DE19952568C2

DE19952568C2 - Fluoreszenzmarkierte Nukleinsäure-Liganden

Info

Publication number: DE19952568C2
Application number: DE19952568A
Authority: DE
Inventors: Volker A Erdmann; Jens Peter Fuerste; Claudia Gauglitz; Sven Klusmann
Original assignee: Noxxon Pharma AG
Current assignee: TME Pharma AG
Priority date: 1999-11-02
Filing date: 1999-11-02
Publication date: 2003-05-22
Anticipated expiration: 2019-11-03
Also published as: DE19952568A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentrationsbestimmung eines Zielmole küls gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1; ferner ein Verfahren zur schnellen und direkten Bestimmung von Bindungskonstanten eines Ligand-Target-Komplexes gemäß Anspruch 20, insbesondere unter Verwendung von Nukleinsäuren als Li ganden; ferner die Verwendung dieses Verfahrens im Rahmen diagnostischer und analytischer Untersuchungen.

Diagnostika dienen der Überprüfung von Zustand und Funktion des menschlichen Körpers und seiner Organe. Sie können prinzipiell im und am Organismus (unmittel bar) oder außerhalb des Körpers (mittelbar) angewandt werden. Zu den mittelbaren Diagnostika zählen unter anderem die Reagenzien der Harn- und Blutanalytik. Die unmittelbaren, oral oder parenteral zu applizierenden Diagnostika können für die Stoffwechsel-, Funktions- und Organdiagnostik verwendet werden. Diagnostika die nen der Kontrolle des Krankheitsverlaufs, der Therapiekontrolle sowie der Therapie steuerung. Sie können chemischer, biochemischer oder immunologischer Herkunft sein. Die mit Diagnostika durchgeführten Bestimmungsmethoden sollten bei hoher Spezifität, Genauigkeit und Nachweisempfindlichkeit schnell und einfach durchführ bar und nach Möglichkeit auch automatisierbar sein.

Viele diagnostische und umweltanalytische Verfahren beruhen darauf, bestimmte Substanzen und deren Konzentrationen in physiologischen oder nichtphysiologi schen Testmedien nachzuweisen. Die Art und Funktion des nachzuweisenden Mo leküls kann dabei stark variieren. Es kann sich dabei um makro- oder niedermoleku lare körpereigene Stoffe aber auch um Arznei- oder Giftstoffe (z. B. Pestizide) han deln, deren Konzentration im Serum, in Organen oder auch in Boden- oder Luftpro ben nachzuweisen sind. Da die Konzentration der nachzuweisenden Stoffe häufig sehr niedrig ist, ist es wichtig, empfindliche und zuverlässige analytische Methoden zur Verfügung zu haben.

Bei der Suche nach neuen Diagnostika ist die Bestimmung der Bindungskonstanten des Targetkomplexes von essentieller Bedeutung. Die Wechselwirkungen zwischen einem Diagnostikum und dessen Zielstrukturen werden durch physikalisch chemisch definierbare Bindungskräfte bestimmt. Das Ausmaß dieser Kräfte hängt von der Art und Anzahl der Partialstrukturen ab, die an der Bindung beteiligt sind. Auch die stereochemischen Möglichkeiten, die die Moleküle zur Anpassung an mak romolekulare Bindungspartner (z. B. Proteine und Rezeptoren) oder auch kleinere Targetstrukturen (z. B. niedermolekulare Arzneistoffe, Neurotransmitter) haben, wir ken sich entscheidend auf die Stärke der Komplexbildung aus.

In der modernen Labordiagnostik haben sich Immunoassays aufgrund der hohen Spezifität der hierbei verwendeten Antikörper etabliert. Antigene Substanzen wer den dabei in vitro durch Antigen-Antikörper-Reaktionen als Prinzip immunologischer und serologischer Testverfahren mit unterschiedlichem Testaufbau nachgewiesen. Antigene und Antikörper können dabei frei (gelöst) oder gebunden, markiert oder unmarkiert vorliegen. Die Möglichkeit der Markierung eines Antikörpers ist dabei vielfältig (z. B. mit einem Radionuklid, einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem En zym) und hängt vom gewählten Nachweisverfahren ab. Bei den Immungssays kön nen kompetitive und nichtkompetitive Nachweismethoden angewandt werden. Die Antigen-Antikörper-Komplexbildung kann direkt (z. B. turbimetrisch, nephelo metrisch oder mit Hilfe der Biosensorik) oder indirekt (anhand der Markierung) aus gewertet werden.

Bei kompetitiven Immungssays werden die nicht durch ein Antigen gebundenen Bindungsstellen des Antikörpers durch Zugabe eines weiteren markierten Antikör pers (Anti-Komplex-Antikörper, Reporter) nachgewiesen (Cook & Self, 1995). Der Nachweis ist besonders problematisch, wenn geringe Konzentrationen einer antige nen Struktur bestimmt werden sollen. In diesem Fall wird eine große Menge des Reporters gebunden. Das Ausgangssignal ist daher zwangsläufig hoch. Der Unter schied der Signalstärke zweier Proben mit niedrigen, aber unterschiedlichen Anti genkonzentrationen wird somit im Verhältnis zur Gesamtsignalstärke sehr klein. Kompetitive Assays besitzen deshalb eine eingeschränkte Sensitivität. Eine weitere Variante eines kompetitiven Immungssays ist der Einsatz zweier Antikörper, die miteinander um das Antigenepitop konkurrieren. Bei Zugabe des zweiten Antikör pers, wird der erste aus dem gebildeten Komplex verdrängt. Nachgewiesen wird dann die Konzentration des freien ersten Antikörpers.

Zu den wichtigsten nichtkompetitiven Immungssays zählt das Sandwich-Verfahren. Bei diesem Assay werden ebenfalls zwei Antikörper eingesetzt. Diese konkurrieren jedoch nicht miteinander um die gleiche Bindungsstelle. Entweder erkennen sie ver schiedene Epitope des Antigens oder der zweite Antikörper bindet an den bereits im Komplex befindlichen, ersten Antikörper. In beiden Fällen ist der nachträglich zuge gebene Antikörper markiert und seine Komplexkonzentration wird gemessen. Nachteilig an dem Sandwich-Verfahren ist die Schwierigkeit der Herstellung von Antikörpern gegen niedermolekulare Stoffe wie z. B. das hier verwendete Adenosin. Zum einen ist es generell problematisch, bei niedermolekularen Verbindungen, wie es die meisten Arzneistoffe, Drogen, Umweltgifte, kleinere Peptide und Metaboliten sind, Antikörper gegen zwei unterschiedliche Epitope der antigenen Struktur zu ent wickeln. Ein weiteres Problem ist es, daß beim Sandwich-Assay beide Antikörper gleichzeitig an das antigene Molekül binden müssen. Damit läßt sich das Sandwich- Verfahrens zum Nachweis sehr kleiner Moleküle nicht mehr anwenden.

Als der Erfindung nächstkommender Stand der Technik beschreiben Kleinjung et al. (Anal. Chem. 70 (1998), 328-331) beschreiben einen Biosensor für L-Adenosin, bei dem modifizierte Nukleotide eingeführt werden können, um ein Bindungsereignis direkt darzustellen, wobei die spezifische Position der fluoreszierenden Gruppe in nerhalb einer als Liganden dienenden Nukleinsäure jedoch nicht spezifiziert ist.

Die DE 37 85 591 T2 offenbart keine spezifische Ausgestaltung des dort verwende ten Nukleinsäure-Liganden. Diese Druckschrift offenbart nicht die spezifische Aus gestaltung des Nukleinsäure-Liganden; die Markierung ist terminal angebracht und nicht, wie Gegenstand der vorliegenden Erfindung in einer Schleife oder einer un gepaarten Region der Nukleinsäure, wobei hier ungepaart im. Sinne eines "bulge" zu verstehen ist und nicht etwa auch ein 5'- oder 3'-Ende einer Nukleinsäuresequenz bezeichnen kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es mithin, ein System zur direkten und nichtkompetitiven Bestimmung von Dissoziationskonstanten zwischen einem Ligan den und seinem Targetmolekül zur Verfügung zu stellen. Weitere Aufgabe der Er findung ist es, dieses System ohne Markierung mit radioaktiven Isotopen zur Verfü gung zu stellen.

Die in vitro-Evolution bietet die Möglichkeit, ausgehend von großen Nukleinsäurebibliotheken hochaffine RNAs (haRNAs) oder DNAs (haDNAs) gegen nahezu jedes beliebige Target (z. B. Arzneistoffe, Hormone, Neurotransmitter, Metaboliten, Proteine und Pestizide) zu entwickeln (Gold et al., 1995; Uphoff et al., 1996). Diese Nukleinsäureliganden, die je nach ihrer Struktur als Aptamere (Ellington & Szostak, 1990) oder Spiegelmere (Klußmann et al., 1996; Klußmann et al., 1990; PCT/EP 97/04726) bezeichnet werden können, binden ihr Target wie ein Antikörper mit hoher Affinität und Spezifität. Im Gegensatz zu den Antikörpern besitzen sie jedoch den enormen Vorteil, daß sie chemisch synthetisierbar sind. Auch die US 5,958,691 beschreibt den Einbau modifizierter Nukleotide während des Verfahrens der in vitro-Evolution (SELEX) von Aptameren und stellt allgemeinen Stand der Technik dar.

Hochaffine Nukleinsäuren zeichnen sich im Vergleich zu Antikörpern durch ihren einfachen Aufbau und ihre geringe Größe aus. Während ein Nukleinsäureligand aus einer oder zwei miteinander hybridisierten kurzen Oligonukleotidketten (ca. 15 bis 60 Nukleotide) besteht, ist ein IgG-Antikörper aus vier Polypeptidketten zusammenge setzt, die zudem noch über mehrere Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Mit einer molaren Masse von ca. 150.000 Da enthält ein Antikörper ca. 1360 Aminosäu ren. Ein großer Vorteil, den hochaffine Nukleinsäuren somit gegenüber Antikörpern haben, ist die Möglichkeit, sie chemisch herstellen zu können.

Die chemische Synthese bietet ein Werkzeug zum Einbau modifizierter Nukleotide an vorbestimmte Positionen innerhalb eines Liganden. Dies ist z. B. wichtig für die Stabilisierung eines Liganden gegenüber enzymatischer Spaltung oder auch bei der Strukturanalyse von Nukleinsäureliganden bzw. Ligand-Target-Komplexen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale. Durch diese erfindungsgemäßen Maßnahmen wird ein System zur direkten und nichtkompetitiven Bestimmung von Dissoziationskonstanten zwischen einem Ligan den und seinem Targetmolekül durch Fluoreszenztitration geschaffen. Die Erfindung arbeitet ohne Markierung mit radioaktiven Isotopen und verknüpft zwei Techniken miteinander, die in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen haben, nämlich die in vitro-Evolution von Nukleinsäuren und die Fluoreszenzspektroskopie.

Durch den erfindungsgemäßen Einbau einer fluoreszierenden Base in einen Nuk leinsäure-Liganden ist es nunmehr möglich, über die Bindungskonstante eines Li gand-Target-Komplexes und damit auch über die Targetkonzentration in der Testlö sung Aussagen treffen zu können. Meßgröße ist hierbei die Änderung der Fluores zenzintensität der Nukleinsäure bei Komplexbildung. Die Integration der Reporter gruppe in den Liganden ermöglicht eine nichtkompetitive analytische Messung und liefert dadurch bessere Ergebnisse als kompetitive Methoden. Als Reportergruppe wird vorzugsweise - aber nicht ausschließlich - 1,N⁶-Ethenoadenosin verwendet, das nach Bestrahlung mit Licht der Wellenlänge 300 nm starke Fluoreszenz mit ei nem Maximum bei 410 nm aufweist. Der Fluorophor ersetzt in der Sequenz des Liganden ein Adenosin, das sich vorzugsweise in einer Loop- oder Bulge-Position befindet. Da an dieser Position keine Basenpaarung vorliegt, wird die räumliche Struktur des Moleküls auch nach Substitution weitgehend erhalten bleiben. Dadurch ist eine vergleichsweise starke Bindung des Targetmoleküls an den neuen RNA- Liganden wahrscheinlich. Die Fluoreszenzintensität der Reportergruppe ist überra schenderweise trotz eines möglichen Quenchingeffektes durch den Einbau in ein Oligomer noch ausreichend stark. Die Position der Reportergruppe innerhalb des Oligoribonukleotidliganden wird deshalb so gewählt, daß bei Bindung des Targetmo leküls an den Liganden ein deutlicher Effekt auf die Fluoreszenzeigenschaften der Testlösung nachzuweisen ist (Fluoreszenzsminderung oder -steigerung in Abhän gigkeit von der zugegebenen Targetmenge und damit auch von der Konzentration des entstehenden Komplexes).

Im Sinne der Erfindung werden als "bulge"-Regionen im Englischen ungepaarte Nukleinsäure-Regionen bezeichnet. Die der Erfindung zugrundeliegende Markie rung ist in einer Schleife oder einer ungepaarten Region der Nukleinsäure angeord net, wobei hier ungepaart im Sinne eines "bulge" zu verstehen ist und nicht etwa auch ein 5- oder 3'-Ende einer Nukleinsäuresequenz bezeichnen kann.

Durch die vorliegende Erfindung wird ein System zur direkten und nicht radioaktiven Bestimmung von Dissoziationskonstanten zwischen Nukleinsäureliganden und ih rem Zielmolekül geschaffen. Durch den Austausch von Adenosin durch 1,N⁶- Ethenoadenosin, eines fluoreszierenden Derivats des natürlich vorkommenden Nukleotids Adenosin, in eine Nukleinsäure (D-DNA oder L-DNA oder D-RNA oder L- RNA) mittels automatisierter Phosphoramidit-Festphasensynthese kann ein Nukleinsäureligand hergestellt werden, der zusätzlich zu seinen bindenden Eigen schaften selbst als Signalmolekül zur fluorimetrischen Detektion dient. Das Problem der geringen Stabilität des Fluorophors in basischem Milieu kann durch den Einsatz von Phosphoramiditen mit leicht abspaltbaren Schutzgruppen an den Aminofunktio nen und daraus folgenden geringen alkalischen Entschützungszeiten umgangen werden. Die durch direkte fluorimetrische Titration erhaltenen Dissoziationskonstan ten sind mit denen vergleichbar, die durch die nichtkompetitive Gleichgewichtsdialy se erhalten werden. Durch den Austausch des Adenosins an verschiedene Positio nen eines Nukleinsäureliganden können zudem erste Aussagen über seine Beteili gung am Bindungsvorgang bei der Komplexbildung gemacht werden (kinetische Messungen).

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren für hochaffine Nukleinsäuren ist es möglich auch sehr kleine Moleküle in der klinischen Diagnostik nachzuweisen. Bei fluori metrischer Quantifizierung von Komplexen zwischen hochaffinen Nukleinsäuren und ihrem Target war es bisher notwendig, den Analyten nach der Selektion durch Kopplung mit einer fluoreszierenden Reportergruppe zu modifizieren. Somit wurde nicht die Affinität zwischen Ligand und Target, sondern die Affinität zum modifizier ten Bindungspartner gemessen. Erst mit der kompetitiven Verdrängung des modifi zierten Moleküls durch seine unmodifizierte Variante konnten Erkenntnisse über den Bindungsvorgang gesammelt werden, der untersucht werden sollte. Nachteil einer kompetitiven Bestimmung von Bindungskonstanten gegenüber eines nichtkompetiti ven Assays ist die größere Ungenauigkeit des Verfahrens. Bei Anwendung eines kompetitiven Verfahrens werden zwei Bindungsvorgänge quantifiziert. Dieses kann zu einer erhöhten Meßungenauigkeit führen. Ein Vergleich von Dissoziati onskonstanten, die mit nichtkompetitiven und kompetitiven Verfahren parallel ermit telt wurden, zeigt deutliche Unterschiede zwischen den ermittelten K_d-Werten (Jeni son et al., 1994; Klußmann, 1996). Der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein gesetzte Ligand hingegen hat eine fluoreszierende Reportergruppe in seiner Se quenz integriert. Somit ist eine fluorimetrische Quantifizierung auch ohne zusätzli che Markierung des Targets möglich.

Vorteilhaft hat sich die Verwendung von 1,N⁶-Ethenoadenosin als Fluorophor zum Einbau in einen Liganden erwiesen. Die Base 1,N⁶-Ethenoadenin kann physiolo gisch durch den Kontakt mit Vinylhalogeniden, Urethanen und Vinylcarbamaten aus Adenin gebildet werden (Barbin et al., 1975). Diese karzinogenen Verbindungen sind gängige Industriechemikalien und werden durch das Cytochrom-P450 System zu ihren entsprechenden Epoxiden metabolisiert. Die so entstandenen hoch reakti ven Verbindungen können Adenosin, Cytosin und Guanosin zu den zyklischen DNA-Addukten, 1,N⁶-Ethenodesoxyadenosin, N²,3-Ethenodesoxyguanosin und 3,N⁴-Ethenodesoxycytosin modifizieren. In den betroffenen DNA-Regionen entste hen dann Fehler bei der Replikation und Transkription (Barbin et at, 1981; Hall et at 1981; Kusmierek & Singer, 1982).

1,N⁶-Ethenoadenosin weist große strukturelle Ähnlichkeit zum natürlich in der Nuk leinsäure vorkommendem Adenosin auf. Als Nukleotid unterbricht es das Zucker- Phosphat-Rückgrad der Nukleinsäurestruktur nicht. Außerdem besitzt das fluores zierende Nukleotid in etwa die gleiche Größe wie die vier natürlichen Nukleotide und beeinflusst deshalb die Sekundär- und Tertiärstruktur des Liganden und somit auch die Bildung eines Liganden-Target-Komplexes kaum. Als aromatischer Fluorophor ist es bei Anregung durch Licht zur Eigenfluoreszenz fähig. 1,N⁶-Ethenoadenosin zeigt starke Fluoreszenz mit einer Lebensdauer von 20 nsec in Wasser. Bei Anre gung mit Licht der Wellenlänge 300 nm liegt das Fluoreszenzmaximum im neutralen Milieu bei 410 nm (Barrio et al., 1972).

Die Platzierung des 1,N⁶-Ethenoadenosins in eine Loop- oder Bulge-Region des Liganden hat sich als vorteilhaft erwiesen, weil keine Doppelstrangregionen oder Helixstrukturen durch Störung von Watson-Crick Basenpaarungen aufgebrochen werden. Durch die Ethenobrücke zwischen den Positionen N1 und N6 des Adeno sins und dem dadurch entstandenen zusätzlichen dritten Ring im Molekül steht der Wasserstoff an N1 des Adenosins nicht mehr für die Ausbildung einer Wasserstoff brückenbindung mit dem Sauerstoff des Uridins zur Verfügung. An der Position N6 ändert sich außerdem die sterische Ausrichtung des freien Elektronenpaares des Stickstoffatoms. Auch hier kann keine Wasserstoffbrücke mehr mit Uridin ausgebil det werden.

Hervorzuheben ist, dass Ethenoadenosin nur eines der möglichen von vielen be kannten fluoreszenten Basenanaloga ist. Weiterhin sind auch fluoreszente Gruppen denkbar, die an andere Positionen der Nukleinsäure gehängt werden (z. B. an den Zucker, an die Phosphodiesterbindung oder 5'- bzw. 3'-terminal).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die D-Nucleinsäuren D-Ribonucleinsäuren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah rens sind die D-Ribonucleinsäuren Ribozyme.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die D-Nucleinsäuren D-Desoxyribonucleinsäuren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah rens sind die D-Ribonucleinsäuren Desoxyribozyme.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Zielmolekül ein Peptid, ein Polypeptid, oder ein aus mehreren Polypeptiden zusam mengesetztes Protein. Erfindungsgemäß wird unter Peptid, Polypeptid und Protein jedes dieser (Makro)Moleküle verstanden, mit der die D-Nucleinsäuren wechselwir ken können. Beispiele derartiger (Makro)Moleküle sind Enzyme, Strukturproteine und Hormone. Die (Makro)Moleküle können demgemäß Bestandteile einer größeren Struktur sein oder frei in biologischen Systemen in Lösung vorliegen.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Zielmolekül eine einzelsträngige RNA, eine doppelsträngige RNA, eine ein zelsträngige DNA oder eine doppelsträngige DNA, sowie Kombinationen daraus.

Für den Fachmann ist selbstverständlich, daß diese Nukleinsäuren unter verschie denen Bedingungen verschiedene Konformationen einnehmen können. Das erfin dungsgemäße Verfahren umfaßt jede Konformation, die diese (Makro)Moleküle o der Kombinationen daraus einnehmen können. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt weiterhin Kombinationen dieser Makromoleküle. Solche Kombinationen können beispielsweise aus einzel- und doppelsträngiger RNA oder DNA oder aus Tripelhelices bestehen.

Ein Antibiotikum oder ein pharmazeutisch wirksames Substrat ist das Zielmolekül einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Zielmolekül in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemä ßen Verfahrens ist ein Zuckermolekül. Der Begriff "Zuckermolekül", wie hier ver wendet, betrifft sowohl monomere als auch zusammengesetzte komplexe Zucker strukturen.

Die Erfindung betrifft ferner L-Nucleinsäuren, die spezifisch an ein wie vorstehend definiertes Zielmolekül binden.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße L- Nucleinsäure eine L-Ribonucleinsäure. Diese L-Ribonucleinsäure kann in einzel- oder doppelsträngiger Form vorliegen.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemä ße L-Nucleinsäure ein Ribozym.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemä ße L-Nucleinsäure eine L-Desoxyribonucleinsäure.

Wie bereits für die erfindungsgemäßen L-Ribonucleinsäuren bemerkt, kann die L- Desoxyribonucleinsäure in einzel- oder doppelsträngiger Form vorliegen.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemä ße L-Nucleinsäure ein Desoxyribozym.

Schließlich betrifft die Erfindung einen Kit. Der erfindungsgemäße Kit kann für dia gnostische und analytische Zwecke verwendet werden. Da die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, wie vorstehend beschrieben, in ähnlicher Weise wie monoclonale Antikörper eingesetzt werden können, bietet sich dem Fachmann als Einsatzgebiet für den erfindungsgemäßen Kit das gesamte Spektrum der diagnostischen Möglich keiten monoklonaler Antikörper.

Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren mit den im Stand der Technik be kannten Methoden zur biosensorischen Messung verwendet werden. Der Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß im Gegensatz zu beschriebenen Verfahren (Kleinjung et al., Anal. Chem. 70 (1998), 328-331) der Analyt in unmodifizierter Form in Echtzeit zu erfassen ist.

Mithin kombiniert das erfindungsgemäße Verfahren zusammenfassend die Methode der in vitro-Evolution von Nukleinsäuren mit fluorometrischen Bestimmungsmetho den. Durch eine nachfolgende Synthese des entsprechenden fluoreszierenden L- RNA-Liganden gegen das natürlich vorkommende D-Adenosin (Spiegel-Design) steht ein potentes nichtradioaktives und nukleasestabiles Diagnostikum zur Verfü gung.

Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen enthalten. Die Erfindung ist in den anliegenden Zeichnungen dargestellt und wird nachfolgend näher beschrieben. Es zeigt:

Fig. 1 Die 2'-O-tert-Butyldimethylsilyl-5'-O-(4,4'- Dimethoxytrityl)-β-D-ribonukleosid-3'-O-β-cyanoethyl- N,N'-diisopropyl-phoshoramidite der einzelnen Ba sen.

Fig. 2 Sekundärstruktur des RNA-Liganden D- A649_38. Das Modell zeigt alle sechs synthetisierten Oligoribonukleotidstränge. Die Struktur wurde mit dem Computer-programm RNA FOLD berechnet. Die Positionen, an denen ein Adenosin gegen ein 1,N⁶- Ethenoadenosin ausgetauscht wurde, sind mit der Bezeichnung des Oligomers gekennzeichnet. Die Namen der unmodifizierten Ligandenhälften wurden mit den Suffixen (u) bzw. (l) versehen.

Die Fig. 1 zeigt die 2'-O-tert-Butyldimethylsilyl-5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-β-D- ribonukleosid-3'-O-β-cyanoethyl-N,N'-diisopropyl-phoshoramidite der einzelnen Ba sen, nämlich
A: N⁶-tert-Butylphenoxyacetyl-adenyl
B: N⁴-fert-Butylphenoxyacetyl-cytosyl
C: N²-tert-Butylphenoxyacetyl-guanyl
D: Uracyl
E: 1,N⁶-Ethenoadenosyl

Fig. 2 zeigt die Sekundärstruktur des RNA-Liganden D-A649_38. Das Modell zeigt alle sechs synthetisierten Oligoribonukleotidstränge. Die Struktur wurde mit dem Computer-programm RNA FOLD berechnet. Die Positionen, an denen ein Adenosin gegen ein 1,N⁶-Ethenoadenosin ausgetauscht wurde, sind mit der Bezeichnung des Oligomers gekennzeichnet. Die Namen der unmodifizierten Ligandenhälften wurden mit den Suffixen (u) bzw. (l) versehen:
(u): oberer Strang (upper)
(f): unterer Strang (lower)

Die Erfindung sei an folgendem Beispiel der Positionierung eines fluoreszierenden Reporternukleotids in einen durch in vitro-Evolution gewonnenen RNA-Liganden erläutert, mit dem ein Fluoreszenzassay zur direkten Bestimmung von Bindungs konstanten ermöglicht wird:
Als Testsequenz für die Synthese fluoreszierender Oligoribonukleotide und für den Aufbau des direkten Nachweisverfahrens wurde der an L-Adenosin bindende RNA- Ligand D-A649_38εA25 gewählt (vgl. Fig. 2). Dieser Ligand wurde durch in vitro- Evolution und nachfolgender Deletionsanalyse entwickelt (Klußmann, 1996).

Der verwendete RNA-Ligand D-A649_38∈A25 enthält nach Aussagen der Sekun därstrukturvorhersage (Computerprogramm RNA FOLD, dem der Faltungsalgorith mus nach Zuker und Stiegler zugrunde liegt (Zuker & Stiegler, 1981; Zuker 1989)) vier Adenosine, die sich in einer Bulge- oder Loop-Position befinden. Die Oligoribo nukleotide wurden durch bekannte Festphasensynthese an einem Syntheseautoma ten durchgeführt. Die Ribonukleinsäuren wurden nach dem ebenfalls bekannten Phosphoramidit-Verfahren (Beaucage & Caruthers, 1981) unter Verwendung von Standardlösungsmitteln synthetisiert. Bei den Phosphoramiditen wurde zum Schutz der 2'-Hydroxylgruppen entweder eine Triisopropylsilylgruppe verwendet oder eine tert-Butyldimethylsilylgruppe (tBDMS). Die 5'-Hydroxylgruppen aller Phosphoramidi te wurden durch eine Dimethoxytritylgruppe und der Phosphor durch eine β-Cyanoethyl- und eine Diisopropylamingruppe geschützt. Die Phosphoramidite wurden direkt vor Synthesebeginn in trockenem Acetonitril (Wassergehalt < 0,001%) unter Argon gelöst. Die Endkonzentration betrug 0,15 M für Adenosin, Guanosin, Cytidin und Uracil bzw. 0,2 M für 1,N⁶-Ethenoadenosin in absolutem Ace tonitril. Es wurde der Standardsynthesezyklus verwendet (Nolte et al., 1996). Die Kopplungszeit der Phosphoramidite wurde auf 900 sec festgesetzt, um trotz steri scher Hinderung der voluminösen 2'-Hydroxylschutzgruppen eine ausreichend gute Kopplung zu ermöglichen. Die Synthese begann mit der Abspaltung der säurelabi len DMT-Schutzgruppe mittels Trichloressigsäure (TCA) am Startnukleosid. An schließend wurde das Phosphoramidit des folgenden Nukleosids gemeinsam mit aktivierendem Tetrazol auf die Synthesesäule gegeben. Im Anschluß wurden mit einer Mischung von Acetanhydrid bzw. tert-Butylphenoxy-acetanhydrid mit N- Methylimidazol die nicht gekoppelten 5'-Hydroxylgruppen acyliert (Capping). Nach Kopplung und Capping wurde die trivalente Phosphortriester-Bindung mittels Iodlö sung zu einer stabileren pentavalenten Phosphorbindung oxidiert und der Synthe sezyklus damit beendet.

Der Synthesezyklus wurde so lange wiederholt, bis die erwünschte Kettenlänge erreicht wurde. Abschließend wurde die DMT-Schutzgruppe, die sich am letzten Nukleosid befand, abgespalten. Das Syntheseprodukt wurde unter Argon getrock net. Das bei der Festphasensynthese erhaltene Substanzgemisch muß vor der Auf reinigung vom Säulenmaterial abgespalten und von Schutzgruppen befreit werden. Die Abspaltung des Trägermaterials sowie die Entfernung der Basen- und Phos phatschutzgruppen findet durch alkalische Hydrolyse statt.

Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die synthetisierten RNA-Sequenzen mit 1,N⁶- Ethenoadenosin als fluoreszierendem Nukleotid:

Tabelle 1

Der fluoreszierende Nukleosidbaustein ist äußerst instabil in alkalischem Milieu. Als vorteilhaft haben sich folgende alkalischen Entschützungsbedingungen, denen die Oligoribonukleotide nach der Synthese unterworfen wurden, erwiesen:

Tabelle 2

Die vier chemisch synthetisierten Oligoribonukleotide D-A649_38εA23, D-A649_38εA25, D-A649_38εA48 und D-A649_38εA53 enthielten jeweils ein 1,N⁶-Ethenoadenosin als Reportergruppe in definierter Position (gekennzeichnet durch "ε"). Es wurde dazu ein ungepaartes Adenosin des ursprünglichen D- A649_38 RNA-Liganden durch 1,N⁶-Etheno-adenosin ersetzt (Fig. 2). Durch die Verwendung tert-Butylphenoxyacetyl-geschützter Synthone konnte die Zeit für die Entschützung der freien exozyklischen Aminofunktionen mit wäßrigem Ammoniak auf 30 Minuten gesenkt werden, und somit der Zerstörungsgrad des Fluorophors minimiert werden.

Die Tabelle 3 zeigt die molaren Extinktionskoeffizienten und molare Massen der für die Bindungsanalysen synthetisierten Oligoribonukleotide. Die Oligoribonukleotide εA23, εA25, εA48 und εA53 sind modifiziert. Anhand der Werte der letzten Spalte konnte die gemessene Absorption bei 260 nm direkt in die Masse umgerechnet werden.

Tabelle 3

Bestimmung der Bindungskonstanten

Die Affinität zwischen einem Makromolekül und seinem Targetmolekül wird durch die Dissoziationskonstante des gebildeten Komplexes beschrieben. Wenn dieser Komplex nicht zu einem weiteren Produkt umgesetzt wird, kann die Dissoziati onskonstante mittels direkter "Steady-State"-Studien bestimmt werden. Die Kom plexbildung und ihre Dissoziation kann durch folgende allgemeine Gleichung be schrieben werden:

K_a steht hierbei für die Assoziationskonstante des Komplexes und K_d für dessen Dissoziationskonstante (1/K_a). Die Dissoziationskonstante, die in der Dimension M (molar) angegeben wird, kann über das Massenwirkungsgesetz beschrieben wer den.

Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten wird das Gleichgewicht zwischen Li gand und Target als Funktion der Ligandenkonzentration bei gleichbleibender Tar getkonzentration betrachtet. Hierbei müssen die Konzentrationen des RNA- Liganden, des Targetmoleküls sowie die des gebildeten Komplexes im Gleichge wichtszustand bestimmt werden. Eine Methode, die relativ zuverlässige Bestim mungen der Dissoziationskonstanten im Bereich von 10^-7 bis 10^-3 M zuläßt, ist die Gleichgewichtsdialyse (Uhlenbeck et al., 1970; Bisswanger, 1994). Bei dieser Me thode wird die Konzentration des freien und des komplexierten Targets direkt ge messen.

Für einige RNA-Liganden wurde eine Bestimmung der Dissoziationskonstanten an hand eines Meßpunktes (Einpunktbestimmung) unter Verwendung der oben er wähnten Gleichung durchgeführt. Die fehlenden Werte zur Berechnung der Bin dungskonstanten ergaben sich aus der Messung der Radioaktivität der beiden Kammerhälften und der Kenntnis der eingesetzten Ausgangskonzentrationen an L- Adenosin und Oligoribonukleotid. Die Berechnung der Dissoziationskonstanten durch Einpunktmessung erfolgt durch folgende Formel:

wobei cpm₁ die Aktivität des RNA-enthaltenden Kammerkompartiments und cpm₂ die Aktivität des ausschließlich L-Adenosin-enthaltenden Kammerkompartiments ist.

Die mit dieser Methode erhaltenen Werte wiesen eine relativ starke Streuung aus. Es wurden deshalb Mittelwerte aus drei Bestimmungen gebildet. Um genauere Wer te für die Dissoziationskonstante zu erhalten, wurden bei dem unmodifizierten Li ganden D-A649 38 und dem zur Fluoreszenztitration verwendeten Liganden D- A649_38∈A25 Meßreihen von je sieben Meßpunkten durchgeführt. Hierbei wurden Doppelbestimmungen gemacht und ebenfalls die Mittelwerte der einzelnen Meß punkte der Berechnung des K_d-Wertes zugrunde gelegt. Die ermittelten Bindungs konstanten werden in Tabelle 4 aufgeführt:

Tabelle 4

Diese Tabelle zeigt die Dissoziationskonstanten der Liganden-Target-Komplexe. Dargestellt sind die Dissoziationskonstanten für die einzelnen RNA-Liganden. Die Werte wurden entweder durch Einpunktbestimmungen (a) oder Meßreihen (b) ermit telt.

Die Fig. 2 zeigt ferner, daß verschiedene Adenosine innerhalb des Liganden durch 1,N⁶-Ethenoadenosin ausgetauscht wurden. Drei der vier Modifikationen des Aus gangsliganden zeigten Bindungskonstanten, die um das mindestens 18-fache höher lagen, als die des unmodifizierten Binders. Es ist daher offensichtlich, daß die Ade nosine in diesen Positionen für die Bindung mit dem Targetmolekül von Bedeutung sind. Die Komplexbildung kann z. B. durch nicht aufzubauende Wasserstoffbrücken zwischen der Base und dem Target gestört worden sein. Ferner ist eine sterische Hinderung der Einlagerung des Targets in die Bindungstasche durch den zusätzli chen Imidazolring möglich. Als weitere Möglichkeit ist eine Störung bei der Ausbil dung der Tertiärstruktur in Betracht zu ziehen. Auch in diesem Falle können sich die veränderten Verhältnisse an den Stickstoffatomen der Base bei der Ausbildung von Interaktionen zwischen verschiedenen Basen als störend erweisen.

Eine Modifikation des Ursprungsliganden an Position 25 resultiert in einer Bindungs konstanten, die nur um das etwa 1,5-fache erhöht war. Der Einbau des Fluorophors in dieser Position hat eine Zunahme der Fluoreszenz des Liganden bei Titration mit steigenden Targetkonzentrationen zur Folge. L-Adenosin selbst weist unter den Testbedingungen keine Fluoreszenz auf, so daß sich die Änderung der Fluoreszenzintensität bei Titration auf eine Konformationsänderung des Liganden bei Komplexbildung zurückführen läßt. Aufgrund des Anstiegs der relativen Fluoreszenzintensität bei Anregung mit Licht der Wellenlänge 300 nm und einer Emissionswellenlänge von 410 nm kann die Dissoziationskonstante des Liganden- Target-Komplexes direkt ermittelt werden.

Das Auftreten einer Fluoreszenzsteigerung statt -löschung zeigt zudem, daß das Reporternukleotid, wenn es sich an Position 25 befindet, nicht direkt mit dem Target interagiert. Statt dessen scheint sich die aromatische Dreiringstruktur der Base bei Bindung an das Target durch eine Konformationsänderung der Oligoribonukleo tidstruktur aus dem entstehenden Komplex herauszudrehen. Der Fluorophor steht dann nicht mehr in direktem Kontakt zu den benachbarten Basen, was einen Ener gieaustausch auf Donor-Akzeptor-Basis erschwert oder gar unterdrückt.

Die Fluoreszenzintensität des 1,N⁶-Ethenoadenosins ist sehr sensitiv gegenüber Basenstapelung (base stacking). Schon der Einbau in das Dinukleotid (∈A)p(∈A) senkt die relative Fluoreszenzintensität des Fluorophors um das 14-fache (Tolman et al., 1974). Durch Einbau von 1,N⁶-Ethenoadenosin an Position 73 in die tRNA^Phe von Hefe mit Hilfe von RNA-Ligase T4 erhielt man z. B. eine biochemisch aktive tRNA, bei der die Auflockerung der Sekundär- und Tertiärstruktur (Destacking) nach Zugabe von Magnesiumionen fluoreszenzspektroskopisch zu verfolgen war (Paul sen & Wintermeyer, 1984). Untersuchungen mit der prokaryontischen lntitiator-tRNA (tRNA^fMet) zeigten eine Fluoreszenzabnahme des 1,N⁶-Ethenoadenosins nach Ein bau an Position 73 der tRNA und eine Fluoreszenzzunahme bei Bindung der ent sprechenden aminoacetylierten tRNA an die ribosomalen P-Seite. Auch bei diesen Experimenten konnte die Auswirkung der Basenstapelung auf die Fluoreszenz der Reportergruppe beobachtet werden.

Das System, das durch den Einbau von 1,N⁶-Ethenoadenosin in einen RNA- Liganden entwickelt wurde, bietet eine direkte Methode zur Bestimmung von Disso ziationskonstanten durch den Einsatz fluoreszierender RNA-Liganden. Durch Nut zung hochaffiner Oligoribonukleotide, die durch Einbau eines fluoreszierenden Nukleotids in ihre Sequenz selbst zum funktionellen Reportersystem wurden, kön nen außerdem erste Aussagen zu Interaktionen zwischen einem Liganden und sei nem Target sowie über Konformationsänderungen des Liganden bei der Komplex bildung gemacht werden. Mit dem entwickelten System könnten vor allem die Kon zentrationen niedermolekularer Stoffe, die bisher nur durch aufwendige und kosten intensive HPLC-Diagnostikverfahren bestimmbar waren, genau und mit geringerem Aufwand ermittelt werden.

Literaturliste

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung eines Zielmoleküls, wobei
das Zielmolekül mit einem eine fluoreszierende Gruppe umfassenden Li ganden in Kontakt gebracht wird und ein Komplex aus Zielmolekül und Ligand gebildet wird,
das Fluoreszenzsignal des Liganden im Komplex sich vom Fluoreszenz signal des freien Liganden unterscheidet,
das Fluoreszenzsignal des Liganden im Komplex bestimmt wird und dar aus die Konzentration des Komplexes und damit des Zielmoleküls be stimmt wird,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Ligand eine Nukleinsäure ist und die Nukleinsäure mindestens eine fluoreszierende Gruppe umfasst, wobei die fluoreszierende Gruppe in ei ner Schleife oder einer ungepaarten Region der Nukleinsäure angeord net ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszie rende Gruppe 1,N⁶-Ethenoadenosin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nuk leinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die D-Ribonukleinsäure, L- Ribonukleinsäure, D-Desoxyribonukleinsäure und L-Desoxyribonukleinsäure umfasst.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Synthese des Fluorophors Phosphoramidite mit leicht abspaltbaren Schutzgruppen an den Aminofunktionen eingesetzt werden.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die D- Nukleinsäure eine D-Ribonukleinsäuren ist.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die D- Ribonukleinsäure Ribozyme sind.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die D- Nukleinsäure eine D-Desoxyribonukleinsäure ist.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die D- Ribonukleinsäuren Desoxyribozyme sind.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei als Zielmolekül ein Peptid, ein Polypeptid und/oder ein aus mehreren Polypeptiden zusam mengesetztes Protein eingesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei als Zielmolekül eine einzelsträngige RNA, eine doppelsträngige RNA, eine einzelsträngige DNA und/oder eine doppelsträngige DNA, sowie Kombinationen daraus, eingesetzt werden.

11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei als Zielmolekül ein Antibiotikum oder ein pharmazeutisch wirksames Substrat eingesetzt wird.

12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei als Zielmolekül ein Zuckermolekül eingesetzt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei eine L-Nukleinsäure spezifisch an ein solches Zuckermolekül gebunden wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die L-Nukleinsäure eine L- Ribonukleinsäure ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die L-Nukleinsäure ein Ribozym ist.

16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die L-Nukleinsäure eine L- Desoxyribonukleinsäure ist.

17. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die L-Nukleinsäure ein Desoxyribozym ist.

18. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die L-Nukleinsäure eine L- Ribonukleinsäure ist.

19. Verwendung eines Verfahrens nach den vorangehenden Ansprüchen für ei nen Immunoassay.

20. Verfahren zur schnellen und direkten Bestimmung der Bindungskonstante eines Liganden-Zielmolekül-Komplexes, wobei
eine bestimmte Konzentration an Zielmolekül und an Ligand bereit gestellt wird,
Ligand und Zielmolekül miteinander in Kontakt gebracht werden,
die Konzentration des Zielmoleküls im Komplex und/oder des Kom plexes bestimmt wird nach einem Verfahren nach einem der Ansprü che 1 bis 18 und
die Bindungskonstante daraus berechnet wird.

21. Kit für diagnostische und analytische Zwecke, verwendend das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 und/oder Anspruch 20.