DE2000818A1 - Verfahren zur Herstellung von hochkonzentrierten Nisinkonzentraten - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von hochkonzentrierten Nisinkonzentraten

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DE2000818A1
DE2000818A1 DE19702000818 DE2000818A DE2000818A1 DE 2000818 A1 DE2000818 A1 DE 2000818A1 DE 19702000818 DE19702000818 DE 19702000818 DE 2000818 A DE2000818 A DE 2000818A DE 2000818 A1 DE2000818 A1 DE 2000818A1
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DE
Germany
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nisin
foam
milk
temperature
whey
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Pending
Application number
DE19702000818
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English (en)
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Kazimierz Bronikowski
Wosko Geb Chudzik
Szadkowska Geb Lazarowicz
Lipinska Geb Leder
Jerzy Meller
Bogdan Rakowski
Jakubczyk Geb Reston
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KUTNOWSKIE ZAKL FARMA
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KUTNOWSKIE ZAKL FARMA
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF
PATENTANWÄLTE 8 MÜNCHEN 2, HILBLESTRASSE
2000819
Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8 München 2, HllblestraBe 20 · Ihr Zeichen
Linse
rZehAen 19 235
Datum
9. JAM. 1370
Anwaltsakte 19 235
Kutnowakie Zakdtady Farmaceutyczne "Polfa" Przedeiebioretwo Panstwowe Kutno, Polen
"Verfahren zur Herstellung von hochkonzentrierten Niainkonzentraten"
Erfinder: Jerzy Meiler, Haiina iYoako, Kazimierz Dronikowwki, Dogdan Hakowski, Kwa Lipinaka, jiilzbieta Jakubczyk und Maria Szadkowaka
ff α ff 4 j
009836/2217
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von hochkonzentrierten Nisinkonzentraten, die aus Gährbrühen durch Vergährung von bekannten, aus Milch oder Molke und aus die Biosynthese des Antibiotikums stimulierenden Zusätzen bestehenden Nährböden mit Hilfe von Mikroorganismen des nie inproduzierenden Stammes Streptococcus lactis erhalten werden. Nisin stellt eine Mischung von Polypeptiden dar und ist ein Hemmstoff für das (Vachstum von verschiedenen Mikroorganismen, darunter einer Aeihe von Clostridienstämmen. Die bisher bekannten Verfahren zur Gewinnung des Nie ins aus Gährbrühen sind dem Chrakter der Gährbrühe und den Anforderungen, die an das Nisinkonzentrat gestellt werden, angepaßt. Die Zusammensetzung der Gährbrühe entscheidet über die Auswahl der Parameter bei den einzelnen Verfahreneschritten während des Aufarbeitungsvorgangs, wobei deren richtige Auswahl sich sowohl entscheidend auf die Ausbeute des Verfahrens, als auch auf die Aktivität und Deständigkeit des hergestellten Konzentrats auswirkt. Nach der Deutschen Patentschrift 1 121 444 wird ein Produkt mit einer Aktivität von 12 UOU tiinh/g (Einheiten nach Heading) aus einer Gährbrühe dargestellt, die durch Vergährung von Milch erhalten wird und aus der das Niein zusammen mit dem Kasein unter geeigneter Auewahl der Fällungsparameter ausgefällt wird.
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Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Nisinkonzentraten, mit einer Aktivität von 1,4 . 10 Einh/g und einer Ausbeute von etwa 55 % ist in der Britischen Patentschrift 844 782 dargelegt. Nach diesem Verfahren wird das Kasein aus der vergorenen Milch mittels Zugabe von Kälberlab und Calciumchlorid bei pH 6,0 - 6,3 ausgefällt, das entstandene Gerinsel zerschnitten, die Molke auf pH 4,5 angesäuert, der Niederschlag von ρ - Kasein abgetrennt und mit Wasser von pH 4,0 - 4,5 zum Auswaschen des adsorbierten Nisins gespült. Die gesammelten Filtrate werden auf pH 5,0 gebracht, mit etwa 0,1 % eines schaumbildenden Mittels versetzt und in .Rohren zur Schaumbildung in Umlauf gebracht. Der gesammelte Schaum wird verflüssigt und aus dieser Flüssigkeit wird das Nisinkonzentrat ausgesalzen. Der Niederschlag wird in Methylalkohol gelöst und das Niainkonzentrat mit Aceton gefällt und getrocknet.
Die bekannten Verfahren sind durch niedrige Ausbeuten und Aktivität der Koncentrate gekennzeichnet und ferner sind sie Kit einer Beihe von Fehlern und unvorteilhaften Verfahrensbedingungen behaftet.
Es wmrde festgestellt, daß man hochkonzentrierte Nisinkon-
ft
sentrate mit einer Wirkkraft von über 8.10 Einh/g Feststoff und dabei mit guter Ausbeute erhalten kann, wenn ge-
— 4 —
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maß der Erfindung die Ausfällung des Eiweiß aus der Gährbrühe, die durch Vergährung von Milch oder Molke Bit Zusatz von Glukose oder Kartoffelsirup und Pepsinhydrolisat einer Streptokokkenkultur der serologischen Gruppe N erhalten wurde, bei einem pH-Wert von 3,5 unter gleichzeitiger Erhöhung der Temperatur durchgeführt wird und zur Extraktion des Nie inrücketandee im abgetrennten ßiweissniederschlag nisinarme *olke verwendet wird und wenn konzentrierte, durch Abschäumung der kolke und der Extrakte gewonnene wässrige Nisinkonzentrate bei pH 3,5 ausgesalcen werden, der abgetrennte Niederschlag des Nisinkoncentrats mit Hilfe von unter 0 C abgeküßten Aceton entwässert, der Niederschlag abfiltriert wird und die Acetonreste unter vermindertem Druck bei einer unter 0 C erniedrigten Temperatur vertrieben werden.
Die Erfindung ist weiterhin durch das Konzentrierungsverfahren von Nisin durch Abschäumung gekennzeichnet. Erfindungsgemäfi wird die Darstellung von wässrigen Nisinkonzentraten kontinuierlich ohne Zusatz von oberflächen-aktiven Mitteln durch Überführung der gesamten Gährbrühenmenge mit Hilfe eines mechanischen Schaumgeneratore, der aus einer hochtourigen Kreiselpumpe bestehen kann, in die laufend Gährbrühe und Luft in einem Volumenverhältnie von 6 : 1 zugeführt werden, durchgeführt. Der anfallende Schaum wird in
einem Behälter, der unten mit einer Einrichtung zum kontinuierlichen Abfluß der verarmten Gährbrühe und oben mit
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einem Trichter zum Abfangen dee Schaumes versehen ist, getrocknet. Der getrocknete Schaum wird mit Hilfe von Unterdruck in einem Trichter gesammelt und durch Änderung der Strömungegeschwindigkeit des Schaumes in den flüssigen Zustand übergeführt. Der verflüssigte Schaum stellt die sogenannte raktion des hochkonzentrierten wässrigen Nisin-
konzentrata dar. Die verarmte Gährbrühe fließt am unteren Behälterende ab und kann auf eine nächste Stufe geleitet werden, auf welcher der Verfahrensablauf wiederholt wird.
Die Anzahl der Stufen hängt von den Schämungseigenschaften der Flüssigkeit und von dem nötigen Konzentrierungsgrad ab. Als nesultat werden aus jeder Stufe Fraktionen mit einem konstanten Nisin ehalt gewonnen, wobei eine 100-fache Konzentrierung erreicht werden kann. In der letzten Stufe dagegen enthält die Gährbrühe nur sehr geringe Nisinmengen, die weniger als 40 Einh/ml betragen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne sie einzuschränken.
Beispiel 1
lOOO 1 Gährbrühe mit einer Aktivität von 4200 Einh/ml, die durch Verfährung von einem aus 750 Liter Molke, 20 kg Kartoffel· imp und 250 Liter Pepsinhydroliaat einer Streptokokkenkultur der serologischen Gruppe N bestehenden Nährboden Bit Hilf· «in·· Niai»bild*ndan Stammt« erhalten wurde,
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wurde mit 18 >iiger Salzsäure auf pH 3,5 angesäuert, nachfolgend bis zu einer Temperatur von 95 C erhitzt und bei dieser Temperatur über 5 kinuten behalten. Danach wurde die Gährbriihe auf eine Temperatur von 25 C abgekühlt, der ausgefällte LiweiQniederschlag abfiltriert und das Filtrat der Abschäumung nach dem oben beschriebenen Verfahren unterworfen, wobei ein zweistufiger Abschäumungsvorgang zur Anwendung kam. L>er in einer Menge von 20 kg anfallende, eiweißhaltige Niederschlag mit einem Nisingehalt von 70UÜ tiinh/g wurde mit 180 Liter nisinarmer Gährbrühe, d. h. mit Molke, mit einem Wie ingehalt von weniger als 40 Einh/nl, extrahiert. Der erhaltene Extrakt wurde abfiltriert und dem Abschäumungsvorgang mit dreimaliger Wiederholung der Abschäumung unterworfen. Aus dem gesammelten Schaum wurden insgesamt 32,5 Liter einer flüssigen Fraktion mit einer Aktivität von 120 OUO Kinh/ral erhalten, zu dieser wurde 8,3 g Kochsalz hinzugegeben und der gebildete Niederschlag abzentrifugiert. Durch dreimaliges Aufschwemmen in 15 Liter, auf 15 C unter Null gekühltem Aceton, wurde der Niederschlag entwässert und die Acetonreste aus dem Niederschlag bei Unterdruck und einer Temperatur von 15 unter Null vertrieben. Ks wurden ü,45ü kg eines hochkonzentrierten Nisinkonzentrats mit einer Starke von ^3x10 Linh/g erhalten.
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-T-
Beispiel 2
1000 Liter Gährbrühe mit einer Aktivität von 55Ou Einh/ml, die durch Verjährung von entrahmter kiilch mit Hilfe eines Nisin-bildenden Stammes erhalten wurde, wurde mit 18£iger Salzsäure auf pH 3,5 angesäuert, danach bis auf 95 C erhitzt, hei dieser Temperatur über 5 Minuten behalten, nachfolgend bis auf 25 C heruntergekühlt und der ausgefällte Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren einem zweistufigen AbschäumungsVorgang unterworfen. Dagegen der in einer Menge von 80 kg anfallende eiweißhaltige Niederschlag mit einem Nisingehalt von 8000 tinh/g wurde mit 720 Litern nie inarmer Molke extrahiert. Der extrakt wurde in einem zweistufigem Vorgang abgeschäumt. Insgesamt wurden 41,5 Liter einer flüssigen Fraktion mit einer Aktivität von 120 000 Einh/ml, die weiterhin wie es in Beispiel 1 angegeben ist, verarbeitet wurde, wobei 0,550 kg Nisinkonzentrat mit einer Stärke von
8,5 ζ 10 Linh/g erhalten wurde.
- Patentansprüche - 8 -
fi Π U 8 3 G ΓΓίΑ 7

Claims (3)

~8~ 2P0Q818 Patentansprüche :
1. Verfahren sur Herateilung von hochkonzentrierten Niainkonzentraten aus milcheiweiBhaltigen Gährbrühen, die durch Verjährung τοη Nährböden, die au· Vollmilch oder au· Magermilch, au· Kondensmilch oder Trockenmilch, au· kolke oder Kondenamolke mit Glukosezusatz oder Kartoff elsirupzusatz, und einem Pepsinhydrolyaat einer Streptokokkenkultur der serologischen Gruppe N oder einem Kaaeinhydrolyaat oder einem Albuninhydrolysat oder au· einer Kombination jeder einzelnen Komponente miteinander bestehen und mit Hilfe von Mikroorganismen de· nieinbildenden Stamme· Streptococcus lactis erhalten werden, dadurch gekennzeichnet, daß nan die Gährbrühe bis zum Erreichen des pH-Werte· 3,3 - 3,7, -vorteilhaft 3,5, anaäuert, bis zu einer Temperatur von 60 120 C, vorzugsweise 95 C, erhitzt, einige Minuten die·· Tenperatur beibehält, dann abkühlt und filtriert, daß nan au· den erhaltenen Filtrat Nisin durch Abschäarang in Schaumform,abtrennt, dagegen aber das mit dem angefüllten und abgetrennten EiweiSniedersch lag mitgerissene Nisin durch Extraktion mit Hilfe von eiweißniederschlagloser nie inarmer Molke auswäscht und aus dem Filtrat Nisin in Schaumform durch Abachämung abtrennt, den getrockneten Schaum in flüssigen Zustand überführt, die Flüssigkeit bis auf einen pH-Wert von 3,3 bis 3,7, vorzugsweise 3,5, ansäuert und aussalzt, den ausgefällten,
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aktiTen Niederschlag zentrifugiert, durch mehrmaliges Aufschwemmen in Aceton bei einer Temperatur τοη 0 C entwässert und die Acetonreste ebenfalls bei einer Temperatur unter 0°C bei Unterdruck abtreibt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ■an die Gährbrühen oder Extrakte des Eiweißniederβchlages nach der Abtrennung des Eiweißniederschlages mit Hilfe eines Mechanischen Schaumgenerators in Schaumfora überführt, den gebildeten Schaum sammelt, trodnet und durch Änderung der Strömungsgeschwindigkeit des Schaumstromes in Flüssigkeit überführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Vorgang der Nieingewinnung aus Gährbrühen und den nisinhaltigen Extrakten mittels Abschäumung auf kontinuierliche Weise durchführt und gegebenenfalls mehrmals wiederholt.
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DE19702000818 1969-01-17 1970-01-09 Verfahren zur Herstellung von hochkonzentrierten Nisinkonzentraten Pending DE2000818A1 (de)

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