DE19829707A1 - Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Leukozyten, Elastasen, Esterasen und Proteasen - Google Patents

Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Leukozyten, Elastasen, Esterasen und Proteasen

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von Elastasen, Esterasen und Proteasen, und insbesondere auf ein diagnostisches Mittel, mit dem Leukozyten in Körperflüssigkeiten, insbesondere im Harn nachgewiesen werden können. Das diagnostische Mittel ist dadurch gekennzeichnet, daß es als Substrat einen Ester der alpha-Hydroxyvaleriansäure mit der allgemeinen Formel umfaßt: DOLLAR F1 in der R eine Gruppe darstellt, die nach Spaltung des Esters als R-OH in einer Nachweisreaktion erfaßt werden kann, und R' eine Alkoholschutzgruppe ist.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein diagnostisches Mittel, mit dem Enzyme wie Esterasen, Elastasen und/oder Proteasen nachgewiesen werden können, und insbesondere auf ein diagno­ stisches Mittel, das zum Nachweis von Leukozyten in Körper­ flüssigkeiten, insbesondere im Harn, verwendet werden kann. Die Erfindung bezieht sich ferner auf einen neuen α- Hydroxyvaleriansäureester sowie auf dessen Verwendung als Substrat für diagnostische Mittel und auf dessen Herstel­ lung. Der neue α-Hydroxyvaleriansäureester wird im Verlauf der Nachweisreaktion zu einer detektierbaren Verbindung um­ gesetzt und kann sinnvollerweise in diagnostischen Schnell­ tests auf Teststreifenbasis verwendet werden.
Die Ausscheidung von Leukozyten über den Harn stellt ein wichtiges Leitsymptom bei Erkrankungen der Niere und des Urogenitaltraktes dar. Daher haben Verfahren zum Nachweis von Leukozyten im Harn im Rahmen der medizinischen Diagno­ stik eine hohe Bedeutung. Nachweismethoden für Leukozyten sind seit längerem bekannt. So kann der Nachweis mikrosko­ pisch erfolgen, indem die in einem bestimmten Harnvolumen enthaltenen Leukozyten ausgezählt werden. Diese Methode ist jedoch sehr Zeit- und personalaufwendig und sehr ungenau, da andere feste Harnbestandteile eine exakte Bestimmung beein­ flussen können. Außerdem können lysierte Leukozyten auf die­ sem Weg nicht erfaßt werden. Da die Halbwertszeit von Leuko­ zyten besonders in stark alkalischen Harnen relativ gering ist, kann diese Methode bei Harnen mit längerer Standzeit zu Fehlbestimmungen führen. Eine exaktere, einfachere und sehr viel zuverlässigere Bestimmung kann erfolgen, indem man die Aktivitäten der Enzyme (Esterasen/Elastasen/Proteasen) aus­ nutzt, die in Leukozyten enthalten sind.
Bei derartigen Verfahren werden nicht oder nur wenig gefärb­ te Carbonsäureester eingesetzt, die durch die in den Leuko­ zyten enthaltenen Enzyme zu einer Alkohol- und einer Säure­ komponente hydrolysiert werden. Die bei der Hydrolyse frei­ gesetzte (meist ebenfalls farblose) Alkoholkomponente (ROH) reagiert dann mit einem entsprechenden Nachweisreagenz (NW) zu einer detektierbaren (farbigen) Verbindung (NW-ROH) wei­ ter, die visuell oder reflektometrisch bestimmt werden kann.
Obiges Verfahren wird allgemein in kommerziellen Leukozyten­ tests auf Teststreifenbasis verwendet.
Um einen Test mit hoher Spezifität und Nachweisempfindlich­ keit zu erhalten, müssen die eingesetzten Carbonsäureester optimal auf die nachzuweisenden Enzyme abgestimmt sein, d. h., sie müssen aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften besonders schnell von den vorliegenden Enzymen gespalten werden. Außerdem muß die nachfolgende Nachweisreaktion Ver­ bindungen liefern, die im Bereich des sichtbaren Lichts ei­ nen sehr hohen Extinktionskoeffizienten aufweisen, um eine intensive Färbung des Testfeldes zu erzielen. In diagnosti­ schen Tests werden bevorzugt Nachweisreaktionen auf der Ba­ sis von Diazoniumkupplungen verwendet.
Schmalzl/Braunsteiner (Klin. Wschr. 46, 642 (1968)) be­ schreiben einen Nachweis von Leukozyten-Esterase, der auf der Hydrolyse eines Carbonsäureesters und anschließender Kupplung der Alkoholkomponente mit einer Diazoniumverbindung beruht. Sie verwenden z. B. Naphthol-AS-D-Chloracetat als Substrat. Das enzymatisch freigesetzte Naphtholderivat kup­ pelt mit dem Diazoniumsalz Echtgranatsalz GBC zu einer far­ bigen Diazoniumverbindung. Dieser Nachweis zeigt jedoch nur eine sehr geringe Empfindlichkeit, was vor allem auf den verwendeten Carbonsäureester zurückgeführt wird.
Janoff/Basch (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 136, 1045 (1971)) beschreiben Alaninester als spezifische Substrate für Human- Leukozyten-Elastase. Sie setzen u. a. Boc-Alanin-p-nitrophe­ nylester oder N-Acetyl-alanyl-alanyl-alaninmethylester als Substrate ein.
In der EP 0 157 326 wird die Verwendung von Alaninestern von Pyrrol- und Thiophenderivaten als Substrat beansprucht. Nach der enzymatischen Hydrolyse reagiert das freigesetzte Pyrrol- oder Thiophenderivat mit einem Diazoniumsalz zu ei­ ner farbigen Verbindung. Die Alaninester stellen spezifische Substrate für die Human-Leukozyten-Elastase (HLE) dar. In einem auf dieser Druckschrift beruhenden kommerziellen Test wird der Alaninester eines Pyrrols eingesetzt.
Die EP 0 012 957 offenbart die Verwendung von Indoxyl- und Thioindoxylestern von Peptiden oder Aminosäuren als Substra­ te. Die Farbreaktion beruht auf einer Reaktion der Alkohol­ komponenten miteinander nach der enzymatischen Spaltung. Ei­ ne Kombination aus Aminosäure- oder Peptidestern mit Diazo­ niumsalzen wird in der EP 0 039 880 beansprucht. Als Alko­ holkomponente werden Indoxyl- und Thioindoxylderivate (bekannt aus EP 0 012 957), aber auch Phenyl- und Naphthyl­ derivate verwendet. Die Farbreaktion beruht auf einer Diazo­ niumkupplung zwischen speziell aufeinander abgestimmten Dia­ zoniumsalzen und der Alkoholkomponente des Substrates. In einem auf diesen Druckschriften beruhenden kommerziellen Test wird ein Indoxyl-Alaninester verwendet (Kutter et al., Ärztl. Lab. 28, 17, (1982)).
Die Analyse dieser beiden Tests, die am Markt eine bedeuten­ de Stellung einnehmen, zeigt, daß Alanin im Hinblick auf die Reaktivität bezüglich der in Leukozyten enthaltenen Enzyme offenbar das mit Abstand beste Aminosäurederivat darstellt.
Die Verwendung von Lactatestern als Substrat ist in der EP 0 698 600 beschrieben. Diese Lactatester, die eine starke Analogie zu den entsprechenden Alaninderivaten aufweisen, sollen im Vergleich zu diesen eine verbesserte Reaktivität zeigen.
Um die Nachweisempfindlichkeit dieser diagnostischen Tests weiter zu erhöhen, werden den Tests sogenannte Aktivatoren oder Verstärker hinzugefügt. Durch diese Substanzen wird die Reaktionszeit der Nachweisreaktion deutlich verkürzt, was sich in einer erhöhten Nachweisempfindlichkeit nieder­ schlägt. Als Aktivatoren sind insbesondere Heteroaromaten vom Pyridin- oder Imidazol-Typ, aber auch spezielle Alkohole und verschiedene Metallkomplexe geeignet. Solche Aktivatoren sind in der EP 0 014 929 offenbart.
Die diagnostischen Mittel können neben den bereits erwähnten Komponenten ferner geeignete Zusatzstoffe enthalten, wie z. B. Netzmittel, Puffer, Stabilisatoren, Filmbildner, Quell­ mittel, galenische Zusatzstoffe oder ähnliches.
Der Stand der Technik bei obigen diagnostischen Mitteln läßt sich daher so darstellen, daß als geeignete Substrate Ami­ nosäureester, Peptidester oder Milchsäureester bekannt sind, wobei sich die chemische Variabilität auf zwei Stellen des Esters bezieht: 1. auf die Schutzgruppe an der Amino- bzw. Hydroxyfunktion, 2, auf die Alkoholkomponente, die durch die Hydrolyse des Esters freigesetzt wird und zu einer nachweis­ baren Verbindung weiterreagiert. Spezifische Tests mit hoher Nachweisempfindlichkeit benötigen als Substrat einen Alanin­ ester oder einen strukturell sehr ähnlichen Milchsäure­ ester. Bei allen bekannten Testverfahren müssen die Substrate in geeigneter Weise ausgewählt werden, damit eine schnelle und spezifische Spaltung möglich ist, wobei die Substrate ferner auch dahingehend ausgewählt werden müssen, daß die abgespaltene Alkoholkomponente schnell und eindeutig nachge­ wiesen werden kann.
Um Nachweisempfindlichkeit, Spezifität, Stabilität, etc. derartiger diagnostischer Tests weiter zu verbessern, werden weitere Substrate benötigt. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, diagnostische Mittel anzugeben, die gemäß den obigen Ausführungen geeignete Substrate aufweisen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein diagnostisches Mittel nach Anspruch 1.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß Ester der α- Hydroxyvaleriansäure (Formel 1) Substrate mit hoher Reakti­ vität darstellen. Diese Tatsache war umso erstaunlicher, als gute Reaktivitäten bisher nur von Carbonsäurederivaten mit einer Methylgruppe in α-Stellung der Carbonsäurekomponente bekannt waren. Die erfindungsgemäßen Substrate haben folgen­ de Struktur:
wobei R eine Gruppe darstellt, die nach Spaltung des Esters 1 als ROH in einer Nachweisreaktion erfaßt werden kann, und R' eine Alkoholschutzgruppe ist. Mit einem diagnostischen Mittel, das als Enzymsubstrat einen Ester gemäß obenstehen­ der Struktur enthält, können schnell, sicher und eindeutig die o. g. Enzyme nachgewiesen werden und damit die Existenz von Leukozyten in einer entsprechenden Probe angezeigt wer­ den.
Die Alkoholkomponente RO- der Formel 1 liegt nach der Spal­ tung des Esters als ROH vor und stellt eine Verbindung dar, die mit einem entsprechenden Nachweisreagenz nachgewiesen werden kann. RO- umfasst bevorzugt Indoxyl-, Thioindoxyl-, Naphthol- und Phenolderivate, die alle in vielfältiger Weise substituiert sein können. Geeignete Gruppen sind im Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise in EP 0 698 600, EP 0 039 880, EP 0 157 326 oder EP 0 012 957 offenbart. Der Nachweis dieser Alkoholkomponenten erfolgt bevorzugt durch Reaktion mit einem Diazoniumsalz zu einer farbigen Verbin­ dung.
Die als Alkoholschutzgruppe fungierende Gruppe R' der Formel 1 kann jede nach dem Stand der Technik bekannte Schutzgruppe sein, die eine Alkoholgruppe schützt. Hierzu wird z. B. auf EP 0 698 600 verwiesen. Besonders geeignet sind Sulfonyl­ gruppen, wie z. B. Alkyl- oder Arylsulfonylgruppen, außerdem z. B. Benzoylgruppen.
Das diagnostische Mittel nach der Erfindung kann einen oder mehrere Aktivatoren enthalten, die die Hydrolyserate des o. g. Substrates durch die Enzyme beschleunigen. Besonders geeignet sind aliphatische und araliphatische Alkohole. Ge­ eignete Verbindungen sind z. B. in EP 0 014 929 offenbart. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird in dem diagnostischen Mittel 6-Chlor-1-hexanol oder 11-Brom-1- undecanol als Aktivator verwendet.
Ferner kann das diagnostische Mittel einen Puffer enthalten, der einen pH-Wert zwischen 7,0 und 9,0 hat. Weiterhin kann das Mittel weitere Zusatzstoffe enthalten, wie z. B. Netz­ mittel, Oxidationsmittel, Stabilisatoren, Filmbildner, Quellmittel, galenische Zusatzstoffe oder andere Substanzen. Derartige Zusätze sind bekannt und z. B. in EP 0 039 880, EP 0 157 326 oder EP 0 698 600 offenbart.
Ein bevorzugter Träger für das erfindungsgemäße diagnosti­ sche Mittel ist Papier, insbesondere Filterpapier. Die Rea­ genzien können jedoch auch in andere Träger eingebracht wer­ den, wie z. B. Vliese, Membranen, Filme, Tabletten, Gewebe oder ähnliches. Eine Verwendung als Flüssigreagenz ist eben­ falls denkbar.
Die Herstellung des erfindungsgemäßen diagnostischen Mittels erfolgt durch Auflösen der o. g. Komponenten in einem geeig­ neten Lösungsmittel, Imprägnierung des Trägers mit diesen Lösungen und anschließende Trocknung des Trägers. Die Anzahl und Reihenfolge der Imprägnierschritte ist variabel und kann im einzelnen an den verwendeten Träger angepaßt werden. Be­ vorzugt ist eine Imprägnierung in zwei Schritten. In einer ersten (wäßrigen) Imprägnierung werden Puffer und andere wasserlösliche Substanzen auf den Träger aufgebracht. In ei­ nem zweiten (nichtwäßrigen) Schritt erfolgt die Imprägnie­ rung mit dem Substrat und anderen Rezepturbestandteilen, die eine schlechte Löslichkeit in Wasser aufweisen.
Ein bevorzugtes diagnostisches Mittel nach der Erfindung enthält als Substrat O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvale­ riansäure-3-indoxylester. Dies ist eine neue Substanz, die wie folgt hergestellt werden kann:
α-Hydroxyvaleriansäureethylester 2 wird mit Tosylchlorid um­ gesetzt. Der entstandene Ester 3 wird durch Hydrolyse der Ethylesterfunktion in die entsprechende Carbonsäure 4 über­ führt. Diese wird mit Thionylchlorid zum Säurechlorid 5 um­ gesetzt. Die Reaktion des Säurechlorids 5 mit Indoxyl führt schließlich zur Zielverbindung 6.
Ein weiteres bevorzugtes, diagnostisches Mittel nach der Er­ findung umfaßt als Substrat obige Substanz 6, als Aktivator 6-Chlor-1-hexanol oder 11-Brom-1-undecanol sowie als Diazo­ niumsalz 2-Methoxy-4-morpholinobenzol-diazoniumchlorid-Zink­ chlorid-Doppelsalz. Ein diagnostisches Mittel, das u. a. diese Substanzen enthält, hat sich bei Untersuchungen zum Nachweis von Leukozyten im Harn als besonders geeignet her­ ausgestellt, da dieses diagnostische Mittel eine hohe Emp­ findlichkeit aufweist. So läßt sich beispielsweise eine Kon­ zentration von ca. 10-25 Leukozyten/µL Harn nach 1-2 Mi­ nuten mit diesem diagnostischen Mittel sicher nachweisen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert:
Beispiel 1 Herstellung von Substraten
Synthese von O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvaleriansäure-4- methoxy-1-naphthylester 7
Die Verbindung wird in einer vierstufigen Synthese aus α- Hydroxyvaleriansäureethylester 2 hergestellt:
1) O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvaleriansäureethylester 3
5,4 g (56 mmol) Tosylchlorid werden in Pyridin gelöst und bei 0°C werden 5,0 g (34 mmol) α-Hydroxyvaleriansäuree­ thylester 2 zugegeben. Nach ca. 12 Std. wird mit Methylen­ chlorid verdünnt und unter Eiskühlung wird Salzsäure zugege­ ben. Die wäßrige Phase wird mit Methylenchlorid extrahiert und die vereinigten organischen Phasen werden mit Molsieb (4 A) getrocknet und im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 7,7 g (92%) gelbes Öl.
2) O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvaleriansäure 4
7,7 g (25 mmol) O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvalerian­ säureethylester 3 werden mit Eis, Methanol und 1 N Natron­ lauge versetzt. Nach 2 Stunden intensiven Rührens wird mit Salzsäure angesäuert und mit Methylenchlorid mehrfach extra­ hiert. Die organische Phase wird mit Molsieb (4 A) getrock­ net und im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 5,6 g (81%) fast farbloses Öl, das beim Abkühlen kristallisiert.
3) O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hvdroxyvaleriansäurechlorid 5
4,0 g (15 mmol) O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvaleriansäure 4 werden mit Thionylchlorid 15 Minuten unter Rückfluß ge­ kocht. Anschließend wird überschüssiges Thionylchlorid in der Wärme mit Stickstoff ausgetrieben. Ausbeute: 4.1 g (96%) gelbes Öl.
4) O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvaleriansäure-4-methoxy-1- naphthylester 7
Zu 1,04 g (6 mmol) 4-Methoxy-1-naphthol, 1,0 g Magnesiumsul­ fat und 3,0 g Pyridin in Tetrahydrofuran werden bei 0°C 2,05 g (7 mmol, ca. 1,2 eq) O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydro­ xyvaleriansäurechlorid 5 gegeben. Nach 60 Minuten wird die Reaktionsmischung im Vakuum eingeengt, in Methylenchlorid aufgenommen und mit verd. Zitronensäure, gesättigter Natri­ umhydrogen-carbonatlösung und gesättigter Kochsalzlösung ge­ waschen. Die organische Phase wird anschließend mit Magnesi­ umsulfat getrocknet, kurz mit Aktivkohle gerührt, filtriert und im Vakuum eingeengt. Man erhält ein grünes Öl, aus Me­ thylenchlorid/Petrolether fallen in der Kälte cremefarbene Kristalle. Ausbeute: 750 mg (29%).
1H-NMR (CDCl3): 0,95 (t, 3 H), 1,55 (m, 2 H), 2,08 (m, 2 H), 2,40 (s, 3 H), 4,00 (s, 3 H), 5,20 (t, 1 H), 6,70 (d, 1 H), 7,02 (d, 1 H), 7,30 (d, 2 H), 7,50 (m, 2 H), 7,70 (m, 1 H), 7,90 (d, 2 H), 8,25 (m, 1 H). Smp: 80-85°C, Rf-Wert: 0,66 (Ether/Petrolether 2 : 1, Macherey-Nagel Polygram SIL/G UV254, Detektion: UV 254 nm).
Es wurden ferner folgende Verbindungen in ähnlicher Weise synthetisiert:
O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvaleriansäure-3-indoxylester 6 1
H-NMR (CDCl3
): 0,92 (t, 3H), 1,48 (m, 2 H), 2,00 (m, 2 H), 2,35 (s, 3 H), 5,12 (t, 1 H), 7,08 (t, 1 H), 7,20 (m, 2 H), 7,28 (m, 3 H), 7,40 (d, 1 H), 7,85 (d, 2 H), 8,42 (br s, 1 H). Smp: 57-59°C, Rf-Wert: 0,48 (Ether/Petrolether 2 : 1, Macherey-Nagel Polygram SIL/G UV254, Detektion: NH3
-Gas, blau)
O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvaleriansäure-1-naphthylester 8
Smp: 87-88°C, Rf-Wert: 0,73 (Ether/Petrolether 2 : 1, Ma­ cherey-Nagel Polygram SIL/G UV254, Detektion: UV 254 nm)
O-(Propylsulfonyl)-α-hydroxyvaleriansäure-3-indoxylester 9
Smp: 87°C, Rf-Wert: 0,55 (Ether/Petrolether 2 : 1, Macherey- Nagel Polygram SIL/G UV 254, Detektion: NH3
-Gas, blau)
O-(Methylsulfonyll-α-hydroxyvaleriansäure-3-indoxylester 10
Smp: 73°C, Rf-Wert: 0,39 (Ether/Petrolether 2 : 1, Macherey- Nagel Polygram SIL/G UV 254, Detektion: NH3
-Gas, blau)
O-Benzoyl-α-hydroxyvaleriansäure-3-indoxylester 11 1
H-NMR (CDCl3
): 1,05 (t, 3 H), 1,68 (m, 2 H), 2,18 (m, 2 H), 5,55 (t, 1 H), 7,10 (m, 1 H), 7,15 (m, 1 H), 7,25 (m, 2 H), 7,45 (m, 3 H), 7,58 (m, 1 H), 7,92 (br s, 1 H), 8,15 (d, 2 H). Smp: 123-125°C, Rf-Wert: 0,60 (Ether/Petrolether 2 : 1, Macherey-Nagel Polygram SIL/G UV254, Detektion: NH3
-Gas, blau)
Die Verbindungen 6-11 stellen nur einige Beispiele dar. Die Synthese weiterer Substrate mit veränderter Substitution für die diagnostischen Mittel gemäß Anspruch 1 ist dem Fach­ mann anhand dieser Beispiele ohne weiteres möglich.
Beispiel 2 Diagnostisches Mittel
Filterpapier (z. B. MN 215, Macherey-Nagel) wird nacheinan­ der mit den folgenden Lösungen imprägniert und nach jeder Imprägnierung mit IR-Strahlern getrocknet:
  • 1. 50 mL 1,0 m Borsäurepuffer pH 8,0
    10 g Phosphorsäuretrimorpholid
    ad 100 mL Methanol
  • 2. 15 mg 2-Methoxy-4-morpholinobenzoldiazoniumchlorid- Zinkchlorid-Doppelsalz
    30 mg O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvaleriansäure-3- indoxylester 6
    200 mg 6-Chlor-1-hexanol (alternativ 100 mg 11-Brom-1- undecanol)
    20 mL Aceton
Das imprägnierte Papier wird nach dem Trocknen zu Teststrei­ fen mit 5 × 5 mm großen Testfeldern verarbeitet. Das Test­ feld ergibt beim Eintauchen in leukozytenhaltigen Harn be­ reits bei einem Leukozytengehalt von 10-25 Leukozyten/mL Harn nach 1-2 Minuten eine rosa Färbung. Mit stark leuko­ zytenhaltigem Harn (<500 Leukozyten/µL Harn) entsteht nach kurzer Zeit ein intensiv violett gefärbtes Testfeld. Die Auswertung des Testfeldes kann sowohl visuell als auch re­ missionsphotometrisch vorgenommen werden. Zur remissionspho­ tometrischen Auswertung (z. B. mit URICOLOR von Macherey- Nagel) ist die Verwendung einer grünen LED (560 nm) bevor­ zugt.
Unter Verwendung der anderen unter Beispiel 1 erwähnten In­ doxylester 9-11 anstelle von 6 erhält man beim Eintauchen in leukozytenhaltigen Harn ebenfalls violett gefärbte Test­ felder.
Obige Rezeptur für ein diagnostisches Mittel ist eine von vielen möglichen Ausführungsformen. Neben Variationen von pH-Wert, Puffer, Konzentration der Rezepturbestandteile und Lösungsmittel ist der Einsatz weiterer geeigneter Hilfsmit­ tel (z. B. Stabilisatoren, Detergentien, etc.) möglich, die dem Fachmann bekannt sind. Außerdem sind die Reihenfolge so­ wie die Anzahl der Imprägnierungen und das imprägnierte Me­ dium nicht festgelegt.
Beispiel 3 Diagnostisches Mittel
Filterpapier (z. B. MN 818, Macherey-Nagel) wird nacheinan­ der mit den folgenden Lösungen imprägniert und nach jeder Imprägnierung mit IR-Strahlern getrocknet:
  • 1. 80 mL 1,0 m Borsäurepuffer, pH 7,6
    10 g Phosphorsäuretrimorpholid
    ad 100 mL Methanol
  • 2. 15 mg Diazoniumsalz (siehe folgende Tabelle)
    50 mg O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvaleriansäure- 4-methoxy-1-naphthylester 7
    400 mg Decanol
    20 mL iso-Propanol
Das imprägnierte Papier wird nach dem Trocknen zu Teststrei­ fen mit 5 × 5 mm großen Testfeldern verarbeitet. Das Test­ feld ergibt beim Eintauchen in stark leukozytenhaltigen Harn je nach verwendetem Diazoniumsalz folgende Färbungen:
Diazoniumsalz
Farbe
2-Methoxy-4-morpholinobenzol-diazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz blau
4-Benzoylamido-2-methoxy-5-methyl-benzoldiazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz rotviolett
4-Benzoylamido-2,5-diethoxy-benzoldiazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz braunviolett
4-Benzoylamido-2,5-dimethoxy-benzoldiazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz violett

Claims (13)

1. Diagnostisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Substrat einen Ester der α-Hydroxyvaleriansäure mit der allgemeinen Formel umfaßt:
in der R eine Gruppe darstellt, die nach Spaltung des Esters als R-OH in einer Nachweisreaktion erfaßt werden kann, und R' eine Alkoholschutzgruppe ist.
2. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß RO eine substituierte oder unsubstituierte Indoxyl-, Thioindoxyl-, Phenol- oder Naphtholgruppe um­ faßt.
3. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R' eine Sulfonylgruppe, insbesondere eine Arylsulfonylgruppe oder Alkylsulfonylgruppe oder eine Benzoylgruppe umfaßt.
4. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner einen Aktivator umfaßt.
5. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Aktivator 6-Chlor-1-hexanol oder 11- Brom-1-undecanol ist.
6. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner ein Diazoniumsalz umfaßt.
7. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Diazoniumsalz aus der Gruppe ausge­ wählt ist, die 4-Benzoylamido-2-methoxy-5-methyl-ben­ zoldiazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz, 4-Benzoyl­ amido-2,5-diethoxybenzoldiazoniumchlorid-Zinkchlorid- Doppelsalz, 4-Benzoylamido-2, 5-dimethoxy-benzoldiazo­ niumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz und 2-Methoxy-4- morpholinobenzol-diazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz umfaßt.
8. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner einen Träger, Puf­ fer, Lösungsmittel sowie weitere Hilfsmittel umfaßt.
9. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat O-(4'-Toluol­ sulfonyl)-α-hydroxyvaleriansäure-3-indoxylester und der Aktivator 6-Chlor-1-hexanol oder 11-Brom-1-undecanol ist.
10. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es ferner als Diazoniumsalz 2-Methoxy-4- morpholinobenzol-diazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz umfaßt.
11. O-(4'Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvaleriansäure-3-indoxyl­ ester.
12. Verwendung von O-(4'-Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvalerian­ säure-3-indoxylester als Substrat für diagnostische Mit­ tel.
13. Verfahren zur Herstellung von O-(4'-Toluolsulfonyl)-α- hydroxyvaleriansäure-3-indoxylester, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man α-Hydroxyvaleriansäureethylester mit Tosylchlorid umsetzt, den entstandenen Ester durch Hy­ drolyse der Ethylesterfunktion in die entsprechende Car­ bonsäure überführt, die Carbonsäure mit Thionylchlorid zum Säurechlorid umgesetzt und dieses mit Indoxyl um­ setzt.
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