DE19701037A1 - Mit Schutzliganden der Sauerstoffbindungsstellen versehene Hämoglobine als künstliche Sauerstoffträger zur direkten biologisch-medizinischen Anwendung und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents
Mit Schutzliganden der Sauerstoffbindungsstellen versehene Hämoglobine als künstliche Sauerstoffträger zur direkten biologisch-medizinischen Anwendung und Verfahren zu ihrer HerstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft künstliche Sauerstoffträger aus nativen oder modifizierten
Hämoglobinen, die bis zu ihrer Anwendung andauernd zuverlässig vor
Funktionsverlust geschützt sind, die vor ihrer Anwendung keiner weiteren
Behandlung bedürfen und deren Reaktivierung nach Beginn der Anwendung
steuerbar ist, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Hämoglobinen werden für viele Zwecke
benötigt, sie können aber im Verlaufe ihrer Herstellung und Lagerung teilweise
oder vollständig ihre Funktionsfähigkeit verlieren. Dies zu verhindern ist
notwendig, damit künstliche Sauerstoffträger aus Hämoglobinen möglichst lange
lagerfähig und verwendbar bleiben.
Allgemein werden zur Herstellung künstlicher Sauerstoffträger verschiedene Wege
beschritten, einer davon ist die Herstellung geeigneter Lösungen nativer oder
chemisch modifizierter Hämoglobine (zum Stand der Forschung und
Entwicklungen siehe "Issues from Vth International Symposium on Blood
Substitutes, San Diego/CA, USA, March 1993", Artificial Cells, Blood Substitutes,
and Immobilization Biotechnology 22 (1994), Heft 2-Heft 4). Ein Problem der
Handhabbarkeit solcher pharmazeutischer Zubereitungen als künstliche
Sauerstoffträger ist ihre zunehmende Inaktivierung durch spontane Oxidation zum
Methämoglobin, welches keinen Sauerstoff mehr transportieren kann. Dies betrifft
sowohl die eigentliche Herstellung beim Produzenten, als auch die folgende
Lagerung bis zur Anwendung.
Es gibt eine Reihe von Verfahren und Methoden dieses Problem zu beseitigen.
Entweder verringern sie das Ausmaß der Oxidation des Hämoglobins, oder das
oxidierte Hämoglobin wird wieder reduziert.
Eine Möglichkeit einer weitgehenden Vermeidung spontaner Oxidation besteht
darin, das Hämoglobin zu desoxygenieren (d. h. den Sauerstoff in der
Zubereitung völlig zu entfernen), denn Desoxyhämoglobin wird deutlich
langsamer zu Methämoglobin oxidiert als Oxyhämoglobin (ANTONINI et al. (1981)
(Hrsg.): Methods in Enzymology Volume 76, Hemoglobin, Academic Press, New
York u. a. 1981). Die Schwierigkeit dieser Vorgehensweise liegt in der
Notwendigkeit den Sauerstoff wirklich vollständig zu entfernen, denn verbleibende
Reste wirken weiter, und zwar wird teilweise oxygeniertes Hämoglobin noch
wesentlich schneller oxidiert als völlig oxygeniertes (BROOKS J. (1935): "The
Oxidation of Haemoglobin to Methaemoglobin by Oxygen. II. The Relation
between the Rate of Oxidation and the Partial Pressure of Oxygen", Proceedings
of the Royal Society (London), Series B 118 : 560-570).
Weiter ist es wegen der Temperaturabhängigkeit der Oxidationsgeschwindigkeit
möglich, das Ausmaß der Oxidation durch Lagerung und/oder Präparation bei
niedrigst möglicher Temperatur (für wäßrige Lösungen also bei etwa 4°C) zu
minimieren. Dies erfordert aber die (aufwendige) permanente Bereithaltung
technischer Geräte (Kühlschränke) und hat den weiteren Nachteil, daß die
Zubereitung vor einer Anwendung erwärmt werden muß.
Außerdem ist die Oxidationsgeschwindigkeit des Hämoglobins von der
Wasserstoffionen-Konzentration, also dem pH-Wert, abhängig. Ein Minimum
besteht z. B. für natives menschliches Hämoglobin im Intervall zwischen den pH-
Werten 7,5 und 9,5 (SUGAWARA Y. et al. (1993) : "Autoxidation of Human
Hemoglobin: Kinetic Analysis of the pH-Profile", Japanese Journal of Physiology
43 : 21-34). Messungen an einigen Polymeren menschlichen Hämoglobins
(sogenannte Hyperpolymere) haben gezeigt, daß dies prinzipiell auch für diese
gilt. Die Rückstellung des pH-Wertes vor einer Anwendung ist aber problematisch.
Auch der Zusatz gewisser Alkohole kann die Oxidation des Hämoglobins
vermindern (NEDJARARROUME N. et al. (1993).: "Stabilizing Effect of Water
Alcohol Solvents Towards Autoxidation of Human Haemoglobin", Biotechnology
and Applied Biochemistry 18 : 25-36). Einige von ihnen wirken bereits in geringer
Konzentration. Ein Problem hierbei ist die Toxizität dieser Alkohole.
Gewisse Metallionen (Cu2+, Fe3+ etc.) katalysieren die spontane Oxidation des
Hämoglobins. Sie können durch Komplexierung mit z. B. EDTA (Ethylendiamin-
Tetraessigsäure) unwirksam gemacht werden, allerdings fördert EDTA selbst die
spontane Oxidation von Hämoglobin.
Spezifische Möglichkeiten des Schutzes künstlicher Sauerstoffträger vor Oxidation
bestehen in der Zugabe reduzierender Substanzen. Diese bewirken unter
Umständen sogar eine Re-Aktivierung oxidierten Hämoglobins.
Erstens ist eine chemische Reduktion möglich. Eine Re-aktivierung erfordert aber
die Umsetzung mit einem starken Reduktionsmittel (z. B. mit Dithionit: BAUER
und PACYNA, (1975): "The Conversion of Trivalent to Divalent Iron in Hemoglobin
of Various Species", Analytical Biochemistry 65 : 445-448). Wird ein
Reduktionsmittel nach der Umsetzung entfernt, stellt sich das Problem der
Oxidation des Hämoglobins erneut. Wird ein Reduktionsmittel bleibend zugesetzt,
wird es selbst mit appliziert, was die Auswahl an geeigneten Stoffen stark
vermindert. Geeignet könnte beispielsweise Ascorbinsäure sein (TOMODA (1978):
"Mechanism of Methemoglobin Reduction by Ascorbic Acid under Anaerobic
Conditions", Journal of Biological Chemistry 253 : 7420-7423). Sie ist aber nur
ein relativ schwaches Reduktionsmittel und somit nur zur Verhinderung einer
weiteren Oxidation geeignet.
Hämoglobin kann auch enzymatisch reduziert werden. Für analytische Zwecke
sind einige Möglichkeiten für geeignete Enzyme und Substrate beschrieben
(HAYASHI et al. (1973): "An Enzymic Reduction System for Metmyoglobin and
Methemoglobin, and Ist Application to Functional Studies of Oxygen Carrier",
Biochimica et Biophysica Acta 310 : 309-316, und ROSSI-FANELLI und
ANTONINI (1958): "Studies on the Oxygen and Carbon Monoxide Equilibria of
Human Myoglobin", Archives of Biochemistry and Biophysics 77 : 478-492).
Problematisch ist die Mit-Applikation dieser Proteine, so daß auf diesem Wege nur
ein Oxidationsschutz im Verlauf der Herstellung der künstlichen Sauerstoffträger
praktikabel ist.
Eine bislang für sämtliche Schritte der Präparation von Hämoglobinen bekannte
Methode zur Minimierung des Ausmaßes ihrer Oxidation ist ihre Ligandierung mit
Kohlenmonoxid, also ihre Überführung in Carbonylhämoglobin (oder
Carboxyhämoglobin). Zum Schutz der zur Anwendung vorgesehenen
Zubereitungen künstlicher Sauerstoffträger ist dieses Verfahren bislang jedoch
nie vorgesehen gewesen, denn eine Reihe von Argumenten scheinen eine
Anwendung zum angegebenen Zweck zu verbieten: Kohlenmonoxid wird als
Ligand erheblich fester an die Sauerstoffbindungsstelle das Hämoglobins
gebunden als Sauerstoff. Deshalb steht Carbonylhämoglobin praktisch nicht für
einen Sauerstofftransport zur Verfügung. Carbonylhämoglobin ist deshalb für den
Arzt "vergiftetes" Hämoglobin, da der Anteil des Hämoglobins, der als
Carbonylhämoglobin vorliegt, für einen Sauerstofftransport ausfällt. Bei schweren
Vergiftungen mit Kohlenmonoxid ist dazu oft eine akute Lebensgefährdung des
Patienten vorhanden und die Blockierung der Sauerstofftransportfunktion muß
therapiert werden. In experimentellen Arbeiten zum Nachweis der Wirksamkeit
und Wirkungen künstlicher Sauerstoffträger aus Hämoglobinen werden die
entsprechenden, mit Kohlenmonoxid ligandierten Hämoglobine sogar als akut
nicht-funktionsfähige "Träger" eingesetzt (z. B. CONOVER et al. (1996)
"Evaluation of the Oxygen Delivery Ability of PEG-Hemoglobin in Sprague-Dawley
Rats during Hemodilution" (Abstract), Artificial Cells, Blood Substitutes, and
Immobolization Biotechnology 24 : 325). Eine bleibende Ligandierung künstlicher
Sauerstoffträger aus Hämoglobinen mit Kohlenmonoxid zum Schutz vor Oxidation
scheint deshalb als nicht praktikabel zu sein.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die vorhandene Funktionsfähigkeit
künstlicher Sauerstoffträger aus Hämoglobinen während ihrer Herstellung und
anschließenden Lagerung bis zu ihrer Anwendung weitestmöglich zu erhalten,
ohne daß vor ihrer Anwendung weitere Behandlungsschritte erforderlich sind.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man die Sauerstoffbindungsstelle mit
einem geeigneten Schutzliganden versieht. Überraschend wurde gefunden, daß
eine Überführung des erfindungsgemäßen künstlichen Sauerstoffträgers in eine
Schutzliganden-freie Form vor seiner biologisch-medizinischen Anwendung nicht
erforderlich ist.
Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäß vorzugsweise dadurch gelöst, daß
das Hämoglobin vollständig in Carbonylhämoglobin überführt und in dieser Form
sowohl gelagert wird als auch so als künstlicher Sauerstoffträger ohne weitere
Behandlung zur Anwendung kommt. Der Schutz erfolgt durch eine
gegebenenfalls früh im Verlauf der Synthese durchzuführende Ligandierung mit
Kohlenmonoxid (es entsteht Carboxy-(oder Carbonyl-)hämoglobin), die, als
Wesensmerkmal der Erfindung, vor einer Applikation nicht rückgängig gemacht
wird. Vielmehr erfolgt die Anwendung des künstlichen Sauerstoffträgers in dieser
Form.
Die technisch äußerst aufwendige und kurzfristig nicht durchführbare Entfernung
des Liganden vor einer Applikation kann erfindungsgemäß aus folgenden
Gründen unterbleiben:
- 1. Im Blutgefäßsystem eines Organismus oder exzidierter Organe oder in technischen Vorrichtungen zur Kultur von Zellen zerfällt der applizierte Kohlenmonoxid-Hämoglobin-Komplex, gemäß der Hämoglobin- Kohlenmonoxid-Bindungskurve, wegen des im Blutplasma oder in der Nährlösung sehr niedrigen Partialdrucks des Kohlenmonoxids. Das frei werdende Kohlenmonoxid wird abgeatmet oder mit dem abgeführten Versorgungsgas entfernt. Das zunächst unmittelbar zu einem Sauerstofftransport nicht befähigte Hämoglobin wird so - durch De- Ligandierung - aktiviert.
- 2. Bei einer Anwendung in einem Organismus ist das in der pharmazeutischen Zubereitung des Carboxy-Hämoglobins nicht an Hämoglobin gebundene, frei gelöste Kohlenmonoxid, welches zugleich appliziert wird, zwar prinzipiell fähig, mit dem eigenen Hämoglobin des Empfängers Carboxyhämoglobin zu bilden. Seine Menge kann aber durch geeignete Wahl des Partialdruckes des Kohlenmonoxids in der Zubereitung vernachlässigbar gering gehalten werden. Die Hämoglobin-Kohlenmonoxid-Bindungskurve erlaubt einen vollständigen Umsatz des künstlichen Sauerstoffträgers aus Hämoglobinen zur karbonylierten Form (zum Carboxyhämoglobin) bereits bei sehr niedrigen Partialdrücken. Kohlenmonoxid ist ein natürlich vorkommendes Gas.
Weiterhin wurde gefunden, daß ein erfindungsgemäß geschützter künstlicher
Sauerstoffträger nach Verabreichung durch eine allmähliche Aktivierung
gekennzeichnet ist, wobei die Geschwindigkeit der Reaktivierung - innerhalb
gewisser Grenzen - durch Änderung der inspiratorischen Volumenfraktion oder
des Partialdruckes des Sauerstoffes steuerbar ist.
Carboxyhämoglobin ist bekanntermaßen äußerst stabil gegen spontane
Oxidation, auch während einer Lagerung bei Raumtemperatur, so daß als
erzielbarer Vorteil die erfindungsgemäßen Präparate über lange Zeit ohne
nachteilige Folgen für ihre Funktion als künstliche Sauerstoffträger aufbewahrt
werden können.
Darüber hinaus kann der Prozeß des Zerfalls der Hämoglobin-Kohlenmonoxid-
Komplexe des künstlichen Sauerstoffträgers im Blut durch eine Erhöhung des
Anteils des Sauerstoffes im Inspirationsgas (Erhöhung der inspiratorischen
Sauerstoff-Volumenfraktion), wie es zur Therapie z. B. auch der Vergiftung mit
Kohlenmonoxid angewendet wird, gefördert und die Geschwindigkeit des
Prozesses durch das Ausmaß der Erhöhung der inspiratorischen Sauerstoff-
Volumenfraktion gesteuert werden.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil einer Anwendung der erfindungsgemäß vor
Funktionsverlust geschützten Hämoglobine als künstliche Sauerstoffträger ergibt
sich aus der Möglichkeit - angepaßt an die Erfordernisse des einzelnen Patienten
oder der speziellen Anwendung - ihre Funktion allmählich frei zu geben. So
kommt es nach einer therapeutischen Gabe in einen Organismus nicht zu einer
vorübergehenden relativen Überversorgung minder-durchbluteter Organe mit
Sauerstoff; die funktionell an eine Hypoxie adaptierten Gewebe werden so vor
einem oxidativen Schock mit toxischen Sauerstoffschäden (sogenannte
Reperfusionsschäden) bewahrt.
Eine vorteilhafte Herstellung eines erfindungsgemäßen künstlichen
Sauerstoffträgers aus Hämoglobinen sieht vor, diesen möglichst frühzeitig im
Verlauf seiner Herstellung mit Kohlenmonoxid in mindestens ausreichender
Konzentration, z. B. zunächst mit reinem Kohlenmonoxid, zu äquilibrieren, und so
möglichst vollständig in Carboxyhämoglobin zu überführen. Auf diese Weise ist
das verwendete Hämoglobin auch gegen partielle Oxidation sicher geschützt.
Dieser Zustand wird im weiteren Verlauf der Präparationen aufrecht erhalten. Als
abschließender Schritt wird dann - um den Gehalt frei gelösten Kohlenmonoxids
zu minimieren und zugleich die vollständige Ligandierung des Hämoglobins mit
Kohlenmonoxid zu erhalten - mit Kohlenmonoxid geringstmöglicher Konzentration
(z. B. mit einem Volumenteil Kohlenmonoxid und 99 Volumenteilen Stickstoff)
äquilibriert und die Zubereitung in diesem Zustand gasdicht (z. B. in
Glasampullen oder Infusionsflaschen) zur Lagerung und nachfolgenden
Applikation verpackt.
Als Schutzliganden der Sauerstoffbindungsstelle des Hämoglobins kommen auch
andere dafür in der Literatur beschriebene Stoffgruppen (ANTONINI E. et al
(Hrsg.) (1981): Methods in Enzymology Volume 76 - Hemoglobins (COLOWICK
S.P., KAPLAN N.O. (Hrsg.) Methods in Enzymology) Academic Press, New York
u. a. 1981) in Betracht. Ein wie Kohlenmonoxid in Reinform gasförmiger geeigneter
Schutzligand der Sauerstoffbindungsstelle ist Stickstoffmonoxid (NO). Als nicht
gasförmige kompetitive Liganden sind "Derivate" des Stickstoffmonoxids, wie
Nitrosoverbindungen, und Isocyanide, jeweils in der Form bestimmter geeigneter
Verbindungen, einsetzbar. Ihre sich dem Fachmann bekannte, leicht sich
erschließende oder durch einfache Versuche feststellbare Eignung als
Schutzligand für solche künstliche Sauerstoffträger aus Hämoglobinen hängt von
ihrer Affinität zur Sauerstoffbindungsstelle sowie ihrer Verträglichkeit für den
menschlichen Organismus oder die zu behandelnde Zellkultur oder Präparation
ab.
Die Auswahl bestimmter Schutzliganden kann auf die mit ihrem Einsatz
gewünschten Ergebnisse abgestellt werden. Beispielsweise ist es möglich, durch
eine gleichzeitige Benutzung verschiedener Schutzliganden mit unterschiedlicher
Affinität zu Hämoglobin eine steuerbare (abgestufte) Aktivierung des künstlichen
Sauerstoffträgers während seiner Anwendung zu erreichen.
Claims (5)
1. Künstliche Sauerstoffträger aus Hämoglobinen zur direkten Anwendung in
biologisch-medizinischen Systemen, dadurch gekennzeichnet, daß die
Sauerstoffbindungsstellen mit einem Schutzliganden versehen sind.
2. Künstliche Sauerstoffträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der Schutzligand reversibel mit großer Affinität bindet.
3. Künstliche Sauerstoffträger nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
Kohlenmonoxid als Schutzligand verwendet wird.
4. Künstliche Sauerstoffträger aus Hämoglobinen nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Hämoglobin natürliches oder chemisch
modifiziertes Hämoglobin menschlichen oder tierischen Ursprungs ist.
5. Verfahren zur Herstellung des künstlichen Sauerstoffträgers nach einem der
Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine vollständige Beladung
des Trägers mit Kohlenmonoxid im frühestmöglichen Herstellungsstadium
erfolgt und überschüssiges Kohlenmonoxid am Ende des
Herstellungsverfahrens in an sich bekannter Weise entfernt wird.
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