, 1985), a na jejím 3' konci jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126 až 132, např. PKKKRKV, Dingwall et al., TIBS, 16, 478, 1991), a na jeho 3' konci kyselou transaktivační doménu (TAD) VP16 HSV-1 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al·., Genes Developm., 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190, 1995) a

2. připojenou aktivační sekvenci (složka i)), obsahující:

- sekvenci (např. nukleotidovou sekvenci 5'-TACTGTATGTACATACAGTA-3') pro vazbu proteinu LexA (operátor LexA, Brent et al., Nátuře, 612, 312, 1984), k jejímuž 3' konci je připojen bazální promotor SV40 (nukleové kyseliny 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory), nebo jiný promotor (viz Provedení F).

·« ····

Provedeni H), obsahující:

1. nukleotidovou sekvencí proteinu vázajícího DNA ve fúzním proteinu h) , obsahující:

- cDNA pro protein represoru lac (lac I) (Brown et al.,

Cell, 49, 603, 1987, Fuerst et al. , PNAS USA, 86, 2549,

1989), a na jejím 3' konci jaderný lokalizační signál (NLS) napr.

PKKKRKV,

Dingwall et al., TIBS, 16, 478, 1991), a na jeho

3' konci kyselou doménu

VP16

HSV-1 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg al.,

Genes

Developm., 2,

Curr.

Opin.

Developm., 5,

2. připojenou aktivační sekvenci (složka obsahuj ící operátor lac nukleotidové alespoň jednu sekvenci pro

5' - GAAT T GT GAGC GCT CACAATT C - 3') sekvence:

pro vazbu proteinu represoru lac I (Fuerst et al., PNAS USA, 86, 2549, 1989, Simons et al., PNAS USA, 81, 1624, 1984) a, na jejím 3' konci, banální promotor SV40 (nukleové kyseliny 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor

New York, Ν. Y., Cold Spring Harbor Laboratory), nebo jiný promotor (viz Provedení F).

Provedení I), obsahující:

cDNA pro tetracyklinový represorový protein (tet R) (Gossen et al., PNAS USA, 89, 5547, 1992, Dingermann et al.,

EMBO J., 11, 1487, 1992) a na jejím 3' konci jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny

126 až 132, např. PKKKRKV, Dingwall et al., TIBS, 16, 478,

1991), a na jeho 3' konci kyselou transaktivační doménu (TAD) • ·

VP16 HSV-1 (aminokyseliny 405 až 488 , Triezenberg et al., Genes Developm., 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190, 1995) a

2. připojenou aktivační sekvenci (s loz i)) obsahující alespoň jednu sekvenci tetracyklinového operátoru (tet O) (např. nukleotidové sekvence: 5'TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3') pro vazbu tetracyklinového represorového proteinu (tet R) a, na jejím 3' konci, bazální promotor SV40 (nukleové kyseliny 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, N. Y., Cold Spring Harbor Laboratory), nebo jiný promotor (viz Provedení F).

Provedení

J), obsahuj ící

1. nukleotidovou sekvenci proteinu vázajícího

DNA ve fúzním proteinu h) , obsahující:

cDNA pro protein ZFHD-1

Science, 267, a na jejím 3' konci jaderný aminokyseliny

126 až 132, např.

PKKKRKV, Dingwall et al·., TIBS,

16, a na jeho 3' konci kyselou transaktivačni doménu

VP16

HSV-1 (aminokyseliny al.,

Genes

Developm., 2,

Opin.

2. připojenou aktivační sekvenci (složka i)) obsahující:

alespoň jednu sekvenci (např. nukleotidovou sekvenci 5'proteinu ZFHD-1 (Pomerantz et al., na jejím 3' konci bazální promotor

SV40 (nukleové kyseliny 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor

Viruses (Cold Spring Harbor New York, New York, Cold Spring

Harbor Laboratory) nebo jiný promotor (viz možnost F).

3. Promotorové sekvence

Ve smyslu vynálezu nukleotidové sekvence, které po vazbě proteinových transkripčnich faktorů aktivují transkripci strukturálního genu, který je lokalizován v přilehlé pozici na 3' konci, jsou používány jako promotorové sekvence (složky b) , e), g) a i)). Výběr promotorových sekvencí záleží na léčené nemoci a na cílové buňce, která je transdukována. Tedy promotorové sekvence může být aktivována neomezeným způsobem, způsobem specifickým pro cílovou buňku, za konkrétních metabolických podmínek, způsobem specifickým pro fázi buněčného cyklu nebo způsobem specifickým pro určitý virus. Navíc ve složkách b), e) a/nebo g) a ve složce

i) mohou být použity totožné nebo různé promotorové sekvence. Příklady těchto promotorových sekvencí, vedle promotorových sekvencí, které byly již uvedeny v provedeních A) až J), j sou:

promotorové a aktivační sekvence, které mohou být aktivovány neomezeným způsobem

- promotor RNA polymerázy III

- promotor RNA polymerázy II

- promotor CMV a zesilovač CMV

- promotor SV40

- virové promotorové a aktivační sekvence, jako

- HBV

- HCV

- HSV

- HPV

- EBV

- HTLV

HIV

Když je použit promotor HIV, je použita celá sekvence LTR včetně sekvence TAR (pozice < -453 až > +80, Rosen et al., Cell, 41, 813, 1985) jako virově specifický promotor.

- Promotorové sekvence nebo sekvence zesilovače, které mohou být aktivovány metabolicky, jako zesilovač nebo promotor, který je indukovatelný hypoxií.

- Promotory, které mohou být aktivovány způsobem specifickým pro fázi buněčného cyklu, jako je promotor genu cdc25C, promotor genu cyklinu A, promotor genu cdc2, promotor genu B-myb, promotor genu DHFR nebo promotor E2F-1, nebo jiné vazebné sekvence pro proteinové transkripční faktory, které se objevují nebo jsou aktivovány během buněčné proliferace. Tyto vazebné sekvence zahrnují například vazebné sekvence pro proteiny c-myc. Tyto vazebné sekvence také zahrnují monomery nebo multimery nukleotidové sekvence, která se nazývá box E genu myc, např. (5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC3', Blackwood a Eismann, Science, 251, 1211, 1991).

- Promotory, které mohou být aktivovány tetracyklinem, jako tetracyklinový operátor v kombinaci s odpovídajícím represorem.

- Chimérické promotory.

Chimérický promotor tvoří kombinace aktivátorové sekvence proti směru čtení, která může být aktivována způsobem specifickým pro určitou buňku, metabolicky nebo způsobem specifickým pro určitý virus, s promotorovým modulem po směru čtení, který může vázat proteinové transkripční faktory z rodin CDF a CHF nebo E2F a CHF, a je tím schopný inhibovat aktivaci aktivátorové sekvence proti směru čtení ve fázích G0 a G1 buněčného cyklu.

- Hybridní promotory například ve formě, ve které je mutována sekvence TATA promotoru, tato mutace je kompenzována odpovídající mutací v genu proteinu vázajícího •a

TATA a tento prote promotorem

Promotory, které mohou bý

Ktivovar

Tyto promotory obsahují nej vhodněji promotorové proteiny ve vybraných buňkách.

Například ve smyslu • · · • · · · · • Φ · « · · · íva j i promotory pro následující proteiny v následujících buňkách:

promotorové sekvence nebo aktivátorové sekvence, které endoglin receptor VEGF 2 (flk-1, KDR)

B61 endotelin-1 endotelinu B

IL-ld, IL-Ιβ receptor IL-1 adhezivní molekula cévní buňky (VCAM-1) syntetické aktivátorové sekvence ecepto

Jako alternativa k přirozeným promotorům specifickým selektivně aktivní v endotelových buňkách. Jako příklad pro endotel se mohou také použít syntetické aktivátorové sekvence, které obsahují oligomerizovaná vazebná místa pro proteinové transkripční faktory, které jsou přednostně nebo

těchto proteinových transkripčních faktorů je proteinový transkripční faktor GATA-2, jehož vazebné místo například v genu endotelinu-1 je 5'-TTATCT-3'.

Promotorové nebo aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v buňkách v sousedství aktivovaných endotelových buněk

- VEGF

Genově regulační sekvence pro gen VEGF jsou

- 5' hraniční oblast nebo

- 3' hraniční oblast nebo

- gen c-Src nebo

- gen v-Src

- Receptory steroidních hormonů a jejich promotorové prvky (Truss a Beato, Endocr. Rev., 14, 459, 1993), zejména promotor viru myšího tumoru mléčné žlázy.

Promotorové nebo aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány ve svalových buňkách, zejména v buňkách hladkého svalstva

- tropomyozin

- a-aktin

- a-myozin

- receptor pro PDGF

- receptor pro FGF

- MRF-4

- fosfofruktokináza A

- fosfoglycerátmutáza

- troponin C

- myogenin

- receptory pro endotelin A

- dezmin

VEGF • · · ·

• 4

Genové regulační sekvence pro gen VEGF již byly uvedeny v části nazvané „Promotory, které jsou aktivované v buňkách v sousedství aktivovaných endotelových buněk (viz výše).

- „Syntetické promotory

Faktory rodiny HLH (šroubovice-smyčka-šroubovice, <. helix-locp-helix) (MyoD, Myf-5, myogeny a MRF4) jsou uváděny jako transkripční aktivátory specifické pro svaly. Transkripční aktivátory specifické pro svaly zahrnuji také skupiny proteinu „zinkového prstu GATA-4 a transkripčniho faktoru MEF.

Proteiny HLH, a také GATA-4, projevuji transkripci specifickou pro svaly nejenom s promotory genů svalově specifických, ale také v heterologním kontextu, tedy rovněž se syntetickými promotory. Příklady těchto syntetických promotorů jsou:

- mnohonásobné kopie místa DNA pro vazbu proteinů HLH specifických pro svaly, jako je sekvence E (Myo D) (např. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC)

- mnohonásobné kopie místa DNA pro vazbu GATA-4 genů těžkého řetězce α-myozinu (např. 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGC CGATGGGCAGATAGAGG-3')

- Promotorové a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány . v gliových buňkách. Tyto zahrnují zejména genově regulační sekvence nebo prvky genů, které například kóduji následující -· proteiny:

- protein periaxin specifický pro Schwannovy buňky

- glutaminsyntetázu

- protein specifický pro gliové buňky (gliový vláknitý kyselý protein = GFAP)

- protein SlOOb gliové buňky

- IL-6 (CNTF)

- receptory 5-HT

- TNFa

- IL-10

- receptor růstového faktoru podobného inzulínu I a II

- VEGF

Genově regulační sekvence pro gen VEGF již byly uvedeny výše.

- Promotorové a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v hematopoetických buňkách

Tyto genové regulační sekvence zahrnují promotorové sekvence pro geny cytokinu nebo jeho receptoru, tyto geny jsou exprimovány v hematopoetických buňkách nebo v sousedních buňkách, jako jsou buňky stromatu.

Tyto sekvence zahrnují promotorové sekvence například pro následující cytokiny a jejich receptory:

- receptor faktoru kmenové buňky

- faktor kmenové buňky

- IL-la
- receptor	IL-1
- IL-3
- receptor	IL-3	(podj ednotka	a
- receptor	IL-3	(podjednotka	β
- IL-6
- receptor	IL-6

- GM-CSF

- receptor GM-CSF (řetězec a)

- interferonový regulační faktor 1 (IRF-1)

Promotor IRF-1 je aktivován do stejné míry IL-6 jako IFN-a, IFN-β nebo IFN-γ.

- erytropoetin

- receptor erytropoetinu

- Promotorové a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v lymfocytech a/nebo makrofázích

Ty zahrnuji například promotorové sekvence a aktivátorové sekvence genů cytokinů, cytokinových receptorů a adhezivních molekul a receptorů pro fragment Fc protilátek.

Příklady těch druhých jsou:

- receptor	IL-1
- IL-la
- IL-Ιβ
- IL-2
- receptor	IL-2
- IL-3
- receptor	IL-3
- receptor	IL-3
- IL-4
- receptor	IL-4
- IL-5
- IL-6

(podjednotka a) (podjednotka β)

- interferonový regulační faktor 1 (IRF-1) (Promotor IRF-1 je aktivován do stejné míry IL-6 jako

IFN-α nebo IFN-β).

- promotor responzivní na IFN-γ

- IL-7

- IL-8

- IL-10

- IL-11

- IFN-γ

- GM-CSF

- receptor GM-CSF (řetězec a)

- IL-13

LIF • · · · · · ·· • · · « · · · · · ··

- receptor faktoru stimulujícího kolonii makrofágů (MCSF)

- receptory makrofága I a II

- MAC-1 (leukocytární funkční antigen)

- LFA-Ια (leukocytární funkční antigen)

- pl50,95 (leukocytární funkční antigen)

- Promotorové sekvence a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v synoviálních buňkách

Ty zahrnují promotorové sekvence pro metaloproteinázy mezibuněčné hmoty (MMP), například pro

- MMP-1 (intersticiální kolagenáza)

- MMP-3 (lyzin/tranzin stromatu)

Dále zahrnují promotorové sekvence pro tkáňové inhibitory metaloproteináz (TIMP), například

- TIMP-1

- TIMP-2

- TIMP-3

- Promotory a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v leukemických buňkách

Ty obsahují například promotory pro

- c- myc

- HSP-70

- bcl-l/cyklin D-l

-bcl-2

-IL-6

-IL-10

- NFa, TNFp

- HOX-11

- BCR-Abl

- E2A-PBX-1

- PML-RARA (promyelocytární leukemie - receptor kyseliny retinové)

— c-myc

Proteiny c-myc se váží na a aktivují multimery nukleotidové sekvence, která se nazývá box E myc (např. 5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3') .

- Promotory nebo aktivátorové sekvence pro nádorové buňky

Genové regulační sekvence, se kterými interagují proteinové transkripční faktory, které se tvoří nebo jsou aktivní v nádorových buňkách, se považují za promotorové sekvence nebo aktivátorové sekvence.

Ve smyslu tohoto vynálezu výhodné promotory nebo aktivátorové sekvence zahrnují genově regulační sekvence nebo prvky z genů, které kódují proteiny, které jsou tvořeny zejména v rakovinných buňkách nebo buňkách sarkomů. Tedy v případě malobuněčných bronchiálních karcinomů je výhodné použití promotoru proteinu karcinomů použití promotoru hepatitidy nebo L-plastinu, karcinomů použití promotoru epitelového mucinu (PEM).

N-CAM, v případě ovariálních receptoru růstového faktoru a v případě pankreatických L-plastinu nebo polymorfního

4. Jaderné exportní signály a jaderné exportní faktory

Ve smyslu vynálezu jsou jaderné exportní signály (NES) výhodně sekvence retrovirového rev-responzivního prvku (RRE). V případě HIV-1, tento RRE je sekvence 243 nukleotidů (nukleotidy 7362 až 7595, Muesing et al., Nátuře, 313, 450, 1985) v genu env (Malim et al., Nátuře, 338, 254, 1989, Kjems et al., PNAS, 88, 683, 1991). Avšak ve smyslu vynálezu jaderný exportní signál (NES) může také být jakákoliv homologní a/nebo funkčně podobná (analogická) nukleotidové sekvence, jako je například RRE-ekvivalentní prvek viru HBV (Huang et al., Mol. Cell Biol., 13, 7476, 1993).

V nových konstruktech nukleové kyseliny je jaderný exportní faktor (NEF) nukleotidová sekvence, která kóduje protein, který se váže na mRNA z NRS a zprostředkovává transport pre-messenger RNA nebo messenger RNA z buněčného jádra a do cytoplazmy (nebo z cytoplazmy a do buněčného jádra). Ve smyslu vynálezu se zejména používá gen rev retrovirů, především z virů HIV-1 nebo HIV-2 (Daly et al., Nátuře, 342, 816, 1989, Emerman et al., Cell, 57, 1155, 1989, Felber et al. , PNAS, 86, 1495, 1989, Fischer et al.,

EMBO J., 13, 4105, 1994).

Protein rev retrovirového genu rev se váže svou doménou na N-koncové části (Zapp et al., Nátuře, 342, 7154, 1989, Malim et al., Cell, 65, 241, 1991) k RRE v pre-mRNA (Iwai et al., Nucl. Acids Res., 20, 6465, 1992). Vazba mezi RRE a proteinem rev usnadňuje transport nesestřižené pre-messenger RNA, a také jakékoliv další RNA, která obsahuje RRE, ven z buněčného jádra a do cytoplazmy (Fischer et al., EMBO J., 13, 4105, 1994, Fischer et al., Cell, 82, 475, 1995), a tím podstatně zesiluje translaci.

Ve smyslu vynálezu mohou být také jako NEF použity nukleotidové sekvence, které kódují proteiny, které jsou homologní a funkčně podobné proteinu rev HIV-1 (Bogerd et al., Cell, 82, 485, 1995) jako je gen rev viru visna-maedi (VMV, Tiley et al., J. Virol., 65, 3877, 1991) nebo gen rev viru kozí artritidy a encefalitidy (CAEV, Tiley et al., J. Virol., 65, 3877, 1991).

Avšak ve smyslu vynálezu mohou být také použity ty geny, které kódují proteiny, které jsou funkčně podobné proteinu rev HIV-1, i když mají slabou nebo vůbec žádnou homologii s proteinem rev.

Tyto geny zahrnují například gen rev HTLV-1 (Cullen,

Microbiol. Rev., 56, 375, 1992) a gen rev viru koňské

infekční anémie (EIAV) a viru imunodeficitu koček (FIV) (Manusco et al., J. Virol., 68, 1988, 1994).

V alternativním provedeni mohou být NEF také nukleotidové sekvence proteinů, které ovlivňuji sekreci RNA z jádra, dokonce aniž by tato RNA byla zadržena v jádru prostřednictvím NRS. Tyto proteiny zahrnují například proteinový transkripční faktor TFIIIA (Gaddat et al., Cell, 60, 619, 1990, Drew et al., Gene, 159, 215, 1995) nebo heterogenní jaderný ribonukleoprotein Al (protein hnRNPAl, Pinol-Roma et al., Nátuře, 355, 730, 1992).

V širším smyslu jaderné transportní proteiny také zahrnují protein tepelného šoku 70 (hsp70, Mandeli et al., J. Cell Biol., 111, 1775, 1990) nebo inhibitor proteinkinázy CPKI (Fantozzi et al., J. Biol. Chem., 269, 2676, 1994, Wen et al., J. Biol. Chem., 269, 32214, 1994).

Charakteristické vlastnosti, které obecně mají NEF a s ním homologní a analogické proteiny, je přítomnost domény lokalizované blíže N-koncové části pro vazbu monomerního proteinu k NRS RNA (J. Virol., 64, 881, 1990, Kjems et al., EMBO J., 11, 119, 1992) a doménu, která je obvykle bohatá na leucin (výjimkou je hnRnPAl) a která je nutná pro

transpor	tni	funkci NEF	(Wen et .	al.,	Cell, 82, 463, 1995,
Fischer	et	al., Cell,	82, 475,	1995, Malim et al.,	J.
Virol.,	65,	4248, 1991,	Venkatesh	et	al. , Virol., 178 ,	327,
1990).
Ve	smyslu tohoto	vynálezu	je	exprese genu NEF	pod

kontrolou promotorové sekvence (složka b') ) , která je lokalizovaná proti směru čtení od 5' konce genu NEF (viz obr.

a 7, a je již popsána výše) nebo farmakologicky regulovatelný promotorový modul (viz obr. 8 a 9) .

• · 0 · · ·

000 00 000 00

000Φ0 0 · · 0000«

0 0000 00« 000 *0 00 0··· ··

5. Vnitřní ribozomální vstupní místo (IRES)

Vnitřní ribozomální vstupní místo umožňuje expresi dvou sekvencí DNA, které jsou spojeny k sobě navzájem („vzájemně spojeny) prostřednictvím IRES.

IRES této povahy byly popsány například v článcích autorů: Montford a Smith, TIG, 11, 179, 1995, Kaufman et al., Nucl. Acids Res., 19, 4485, 1991, Morgan et al., Nucl. Acids Res., 20, 1293, 1992, Dirks et al., Gene, 128, 247,

1993, Pelletier a Sonenberg, Nátuře, 334, 320, 1988 a

Sugitomo et al., BioTechn., 12, 694, 1994.

Tak například může být použita cDNA sekvence IRES polioviru (pozice < 140 až > 630 z 5' UTR (Pelletier a Sonenberg, Nátuře, 334, 320, 1988) ke spojení DNA. složky c) k DNA složky d).

6. Strukturální geny

Ve smyslu vynálezu strukturální geny (složka c)) kódují aktivní sloučeninu pro profylaxi a/nebo léčbu nemoci. Strukturální geny a promotorové sekvence jsou vybírány s ohledem na povahu léčby nemoci a berou se do úvahy cílové buňky, které mají být transdukovány.

Například následující kombinace promotorových sekvencí (příklady viz část 3) a strukturálních genů se vybírají ve spojení s následujícími nemocemi:

a) Léčba nádorů

- Cílové buňky:

- proliferující endotelové buňky nebo

- buňky stromatu a svalové buňky, které sousedí s endotelovými buňkami nebo

- nádorové nebo leukemické buňky • · · · · ·

- Promotory:

- specifické pro endotelové buňky a specifické pro fázi buněčného cyklu nebo buněčně nespecifické nebo specifické pro svalové

buněčného cyklu nebo specifické pro nádorové buňky (solidní nádory a leukemie)

- Strukturální geny inhibitorů buněčné proliferace například pro:

protein retinoblastomu (pRb/pllO) nebo příbuzné proteiny pl07 a pl30

- protein p53

- protein p21 (WAF-1)

- protein pl6

- další inhibitory cdk

- protein GADD45

- protein bak

- Protein retinoblastomu (pRb/pllO) a příbuzné proteiny p!07 a pl30 jsou inaktivovány fosforylací. Dává se přednost použití takových genů těchto inhibitorů buněčného cyklu, které projevují mutace pro inaktivační místa exprimovaných proteinů, aniž by se tím zhoršila funkce těchto proteinů. Příklady těchto mutací jsou popsány v případě pllO. Sekvence DNA proteinu plQ7 nebo proteinu pl30 je mutována analogicky.

V buňce je protein p53 inaktivován buď vazbou na speciální proteiny, jako je MDM2, nebo oligomerizací p53 prostřednictvím defosforylovaného šeřinu

392 na

C-koncové části. Proto se dává přednost použití sekvence

DNA pro protein p53, který byl na

C-koncové části zkrácen odstraněním šeřinu 392.

• ·« · ·

- Strukturální geny pro faktory vyvolávající koagulaci a inhibitory angiogeneze, například:

- inhibitor aktivátoru plazminogenu 1 (PAI-1)

- PAI-2

- PAI-3

- angiostatin

- interferony, zejména

IFNa

ΙΡΝβ

IFNy

- destičkový faktor 4

- IL-12

- TIMP-1

- TIPM-2

- TIMP-3

- leukemický inhibiční faktor (LIF)

- tkáňový faktor (TF) a jeho koagulačně aktivní fragmenty

- Strukturální geny pro cytostatické a cytotoxické proteiny, například pro:

- perforin

- granzym

-IL-2

-IL-4

-IL-12

- interferony, jako je

IFNa

IFNP

IFNy

- TNF, zejména

TNFa

TNFP • ·

- onkostatin Μ

- sfingomyelináza

- magainin a deriváty magaininu

Strukturální geny pro cytostatické nebo cytotoxické protilátky a pro fúzní proteiny mezi protilátkovými fragmenty vázajícími antigen a cytostatickými, cytotoxickými nebo zánět vyvolávajícími proteiny nebo enzymy:

- Cytostatické nebo cytotoxické protilátky zahrnují ty, které jsou namířeny proti membránovým strukturám endotelových buněk, jak byly popsány například autory:

Burrows et al., (Pharmac.

Ther.,

64, 155, 1994), Hughes et al., (Cancer' Res., 49, 6214, 1989) a Maruyama et al., (PNAS

USA, 87, 5744, 1990). Tyto protilátky zahrnují zejména protilátky proti receptorům VEGF.

Tyto protilátky dále zahrnují cytostatické nebo cytotoxické protilátky, které jsou namířeny proti membránovým strukturám na nádorových buňkách. Protilátky této povahy byly uvedeny v přehledech autory: Sedlaček et al., (Contrib. To Oncol., 32, Karger Verlag, Munich, 1988, and Contrib. To Oncol., 43, Karger Verlag, Munich, 1992). Dalšími příklady jsou protilátky pro:

sialyl Lewis peptidy na nádorech, které jsou rozeznávány T buňkami proteiny, které jsou exprimovány onkogeny gangliosidy, jako GD3, GD2, GM2, 9-O-acetyl GD3, fukosyl GM1 antigeny krevních skupin a jejich prekurzory antigeny na polymorfním epitelovém mucinu antigen na proteinech tepelného šoku

- Tyto protilátky dále zahrnují protilátky, které jsou namířeny proti membránovým strukturám leukemických buněk.

• ·· ······ ·· ·· • · · · · · · ♦ · · · • « · · · · ···· • ····· · ·· ··· · · • · ···· · · · * · · * · ·· 4 · ··· ·

Velké množství monoklonálních protilátek této povahy již bylo popsáno v diagnostických a léčebných způsobech (přehledy v: Kristensen, Danish Medical Bulletin, 41,52,

1994, Schranz, Therapia Hungarica, 38, 3, 1990, Drexler et al., Leuk. Res., 10, 279, 1986, Naeim, Dis. Markers, 7,1,

1989, Stickney et al., Curr. Opin. Oncol., 4, 847, 1992, Drexler et al., Blut, 57, 327, 1988, Freedman et al., Cancer Invest., 9, 69, 1991). V závislosti na typu leukemie jsou například následující monoklonální protilátky nebo jejich protilátkové fragmenty vázající antigen vhodné pro použití jako ligandy:

Buňky	Membránový antigen	Monoklonální protilátky popsané
AML	CD13	Kaneko et al., Leuk. Lymph., 14, 219, 1994
	CD14	Balí, Bone Marrow Transplant., 3, 387, 1988
	CD15	Campos et al., Eur. J. Cancer, 28, 37, 1992
	CD33	Jurcic et al., Leukaemia, 9, 244, 1995
	CAMAL	Shellard et al., Exp. Hematol., 19, 136, 1991
	Sialosyl-Le	Muroi et al., Blood, 79, 713, 1992
B-CLL	CD5	Tassone et al., Immunoi. Lett., 39, 137, 1994
	CDlc CD23	Orazi et al., Eur. J. Haematol., 47, 28, 1991

·· «> · ·« ·

Buňky	Membránový antigen	Monoklonální protilátky popsané
	Idiotypy a izotypy membrány imunoglobulínů	Schroeder et al., Immunol. Today, 15, 289, 1994
η-» Γ'-τ r — k-- .*-> J_i	CD 3 3 M38	Imai et al·., J. Immunol., 151, 6470, 1993
	receptory IL-2 receptory T buněk	Waldmann et al., Blood, 82, 1701, 1993
ALL	CALLA	Morishima et al., Bone Marrow Transplant., 11, 255, 1993
	CD19	Anderson et al., Blood, 80, 84, 1993
	Nehodgkinský lymfom	Okazaki et al., Blood, 80, 84, 1993

Humanizace myších protilátek a příprava a optimalizace genů pro Fab a rekombinantní fragmenty Fv se provádějí analogicky se způsoby, které již byly popsány pro přípravu rekombinantních fragmentů Fv (viz část 2). Rekombinantní fragmenty Fv se fúzují s geny pro cytostatické, cytotoxické nebo zánět vyvolávající proteiny nebo enzymy v souladu se stavem techniky, který je odborníkům znám.

Strukturální geny pro fúzní proteiny mezi ligandy vázajícími cílovou buňku a cytostatickými a cytotoxickými proteiny:

Tyto zahrnují všechny látky, které se váží na membránové struktury nebo membránové receptory na endotelových buňkách. Například zahrnují IL-1 nebo růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, které se váží na receptory, které jsou exprimovány endotelovými

• ··	··	····	99
·· · ·	• ·	•	9 9	•	9
• · ·	• ·	«	9 9	99
• *··	• · ·	•	9 9 ··	9	9
• ·	• ·	• ·	•	9	9
K· ··	··	4·		99

buňkami, jako je PDGF, bFGF, VEGF a Τ6Εβ (Pusztain et al., J. Pathol., 169, 191, 1993).

- Dále zahrnují adhezivní molekuly, které se váží na aktivované a/nebo proliferující endotelové buňky. Adhezivní molekuly této povahy, jako Síex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA4 nebo vitronektin, byly již popsány (přehledy autoři: Augustin-Voss et al., J. Cell Biol., 119, 483, 1992, Pauli et al., Cancer Metast. Rev., 9, 175, 1990, Honn et al.,

Cancer Metast. Rev., 11, 353, 1992 a Varner et al., Cell

Adh. Commun., 3, 367, 1995).

- Dále zahrnují látky, které se váží na membránové struktury nebo membránové receptory nádorových buněk nebo leukemických buněk. Například zahrnují růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, které se váží na receptory, které jsou exprimovány leukemickými nebo nádorovými buňkami.

Růstové faktory této povahy již byly popsány (přehledy autorů: Cross et al., Cell, 64, 271, 1991, Aulitzky et al.,

Drugs, 48, 667, 1994, Moore, Clin. Cancer Res., 1, 3, 1995 a Van Kooten et al., Leuk. Lymph., 12, 27, 1993.

- Geny pro tyto ligandy, které se váží na cílovou buňku jsou fúzovány s geny pro cytostatické, cytotoxické nebo zánět vyvolávající proteiny nebo enzymy v souladu se stavem techniky za použití metod, které jsou odborníkovi známy.

- Strukturální geny pro induktory zánětů, například pro:

- RANTES (MCP-2)

- monocytární chemotaktický a aktivační faktor (MCAF)

- IL-8

- makrofágový zánětlivý protein 1 (ΜΙΡ-Ια, -β)

- neutrofilový aktivační protein 2 (NAP-2)

- IL-3

IL-5 • · · · • ·

- lidský leukemický inhibiční faktor (Lir)

-IL-7

-IL-11

-IL-13

- GM-CSF

-G-CSF

-M-CSF

- faktor kobřího jedu (CVF) nebo částečné sekvence CVF, které funkčně odpovídají lidskému komplementovému faktoru C3b, tj., které jsou schopny se vázat ke komplementovému faktoru B a které tvoří konvertázu C3 po štěpení faktorem D

- lidský komplementový faktor 03 nebo jeho částečná sekvence C3b

- štěpné produkty lidského komplementového faktoru C3, které jsou funkčně a strukturálně podobné CVF

- bakteriální proteiny, které aktivují komplement nebo vyvolávají záněty, jako jsou poriny Salmonella typhimurium, srážlivé faktory Staphylococcus aureus, moduliny, zejména z gramnegativních bakterií, hlavní vnější membránový protein legionel nebo Haemophilus influenzae typu B nebo klebsiel, nebo M molekuly streptokoků skupiny G.

Strukturální geny pro enzymy pro aktivaci prekurzorů cytostatických agens, například pro enzymy, které štěpí inaktivní prekurzorové látky (předléky), a tím tvoří aktivní cytostatické přípravky (léky).

Látky této povahy a předléky a léky, ke kterým jsou připojeny v jednotlivých případech, již byly uvedeny v přehledech autorů: Deonarain et al., (Br. J. Cancer, 70, 786, 1994), Mullen (Pharmac. Ther., 63, 199, 1994) a Harris et al., (Gene Ther., 1, 170, 1994). Lze použít například sekvence DNA pro jakýkoliv enzym z následujícíh:

- thymidinkináza viru herpes simplex

- thymidinkináza viru varicella zoster

- bakteriální nitroreduktáza

- bakteriální β-glukuronidáza

- rostlinná β-glukuronidáza ze Secale cereale

- lidská β-glukuronidáza

- lidská karboxypeptidáza (CB), například

CB-A mastocytů pankreatická CB-B bakteriální karboxypeptidáza bakteriální β-laktamáza bakteriální cytosindeamináza lidská kataláza nebo peroxidáza fosfatáza, zejména lidská alkalická fosfatáza lidská kyselá prostatická fosfatáza kyselá fosfatáza typu 5 oxidáza, zejména lidská lysyloxidáza lidská kyselá D-aminooxidáza

- peroxidáza, zejména lidská glutathionperoxidáza lidská eosinofilní peroxidáza lidská thyroidní peroxidáza

- β-galaktosidáza

b) Léčba autoimunitních nemocí a zánětů

- Cílové buňky:

- proliferující endotelové buňky nebo

- makrofágy a/nebo lymfocyty nebo

- synoviální buňky ·· · · ···· · · ·· • ·· · ···· •·· · · · · · ···· · • ···· ···

- promotory:

- specifické pro endotelové buňky a specifické pro fázi buněčného cyklu nebo specifické pro makrofágy a/nebo specifické pro lymfocyty a/nebo specifické pro fázi buněčného cyklu

- specifické pro synoviální buňky a/nebo specifické pro fázi buněčného cyklu

- Strukturální geny pro léčbu alergií, například pro:

- IFN-β

- IFN-γ

-IL-10

- protilátky nebo protilátkové fragmenty proti IL-4

- rozpustné receptory IL-4

-IL-12

-ΤΟΕβ

- Strukturální geny pro prevenci rejekce transplantovaných orgánů, například pro:

-IL-10

- TGF3

- rozpustné receptory IL-1

- rozpustné receptory IL-2

- antagonisté receptoru IL-1

- rozpustné receptory IL-6 imunosupresivní protilátky nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_L nebo jejich fragmenty V_H a V_L, které jsou spojeny prostřednictvím spojky, která je připravena například v souladu s metodou popsanou Marasco et al., (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 7889, 1993). Příklady imunosupresivních protilátek jsou protilátky:

- které jsou specifické pro T buněčný receptor nebo jeho komplex CD3

- které jsou namířeny proti CD4 nebo CD8, a dále

- které jsou namířeny proti receptoru IL-2, receptoru

IL-1 nebo receptoru IL-4, nebo

- které jsou namířeny proti adhezivním molekulám CD2, LFA-l, CD23 nebo CD40.

-Strukturální geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných protilátkami, například pro:

- TFGp

- IFN-a

- IFN-β

- IFN-γ

- IL-12

- rozpustné receptory IL-4

- rozpustné receptory IL-6

- imunosupresivní protilátky nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_L

-Strukturální geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných buňkami, například:

-IL-6

-IL-9

-IL-10

-IL-13

-TNFa

-IL-4

- TNFP

- imunosupresivní protilátka nebo její fragmenty obsahující V_H a V_L

Strukturální geny pro inhibitory buněčné proliferace, cytostatické nebo cytotoxické proteiny a enzymy pro aktivaci prekurzorů cytostatických přípravků.

Příklady genů kódujících proteiny této povahy již byly uvedeny v části nazvané „Strukturální geny pro léčbu nádorů”.

• · · · • · • · · · · · ···· • ····« · · · ···· · • · · · · · · · · ·««·· ♦· · · · · · ·

Ve smyslu vynálezu mohou být použity, ve stejné formě jak již bylo v příslušném bodě popsáno, strukturální geny, které kóduji fúzní proteiny, které obsahují protilátky nebo fragmenty Fab nebo rekombinantní fragmenty Fv těchto protilátek nebo jiných ligandů, které jsou specifické pro cílovou buňku, a výše zmíněné cytokiny, růstové faktory, receptory, cytostatické nebo cytotoxické proteiny a enzymy.

- Strukturální geny pro léčbu artritidy

Ve smyslu vynálezu jsou vybrány strukturální geny, jejichž exprimovaný protein přímo nebo nepřímo inhibuje zánět, například v kloubu, a/nebo podporuje rekonstituci mezibuněčné hmoty (chrupavky a vazivové tkáně) v kloubu.

Příklady těchto proteinů jsou:

- antagonista receptoru IL-1 (IL-l-RA)

IL-l-RA inhibuje vazbu IL-Ια a IL-Ιβ

- rozpustný receptor IL-1 rozpustný receptor IL-1 váže a inaktivuje IL-1

- IL-6

IL-6 zvyšuje sekreci TIMP a superoxidů a snižuje sekreci IL-1 a TNFa synoviálními buňkami a chondrocyty

- rozpustný receptor TNF rozpustný receptor TNF váže a inaktivuje TNF

- IL-4

IL-4 inhibuje tvorbu a sekreci IL-1, TNFa a MMP

- IL-10

IL-10 inhibuje tvorbu a sekreci IL-1, TNFa a MMP a zvyšuje sekreci TIMP

- růstový faktor podobný inzulínu (IGF-1)

IGF-1 stimuluje syntézu mezibuněčné hmoty

- ΤΰΓβ,, zejména ΤΰΡβί a τσΡβ2

ΤΘΡβ stimuluje syntézu mezibuněčné hmoty • · · · ♦ · • · • ····· · ·· ··· · · • · · · * · · · · • · · · · ·· »v · · ··

- superoxiddismutáza

- TIMP (tkáňové inhibitory metaloproteináz), zejména

TIMP-1

TIMP-2

TIMP-3

c) Léčba nedostatečné hematopoézy

- Cílové buňky:

- proliferující nezralé buňky hematopoetického systému nebo

- buňky stromatu, které jsou lokalizovány v sousedství hematopoetických buněk

- Promotory:

- specifické pro hematopoetické buňky a/nebo specifické pro fázi buněčného cyklu

- buněčně nespecifické

- Strukturální geny pro léčbu anémie, například pro:

- erytropoetin

- Strukturální geny pro léčbu leukopenie, například pro:

- G-CSF

- GM-CSF

Strukturální geny pro léčbu trombocytopenie, například pro:

- IL-3

- leukemický inhibiční faktor (LIF)

- IL-11

- trombopoetin

d) Léčba poškození nervového systému:

- Cílové buňky:

- gliové buňky nebo

- proliferující endotelové buňky « · · · • · ··· « · · ···· • ··· 9 9 9 · ♦ ··· 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 99

- Promotory:

- specifické pro gliové buňky nebo

- specifické pro endotelové buňky a specifické pro fázi buněčného cyklu nebo

- nespecifické a specifické pro fázi buněčného cyklu

Strukturální geny pro neuronové růstové faktory, například:

- FGF

- nervový růstový faktor (NGF)

- neurotrofický faktor pocházející z mozku (BDBF)

- neurotrofin-3 (NT-3)

- neurotrofin-4 (NT-4)

- ciliární neurotrofický faktor (CNTF)

- Strukturální geny pro enzymy, například pro:

- tyrosinhydroxylázu

- dopadekarboxylázu

- Strukturální geny pro cytokiny a jejich inhibitory, které inhibují nebo neutralizují neurotoxický účinek TNFa, například pro:

- TGFP

- rozpustné receptory TNF receptory TNF neutralizují TNFa.

- IL-10

IL-10 inhibuje tvorbu IFNy, TNFa, IL-2 a IL-4

- rozpustné receptory IL-1

- IL-1 receptor I

- IL-1 receptor II rozpustné receptory IL-1 neutralizují aktivitu IL-1

- antagonista receptoru IL-1

- rozpustné receptory IL-6

e) Léčba poruch krevního koagulačního systému a krevního oběhu

- Cílové buňky:

- endotelové buňky nebo

- proliferující endotelové buňky nebo

- somatické buňky v sousedství endotelových buněk a buněk hladkého svalstva nebo

- makrofágy

- Promotory:

- buněčně nespecifické nebo

- buněčně nespecifické a specifické pro fázi buněčného cyklu nebo specifické pro endotelové buňky, buňky hladkého svalstva nebo makrofágy nebo specifické pro endotelové buňky, buňky hladkého svalstva nebo makrofágy a specifické pro fázi buněčného cyklu

-Strukturální geny pro inhibici koagulace nebo pro podporu fibrinolýzy, například pro:

- aktivátor tkáňového plazminogenu (tPA)

- aktivátor plazminogenu urokinázového typu (uPA)

- hybridy tPA a uPA

- protein C

- hirudin

- inhibitory serinové proteázy (serpiny), jako je inhibitor C-1S αΐ-antitrypsin antitrombin III

- inhibitor dráhy tkáňového faktoru (TFPI)

- Strukturální geny pro podporu koagulace, například pro:

- F VIII

F IX

- von Willebrandův faktor

- F XIII

- PAI-1

- PAI-2

- Strukturální geny pro angiogenní faktory, například pro:

- VEGF

- FGF

-Strukturální geny pro snížení krevního tlaku, například pro:

- kalikrein

- syntézu oxidu dusnatého endotelových buněk

- Strukturální geny pro inhibici proliferace buněk hladkého svalstva následující po poranění vrstvy endotelu, například pro:

antiproliferačni, cytostatický nebo cycotoxický protein nebo pro enzym pro štěpeni prekurzorů cytostatických přípravků, a tím tvořící cytostatické přípravky, jak již bylo uvedeno výše (pod nádory), a fúzní proteiny těchto aktivních sloučenin spolu s protilátkami nebo fragmenty protilátek, které jsou specifické pro svalové buňky.

Strukturální geny pro další proteiny krevní plazmy, například pro:

- albumin

- inaktivátor Cl

- sérovou cholinesterázu

- transferin

- al-antitrypsin

f) Léčba nemocí metabolismu a genetických poruch

- Cílové buňky:

- endotelové buňky

- svalové buňky ····* · · · · · · · · • · · · · · · · ·· ♦· ·· ·· ··

- jaterní buňky

- buňky bronchiálního epitelu

- buňky stromatu nebo

- makrofágy

- Promotory:

- nespecifické pro cílovou buňku nebo

- specifické pro cílovou buňku

- Strukturální geny, například pro:

transmembránový regulátor vodivosti (CFTCR) ve spojení s cystickou fibrózou

- gen Fanconiho anémie

- syntetáza uroporfyrinogenu III

- iduronát-2-sulfatáza (mukopolysacharidóza typu II)

- β-glukuronidáza (mukopolysacharidóza VIII)

- glukocerebrosidáza (Gaucherova nemoc)

- fenylalaninhydroxyláza

- dystrofin (svalová dystrofie Duchennova typu)

- receptor inzulínu

- lidský růstový hormon

- protein spojený se surfaktantem SP-A a SP-B

- receptor LDL

- protein upravující mRNA apolipoproteinu B

- adenosindeamináza

g) Inokulace

- Cílové buňky:

- svalové buňky nebo

- makrofágy

- Promotory:

- nespecifické pro cílovou buňku nebo

- specifické pro cílovou buňku nebo

- specifické pro cílovou buňku a specifické pro fázi buněčného cyklu

- Strukturální geny pro profylaxi infekčních nemocí: Možnosti přípravy účinných vakcín obvyklým způsobem jsou omezeny (Brown, Int. J. Technol. Assessm. Health Care, 10, 161, 1994, Ellis, Adv. Exp. Med. Biol., 327, 263, 1992,

Arnon et al., FASEB J., 6, 3265, 1992).

Proto tedy byla vyvinuta technologie DNA vakcín. Avšak tyto DNA vakcíny vyvolávají otázky s ohledem na sílu jejich účinnosti (Fynnan et al., Int. J. Immunopharm., 17, 79,

1995, Donelly et al., Immunol., 2, 20, 1994).

Samozesilující expresní systém podle tohoto vynálezu zvyšuje účinnost DNA vakcín.

DNA, která má být vybrána jako aktivní látka, je DNA pro protein, který je tvořen infekčním agens a který prostřednictvím vyvolání imunitní reakce, tj . pomocí vazby protilátky a/nebo prostřednictvím cytotoxických lymfocytů T, vede k neutralizaci a/nebo destrukci agens. Takzvané neutralizační antigeny této povahy jsou již používány jako vakcinační antigeny (viz přehled v Ellis, Adv. Exp. Med. Biol., 327, 263, 1992). Následující studie poskytují příklady sekvencí DNA, které kódují neutralizační antigeny:

- antigen chřipky A (Ulmer et al., Science, 259, 1745, 1993, Robinson et al., Vaccine, 11, 957, 1993, Fynan et al., Int. J.

Immunopharmac., 17, 79, 1995)

- antigeny HIV (Wang et al., PNAS USA, 90, 4156, 1993)

- antigen viru rabies (Donelly et al., Immunol., 2/1, 20, 1994)

- antigen HSV (virus herpes simplex) (Fleckenstein et al., Nátuře, 274, 57, 1978)

- antigen RSV (respirační syncyciální virus) e ····♦ · · · ···· · • · · · * · ··· ····» ♦· ·· * · ·· (Du et al., Bio/Tech., 12, 813, 1994, Halí, Science,

265, 1393, 1993)

- antigen viru parainfluenzy (Du et al., Bio/Tech., 12, 813, 1994)

- antigen rotaviru (Albert et al., J. Clin. Microbiol·., 25, 183, 1987, Anderson et al., J. Infect. Dis., 153, 823, 1986, Battaglia et al., J. Infect. Dis., 155, 140, 1987, Chanosk et al., J. Infect. Dis., 148, 49, 1983, DyallSmith et al., J. Virol., 38, 1099, 1981, Glass et al., Science, 265, 1389, 1994)

- antigen VZV (virus varicella zoster) (Straus et al., Ann. Intern. Med., 109, 438, 1988, Gershon, Pediatr. Infect. Dis., 2, 171, 1991, Kinchington et al., J. Virol., 64, 4540, 1990)

- antigen CMV (cytomegalovirus) (Plotkin, Science, 265, 1383, 1994)

- antigen viru spalniček (Katz a Kellin, Science, 265, 1391, 1994)

- antigen HPV (lidský papilomavirus) (Tindl a Frazer, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 186, 217, 1994)

- antigen HBV (virus hepatitidy B) (Valenzuela et al., Nátuře, 280, 815, 1979, Heerman et al., J. Virol., 52, 396, 1984)

- antigen HCV (virus hepatitidy C) (Cerny et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 189, 169, 1994, Esteban et al., Progr. Liver Dis., 10, 253, 1992, Jung et al., Eur. J. Clin. Invest., 24, 641, 1994)

- antigen HDV (virus hepatitidy D) (Iwarson, Scand. J. Infect. Dis., 24, 129, 1992,

Consolo et al., Nephron, 61, 251, 1992)

- antigen HEV (virus hepatitidy E) (Iwarson, Scand. J. Infect. Dis., 24, 129, 1992,

Consolo et al., Nephron, 61, 251, 1992)

- antigen HAV (virus hepatitidy A) (ďHondt, Vaccine, 10, 48, 1992, André, J. Infect. Dis., 171, 33, 1995, Lemon et al., Vaccine, 10, 40, 1992, Melnick et al., Vaccine, 10, 24, 1992, Flehming,

Baillieres Clin.

Gastroenterol., 4, 707, 1990) antigen vibria cholery

Kaper, antigen borrelie burgdorferi et al., Immunol. Letuers,

36, 219, 1993,

Wallich et al., Lab. Med., 17, 669, antigen Helicobacteru pylori

1991, Blaser, J.

Infect. Dis., 161,

626, 1990, Cover

Blaser, J. Biol.

Chem., 267, 10570,

1993,

Cover et al.,

Infect.

Immunol. , 58 , 603,

1990,

Dunn

265, 9464, 1990, Dunn et al.,

Infect.

Immunol., 60,

1946, 1992, Lage et al.,

Acta

Gastroenterol. Belg., 56 (suppl.), 61, 1993, Mobley et al., Scand. J.

- antigen malárie (Nussenzweig a Long, Science, 265, 1381, 1994, Maurice, Science, 267, 320, 1995, Enders et al., Vaccine, 10, 920, 1992, Knapp et al., Infect. Imm., 60, 2397, 1992).

Avšak ve smyslu vynálezu aktivní látky této povahy zahrnují také DNA pro anti-idiotypovou protilátku nebo její fragmenty vázající antigen, jejichž struktury vázající antigen (komplementaritu určující oblasti) struktury nebo sacharidové antigenů infekčního agens.

Anti-idiotypové zejména sacharidové infekčních agens.

Anti-idiotypové produkty byly uvedeny (J. Immunother., 14, (Springer Seminars in

- Strukturální geny pro Tyto zahrnují antigeny na nádorových buňkách, povahy byly uvedeny například v et al., Contrib. to Oncol., 32, tvoří kopie proteinové neutralizačního struktury protilátky antigeny této této povahy případě mohou nahradit bakteriálních povahy a jejich štěpné

Hawkins et al., protilátky v přehledech autorů:

273, 1993) a Westerink a Apicella

Immunopathol., 15, 227, 1993).

„nádorové vakcíny

Antigeny této přehledech autorů: Sedlaček Karger Verlag, Municn, 1988, Verlag, Munich, a Contrib. to Oncol., 43, Karger

Další příklady jsou tvořeny geny pro antigeny nebo pro anti-idiotypové protilátky následujícím antigenům:

1992.

následuj ící odpovídáj ící

- sialyl Lewis

- peptidy na nádorech, které jsou rozpoznávány T buňkami exprimované onkogeny krevních skupin a jejich prekurzory na polymorfním epitelovém mucinu a dalších

- proteiny

- antigeny

- antigeny mucinech spojených s nádory

- antigeny na proteinech tepelného šoku

- gangliosidy

h) Léčba chronických infekčních nemocí

- Cílová buňka:

- jaterní buňka

- lymfocyt a/nebo makrofág

- epitelová buňka

- endotelová buňka

- Promotory:

- specifické pro určitý virus

- specifické pro určitou buňku specifické pro určitý virus nebo specifické pro určitou buňku a specifické pro fázi buněčného cyklu

- Strukturální geny například pro:

- protein, který projevuje cytostatické nebo cytotoxické účinky. (Příklady cytotoxických nebo cytóstatických proteinů již byly uvedeny v části nazvané Léčba nádorů).

- enzym, (v tomto ohledu viz část nazvanou Léčba nádorů), který štěpí prekurzor antivirové nebo cytotoxické látky, a tím tvoří aktivní látku.

- Strukturální geny pro antivirové proteiny

- cytokiny a růstové faktory mající antivirovou aktivitu. Jejich příklady jsou:

IFN-a

IFN-β

IFN-v

ΤΝΤβ

TNFa

IL-1 τσρβ

- protilátka mající specifitu, která inaktivuje příslušný virus nebo její fragmenty obsahující V_H a V_L, nebo její fragmenty V_H a V_L, které jsou spojeny prostřednictvím spojky, kteréžto fragmenty mohou být připraveny, jak již bylo popsáno v části 2).

Příklady protilátek proti virovým antigenům jsou:

anti-HBV anti-HCV anti-HSV anti-HPV anti-HIV anti-EBV anti-HTLV anti-Coxsackie virus anti-Hantaan virus

- protein vázající rev. Tyto proteiny se váží k rev RNA a inhibují kroky následující po transkripci závislé na rev v expresi retrovírálních genů. Příklady proteinů vázajících rev jsou:

RBP9-27

RBP1-8U

RBP1-8D pseudogeny RBP1-8

- pro ribozymy, které štěpí mRNA genů pro proteiny, které řídí buněčný cyklus, nebo mRNA virů. Ribozymy, které jsou katalytické pro HIV byly uvedeny v přehledech, například Christoffersen et al., J. Med. Chem., 38, 2033, 1995.

- Strukturální geny pro antibakteriální proteiny

Příklady antibakteriálních proteinů jsou protilátky, které neutralizují bakteriální toxiny nebo které opsonizují baktérie. Příklady těchto protilátek jsou protilátky proti

- meningokokům C nebo B

- E. coli

- Borreliím

- Pseudomonas

- Helicobacter pylori

- Staphylococcus aureus

7) Kombinace totožných nebo odlišných strukturálních genů

Vynález se dále týká samozesílení, kde příslušný farmakologicky regulovatelný expresní systém, ve kterém jsou spojeny sekvence DNA dvou totožných nebo dvou odlišných strukturálních genů (složky c) a c'j ) . Za účelem exprese dvou sekvencí DNA je jako regulační prvek mezi dva strukturální geny výhodně vložena cDNA vnitřního ribozomálního vstupního místa (IRES).

Příklady sekvencí IRES této povahy již byly popsány v části C5).

Ve smyslu vynálezu, jsou dále uvedeny příklady výhodných kombinací strukturálních genů pro

- léčbu nádorů

- odlišné antiproliferační, cytostatické, cytotoxické, zánět vyvolávající proteiny nebo

- totožné enzymy pro štěpení prekurzoru cytostatického přípravku

- léčbu autoímunítních nemocí

- odlišné cytokiny nebo receptory mající synergický účinek pro inhibici buněčné a/nebo humorální imunitní reakce nebo

- odlišné nebo totožné TIMP

- léčbu nedostatečné hematopoezy

- odlišné, hierarchicky následující cytokiny, jako IL-

1, IL-3, IL-6 nebo GM-CSF a erytropoetin, G-CSF nebo trombopoetin

- léčbu poškození nervové buňky

- nervový růstový faktor a cytokin nebo inhibitor cytokinů léčbu poruch krevního koagulačního systému a krevního oběhu

antitrombotické agens a fibrinolytické agens (tPA nebo uPA) nebo antiproliferační, cytostatický nebo protein (nebo enzym) a antitrombotické fibrinolytické agens vakcinace cytotoxický agens nebo

- antigen a cytokin stimulující

- IL-la imunitu, jako je

- IL-Ιβ

- IL-2

GM-CSF

IL-3 nebo

- receptor IL-4

- různé antigeny jednoho infekčního infekčních agens nebo jednoho nádorového nádorových typů

- léčbu virových infekčních

- antivirový protein protein nemocí agens typu a cytostatický protilátky proti jednoho viru nebo několika virů léčbu bakteriálních infekčních nebo nebo nebo odlišným povrchovým nemocí odlišných odlišných cytotoxický antigenům

- protilátky proti odlišným toxinům organismu povrchovým antigenům a/nebo

8) Vloženi signálních sekvencí a transmembránových domén

Aby se usnadnila sekrece expresního produktu strukturálního genu, může být nahrazena homologní signální sekvence, která je přítomná v sekvenci DNA strukturálního genu, heterologní signální sekvencí, která zlepšuje extracelulární sekreci.

Tedy například může být vložena signální sekvence pro imunoglobulin (pozice DNA < 63 až > 107, Riechman et al., Nátuře, 332, 323, 1988) nebo signální sekvence pro CEA (pozice DNA < 33 až > 134, Schrewe et al., Mol. Cell Biol., 10, 2738, 1990, Berling et al., Cancer Res., 50, 6534, 1990) nebo signální sekvence glykoproteinu lidského respiračního syncyciálního viru (cDNA pro aminokyseliny < 38 až > 50 nebo 48 až 65, Lichtenstein et al., J. Gen. Virol., 77, 109, 1996) .

- Alternativně nebo kromě signální sekvence může být vložena sekvence pro transmembránovou doménu, aby se ukotvila aktivní sloučenina v buněčné membráně transdukované buňky, která tvoří aktivní sloučeninu.

Tedy například mezi promotorovou sekvenci a sekvenci strukturálního genu může být vložena transmembránové sekvence lidského faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (pozice DNA < 1485 až > 1554, Cosman et al., Behring Inst. Mitt., 83, 15, 1988) nebo sekvence DNA pro signální a transmembránové oblasti glykoproteinu G lidského respiračního syncyciálního viru (RSV) (aminokyseliny 1 až 63 nebo jejich částečná sekvence, aminokyseliny 38 až 63, Vijaya et al., Mol. Cell Biol., 8, 1709, 1988, Lichtenstein et al., J. Gen. Virol·., 77, 109, 1996) nebo sekvence DNA pro signální a transmembránové oblasti neuraminidázy viru chřipky (aminokyseliny 7 až 35 nebo částečná sekvence aminokyseliny 7 až 27, Brown et al., J. Virol., 62, 3824, 1988) .

- Aby se zesílila translace, může být vložena nukleotidová sekvence GCCACC nebo GCCGCC například na 3' konec promotorové sekvence a přímo na 5' konec startovacího signálu (ATG) • · 9 9· · signální sekvence nebo transmembránové sekvence (Kozák, J. Cell Biol., 108, 209, 1989).

- Avšak nukleotidová sekvence pro glykofosfolipidovou kotvu může být také vložena za účelem ukotvení aktivní sloučeniny do buněčné membrány transdukovaných buněk, které tvoří aktivní sloučeninu.

Glykofosfolipidová kotva je vložena na 3' konec nukleotidové sekvence pro strukturální gen tak, že toto vložení může být provedeno navíc kromě vložení signální sekvence.

Glykofosfolipidové kotvy byly popsány například pro CEA (pozice DNA < 893 až > 1079, Berling et al., Cancer Res., 50, 6534, 1990), pro N-CxAM (Cunningham et al., Science, 236, 799, 1987) a pro další membránové proteiny, jako je Thy-1 (Clissold, Biochem. J. , 281, 129, 1992) nebo CD16 (Selvaray et al., Nátuře, 333, 565, 1988).

Ferguson et al., (Ann. Rev. Biochem., 57, 285, 1988) publikoval přehled membránových proteinů ukotvených glykofosfolipidem.

- Další možností pro ukotvení aktivní sloučeniny v buněčné membráně v souladu s předkládaným vynálezem je použití sekvence DNA pro fúzní protein ligand/aktivní sloučenina. Specifita ligandů tohoto fůzního proteinu je namířena proti membránové struktuře na buněčné membráně vybrané cílové buňky.

Příklady ligandů, které se váží na povrch buněk, jsou protilátky nebo protilátkové fragmenty, které jsou namířeny proti povrchovým strukturám, například:

- endotelových buněk, zejména včetně protilátek proti receptorům VEGF

- nebo svalových buněk, jako

- protilátky proti aktinu nebo ·< ··«·

- protilátky proti receptorům angiotenzinu II nebo

- protilátky proti receptorům pro růstové faktory, jako proti receptorům EGF nebo proti receptorům PDGF nebo proti receptorům FGF nebo protilátky proti receptorům endotelinu A

Myši monoklonální protilátky se výhodně používají v humanizované formě. Fragmenty Fab a rekombinantní fragmenty Fv a jejich fúzni produkty se připravují jak již bylo popsáno výše.

Ligandy dále zahrnují všechny aktivní sloučeniny, jako jsou cytokiny nebo adhezivni molekuly, růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, nebo mediátory, které se vážou na membránové struktury nebo membránové receptory na vybraných konkrétních buňkách. Příklady těchto ligandů jsou ligandy pro endotelové buňky, jako je IL-1, PDGF, bFGF, VEGF, TGG3 (Pusztain et al., J. Patnol., 169, 191, 1993) nebo kinin, a deriváty nebo analogy kininu. Ligandy dále zahrnují adhezivni molekuly. Adhezivni molekuly této povahy, jako je Slex, LFA-1, MAC-1, LeCAM-1, VLA-4 nebo vitronektin a deriváty nebo analogy vitronektinu, již byly popsány pro endotelové buňky (přehledy Augustin-Voss et al·., J. Cell Biol., 119, 483, 1992, Pauli et al., Cancer Metast. Rev., 9, 175, 1990, Honn et al., Cancer Metast. Rev., 11, 353, 1992,

Varner et al., Cell Adh. Commun., 3, 367, 1995).

Ligandy také zahrnuji protilátky nebo jejich fragmenty, které jsou namířeny proti nádorově specifickým nebo s nádorem spojeným antigenům na buněčné membráně nádorových buněk. Protilátky této povahy již byly popsány v části C6a).

Vynález se také týká přípravku, který obsahuje nový konstrukt nukleové kyseliny a spojovací látku j), která má vazebné místo pro protein A složky f) a pro protein B složky

h) . Spojovací látka j) je výhodně farmaceutický přípravek, konkrétně látka, která může pronikat skrz buněčnou membránu a do buňky, zejména rapamycin, FK506, cyklosporin A, metotrexát, kyselina listová, kyselina retinová, penicilín, 4-hydroxytamoxifen, tamoxifen nebo tetracyklin nebo konjugát tetracyklin/isopropyl-p-D-thiogalaktosidu.

Předkládaný vynález se také týká buněk, zejména buněk kvasinek nukleové nebo savčích buněk, kyseliny, a způsobu ve kterém jsou jednotlivé kyseliny, navzájem.

Předkládaný vynález se také konstruktu nukleové kyseliny pro transdermální, lokální, např.

které obsahují nový konstrukt přípravy konstruktu nukleové složky spojeny k sobě týká použití nového přípravu léčiva pro nazálni, perorální, gastrointestinálni, intrabronchiálni, intravezikulární, intravaginální, intrauterinní, subkutánní, int rámus kulám!, intradermální, periartikulární nebo intraartikulární podávání, pro podávání do mozkomíšního moku, do mozku, do jater, do ledvin, do střeva nebo do jazyku, nebo pro intraperitoneální, intrapleurální nebo systémové, např. intravenózní, intraarteriální, intraportální nebo intrakardiální, podávání pro profylaxi a/nebo léčbu nádorů, leukémií, autoimunitních nemocí, zánětů, poškození nervového systému, poruch krevního koagulačního systému a krevního oběhu, metabolických nemocí, genetického poškození, virových nebo bakteriálních infekčních nemocí a/nebo nedostatečné hematopoezy a/nebo pro vakcinaci proti virovým, bakteriálním nebo parazitárním infekcím a/nebo proti nádorům, a pro použití buňky v souladu s vynálezem pro přípravu léčiva pro lokální nebo systémové podávání pro profylaxi a/nebo léčbu nemocí.

Popis obrázků

Obr. i ukazuje schéma nového konstruktu nukleové kyseliny v jeho nejjednodušší formě.

Obr. 2 ukazuje schéma konstruktu nukleové kyseliny zobrazené na obr. 1 po doplněni genem kódujícím jaderný exportní signál (NES) a genem kódujícím jaderný exportní faktor (NEF).

Obr. 3 ukazuje schéma spojení složek c) a d) prostřednictvím IRES.

Obr. 4 ukazuje schéma, jak jednotlivé složky zobrazené na obr. 1 až 3 reagují.

Obr. 5 ukazuje schéma zvětšení konstruktu nukleové kyseliny o další strukturální geny.

Obr. 6 ukazuje schéma zvětšení konstruktu nukleové kyseliny o další geny pro proteinové transkripční faktory.

Obr. 7 ukazuje schéma konstruktu nukleové kyseliny zobrazené na obr. 3 po doplnění geny kódujícími NES a NEF.

Obr. 8 ukazuje schéma farmakologicky regulovatelného promotorového modulu v jeho nej jednodušší formě.

Obr. 9 ukazuje schéma, jak jednotlivé složky zobrazené na obr. 8 reagují.

Obr. 10 ukazuje schéma samozesilujícího farmakologicky regulovatelného expresního systému.

Obr. 11 ukazuje schéma nahrazení složek a) a b) složkou

i) a nahrazeni složky d) , spolu s oblasti IRES, farmakologicky regulovatelným promotorovým modulem obsahujícím složky e), f), g) a h).

Obr. 12 ukazuje schéma nahrazení složek b') farmakologicky regulovatelným promotorovým modulem obsahujícím složky e), f), g), h) a i).

• · · · • ·

Obr. 13 ukazuje schéma samozesilujiciho expresního systému s expresí β-glukuronidázy specifickou pro fázi buněčného cyklu a specifickou pro určitou buňku.

Obr. 14 a 15 ukazují schémata dvou expresních systémů, které nejsou samozesilující.

Obr. 16 ukazuje schéma samozesilujiciho farmakologicky regulovatelného expresního systému pro expresi βglukuronidázy, která je specifická pro fázi buněčného cyklu a farmakologicky regulovatelná.

Příklady provedeni vynálezu

Vynález je vysvětlen detailněji pomocí následujících příkladů

Příklad 1

Konstrukce samozesilujiciho expresního systému

Samozesilující expresní systém podle schématu zobrazeného na obr. 13 se připraví za účelem exprese βglukuronidázy způsobem specifickým pro fázi buněčného cyklu a určitou buňku.

Sekvence DNA jednotlivých složek jsou spojeny dohromady, ve směru 5' až 3', jak následuje:

- složka a):

- sekvence (nukleotidová sekvence: 5'-CGGACAACTGTTGAC CG-3') pro vazbu proteinu Gal4 (Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916, 1990)

- složka b):

- promotorové sekvence genu cdc25C (nukleové kyseliny: -290 až +121, Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995, ···· · ♦ · ···' ··· ·· · ···· • ····· · ·· ♦·· · • · ···· · · ····· ·· ·· ·· ··

Zwicker et al., Nucl. Acids Res., 23, 3822, 1995,

EMBO J., 14, 4514, 1995).

- složka c) :

- sekvence GCCACC (Kozák, J. Cell Biol., 108, 229,

1989)

- cDNA pro signální peptid imunoglobulinu (nukleotidová sekvence < 63 až > 107, Riechmann et al., Nátuře, 332,

323, 1988) cDNA pro lidskou β-glukuronidázu (nukleotidová sekvence < 93 až > 1982, Oshima et al., PNAS USA, 84,

685, 1987)

- složka a') :

- sekvence pro vazbu proteinu Gal4 (Chasman a Kornberg,

Mol. Cell Biol., 10, 2916, 1990)

- složka b') :

- promotorové sekvence genu receptoru VEGF (nukleové kyseliny -1195 až +>100, Morishita et al., J. Biol.

Chem., 270, 27948, 1995)

- složka d):

cDNA pro doménu vázající DNA proteinu Gal4 (aminokyseliny 1 až 147, Chasman a Kornberg, Mol. Cell

Biol., 10, 2916, 1990)

- cDNA pro jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126 až 132, PKKKRKV, Dingwall et al., TIBS, 16, 478, 1991)

- cDNA pro kyselou transaktivační doménu (TAD) VP16

HSV-1 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al.,

Genes Developm., 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin.

Gen. Developm., 5, 190, 1995).

Jednotlivé složky konstruktu jsou spojeny prostřednictvím vhodných restrikčnich míst, která jsou

současně vložena na konce různých prvků během amplifikace metodou PCR. Složky jsou spojeny za použiti enzymů, které jsou specifické pro restrikčni místa, a DNA ligáz, které jsou odborníkovi známy. Tyto enzymy mohou být získány komerčně.

Endotelové buňky z lidského pupečníku a fibroblasty (Wi-38), které jsou udržovány v tkáňové kultuře, jsou transfekovány popsaným plazmidem za použití metod známých odborníkovi (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995) a množství β-glukuronidázy, která je tvořena endotelovými buňkami, se měří za použití 4-metylumbelliferyl^glukuronidu jako substrátu.

Za účelem kontroly specifity pro fázi buněčného cyklu se synchronizují endotelové buňky v G0/G1 odstraněním methioninu na 48 hodin. Obsah DNA buněk se určí na FACS po obarvení Hoechstem 33258 (Hoechst Ag, Frankfurt) (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995).

Získaly se následující výsledky:

Není možné detekovat žádné zvýšeni β-glukuronidázy v transfekovaných fibroblastech při srovnání s netransfekovanými fibroblasty.

Transfekované endotelové buňky exprimují výrazně více β-glukuronidázy než exprimují netransfekované endotelové buňky.

Proliferující endotelové buňky (DNA > 2S) secernují výrazně více β-glukuronidázy než endotelové buňky, které jsou synchronizovány v G0/G1 (DNA = 2S).

Proto tedy samozesilující expresní systém, který byl popsán, vede k expresi strukturálního genu β-glukuronidázy, která je specifická pro určitou buňku a pro fázi buněčného cyklu.

• ·

Sila exprese způsobená novým samozesilujicim expresním systémem je nyní srovnána se silou způsobenou dvěma expresními systémy, které nejsou samozesilující. Tyto posledně zmíněné systémy jsou připraveny podle schémat zobrazených na obr. 14 a 15.

V tomto případě součásti složek b), b') a c) jsou totožné, jak již bylo popsáno pro schéma zobrazené na obr. 13.

Jednotlivé složky konstruktu jsou spojeny prostřednictvím vhodných restrikčních míst, která jsou vložena na konce různých prvků během amplifikace metodou PCR. Složky jsou spojeny za použiti enzymů, které jsou specifické pro restrikční místa, a DNA ligáz, které jsou odborníkům známy. Tyto enzymy mohou být získány komerčně.

Nukleotidový konstrukt, který byl připraven tímto způsobem, se klonuje do plazmidových vektorů pUC18/19 nebo vektorů odvozených z Bluescriptu.

Endotelové buňky z lidského pupečníku, které jsou udržovány ve tkáňové kultuře, jsou transfekovány popsanými plazmidy za použití způsobu odborníkovi známého (Lucibello et al·., EMBO J., 14, 132, 1995) a množství β-glukuronidázy, které se tvoří endotelovými buňkami, se měří za použití 4-methylumbeliferyl^-glukuronidu jako substrátu.

Získaly se následující výsledky:

Proliferující endotelové buňky, které jsou transfekovány plazmidem obsahujícím konstrukt nukleové kyseliny zobrazený na obr. 14 a 15, exprimují výrazně méně β-glukuronidázy než proliferující endotelové buňky, které jsou transfekovány plazmidem obsahujícím konstrukt nukleové kyseliny zobrazený na obr. 13.

• · • ·

Samozesilující expresní systém, který byl popsán, způsobuje výrazně zvýšenou expresi strukturálního genu β-glukuronidázy.

Příklad 2

Konstrukce samozesilujícího farmakologicky regulovatelného expresního systému

Samozesilující farmakologicky regulovatelný expresní systém, odpovídající struktuře ukázané ve schématu na obr. 11, se připraví pro farmakologicky regulovatelnou expresi β-glukuronidázy, která je specifická pro fázi buněčného cyklu, jak zobrazeno na obr. 16.

Sekvence DNA jednotlivých složek jsou spojeny dohromady ve směru 5' až 3', jak následuje:

- složka i):

- sekvence (nukleotidové sekvence: 5'-CGGACAACTGTTGACCG3') pro vazbu proteinu Gal4 (Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916, 1990)

- bazální promotor SV40 (nukleotidy: 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory)

- složka c):

sekvence GCCACC (Kozák, J. Cell Biol., 108, 229,

1989)

- cDNA pro signální peptid imunoglobulinu (nukleotidová sekvence < 63 až > 107, Riechmann et al., Nátuře, 332, 323, 1988) cDNA pro lidskou β-glukuronidázu (nukleotidová sekvence < 93 až > 1982, Oshima et al., PNAS USA, 84, 685, 1987)

- složka e):

- sekvence pro vazbu proteinu Gal (Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916, 1990)

- promotorové sekvence genu cdc25C (nukleotidy: -290 až + 121, Lucibello et al., EMBO J., 14,- 132, 1995, Zwicker et al., Nucl. Acids Res., 23, 3822, 1995, EMBO J., 14,

4514, 1995)

- složka f):

- cDNA pro aktivační doménu VP16 herpes viru (Greaves et al., J. Virol., 64, 2716, 1990, 65, 6705, 1991) cDNA pro rekombinantní anti-cyklosporin A Ev (A) (protein A)

- složka g):

- odpovídá složce e)

- složka h):

cDNA pro rekombinantní anti-cyklosporin A Fv (B) (protein B) cDNA pro doménu vázající DNA proteinu Gal4 (aminokyseliny 1 až 147, Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916, 1990)

- cDNA pro kyselou transaktivačni doménu (TAD) VP16 HSV-1 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al., Genes Developm., 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190, 1995).

Protilátky proti cyklosporinu A se připravují, jak popsáno Cacalano et al., (Mol. Immunol. 29, 107, 1992). Pro tento účel je cyklosporin A připojen k bovinnímu sérovému albuminu za použití kyseliny 4-benzoylbenzoové a UV světla.

• » · · • ·

Spojovací produkt se několikrát podává subkutánně myším kmene Balb/c. 14 dnů po poslední imunizaci se izolují buňky sleziny. mRNA se z těchto buněk extrahuje za použití extrakčni soupravy pro mRNA (Pharmacia, Freiburg). Poté se použije reverzní transkripce, aby se přepsala tato mRNA do cDNA, pomocí syntetické

99 9 9 99

9 9 99

9 9 · ·· 9 soupravy cDNA a náhodných hexaoligonukleotidů (Pharmacia, Freiburg). Tato cDNA slouží jako počáteční materiál pro amplifikaci variabilního těžkého řetězce nebo variabilního lehkého řetězce imunoglobulinů prostřednictvím polymerázové řetězové reakce (Saiki et al., Science, 230, 1350, 1985) za použití specifických primerů (Clackson et al., Nátuře, 352, 624, 1991, Sastry et al., PNAS USA, 86, 5728, 1989, Ward et al., Nátuře, 341, 544, 1989, Orlandi et al., PNAS USA, 86, 3833, 1989).

Primery se používají k tomu, že ve stejnou dobu vnesou restrikční štěpná místa pro klonování fragmentů do bakteriálního expresního vektoru pHENIS (který je odvozen z pHENl, Hogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19, 4133, 1991, viz obr. 1) . Tento vektor obsahuje signální sekvenci pelB pro periplazmatickou sekreci, značku myc pro detekci monoklonální protilátkou 9E10, histidinovou značku pro purifikaci prostřednictvím afinitni chromatografie s zmobilizovaným. kovem (IMAC), a také klonovací oblast pro těžký řetězec a lehký řetězec a krátkou sekvenci, která kóduje spojku glycin-serin dlouhou 14 aminokyselin. Fúze s proteinem genu 3 (g3P) se také provádí za účelem prezentace na povrchu bakteriofágů. Těžké a lehké řetězce jsou štěpeny příslušnými restrikčními enzymy (VH s enzymy Sfil a Shol, VL s ApaLI a Notl) a následně klonovány do vektoru. Toto ústí v rekombinantní jednořetězcový fragment Fv obsahující variabilní těžký řetězec a variabilní lehký řetězec, které • ··· · · · · · ··· · · • · · · · · · · · • · · « · ·· · · ·· ·· jsou kovalentně spojeny prostřednictvím krátké peptidové sekvence.

Ve shodě s fágovou expozicí protilátkových fragmentů jsou domény vázající antigen klonovány ve formě fragmentů scFv (McCafferty et al., Nátuře, 348, 552, 1990) jako fúzní proteiny s obalovým proteinem g3P vláknitého bakteriofága do fagemidových vektorů (Breitling et al., Gene, 104, 147, 1994). Fágy vázající antigen se selektují v plastických nádobách povlečených cyklosporinem A (tzv. rýžování) (Marks et al., J. Mol. Biol., 222, 581, 1991).

Fágy, které se váží na cyklosporin A, se klonují a rozmnožují, a poté ještě jednou selektují v plastických nádobách povlečených cyklosporinem A. Poté, co se selektují čtyřikrát, se vyberou dva klony (proteiny A a Β), které neinhibují vzájemnou vazbu toho druhého na cyklosporin A.

Myší rekombinantní fragmenty Fv (proteiny A a B) se humanizují specifickým nahrazením hypervariabilních oblastí lidských protilátek odpovídajícími oblastmi těchto myších rekombinantních fragmentů Fv (Jones et al., Nátuře, 321, 522, 1987).

Konstrukt je spojen prostřednictvím vhodných restrikčních míst, která jsou zavedena na konce odlišných prvků během amplifikace metodou PCR. Spojování se provádí za použití enzymů, které jsou specifické pro restrikční místa, a DNA ligáz, které jsou odborníkům známy. Tyto enzymy lze získat komerčně.

Endotelové buňky z lidského pupečníku, které jsou udržovány v tkáňové kultuře, jsou transfekovány popsaným plazmidem za použití metod známých odborníkovi (Lucibello et ·

• · al., EMBO J., 14, 132, 1995) a množství β-glukuronidázy, která je tvořena endotelovými buňkami při přidání a bez přidání cyklosporinu A (0,01 až 1,0 gg/ml živného média), se měří za použití 4-metylumbelliferyl-^-glukuronidu jako substrátu.

Za účelem kontroly specifity pro fázi buněčného cyklu se endotelové buňky synchronizují v G0/G1 odstraněním methioninu na 48 hodin. Obsah DNA buněk se určí na FACS po obarvení Hoechstem 33258 (Hoechst Ag, Frankfurt) (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995).

Získaly se následující výsledky:

V nepřítomnosti přidaného cyklosporinu A není možné detekovat jakékoliv zvýšení β-glukuronidázy v transfekovaných endotelových buňkách při srovnání s netransfekovanými endotelovými buňkami.

Po přidání cyklosporinu A exprimují transfekované endotelové buňky výrazně více β-glukuronidázy než exprimují netransfekované endotelové buňky.

f Samozesilující expresní systém, který byl popsán, vede k expresi strukturálního genu β-glukuronidázy, která je závislá na fázi buněčného cyklu a která může být regulována přidáním cyklosporinu A.

Síla exprese dosažená novým samozesilujícím farmakologicky regulovatelným expresním systémem než síla dosažená nesamozesilujícím expresním který byl připraven v příkladu 1 v souladu se je větší systémem, schématem zobrazeným na obr. 14.

• · ··

Průmyslová využitelnost

Vynález poskytuje samozesilující konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň jednu regulační sekvenci spojenou s alespoň jedním strukturálním genem a alespoň jedním genem pro proteinový transkripční faktor. Předkládaný vynález dále poskytuje buňku, která obsahuje nový konstrukt a způsobu přípravy konstruktu, ve kterém jsou jednotlivé složky spojeny k sobě navzájem.

Nový konstrukt nukleové kyseliny lze použít pro přípravu léčiva pro podávání pro profylaxi a/nebo léčbu nemocí. Buňky v souladu s vynálezem lze užít pro přípravu léčiva pro lokální nebo systémové podávání pro profylaxi a/nebo léčbu nemocí.

Claims

PATENT 0 V É NÁROKY 1. Konstrukt nukleové kysel iny, který obsahuje: alespoň jeden první strukturální gen, který kóduje aktivní sloučeninu, alespoň jeden druhý strukturální gen, který kóduje

proteinový transkripční faktor, a alespoň jednu aktivační sekvenci složenou z alespoň jedné sekvence, která váže proteinový transkripční faktor, a alespoň jedné promotorové sekvence, kde každá aktivační sekvence aktivuje expresi strukturálního genu a expresi proteinového transkripčního faktoru.
2. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 1, kde je aktivační sekvence připojena na 5' konec prvního strukturálního genu a aktivační sekvence je připojena na 5' konec genu proteinového transkripčního faktoru.
3. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 1 nebo 2, který obsahuje dvě totožné sekvence vázající proteinový transkripční faktor a dva neidentické promotory.
4. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 1, který dále obsahuje vnitřní ribozomální vstupní místo (IRES), a kde se vnitřní ribozomální vstupní místo zapojuje do aktivace exprese proteinového transkripčního faktoru aktivační sekvencí.
5. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, který dále obsahuje:

jadernou exportní signální sekvenci připojenou k prvnímu strukturálnímu genu, ·· ·· ···♦ ·· ·· • · · · ···· • · · · · · · · • · · ·· ·· ·· ·· ·· třetí promotor, a sekvenci genu jaderného exportního faktoru.
6. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde alespoň dva strukturální geny jsou spojeny ^v navzájem sekvencí IRES nebo aktivační sekvencí.
7. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároků 1 až 6, kde jsou alespoň dva geny proteinových transkripčních faktorů spojeny navzájem sekvencí IRES nebo aktivační sekvencí.
8. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 7, kde geny proteinových transkripčních faktorů nejsou totožné a proteinové transkripční faktory tvořené uvedenými geny se váží na sekvence konstruktu nukleové kyseliny vázající proteinové transkripční faktory.
9. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, který dále obsahuje farmakologický regulační modul, který obsahuje v sériovém uspořádání:

alespoň jeden promotor, alespoň jeden gen fúzního proteinu, který obsahuje < aktivační doménu proteinového transkripčního faktoru, a sekvenci, která váže spojovací protein, alespoň jeden promotor, alespoň jeden gen fúzního proteinu, kde fúzní protein obsahuje protein vázající DNA a protein, který váže spojovací látku, a alespoň jednu aktivační sekvenci, která obsahuje místo pro protein vázající DNA.

• · • · ····
10. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků

1 až 9, který obsahuje:

alespoň jeden první strukturální gen, který kóduje aktivní sloučeninu, alespoň jeden druhý strukturální gen, který kóduje proteinový transkripční faktor, a alespoň jednu aktivační sekvenci složenou z alespoň jedné sekvence, která váže proteinový transkripční faktor a alespoň jednoho farmakologického regulačního modulu, který obsahuje v sériovém uspořádání alespoň jeden promotor, alespoň jeden gen fúzního proteinu kódující aktivační doménu proteinového transkripčního faktoru a kódující proteinovou spojovací látku, alespoň jeden promotor, alespoň jeden gen fúzního proteinu kódující protein vázající DNA a kódující druhou proteinovou spojovací látku a alespoň jednu aktivační sekvenci, která obsahuje místo pro protein vázající DNA, kde každá aktivační sekvence aktivuje expresi strukturálního genu a expresi proteinového transkripčního faktoru.
11. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků

f 1 až 10, který obsahuje: alespoň jeden první strukturální gen, který kóduj e *· aktivní sloučeninu, alespoň jeden druhý strukturální gen, který kóduje alespoň jeden první fúzní protein, který i obsahuje

aktivační doménu proteinového transkripčního faktoru, a sekvenci, která váže spojovací látku, alespoň jeden třetí strukturální gen, který kóduje alespoň jeden druhý fúzní protein, který obsahuje protein, který váže spojovací látku a protein vázající DNA, alespoň jednu aktivační sekvenci složenou z alespoň jedné sekvence, která váže uvedený druhý fúzní protein spojený s uvedeným prvním fúznim proteinem spojovací látkou, a alespoň jedné promotorové sekvence, kde každá aktivační sekvence aktivuje expresi alespoň jednoho z uvedených strukturálních genů.
12. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kde aktivační sekvence obsahuje:

sekvenci pro vazbu proteinového transkripčního faktoru,kde sekvence je vybrána ze skupiny skládající se z genu proteinu Gal4, genu proteinu LexA, genu proteinu represoru Lac I, genu represorového tetracyklinového proteinu a genu proteinu ZFHD-1, promotorové sekvence vybrané ze skupiny skládající se z bazálního promotoru c-fos v kombinaci s transaktivační doménou VP16 HSV-1, promotoru U2 sn RNA v kombinaci se sekvencí aktivační domény Oct-2 a promotoru TK HSV, a gen proteinového transkripčního faktoru vybraného ze * skupiny skládající se z domény vázající DNA proteinu Gal4, domény vázající DNA proteinu LexA, genu proteinu represoru Lac I, genu represorového tetracyklinového proteinu a genu proteinu ZFHD-1.
13. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 12, kde proteinový transkripční faktor obsahuje jaderný lokalizační signál SV40 a kyselou transaktivační doménu VP16 HSV-1.

• · • · ···· ··· ··· ·· ·· ·· *· ··
14. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 9 až 11, kde sekvence, která kóduje první fúzní protein, je vybrána ze skupiny skládající se z transaktivační domény VP16 viru herpes, podjednotky p65 transkripčního faktoru NF-_KB, a ' N-koncové části domény Oct-2 bohaté na glutamin, která je přímo nebo nepřímo spojena s C-koncovou doménou Oct-2 bohatou na prolin, sekvence, která kóduje druhý fúzní protein, je vybrána ze skupiny skládající se z domény vázající DNA proteinu Gal4, domény vázající DNA proteinu LexA, proteinu represoru Lac I, represorového tetracyklinového proteinu a proteinu ZFHD-1, aktivační sekvence, která váže protein, je vybrána ze skupiny skládající se z proteinu Gal4, proteinu LexA, proteinu represoru Lac I, represorového tetracyklinového proteinu a proteinu ZFHD-1, a kde aktivační sekvence, která váže protein, je spojena s promotorem vybraným ze skupiny skládající se z bazálního promotoru SV40, promotoru c-fos v kombinaci s transaktivační doménou VP16 HSV-1, promotoru U2 sn RNA v kombinaci s transaktivační doménou VP16 HSV-1 nebo alespoň se sekvencí aktivační domény Oct-2, a promotoru TK HSV.
15. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 14, který dále obsahuje jaderný lokalizační signál SV40 a kyselou transaktivační doménu VP16 HSV-1, kde jaderný lokalizační signál SV40 a kyselá transaktivační doména VP16 HSV-1 jsou přítomny v genu, který kóduje fúzní protein.

• · · · ··· ·· · ···· • ····· · · · ·· · · · • ·«··· · · · ··· ·· ·· ·· ·· ··
16. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 9 až 15, kde alespoň jeden fúzní protein obsahuje protilátku nebo protilátkový fragment.
17. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 16, kde protilátkový fragment obsahuje jednořetězcový fragment Fv, který má variabilní řetězec a lehký řetězec, kde variabilní a lehké řetězce jsou kovalentně spojeny krátkou peptidovou sekvencí.
18. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků

9 až 15, kde alespoň jeden fúzní protein obsahuje vazebnou doménu přirozeně se vyskytujícího proteinu.
19. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků

1 až 18, kde alespoň jeden promotor je vybraný ze skupiny skládající se z RNA polymerázy III, RNA polymerázy II, promotoru a zesilovače CMV, promotoru SV40, promotoru HBV, promotoru HCV, promotoru HSV, promotoru HPV, promotoru EBV, promotoru HTLV, promotoru HIV, promotoru cdc25C, promotoru cyklinu A, promotoru cdc2, promotoru bmyb, promotoru DHFR a promotoru E2F-1.
20. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 5, kde jaderný exportní signál a odpovídající jaderný exportní faktor jsou vybrány z rev-responzivního prvku/proteinu rev retrovirú, který je vybrán ze skupiny skládající se z HIV-1, HIV-2, HTLV-l a HBV.
21. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20, kde strukturální gen kóduje sloučeninu vybranou ze skupiny skládající se z inhibitorů buněčné proliferace, cytotoxických protilátek, proteinů, fúzních proteiny, pro cytokiny zánětu, enzymů pro proteinů cytokinů, a růstové faktorů cytostatických nebo štěpení předléků, protilátkových fragmentů a dalšími růstových faktorů, hormonů, receptorů faktory, antagonistů cytokinů, induktorů vajících koagulaci, inhibitorů koagulace, inhibitorů angiogeneze, proteinů krevní receptoru LDL, enzymů, metabolickým onemocněním nebo antigenů, bakteriálních antigenů, nádorových antigenů, antityto antigeny, a fúzního kombinace výše uvedených.

vyvolávajících koagulaci, vyvolávajících fibrinolýzu, angiogeneze, receptoru nedostatek proteinů faktorů hypotenznich peptidů, inzulínu, imunosupresi, vede k virových antigenů protilátek parazitárních idiotypových proteinu odvozeného z jakékoliv nebo pro

-C.^z22. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků

9 až 21, kde jsou alespoň dva strukturální geny spojeny navzájem sekvencí IRES nebo aktivační sekvencí.

23. Vektor obsahující konstrukt kteréhokoliv z nároků 1 až 22.

nukleové kyseliny podle

24. Farmaceutický tím, že obsahuje kteréhokoliv z nároků přípravek v : konstrukt y z n a č nukleové u j i c i kyseliny nosič.

25.

Farmaceutický vyznačuj ící spojovací látku, která

1 až 22 a přípravek podle farmaceuticky přijatelný podle nároku

24, m, že dále obsahuje se váže k fúznímu proteinu.

r· »»♦·

26. farmaceutický přípravek tím, že spojovací nároku

25, vyznačuj ící prostupuje buněčnými membránami a vstupuje do buněk.

27. Farmaceutický přípravek podle nároku 25, vyznačující se tím, že spojovací látka je vybrána ze skupiny skládající se z rapamycinu, FK506, cyklosporinu A, metotrexátu, kyseliny listové, kyseliny retinové, penicilinu, 4-hydroxytamoxifenu, tamoxifenu, tetracyklinu a konjugátu tetracyklin/isopropyl-p-Dthiogalaktosidu.

23. Buňka, která obsahuje konstrukt nukleové kyseliny podle kter éhokoliv z nároků 1 až 22. 29. Způsob přípravy konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22, v y z n a č u j i c i s e

tím, že obsahuje:

spojení sekvence, která váže proteinový transkripční faktor, s promotorovou sekvencí, takže se vytvoří aktivační sekvence, a spojení aktivační sekvence s alespoň jedním r strukturálním genem a s alespoň jedním genem, který kóduje proteinový transkripční faktor.

30. Použití konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22, vektoru podle nároku 23, farmaceutického přípravku podle kteréhokoliv z nároků 24 až 27 nebo buňky podle nároku 28 pro přípravu léčiva pro prevenci nebo zmírnění nemoci.

Zoůsob příp avv farmaceutického vyznačuj re i se m, že obsahuje:

transformován buňky mnohonásobné • · ··· · vitro konstruktem
22, přípravku

DNA podle buňky, aby se získaly

DNA, a

DNA z kultivovaných buněk.