DE2000818A1 - Verfahren zur Herstellung von hochkonzentrierten Nisinkonzentraten - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von hochkonzentrierten NisinkonzentratenInfo
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Description
PATENTANWÄLTE 8 MÜNCHEN 2, HILBLESTRASSE
2000819
Linse
rZehAen 19 235
Datum
9. JAM. 1370
Kutnowakie Zakdtady Farmaceutyczne "Polfa"
Przedeiebioretwo Panstwowe
Kutno, Polen
"Verfahren zur Herstellung von hochkonzentrierten Niainkonzentraten"
Erfinder: Jerzy Meiler, Haiina iYoako, Kazimierz
Dronikowwki, Dogdan Hakowski, Kwa
Lipinaka, jiilzbieta Jakubczyk und
Maria Szadkowaka
ff α ff 4 j
009836/2217
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von hochkonzentrierten Nisinkonzentraten, die
aus Gährbrühen durch Vergährung von bekannten, aus Milch oder Molke und aus die Biosynthese des Antibiotikums
stimulierenden Zusätzen bestehenden Nährböden mit Hilfe
von Mikroorganismen des nie inproduzierenden Stammes
Streptococcus lactis erhalten werden. Nisin stellt eine Mischung von Polypeptiden dar und ist ein Hemmstoff für
das (Vachstum von verschiedenen Mikroorganismen, darunter einer Aeihe von Clostridienstämmen. Die bisher bekannten
Verfahren zur Gewinnung des Nie ins aus Gährbrühen sind dem Chrakter der Gährbrühe und den Anforderungen, die an
das Nisinkonzentrat gestellt werden, angepaßt. Die Zusammensetzung der Gährbrühe entscheidet über die Auswahl
der Parameter bei den einzelnen Verfahreneschritten während des Aufarbeitungsvorgangs, wobei deren richtige Auswahl
sich sowohl entscheidend auf die Ausbeute des Verfahrens, als auch auf die Aktivität und Deständigkeit des
hergestellten Konzentrats auswirkt. Nach der Deutschen Patentschrift 1 121 444 wird ein Produkt mit einer Aktivität
von 12 UOU tiinh/g (Einheiten nach Heading) aus einer Gährbrühe
dargestellt, die durch Vergährung von Milch erhalten wird und aus der das Niein zusammen mit dem Kasein
unter geeigneter Auewahl der Fällungsparameter ausgefällt
wird.
009836/221 7
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Nisinkonzentraten,
mit einer Aktivität von 1,4 . 10 Einh/g und einer Ausbeute von etwa 55 % ist in der Britischen Patentschrift
844 782 dargelegt. Nach diesem Verfahren wird das Kasein aus der vergorenen Milch mittels Zugabe von
Kälberlab und Calciumchlorid bei pH 6,0 - 6,3 ausgefällt,
das entstandene Gerinsel zerschnitten, die Molke auf pH 4,5 angesäuert, der Niederschlag von ρ - Kasein abgetrennt
und mit Wasser von pH 4,0 - 4,5 zum Auswaschen des adsorbierten Nisins gespült. Die gesammelten Filtrate werden
auf pH 5,0 gebracht, mit etwa 0,1 % eines schaumbildenden
Mittels versetzt und in .Rohren zur Schaumbildung in Umlauf gebracht. Der gesammelte Schaum wird verflüssigt und
aus dieser Flüssigkeit wird das Nisinkonzentrat ausgesalzen. Der Niederschlag wird in Methylalkohol gelöst und
das Niainkonzentrat mit Aceton gefällt und getrocknet.
Die bekannten Verfahren sind durch niedrige Ausbeuten und Aktivität der Koncentrate gekennzeichnet und ferner sind
sie Kit einer Beihe von Fehlern und unvorteilhaften Verfahrensbedingungen
behaftet.
ft
sentrate mit einer Wirkkraft von über 8.10 Einh/g Feststoff
und dabei mit guter Ausbeute erhalten kann, wenn ge-
— 4 —
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maß der Erfindung die Ausfällung des Eiweiß aus der
Gährbrühe, die durch Vergährung von Milch oder Molke
Bit Zusatz von Glukose oder Kartoffelsirup und Pepsinhydrolisat
einer Streptokokkenkultur der serologischen Gruppe N erhalten wurde, bei einem pH-Wert von 3,5 unter
gleichzeitiger Erhöhung der Temperatur durchgeführt wird und zur Extraktion des Nie inrücketandee im abgetrennten
ßiweissniederschlag nisinarme *olke verwendet
wird und wenn konzentrierte, durch Abschäumung der kolke und der Extrakte gewonnene wässrige Nisinkonzentrate bei
pH 3,5 ausgesalcen werden, der abgetrennte Niederschlag
des Nisinkoncentrats mit Hilfe von unter 0 C abgeküßten
Aceton entwässert, der Niederschlag abfiltriert wird und die Acetonreste unter vermindertem Druck bei einer unter
0 C erniedrigten Temperatur vertrieben werden.
Die Erfindung ist weiterhin durch das Konzentrierungsverfahren von Nisin durch Abschäumung gekennzeichnet. Erfindungsgemäfi
wird die Darstellung von wässrigen Nisinkonzentraten
kontinuierlich ohne Zusatz von oberflächen-aktiven Mitteln durch Überführung der gesamten Gährbrühenmenge mit
Hilfe eines mechanischen Schaumgeneratore, der aus einer hochtourigen Kreiselpumpe bestehen kann, in die laufend
Gährbrühe und Luft in einem Volumenverhältnie von 6 : 1 zugeführt
werden, durchgeführt. Der anfallende Schaum wird in
einem Behälter, der unten mit einer Einrichtung zum kontinuierlichen
Abfluß der verarmten Gährbrühe und oben mit
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einem Trichter zum Abfangen dee Schaumes versehen ist,
getrocknet. Der getrocknete Schaum wird mit Hilfe von Unterdruck in einem Trichter gesammelt und durch Änderung
der Strömungegeschwindigkeit des Schaumes in den flüssigen Zustand übergeführt. Der verflüssigte Schaum stellt die
sogenannte raktion des hochkonzentrierten wässrigen Nisin-
konzentrata dar. Die verarmte Gährbrühe fließt am unteren Behälterende ab und kann auf eine nächste Stufe geleitet
werden, auf welcher der Verfahrensablauf wiederholt wird.
Die Anzahl der Stufen hängt von den Schämungseigenschaften
der Flüssigkeit und von dem nötigen Konzentrierungsgrad ab. Als nesultat werden aus jeder Stufe Fraktionen mit einem
konstanten Nisin ehalt gewonnen, wobei eine 100-fache Konzentrierung erreicht werden kann. In der letzten Stufe dagegen
enthält die Gährbrühe nur sehr geringe Nisinmengen, die weniger als 40 Einh/ml betragen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung,
ohne sie einzuschränken.
lOOO 1 Gährbrühe mit einer Aktivität von 4200 Einh/ml, die
durch Verfährung von einem aus 750 Liter Molke, 20 kg Kartoffel· imp und 250 Liter Pepsinhydroliaat einer Streptokokkenkultur
der serologischen Gruppe N bestehenden Nährboden Bit Hilf· «in·· Niai»bild*ndan Stammt« erhalten wurde,
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wurde mit 18 >iiger Salzsäure auf pH 3,5 angesäuert, nachfolgend
bis zu einer Temperatur von 95 C erhitzt und bei dieser Temperatur über 5 kinuten behalten. Danach wurde
die Gährbriihe auf eine Temperatur von 25 C abgekühlt, der
ausgefällte LiweiQniederschlag abfiltriert und das Filtrat
der Abschäumung nach dem oben beschriebenen Verfahren unterworfen,
wobei ein zweistufiger Abschäumungsvorgang zur
Anwendung kam. L>er in einer Menge von 20 kg anfallende,
eiweißhaltige Niederschlag mit einem Nisingehalt von 70UÜ
tiinh/g wurde mit 180 Liter nisinarmer Gährbrühe, d. h. mit
Molke, mit einem Wie ingehalt von weniger als 40 Einh/nl,
extrahiert. Der erhaltene Extrakt wurde abfiltriert und dem Abschäumungsvorgang mit dreimaliger Wiederholung der
Abschäumung unterworfen. Aus dem gesammelten Schaum wurden insgesamt 32,5 Liter einer flüssigen Fraktion mit einer
Aktivität von 120 OUO Kinh/ral erhalten, zu dieser wurde
8,3 g Kochsalz hinzugegeben und der gebildete Niederschlag
abzentrifugiert. Durch dreimaliges Aufschwemmen in 15 Liter,
auf 15 C unter Null gekühltem Aceton, wurde der Niederschlag entwässert und die Acetonreste aus dem Niederschlag
bei Unterdruck und einer Temperatur von 15 unter Null vertrieben. Ks wurden ü,45ü kg eines hochkonzentrierten
Nisinkonzentrats mit einer Starke von ^3x10 Linh/g
erhalten.
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-T-
1000 Liter Gährbrühe mit einer Aktivität von 55Ou Einh/ml,
die durch Verjährung von entrahmter kiilch mit Hilfe eines
Nisin-bildenden Stammes erhalten wurde, wurde mit 18£iger
Salzsäure auf pH 3,5 angesäuert, danach bis auf 95 C erhitzt, hei dieser Temperatur über 5 Minuten behalten, nachfolgend
bis auf 25 C heruntergekühlt und der ausgefällte Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wurde nach dem oben
beschriebenen Verfahren einem zweistufigen AbschäumungsVorgang
unterworfen. Dagegen der in einer Menge von 80 kg anfallende
eiweißhaltige Niederschlag mit einem Nisingehalt von 8000 tinh/g wurde mit 720 Litern nie inarmer Molke extrahiert.
Der extrakt wurde in einem zweistufigem Vorgang
abgeschäumt. Insgesamt wurden 41,5 Liter einer flüssigen Fraktion mit einer Aktivität von 120 000 Einh/ml, die weiterhin
wie es in Beispiel 1 angegeben ist, verarbeitet wurde, wobei 0,550 kg Nisinkonzentrat mit einer Stärke von
8,5 ζ 10 Linh/g erhalten wurde.
- Patentansprüche - 8 -
fi Π U 8 3 G ΓΓίΑ 7
Claims (3)
1. Verfahren sur Herateilung von hochkonzentrierten
Niainkonzentraten aus milcheiweiBhaltigen Gährbrühen,
die durch Verjährung τοη Nährböden, die au· Vollmilch
oder au· Magermilch, au· Kondensmilch oder Trockenmilch,
au· kolke oder Kondenamolke mit Glukosezusatz oder Kartoff
elsirupzusatz, und einem Pepsinhydrolyaat einer
Streptokokkenkultur der serologischen Gruppe N oder einem Kaaeinhydrolyaat oder einem Albuninhydrolysat
oder au· einer Kombination jeder einzelnen Komponente miteinander bestehen und mit Hilfe von Mikroorganismen
de· nieinbildenden Stamme· Streptococcus lactis erhalten
werden, dadurch gekennzeichnet, daß nan die Gährbrühe
bis zum Erreichen des pH-Werte· 3,3 - 3,7, -vorteilhaft
3,5, anaäuert, bis zu einer Temperatur von 60 120
C, vorzugsweise 95 C, erhitzt, einige Minuten die·· Tenperatur beibehält, dann abkühlt und filtriert, daß
nan au· den erhaltenen Filtrat Nisin durch Abschäarang
in Schaumform,abtrennt, dagegen aber das mit dem angefüllten
und abgetrennten EiweiSniedersch lag mitgerissene Nisin durch Extraktion mit Hilfe von eiweißniederschlagloser
nie inarmer Molke auswäscht und aus dem Filtrat Nisin in Schaumform durch Abachämung abtrennt, den
getrockneten Schaum in flüssigen Zustand überführt, die Flüssigkeit bis auf einen pH-Wert von 3,3 bis 3,7, vorzugsweise
3,5, ansäuert und aussalzt, den ausgefällten,
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aktiTen Niederschlag zentrifugiert, durch mehrmaliges Aufschwemmen in Aceton bei einer Temperatur τοη 0 C
entwässert und die Acetonreste ebenfalls bei einer Temperatur unter 0°C bei Unterdruck abtreibt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
■an die Gährbrühen oder Extrakte des Eiweißniederβchlages
nach der Abtrennung des Eiweißniederschlages mit Hilfe eines Mechanischen Schaumgenerators in Schaumfora
überführt, den gebildeten Schaum sammelt, trodnet und durch Änderung der Strömungsgeschwindigkeit des Schaumstromes
in Flüssigkeit überführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Vorgang der Nieingewinnung aus Gährbrühen
und den nisinhaltigen Extrakten mittels Abschäumung auf kontinuierliche Weise durchführt und gegebenenfalls mehrmals
wiederholt.
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