DE20121865U1

DE20121865U1 - Inhibitoren von Transglutaminasen

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Publication number: DE20121865U1
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Original assignee: N Zyme Biotec GmbH
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Description

Inhibitoren von Transglutaminasen

Die vorliegende Erfindung betrifft chemische Verbindungen als eine neue Klasse spezifischer Inhibitoren von Transglutaminasen sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten. Die chemischen Verbindungen sind als Inhibitoren von Transglutaminasen geeignet und können zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten, bei denen Transglutaminasen eine entscheidende Rolle spielen, verwendet werden.

Die medizinische Relevanz von Transglutaminasen und der von ihnen katalysierten Vernetzungsreaktion bei Krankheiten wurde bereits vielfach erkannt und ist eingehend in der einschlägigen Literatur beschrieben.

Beispielsweise wurde gezeigt, dass die Trübung der Linse des menschlichen Auges durch die enzymatische Vernetzung von ß-Crystallin-Untereinheiten hervorgerufen wird. Die Aktivität von Gewebetransglutaminase ist dabei signifikant erhöht und resultiert in der vermehrten Bildung von 8-(y-Glutamyl)lysin-Querbrücken, die maßgeblich zum Entstehen des grauen Stars (Katarakt) beitragen.

Des weiteren wird die Beteiligung von Gewebetransglutaminase an Krankheiten diskutiert, die mit einer Stimulierung des Enzyms Phospholipase A2 (PLA2) assoziiert sind. Durch die von Transglutaminase katalysierte Modifizierung der Phospholipase kommt es zur Initiierung und Ausbreitung von entzündlichen Erkrankungen, insbesondere bei der rheumatoiden Arthritis und bei der juvenilen chronischen Arthritis.

In jüngster Zeit richtet sich die Aufmerksamkeit auf die Bedeutung von Transglutaminasen bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen, speziell bei der Alzheimer-Krankheit. Dabei sind die Akkumulation von unlöslichen, lockenförmigen Alzheimerfibrillen innerhalb der Neuronen und die extrazellulären Amyloidablagerungen wichtige pathologische Kennzeichen. Die Charakterisierung dieser vernetzten Proteinpolymere sowie die erhöhte Transglutaminaseaktivität sind eindeutige Hinweise auf die ursächliche Beteiligung von Transglutaminase an der Demenz.

• · · &diams;

Bei weiteren neurologischen Leiden kommt es zum genetisch bedingten Einschub von Glutaminoligomeren in im Gehirn lokalisierte Proteine, die dadurch zu Transglutaminasesubstraten werden. Beispielhaft soll an dieser Stelle Chorea Huntington (Veitstanz) angeführt werden. Es kommt zu einer Vernetzung durch ebenfalls im Gehirn lokalisierte Gewebetransglutaminasen, resultierend in unlöslichen Aggregaten, die nach dem momentanen Stand der medizinisch-wissenschaftlichen Literatur ursächlich für diese Erkrankungen sein könnten.

Ein weiterer sehr interessanter Ansatzpunkt ist es, gezielt Transglutaminase von parasitären Nematoden zu inhibieren. Das Enzym, das erst kürzlich sequenziert und eingehend charakterisiert wurde, spielt eine essentielle Rolle bei der Entwicklung der Fadenwürmer. Es gibt bereits vielversprechende Untersuchungen, bei denen mit vergleichsweise unspezifischen Inhibitoren das Wachstum und das Überleben der Nematoden reduziert wurde.

Die Beteiligung von Transglutaminasen an der Apoptose, bei der Blutgerinnung, bei der Entstehung von Akne, bei Krebs, bei Infektionen mit HIV und Psoriasis verdeutlichen eindrucksvoll den Bedarf an spezifischen Inhibitoren für den pharmazeutischen Einsatz.

Die von Transglutaminasen katalysierte Reaktion ist nachfolgend vereinfacht dargestellt. Die &ggr;-Carboxamidgruppe von proteingebundenem Glutamin wird unter Freisetzung von Ammoniak auf ein primäres Amin übertragen. Wenn als Glutamylakzeptor die &egr;-Aminofunktion eines ebenfalls proteingebundenen Lysins fungiert, resultiert entsprechend eine inter- bzw. intramolekulare Isopeptidbindung, abhängig davon, ob eine zweite oder dieselbe Peptidkette als Amindonor beteiligt ist.

O=A-^r

Kovalente Verknüpfung der Seitenketten von Glutamin und Lysin durch eine Transglutaminase

Die s-(y-Glutamyl)lysin-lsopeptidbindungen in Proteinaggregaten werden in vivo nicht durch Proteasen hydrolysiert. Dementsprechend ist die durch Transglutaminasen katalysierte Vernetzung nach heutigem Kenntnisstand irreversibel.

Für die Inhibierung von Transglutaminasen existieren bereits zahlreiche Verbindungen, die allerdings nicht oder nur wenig zwischen den bekannten Transglutaminasen unterscheiden. Deshalb werden diese Hemmstoffe hier als unspezifisch bezeichnet. Eine Inhibierung erfolgt in der Regel dadurch, dass die Aminosäuren im Aktivzentrum reversibel oder irreversibel blockiert werden (in erster Linie wird ein für die Transglutaminase essentielles Cystein modifiziert), nach Ausbildung des Acyl-Enzym-Komplexes die Bindungsstelle für peptidgebundenes Lysin durch ein Amin besetzt wird, und die für die katalytische Aktivität essentiellen Ca²⁺-lonen komplexiert werden oder durch oxidative Prozesse Disulfidbrücken entstehen.

Zur ersten Gruppe von Hemmstoffen gehören lodacetamid [Folk & Cole, J. Biol. Chem. 241, 3238-3240 (1966)], N-Ethylmaleinimid, para-Chlormercuribenzoesäure [Folk & Cole, Biochim. Biophys. Acta, 122, 244-264 (1966)], Alkylisocyanate [Gross et al., J. Biol. Chem. 250, 7693-7699 (1975)] und andere Moleküle mit einem elektrophilen Kohlenstoff,

die mit der Thiolfunktion des Cysteins eine stabile Bindung eingehen. Nachteilig bei diesen Inhibitoren ist, dass sie unspezifisch mit einer Vielzahl von Thiolgruppen reagieren. Sie besitzen entsprechend ein hohes toxisches Potential, da viele andere Enzyme, wie zum Beispiel Proteasen, in gleicher Weise wie Transglutaminasen inhibiert werden können.

Nach Folk [J. Biol. Chem. 244, 3707-3713 (1969)] und Chung et al. [J. Biol. Chem. 245, 6424-6435 (1970)] entsteht die Bindungsstelle für proteingebundenes Lysin oder ein primäres Amin erst nach Ausbildung der Thioesterbindung zwischen dem Cystein im Aktivzentrum von Transglutaminase und einem Glutaminsubstrat durch Änderung der Proteinkonformation. Deshalb erlangen Amininhibitoren erst ihre Wirkung, wenn das Glutaminsubstrat an das Enzym gebunden hat. Die Anforderungen von Transglutaminasen an das Lysinsubstrat oder ein anderes Amin sind dabei vergleichsweise gering. Kleine Aminoverbindungen, wie Cadaverin, Putrescin, Spermin und Spermidin (oder sogar Ammoniak, einem Reaktionsansatz zugesetzt als Ammoniumsalz), inhibieren die physiologische Reaktion, indem sie die entstandene Bindungsstelle kompetitiv besetzen und nachfolgend selbst in das Glutaminsubstrat eingebaut werden. Nachteilig ist, daß der Hemmstoff gegenüber dem natürlichen Substrat deutlich höher konzentriert sein muß, damit eine signifikante Inhibierung eintritt. Zusätzlich sind Amine aufgrund des mechanistischen Ablaufs der katalysierten Reaktion nicht geeignet, Transglutaminasen irreversibel zu blockieren oder zwischen unterschiedlichen Transglutaminasen zu unterscheiden.

Die dritte Gruppe von Inhibitoren hat nur eine Wirkung auf Ca²⁺-abhängige Transglutaminasen. Sie blockieren nicht eine Aminosäure im Aktivzentrum oder an einer anderen essentiellen Stelle des Proteins, sondern fangen die für die Katalyse notwendigen bivalenten Kationen durch Komplexierung oder Ausbildung unlöslicher Salze ab. Zu diesen Verbindungen zählen beispielsweise Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EDTA), 1,2-Bis-(2-aminoethoxy-ethan)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA), Oxalsäure und Phosphat. Für einen pharmakologischen Einsatz sind solche Komplexbildner nicht geeignet, weil bivalente Ionen innerhalb des Organismus essentiell für eine Vielzahl komplexer physiologischer Reaktionen sind.

Kupfer-ll-salze wiederum inaktivieren Transglutaminasen durch Oxidation der SH-Gruppen von Cysteinresten, so dass Cystinbrücken entstehen [Boothe & Folk, J. Biol. Chem. 244, 399-405 (1969)]. Diese Hemmung betrifft vor allem solche Transglutaminasen, die zahlreiche freie Cysteinreste besitzen. Sie kann durch Öffnung der Cystine rückgängig gemacht werden. Nachteilig ist auch bei solchen Verbindungen, dass die pharmazeutische Anwendung von Schwermetallen, wie Kupfersalzen, mit beträchtlichen Nebenwirkungen assoziiert ist.

3,5-Substituierte 4,5-Dihydroisoxazole werden in US-A-4,912,120, US-A-4,970,297 und US-A-4,929,630 als Inhibitoren für Transglutaminasen beschrieben. Eine besondere Wirkung wird ihnen bei der Hemmung von epidermaler Transglutaminase und damit bei der Behandlung von Akne zugeschrieben. Offensichtlich beruht die Wirkung dieser Substanzklasse auf einer Reaktion des Fünfrings mit dem Cystein im Aktivzentrum von Transglutaminase. Als problematisch ist dabei der Dihydroisoxazolring anzusehen, der im Vergleich zu der Glutaminseitenkette eines Proteins aus sterischen Gründen wesentlich schwieriger in das Aktivzentrum eindringen dürfte.

Zur thrombolytischen Therapie wurden Oxiranverbindungen (US-A-5,188,830) entwickelt. Diese Verbindungen sollen Blutfaktor XIII inhibieren und damit die Stabilisierung manifester Blutclots verhindern. Auch wenn es naheliegt, dass humaner Faktor XIII oder eine andere Transglutaminase mit dem reaktiven Dreiring unter Ringöffnung eine stabile Bindung eingeht, erscheinen die beschriebenen Verbindungen nicht geeignet, vorzugsweise mit dem Cystein im Aktivzentrum zu reagieren. Andere nukleophile Gruppen an der Proteinoberfläche, wie beispielsweise Cystein- oder Lysinreste, dürften in gleicher Weise eine Bindung mit dem Oxiranring eingehen, möglicherweise sogar bevorzugt.

US-A-4,968,713, US-A-5,019,572, US-A-5,021,440, US-A-5,030,644, US-A-5,047,416, US-A-5,077,285, US-A-5,084,444, US-A-5,098,707, US-A-5,152,988 und US-A-5,177,092 beschreiben verschiedene Imidazol-, Pyrazol-, Triazol- und Tetrazolverbindungen, die ebenfalls bei der Behandlung von Thrombosen Einsatz finden sollen. Ihre Wirkungsweise ist unklar.

Auch bei anderen Hemmstoffen, die in jüngster Zeit aus biologischem Material gewonnen wurden, ist die Blockierung des Aktivzentrums nicht offensichtlich. Vielmehr schei-

nen die Inhibitoren lediglich durch ihre Bindung / Wechselwirkung die Aktivität der Transglutaminase zu senken. Zum Beispiel wird in dem US-A-5,710,174 (20.01.1998) eine makrozyklische Verbindung, isoliert aus der Kulturbrühe von Penicillium roseopurpureum CBS 170.95, als Faktor XIII Inhibitor identifiziert.

Es wurden auch Versuche unternommen, Glutaminpeptide mit einer vom Transglutaminasesubstrat abgeleiteten Sequenz als nicht toxische Inhibitoren einzusetzen [Achyuthan et al., J. Biol. Chem. 268, 21284-21292 (1993)]. Die Inhibitorwirkung der verwendeten Peptide gegen Faktor XIII war jedoch vergleichsweise gering.

In einer jüngeren Druckschrift (US-A-6,025,330) wird nun ein potenteres Polypeptid aus dem Gewebe oder Sekreten von Blutegeln offenbart, das Faktor XIII inhibiert. Hierbei handelt es sich um ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 7000 - 8000 Dalton. Nachteilig gegenüber niedermolekularen Inhibitoren ist die aufwendige Reinigung, die hohen Produktionskosten und die Anfälligkeit gegen proteolytischen Abbau sowie vor allem mögliche Reaktionen des Immunsystems.

Es ist deshalb die Aufgabe der vorliegenden Erfindung potente Inhibitoren von Transglutaminasen zur Verfügung zu stellen, die insbesondere zum pharmazeutischen und therapeutischen Einsatz geeignet sind. Diese Inhibitoren sollen Enzyme der Transglutaminaseklasse zielgerichtet und selektiv inhibieren. Vorzugsweise sollten die Inhibitoren spezifisch zwischen verschiedenen Transglutaminasen unterscheiden können, um die Hemmung eines bestimmten Transglutaminasetyps bei Mensch und Tier zu erreichen, ohne die Funktion der anderen körpereigenen Transglutaminasen auszuschalten. Diese chemischen Verbindungen sollten somit als potentielle Therapeutika für die Behandlung zahlreicher Krankheiten, die durch Transglutaminasen verursacht werden oder an denen diese Enzyme beteiligt sind, einsetzbar sein.

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine chemische Verbindung der Formel (I):

0)

worin R¹ bedeutet:

(H)

OC

(III)

R6.

(IV)

oder

R² H, Alkyl, das wahlweise mit Halogen oder N₂ substituiert sein kann, oder NH₂ bedeutet;

m und &ogr; O bis 3 und &eegr; O oder 1 bedeuten; a_p, b_q und c_r Aminosäureketten und p, q und r die Anzahl der Aminosäuren bedeuten, wobei a und/oder b und/oder c ebenfalls mindestens eine Seitenkette, dargestellt durch

(CH₂)mYn(CH₂)oC(Z)R², enthalten können, wobei Y, Z, R², m, n, und &ogr; die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) besitzen, und p, q und r gleich oder unterschiedlich sein können und eine ganze Zahl von 0 bis 1000 bedeuten;

R³ und R⁴ unabhängig voneinander H, Alkyl, Aryl, einen Heterozyklus, eine Aminoschutzgruppe oder eine Carboxyschutzgruppe bedeuten; R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander Alkyl, das mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus N, O und S, enthalten kann, Aryl oder einen Heterozyklus bedeuten; X eine Methingruppe, ein Stickstoff- oder Phosphoratom bedeutet; Y ein Sauerstoffatom, Schwefelatom oder eine NH-Gruppe bedeutet; und Z ein Sauerstoffatom, Schwefelatom oder eine NR⁷-Gruppe bedeutet, wobei R⁷ H, Alkyl, Aryl, einen Heterozyklus, O-Alkyl, O-Aryl, O-Heterozyklus, NR₂ oder NHCONR₂ bedeutet, wobei R H, Alkyl, Aryl oder einen Heterozyklus bedeutet; mit der Maßgabe, dass

Rl

NH₂

Rl

NH₂

wobei R¹ wie vorstehend definiert ist, und

A.

O &ldquor; HN O'

MeO

nicht umfasst sind.

.0.XH₂Cl

O O

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die chemische Verbindung der Formel (I), sowie mindestens eine weitere Komponente, ausgewählt aus mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Antikoagulanz, weiteren Wirkstoff und/oder Inhibitor.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die chemische Verbindung der Formel (I) zur Verwendung als Medikament. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der chemischen Verbindung der Formel (I) als Inhibitor von Transglutaminasen.

Im folgenden werden die hierin verwendeten Begriffe näher definiert.

Halogen oder Hai bedeutet Fluor, Chlor, Brom oder Iod, vorzugsweise Fluor oder Chlor.

Alkyl bedeutet eine verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einschließlich Methyl (Me), Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl und Octyl, wobei Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl und t-Butyl bevorzugt sind und Methyl und Ethyl besonders bevorzugt sind.

Aryl bedeutet eine aromatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoff- atomen, z.B. Phenyl oder Naphthyl.

Ein Heterozyklus bedeutet eine 5- oder 6-gliedrige heterozyklische monozyklische Gruppe, z.B. eine Oxazol-2-yl-, Oxazol-4-yl, Oxazol-5-yl-, lsoxazol-3-yl-, lsoxazol-4-yl-, Isoxazol-5-yl-, Thiazol-2-yl-, Thiazol-4-yl-, Thiazol-5-yl-, lsothiazol-3-yl-, lsothiazol-4-yl-, Isothiazol-5-yl-, 1,2,4-Oxadiazol-3-yl-, 1,2,4-Oxadiazol-5-yl-, 1,2,4-Thiadiazol-3-yl-, 1,2,4-Thiadiazol-5-yl-, 1,2,5-Oxadiazol-3-yl-, 1,2,5-Oxadiazol-4-yl-, 1,2,5-Thiadiazol-3-yl-, 1,2,5-Thiadiazol-4-yl-, 1-lmidazolyl-, 2-lmidazolyl-, 4-lmidazolyl-, 1-Pyrrolyl-, 2-Pyrrolyl-, 3-Pyrrolyl-, 2-Furanyl-, 3-Furanyl-, 2-Thienyl-, 3-Thienyl-, 2-Pyridyl-, 3-Pyridyl-, 4-Pyridyl-, 2-Pyrimidinyl-, 4-Pyrimidinyl-, 5-Pyrimidinyl-, 3-Pyridazinyl-, 4-Pyridazinyl-, 2-Pyrazinyl-, 1 -Pyrazolyl-, 3-Pyrazolyl- und eine 4-Pyrazolyl-Gruppe.

Eine Aminoschutzgruppe ist eine übliche Aminoschutzgruppe für Aminosäuren. Beispiele beinhalten eine Benzyloxycarbonyl-, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl-, 2-Brombenzyloxycarbonyl-, fe/t-Butyloxycarbonyl-, pyro-Glutamyl-, Formyl-, Acetyl-, Trifluoracetyl-, Fluorenylmethoxycarbonyl-, Benzoyl-, 2-Nitrobenzoyl-, 4-Nitrobenzoyl-, 5-N₁N-Dimethylaminonaphthalinsulfonyl-, 4-Methylbenzolsulfonyl-, 2-Nitrobenzolsulfonyl-, A-Nitrobenzolsulfonyl-Gruppe. Bevorzugt sind eine Benzyloxycarbonyl-, tert-Butyloxycarbonyl- oder eine Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe.

• ··* &igr; 11 · &igr;&igr; ,*

Eine Carboxyschutzgruppe ist eine übliche Carboxyschutzgruppe für Aminosäuren. Beispiele beinhalten eine Methyl-, Ethyl-, fe/t-Butyl-, Benzyl-, 4-Methylbenzyl-, Benzyloxymethyl-, Anisyl-, Thioanisyl-, Cresyl-, Thiocresyl-, N-Hydroxysuccinimid, Pentafluorphenyl-, Diphenylmethyl-, Triphenylmethyl-, 2,4,5-Trichlorphenyl-Gruppe. Bevorzugt sind eine Methyl-, Ethyl-, fe/t-Butyl- oder Benzyl-Gruppe.

Die chemische Verbindung der Formel (I) wird im folgenden näher erläutert.

In Formel (I) bedeutet Y ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder eine NH-Gruppe. Vorzugsweise ist Y ein Sauerstoffatom.

In Formel (I) sind m und &ogr; 0 bis 3 und &eegr; 0 oder 1. Vorzugsweise bedeuten m 1, &eegr; 0 oder 1 und &ogr; 0 oder 1. Es ist besonders bevorzugt, dass, wenn m 1 bedeutet, &eegr; 1 und &ogr; 0 bedeutet. In diesem Fall ist es bevorzugt, dass Y ein Sauerstoffatom ist. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass, wenn m 1 bedeutet, &eegr; 0 bedeutet und &ogr; 1 bedeutet.

Z in Formel (I) bedeutet ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder eine NR⁷-Gruppe, wobei R⁷, wie vorstehend beschrieben, definiert ist. Besonders bevorzugt ist Z ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom.

R² in Formel (I) bedeutet H, Alkyl, das wahlweise mit Halogen oder N₂ substituiert sein kann, oder NH₂. Vorzugsweise bedeutet R² H₁ Methyl, Ethyl, t-Butyl, CH₂CI, CH₂CH₂CI, CH₂I oder CHN₂. Besonders bevorzugt bedeutet R² H, Methyl, CH₂CI oder CHN₂.

In einer bevorzugten Ausführungsform stellt Z ein Sauerstoffatom und R² H, Me, CH₂HaI oder CHN₂ dar. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet Z ein Schwefelatom und R² H, Me, CH₂HaI oder CHN₂.

Die Seitenkette der erfindungsgemäßen chemischen Verbindung umfasst keine Seitenketten natürlich vorkommender Aminosäuren, insbesondere von Glutamin und Asparagin.

Bevorzugte Beispiele der Seitenkette der erfindungsgemäßen chemischen Verbindung beinhalten:

&Lgr;&Lgr;

O(S)

NR7

P(S) O(S)

NR⁷

X^s1

O(S)

O(S)

O(S)

O(S) X

Der Substituent R in Formel (I) bedeutet

(II)

(III) (IV)

R5

(V)

Vorzugsweise wird R¹ durch die Formel (II) dargestellt.

Mit anderen Worten, gemäß der Formel (II) und (III) kann die chemische Verbindung der Formel (I) eine lineare oder ringförmige Aminosäurenkette a_p, b_q bzw. c_r besitzen.

Die Anzahl der Aminosäuren ist jeweils durch p, q und r gekennzeichnet, wobei &rgr; und q bzw. r gleich oder unterschiedlich sein können und eine ganze Zahl von 0 bis 1000, vorzugsweise 1 bis 100, noch bevorzugter 1 bis 10 bedeuten. Insbesondere bevorzugt ist &rgr; 1,2, 3, 4 oder 5, q 0, 1,2, 3, 4 oder 5 und r 5, 6, 7, 8, 9 oder 10.

• ·

Die Aminosäuresequenzen werden durch a, b und c dargestellt. Übliche Aminosäuren beinhalten Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tryptophan, Phenylalanin, Methionin, Glycin, Serin, Tyrosin, Threonin, Cystein, Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Histidin, Citrullin, Homocystein, Homoserin, 4-Hydroxyprolin, 5-Hydroxylysin, Ornithin und Sarkosin. Beispiele für Aminosäuresequenzen von a_p können sein KLVFF, QKQAP, VGQPK, TPVW, VR, KQT₁ RPINY, QEALP, SKIGS, EKNPL, ERQAG, QVTQT, SKVLP, MEEPA, QIV, TPVLK, QHHLG, von b_q YEVHH, ICHQT, ELPEQ, IPPLT, HTTNS, KPDPS, VAAED, ALAAP₁ FKDRV, KKTET, KETIE, GYVSS, VLSLS, DIPES, EA, KGNPE, TIGEG und von c_r QHHLGTIGEG, TPVLKKGNPE, QIVEA, MEEPADIPES, SKVLPVLSLS, QVTQTGYVSS, ERQAGKETIE₁ EKNPLKKTET, SKIGSFKDRV, QEALPALAAP, RPINYVAAED, KQTKPDPS, VRHTTNS, TPVWIPPLT, vgqpkelpeq, qkqapichqt, klvffyevhh.

Die Aminosäuresequenzen a und/oder b und/oder c können ebenfalls mindestens eine Seitenkette, dargestellt durch (CH₂)mYn(CH₂)oC(Z)R², enthalten, wobei Y₁ Z₁ R², m, n, und &ogr; die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) besitzen. Y, Z, R², m, n, und &ogr; können innerhalb einer chemischen Verbindung der Formel (I) in den jeweiligen Seitenketten gleich oder unterschiedlich sein. Es ist bevorzugt, dass innerhalb einer Verbindung alle Seitenketten (CH₂)_mYn(CH₂)oC(Z)R² gleich sind. Wenn weitere Seitenketten vorhanden sind, sind üblicherweise 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 10, noch bevorzugter 1 bis 3 Seitenketten in a und/oder b und/oder c enthalten.

Die Aminosäuren können als racemische Gemische oder enantiomerenrein vorliegen. Bevorzugt ist die L-Konfiguration. Zur Verhinderung eines proteolytischen Abbaus können jedoch D-Aminosäuren in strategischen Positionen des Polymers, z.B. an typischen Proteaseschnittstellen, eingebaut sein. Damit wird die proteolytische Hydrolyse eines Wirkstoffes unterbunden.

R³ und R⁴ in Formel (II) bedeuten unabhängig voneinander H₁ Alkyl, Aryl, einen Heterozyklus, eine Aminoschutzgruppe oder eine Carboxyschutzgruppe. Bevorzugt bedeuten R³ und R⁴ unabhängig voneinander H₁ Methyl, Ethyl, tert-Butyl oder eine Aminoschutzgruppe, vorzugsweise ausgewählt aus einer Benzyloxycarbonyl-, tert-Butyloxycarbonyl- oder einer Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe.

R⁵ und R⁶ in den Formeln (IV) und (V) bedeuten unabhängig voneinander Alkyl, das ein Heteroatom, ausgewählt aus N, O und S, vorzugsweise O, enthalten kann, Aryl oder einen Heterozyklus, vorzugsweise Alkyl oder Aryl.. X in Formel (IV) bedeutet eine Methingruppe, ein Stickstoff oder ein Phosphoratom, vorzugsweise eine Methingruppe.

Spezielle Beispiele der chemischen Verbindung der Formel (I) werden im folgenden aufgezählt:

O > H

N^ ^CO₂H __ ^_&ogr; "

H O

N. .CO₂H

H O

CO₂H

Die erfindungsgemäße chemische Verbindung kann auf verschiedene Art und Weise synthetisiert werden. Prinzipiell wird die chemische Verbindung, worin R¹ die Formel (II) oder (III) bedeutet, auf einem von zwei üblichen Wegen synthetisiert.

Im ersten Fall wird zunächst ein lineares oder zyklisches Peptid mit einer vorstehend beschriebenen Aminosäurekette molekularbiologisch oder chemisch hergestellt. Übliche Herstellungsverfahren werden beispielsweise bei Davies, Dibner und Battey (1986) Basic methods in molecular biology, Elsevier, New York, bzw. bei Atherton und Sheppard (1989) Solid phase peptide synthesis - A practical approach, IRL Press, Oxford, beschrieben. Das Peptid wird dann mittels chemischer oder enzymatischer Methoden (z.B. Wünsch (1974) Synthese von Peptiden in: Houben-Weyl-Müller, Methoden der Organischen Chemie XV/1 und XV/2, Thieme, Stuttgart, bzw. Wong und Whitesides (1994) Enzymes in synthetic organic chemistry, Elsevier Science, Oxford) so modifiziert, dass die erfindungsgemäße chemische Verbindung erhalten wird.

NH₂

Protein /Peptid

Inhibitor

Alternativ dazu kann zunächst z. B. aus einer geeigneten Aminosäure ein Inhibitorbaustein (&ldquor;Building Block") synthetisiert werden, wie beispielhaft nachfolgend in der Reaktionssequenz a) gezeigt, wobei der Inhibitorbaustein bereits die gewünschte funktioneile Gruppe in der Seitenkette, geschützt oder ungeschützt, trägt.

Danach wird ein lineares oder zyklisches Peptid mit einer vorstehend genannten Aminosäurekette unter Einbau des Inhibitorbausteins konstruiert, wie beispielhaft nachfolgend in den Reaktionssequenzen b) und c) gezeigt.

•t·· «·

OCH₃

H 0

O HO

Prinzipiell kann jedes Peptid oder Protein in einer oder mehreren Aminosäureseitenketten entsprechend modifiziert werden, so dass die erfindungsgemäße chemische Verbindung, worin R¹ die Formeln (II) oder (III) bedeutet, erhalten wird. Ebenso kann ein Inhibitorbaustein aus einer beliebigen natürlichen oder synthetischen Aminosäure hergestellt werden.

Am geeignetesten sind Aminosäuren, die durch einfache chemische Reaktion modifiziert werden können. Im ersten Fall sind sie peptidgebunden, im zweiten Fall sind die Aminosäuren frei oder vorzugsweise mit einer üblichen Schutzgruppe versehen. Geeignete Aminosäuren beinhalten Glutamin, Glutaminsäure, Arginin, Citrullin, Ornithin, Prolin, Serin und Cystein. Beispiele für Modifizierungsreaktionen sind nachfolgend dargestellt.

Glutamin, Glutaminsäure:

• · &igr; • · < •»·t »·

17

RNH

NH₂

Red. RNH

CO₂R¹

CO₂R'

Hydrolyse

RNH

OH

RNH

OR" Red. RNH

CO₂R¹

Arginin, Citrullin, Ornithin:

RNH

NH

CO₂R¹ H

Hydrolyse

Hydrolyse O

RNH

IH₂

^CO₂R¹ Hydrolyse

CO₂R¹ H

Prolin:

Ox.

RN

CO₂R'

Serin, Cystein:

Ox. RNH

CO₂R'

Hydrolyse rnh

CO₂R¹ CO₂R¹

RNH

CO₂R"

CO₂R¹

RNH

O(S)

CO₂R¹

Die erfindungsgemäße chemische Verbindung, worin R¹ die Formeln (IV) oder (V) bedeutet, kann aus verzweigten, linearen oder zyklischen Kohlenwasserstoffen mit und ohne Heteroatomen hergestellt werden. Wesentlich ist lediglich, dass an der Verzweigungsstelle X eine gemäß der Formel (I) dargestellte Seitenkette mit der gewünschten funktionellen Gruppe hängt. Diese Seitenkette kann über eine Kupplungsreaktion mit unedlen Metallen, wie beispielhaft nachfolgend dargestellt, eingeführt werden. Es können aber auch andere Verknüpfungsreaktionen oder andere Synthesestrategien, die allgemein bekannt sind, angewandt werden.

BrMg'

CH-Br + BrMg

R¹

&pgr; y

Obwohl für eine Therapie die erfindungsgemäße chemische Verbindung der Formel (I) allein verwendet werden kann, ist es bevorzugt, den Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zu formulieren.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung enthält neben der chemischen Verbindung der Formel (I) mindestens eine weitere Komponente, ausgewählt aus mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Antikoagulanz, weiteren Wirkstoff und/oder Inhibitor.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen beinhalten Zusammensetzungen, die geeignet sind zur oralen, rektalen, nasalen, topischen, vaginalen, intraartikulären oder parenteralen Aufnahme, einschließlich einer intramuskulären, subkutanen und intravenösen Aufnahme.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann somit in Form eines Feststoffs, wie Tabletten oder gefüllten Kapseln, oder einer Flüssigkeit, wie Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Elixieren oder Kapseln, die damit gefüllt sind, zur oralen Annahme; in Form von Zäpfchen zur rektalen Aufnahme; oder in Form von sterilen injizierbaren Lösungen zur parenteralen Aufnahme vorliegen.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann derart formuliert werden, dass sie die verzögerte Freigabe der Verbindung der Formel (I) erlaubt. Zu diesem Zweck können in der Zusammensetzung übliche Mittel mit Retardwirkung enthalten sein.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann fest oder flüssig sein.

Feste Zusammensetzungen beinhalten Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln, einschließlich Gelatinekapseln, Zäpfchen und Granulate.

Pharmazeutisch annehmbare Träger für Pulver und Tabletten beinhalten Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talk, Zucker, Lactose, Pektin, Dextrin, Stärke, Gelatine, Tragant, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und Wachse mit einem niedrigen Schmelzpunkt.

·· III, JJ '

Weitere Komponenten für Pulver und Tabletten beinhalten Verdünnungsmittel, Aromen, Lösungsvermittler, Schmiermittel, Suspendiermittel, Bindemittel, Konservierungsmittel, Tablettierungshilfsmittel, Sprengmittel und Verkapselungsmittel.

Zur Herstellung von Zäpfchen können als pharmazeutisch annehmbare Träger mindestens ein Wachs mit einem niedrigen Schmelzpunkt, wie Fettsäureglyceride, eingesetzt werden.

Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen in flüssiger Form beinhalten Lösungen, Suspensionen und Emulsionen.

Beispiele des pharmazeutisch annehmbaren Trägers zur parenteralen Anwendung beinhalten Wasser, wässrige Propylenglykollösungen und wässrige Polyethylenglykollösungen.

Weitere Komponenten, die in flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten sein können, beinhalten Konservierungsmittel, Suspendier- und Dispergiermittel, Stabilisatoren, Farbstoffe, Aromen und Verdickungsmittel.

Geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger für eine orale Anwendung beinhalten Wasser und Wassergemische mit viskosen Materialien, wie natürlichen oder synthetischen Gummen, Harzen, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und anderen bekannten Suspendiermitteln.

Pharmazeutisch annehmbare Träger für eine topische Aufnahme sind Zusammensetzungen auf wäßriger oder öliger Grundlage. Dabei können als weitere Komponenten geeignete Verdickungs-und/oder Geliermittel, Emulgatoren, Stabilisatoren, Dispergiermittel, Suspendiermittel oder Farbstoffe verwendet werden.

Weiterhin kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung mindestens einen weiteren Wirkstoff neben der chemischen Verbindung der Formel (I) enthalten. Vorzugsweise ist dieser Wirkstoff ein fibrinolytischer, fibrinogenolytischer oder thrombolytischer Wirkstoff aus der Gruppe, bestehend aus tPA, uPA, Plasmin, Streptokinase, Eminase, Hementin, Hementerin, Staphylokinase und bat-PA.

Außerdem kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung neben der chemischen Verbindung der Formel (I) mindestens einen weiteren Inhibitor enthalten. Vorzugsweise handelt es sich bei diesem Inhibitor um einen Inhibitor von Proteasen und Nukleasen.

Die erfindungsgemäße chemische Verbindung der Formel (I) ist als Inhibitor von Transglutaminasen geeignet.

Es hat sich gezeigt, dass die funktionell Gruppe in der Seitenkette von Formel (I) in einer sekundären Wechselwirkung über den Spacer (CH₂)_mYn(CH₂)o in eine korrekte Position zu den Aminosäuren der katalytischen Triade gebracht wird. Der Spacer bindet dabei an eine hydrophobe Tasche im Inneren des Aktivzentrums und ermöglicht damit der funktioneilen Gruppe mit Cystein, Histidin oder Aspartat eine Wechselwirkung, vorzugsweise eine kovalente Bindung, einzugehen.

Es wurde herausgefunden, dass durch die funktioneile Gruppe der erfindungsgemäßen chemischen Verbindung der Formel (I) eine kovalente Bindung mit den Aminosäuren der katalytischen Triade (Cystein, Histidin, Aspartat) erhalten werden kann, da die funktioneile Gruppe ein elektrophiles Zentrum und insgesamt eine Strukturverwandschaft mit dery-Carboxamidfunktion des Glutamins aufweist.

Insbesondere kann die erfindungsgemäße chemische Verbindung der Formel (I) zur Inhibierung von einer Quervernetzung von Proteinen und Peptiden, einem Einbau von primären Aminen in Proteinen und Peptiden, einer Hydrolyse der &ggr;-Carboxamid-gruppe von protein- und peptidgebundenen Glutaminresten, Säugertransglutaminasen, humanen Transglutaminasen, Blutfaktor XIII / Blutfaktor XIIIa, der Vernetzung von Fibrin und/oder a₂-Plasmininhibitor, Gewebetransglutaminase, Lebertransglutaminase, Gehimtransglutaminase, Augenlinsen-Transglutaminase, Keratinocyten-Transglutaminase, epidermaler Transglutaminase, Prostata-Transglutaminase, pflanzlicher Transglutaminase, parasitärer Transglutaminase und/oder bakterieller Transglutaminase verwendet werden.

Dadurch ist die erfindungsgemäße chemische Verbindung der Formel (I) zur Behandlung zahlreicher Krankheiten, die durch diese Transglutaminasen verursacht werden oder an

denen diese Enzyme beteiligt sind, geeignet. Beispielsweise kann die erfindungsgemäße chemische Verbindung der Formel (I) zur Behandlung von Katarakt, Entzündungserkrankungen, rheumatoider Arthritis, chronischer Arthritis, Thrombosen, Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington, Akne, Krebs (Einleitung der Apoptose), HIV-Infektionen, Krankheiten, hervorgerufen durch Parasiten, und Psoriasis verwendet werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1 &ggr;-Semialdehyd von Carbobenzoxy-L-glutamylglycin

1.01 g (3.00 mmol) Carbobenzoxy-L-glutaminylglycin werden unter Inertgasatmosphäre in 10 ml wasserfreiem THF gerührt. Nach Zutropfen einer Lösung aus 9 ml 1 M LiAIH₄ in THF (9.00 mmol) und 2.67 ml (27.0 mmol) Piperidin wird 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird auf Eis gegossen, mit 10 % Citronensäure angesäuert und mehrfach mit Essigester extrahiert. Nach dem Trocknen über Na₂SO₄ wird das Lösungsmittel i. Vak. abdestilliert. Man erhält 0.350 g (36 %) des y-Semialdehydprodukts.

Beispiel 2 ieri-Butyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-glutaminpentafluorphenylester

1.00 g (2.67 mmol) Boc-Glutaminylglutamin und 0.983 g (5.34 mmol) Pentafluorphenol werden unter Wasserausschluß in 12 ml Dioxan-DMF 3:1 gelöst. Die Reaktionsmischung wird auf <5°C gekühlt und nachfolgend mit 0.606 g (2.94 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid portionsweise versetzt. Man rührt noch 3 h, dabei erwärmt sich der Reaktionsansatz auf Raumtemperatur. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, und der Überstand wird i. Vak. bis zur Trockene eingedampft. Den Rückstand digeriert man mit Diethylether. Man erhält 1.30 g (90 %) eines farblosen Pulvers.

Beispiel 3 L-lsoleucinyl-L-valinmethylester

Eine Suspension von 1.00 g (4.34 mmol) L-lsoleucinyl-L-valin in 50 ml Essigsäuremethylester wird mit 177 g (8.68 mmol) para-Toluolsulfonsäure Monohydrat bei Raumtemperatur versetzt. Dabei geht das Dipeptid in Lösung. Nach 4 Tagen wird die Lösung dreimal mit jeweils 10 ml gesättigter NaHCC>3-Lösung extrahiert, dreimal mit jeweils 10 ml Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels i. Vak. erhält man 0.785 g (74 %) des farblosen Produkts.

Beispiel 4

feri-Butyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-glutaminyl-L-isoleucinyl-L-

valinmethylester

0.540 g (1.00 mmol) Soc-Gln-Gln-OPFP und 0.244 g (1.00 mmol) He-VaI-OMe werden unter Wasserausschluß in 10 ml Dioxan auf <5°C gekühlt. Nach Zugabe von &mgr;&Igr; (1.00 mmol) Triethylamin rührt man insgesamt 3 h. Dabei wird die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur erwärmt. Das Lösungsmittel wird i. Vak. abdestilliert, und der Rückstand wird mit Dieethylether digeriert. Man erhält 0.481 g (80 %) farblose Kristalle.

Beispiel 5
iert-Butyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-glutaminyl-L-isoleucinyl-L-valin

0.601 g (1.00 mmol) Boc-Gln-Gln-lle-Val-OMe werden in 10 ml 1 M NaOH bei Raumtemperatur gerührt. Nach 2.5 h wird mit 1 N HCI neutralisiert. Dabei fällt ein weißer Niederschlag an. Man filtriert und trocknet über Phosphorpentoxid i. Vak. Man erhält 0.230 g (39 %) des Tetrapeptids.

Beispiel 6

&ggr;-Semialdehyd von ierf-Butyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-glutaminyl-L-

isoleucinyl-L-valin

Zu einer gerührten Lösung von 0.293 g (0.500 mmol) ßoc-Gln-Gln-lle-Val in 5 ml wasserfreiem THF werden unter Inertgasatmosphäre eine Lösung aus 2 ml 1 M

LiAIH₄ in THF (2.00 mmol) und 0.6 ml (6.0 mmol) Piperidin bei Raumtemperatur zugetropft. Nach 20 h wird die Reaktionsmischung auf Eis gegossen, mit 10 % Citronensäure
angesäuert und mehrfach mit Essigester extrahiert. Nach dem Trocknen
über Na₂SO₄ wird das Lösungsmittel i. Vak. abdestilliert. Man erhält 71.5 mg (25 %) des &ggr;-Semialdehydprodukts.

Beispiel 7 Carbobenzoxv-L-serinvlqlvcin-ß-formvlester

300 mg (1.01 mmol) Carbobenzoxy-L-serinylglycin gelöst in 10 mL wasserfreiem Tetrahydrofuran werden unter Rühren auf < -5 ⁰C gekühlt. Anschließend versetzt man die Lösung mit 2.06 g (10.0 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid und 756 &mgr;&Igr; (921 mg, 20.0 mmol) Ameisensäure (98-100 %). Man rührt 2 h bei < -5 ⁰C und 2 d bei Raumtemperatur. Die Suspension wird langsam in 40 mL Eiswasser eingetragen, der ausgefallene Feststoff wird durch Filtration über Kieselgur (Celite 521) abgetrennt. Das Filtrat wird dreimal mit je 20 mL Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknen der vereinigten organischen Phasen über Na₂SO₄ wird das Lösungsmittel i. Vak. abgezogen und das resultierende Öl mit Diethylether digeriert. Man erhält 140 mg (44%) Ameisensäureester.

¹H-NMR ([De]-DMSO):

&dgr; [ppm] = 3.77 (m, 2H, CH₂); 4.16 (m, 1H, CH); 4.40 (m, 2H, CH₂); 5.06 (m, 2H, CH₂ (Z)); 7.39 (m, 5H, C₆H₅ (Z)); 7.73 (d, 1H₁ NH); 8.22 (s, 1H₁ HCO); 8.43 (t, 1H, NH).

ESI - MS (MeOH): m/z = 347.1 (M+Na)⁺.

Beispiel 8 Carbobenzoxv-ß-fO-formvn-L-serinvlqlvcinethvlester

250 mg (0.771 mmol) Carbobenzoxy-L-serinylglycinethylester werden unter Rühren in 10 mL wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Das Gemisch wird auf < -5 ⁰C vorgekühlt und anschließend mit 816 mg (4.00 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid und 302 &mgr;&Igr; (368 mg, 8.00 mmol) Ameisensäure (98-100 %) versetzt.

Man rührt 2 h bei < -5 ⁰C und 2 d bei Raumtemperatur. Anschließend wird der ausgefallene Feststoff durch Filtration über Kieselgur abgetrennt. Das Filtrat wird nachfolgend auf 30 g Eiswasser gegossen, wobei das Produkt sofort als farbloser Feststoff ausfällt. Zur Vervollständigung der Fällung wird über Nacht im Kühlschrank gelagert. Das Präzipitat wird abgesaugt, mit wenig Eiswasser gewaschen und i.Vak. über P4O10 getrocknet. Ausbeute: 103 mg (37 %) des Ameisensäureesters.

¹H-NMR ([D₆J-DMSO):

&dgr; [ppm] = 1.18 (t, 3H, CH₃); 3.75-3.93 (m, 2H₁ CH₂); 4.05-4.14 (q, 2H₁ CH₂); 4.10-4.20 (m, 1H, CH); 4.30-4.46 (m, 2H₁ CH₂); 4.99-5.10 (m, 2H₁ CH₂ (Z)); 7.28-7.40 (m, 5H₁ C₆H₅ (Z)); 7.73 (d, 1H, NH); 8.21 (s, 1H, HCO); 8.55 (t, 1H₁ NH).

ESI - MS (MeOH): m/z = 375.1 (M+Na)⁺.

Beispiel 9 Carbobenzoxv-L-serinylglvcin-ß-acetylester

100 mg (0.337 mmol) Carbobenzoxy-L-serinylglycin werden in 3 mL wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst und auf 0 ⁰C gekühlt. Nach Zugabe von 143 pL (159 mg, 2.02 mmol) Acetylchlorid lässt man noch 1 h bei 0 ⁰C, anschließend 5 Tage bei Raumtemperatur rühren. Der Reaktionsansatz wird auf 10 g Eiswasser gegossen, das ölige Produkt wird in 10 mL Ethylacetat aufgenommen, und die wässrige Phase wird zweimal mit je 10 mL Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknung der vereinigten organischen Phasen über Na₂SO₄ wird das Lösungsmittel i. Vak. abdestilliert. Der semikristalline Rückstand wird mit 5 mL Diethylether behandelt und mehrere Stunden auf-20 ⁰C gekühlt. Das Präzipitat wird abgesaugt und an der Luft getrocknet. Man erhält 55 mg (48 %) des acetylierten Dipeptids.

¹H-NMR ([D₆J-DMSO):

&dgr; [ppm] = 1.98 (S, 3H, CH₃CO); 3.66-3.87 (m, 2H, CH₂); 4.01-4.10 (m, 1H, CH); 4.22-4.29 (m, 1H, CH₂); 4.32-4.44 (m, 1H, CH₂); 5.00-5.12 (d, 2H₁CH₂ (Z)); 7.30-7.40 (m, 5H, C₆H₅ (Z)); 7.68 (d, 1H₁ NH); 8.40 (t, 1H, NH); 12.62 (s, 1H₁ CO₂H).

26
ESI - MS (MeOH): m/z = 361.1 (M+Na)⁺; 699.2 (2M+Na)⁺.

Beispiel 10
Carbobenzoxv-ß-iO-acetvD-L-serinvlqlvcinethvlester

250 mg (0.771 mmol) Carbobenzoxy-L-serinylglycinethylester werden in 5 mL wasserfreim Tetrahydrofuran gelöst und auf 0 ⁰C gekühlt. Nach Zugabe von 143 &mgr;&igr; (157 mg, 2.00 mmol) Acetylchlorid lässt man noch 1 h bei 0 ⁰C, anschließend 5 Tage bei Raumtemperatur rühren.

Der Reaktionsansatz wird auf 20 g Eiswasser gegossen und das ölige Produkt in 30 mL Ethylacetat aufgenommen; die wässrige Phase wird noch zweimal mit je 20 mL Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknung der vereinigten Ester-Extrakte über Na₂SO₄ wird das Filtrat i. Vak. zur Trockene eingeengt. Der Rückstand (farbloses Öl) wird mit 5 mL Diethylether digeriert und zur Kristallisation mehrere Stunden bei -20 ⁰C gelagert. Der Feststoff wird abgesaugt und an der Luft getrocknet. Man erhält 125 mg (44 %) des acetylierten Dipeptids.

¹H-NMR ([D₆J-DMSO):

&dgr; [ppm] = 1.18 (t, 3H, CH₃); 1.97 (s, 3H, COCH₃); 3.74-3.95 (m, 2H, CH₂); 4.08 (q, 2H, CH₂); 4.00-4.10 (m, 1H₁ CH); 4.22-4.30 (m, 1H, CH₂); 4.32-4-42 (m, 1H, CH₂); 4.98-5.13 (m, 2H, CH₂ (Z)); 7.28-7.40 (m, 5H, C₆H₅ (Z)); 7.66 (d, 1H, NH), 8.50 (t, 1H, NH).

ESI - MS (MeOH): m/z = 389.1 (M+Na)⁺.

Beispiel 11 Carbobenzoxv-L-serinvlqlvcin-ß-chloracetvlester

200 mg (0.674 mmol) Carbobenzoxy-L-serinylglycin, gelöst in 5 mL wasserfreiem Tetrahydrofuran, werden auf 0 ⁰C gekühlt und anschließend mit 90.0 &mgr;&Igr; (126 mg; 1.12 mmol) Chloracetylchlorid versetzt. Man rührt 2 h bei 0 ⁰C und 5 d bei RT. Der Reaktionsansatz wird nachfolgend auf 10 g Eiswasser gegossen, das ölige Produkt in 10 mL Ethylacetat aufgenommen und die verbleibende wässrige Phase noch viermal mit je 10 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ester-Extrakte werden über Na₂SO₄ getrocknet. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels i. Vak. erhält man einen öligen Rückstand, der zur

1 ·

• ··

• *

Kristallisation mit 5 mL Diethylether digeriert wird. Der resultierende farblose Feststoff wird abgesaugt und an der Luft getrocknet. Ausbeute: 152 mg (61 %) des Chloressigsäureesters.

¹H-NMR ([De]-DMSO):

&dgr; [ppm] = 3.66-3.88 (m, 2H, CH₂); 4.15-4.25 (m, 1H₁ CH); 4.34 (s, 2H, CICH₂CO); 4.32-4.46 (m, 2H, CH₂); 5.00-5.12 (q, 2H, CH₂ (Z)); 7.29-7.43 (m, 5H, C₆H₅ (Z)); 7.71 (d, 1H, NH); 8.42 (t, 1H, NH); 12.68 (s, 1H, CO₂H).

ESI - MS (MeOH): m/z = 373.1 (M+H)⁺; 395.1 (M+Na)⁺; 411.1 (M+K)⁺.

Beispiel 12 Carbobenzoxv-ß-fO-chloracetvH-L-serinviglvcinethvlester

174 mg (0.537 mmol) Carbobenzoxy-L-serinylglycinethylester werden in 5 mL wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst und auf 0 °C gekühlt. Zu dieser Lösung pipettiert man &mgr;&Igr; (226 mg; 2.00 mmol) Chloracetylchlorid. Man rührt 3 h bei 0 ⁰C und 3 d bei RT. Der Reaktionsansatz wird nachfolgend auf 20 g Eiswasser gegossen, wobei das Produkt sofort als farbloser Feststoff ausfällt. Zur Vervollständigung der Fällung wird über Nacht im Kühlschrank gelagert. Das Präzipitat wird abgesaugt, mit wenig Eiswasser gewaschen und i.Vak. über P₄Oi₀ getrocknet. Ausbeute: 165 mg (77 %) des Chloressigsäureesters.

¹H-NMR ([De]-DMSO):

&dgr; [ppm] = 1.18 (t, 3H, CH₃); 3.74-3.93 (m, 2H, CH₂); 4.08 (q, 2H, CH₂); 4.14-4.25 (m, 1H₁ CH); 4.34 (s, 2H, COCH₂CI); 4.32-4.45 (m, 2H, CH₂); 5.00-5.10 (m, 2H, CH₂ (Z)); 7.28-7.40 (m, 5H, C₆H₅ (Z)); 7.70 (d, 1H, NH); 8.53 (t, 1H, NH).

ESI - MS (MeOH): m/z = 423.1 (M+Na)⁺.

Beispiel 13 Chloracetvlester des Heptapeptids pEEGSQIV

Man löst 5.0 mg (6.7 &mgr;&pgr;&igr;&ogr;&Igr;) pEEGSQIV in 0.5 mL wasserfreiem Dimethylsulfoxid, versetzt mit 3 &mgr;&idiagr; (4 mg; 35 &mgr;&igr;&tgr;&igr;&ogr;&Igr;) Chloracetylchlorid und rührt solange bei Raumtemperatur, bis das Edukt chromatographisch nicht mehr nachweisbar ist. Die erhaltene Lösung wird i. Vak. zur Trockene eingedampft.

Beispiel 14 Chloracetvlester von N.N-Dimethvlcasein

100 mg (4.40 pmol) &Ngr;,&Ngr;-Dimethylcasein werden unter Rühren in 5 mL wasserfreiem Dimethylsulfoxid gelöst und bei Raumtemperatur mit 30.0 &mgr;&idiagr; (42.0 mg, 372 &mgr;&igr;&eegr;&ogr;&Igr;) Chloracetylchlorid
versetzt. Man rührt noch 7 d bei Raumtemperatur.
Die resultierende Lösung wird auf zwei Centricon-Röhrchen verteilt und 2 h bei 25 ⁰C und 5000 &khgr; g zentrifugiert. Zur Entfernung von DMSO-Rückständen gibt man 2 mL H₂O zu und zentrifugiert 2 h bei 7000 &khgr; g. Der Waschschritt wird zweimal wiederholt. Lyophilisieren des Retentats ergibt 89 mg modifiziertes Casein.

Beispiel 15 Phenvlcarbonat von Carbobenzoxv-L-serinvlqlycinethvlester

Zu einer gekühlten Lösung (0-5 ⁰C) von 250 mg (0.770 mmol) Carbobenzoxy-L-serinylglycin
in 3 mL wasserfreiem Pyridin gibt man unter Rühren 126 &mgr;&Igr; (1.00 mmol)
Phenylchlorformiat. Man rührt 1 h bei 0-5 ⁰C und 2 h bei Raumtemperatur. Der Reaktionsansatz
wird auf 10 g Eis gegossen. Der farblose Niederschlag wird abgesaugt und
mit wenig eiskaltem Wasser gewaschen. Nach Trocknung über Phosphorpentoxid erhält man 344 mg (99%) des Phenyldipeptidylcarbonats.

Beispiel 16 Carbobenzoxv-ß-fO-carbamovD-L-serinvlalvcinethvlester

Unter Eiskühlung suspendiert man 344 mg des Phenyldipeptidylcarbonats (Beispiel 15) in 1 mL wasserfreiem Methanol. Nachfolgend tropft man langsam eine 7 M Ammoniak-

Lösung in Methanol zu, wobei nach kurzer Zeit eine klare Lösung entsteht. Man rührt noch 2 h bei 0-5 ⁰C und versetzt das Reaktionsgemisch mit 10 mL Diethylether. Nach mehrstündiger Kühlung auf-20 ⁰C bildet sich ein farbloser kristalliner Niederschlag, der nach 12 h abgesaugt, mit 5 mL eiskaltem Diethylether gewaschen und an der Luft getrocknet wird. Ausbeute: 100 mg (36 %) der Carbamoyl-Verbindung.

¹H-NMR ([De]-DMSO):

&dgr; [ppm] = 1.17 (t, 3H, CH₃); 3.75-3.90 (m, 2H, CH₂); 3.90-4.00 (m, 1H, CH₂); 4.02-4.12 (q, 2H, CH₂); 4.13-4.22 (m, 1H, CH); 4.27-4.38 (m, 1H, CH₂); 5.03 (s, 2H₁CH₂ (Z)) 6.55 (S, 2H, NH₂); 7.28-7.40 (m, 5H, C₆H₅ (Z)); 7.58 (d, 1H, NH); 8.46 (t, 1H, NH).

ESI - MS (MeCN): m/z = 376.1 (M+H)⁺; 390.1 (M+Na)⁺; 406.1 (M+K)⁺.

Beispiel 17 Carbobenzoxy-L-serinylglycin-ß-urethan

1.00 g (3.37 mmol) Carbobenzoxy-L-serinylglycin werden mit 0.273 g (3.37 mmol) Kaliumcyanat in 20 ml wasserfreiem THF unter Rühren auf <0°C gekühlt. Nach Zugabe von 0.460 g (3.37 mmol) Trichloressigsäure rührt man noch 3 d bei dieser Temperatur. Man destilliert das Lösungsmittel i. Vak. ab, nimmt den Rückstand in Essigester auf, wäscht mehrfach mit Wasser und trocknet über Na₂SO₄. Nach Abziehen des Lösungsmittels erhält man 0.743 g (65 %) des farblosen Urethans.

Beispiel 18 Carbobenzoxy-L-serinylglycin-ß-tosylat

In eine Lösung von 1.00 g (3.37 mmol) Carbobenzoxy-L-serinylglycin und 0.642 g (3.37 mmol) Toluolsulfonsäurechlorid in 20 ml THF werden unter Wasserausschluß bei 0-3⁰C 0.5 ml (6.19 mmol) Pyridin zugetropft. Man rührt insgesamt 5 h, dabei er-

wärmt sich die Lösung auf Raumtemperatur. Man gießt auf Eiswasser und saugt den ausgefallenen Niederschlag ab. Man erhält 1.03 g (68 %) des farblosen Tosylesters.

Beispiel 19 Carbobenzoxy-ß-amino-L-alanylglycin

1.00 g (2.22 mmol) Carbobenzoxy-L-serinylglycin-ß-tosylat werden in 20 ml Ethanol gelöst. Nach Zugabe von 0.5 ml (6.68 mmol) 25 % NH₃ wird noch 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Man dampft i. Vak. zur Trockene ein. Man erhält 1.10 g rohes Ammoniumsalz, das ohne weitere Reinigung zum Harnstoffderivat umgesetzt wird.

Beispiel 20 Carbobenzoxy-ß-ureyl-L-alanylglycin

1.10 g rohes Ammoniumsalz von Carbobenzoxy-ß-amino-L-alanylglycin werden mit 0.180 g (2.22 mmol) Kaliumcyanat in 20 ml wasserfreiem THF bei <0°C gerührt. Nach Zugabe von 0.909 g (6.66 mmol) Trichloressigsäure läßt man noch 3 d bei dieser Temperatur weiterreagieren. Das Lösungsmittel wird abdestilliert, und der Rückstand wird mehrfach mit Essigester ausgezogen. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit Wasser gewaschen und über Na2SC>4 getrocknet. Nach Abdestillieren des Solvens erhält man 0.338 g (45 %) des Harnstoffderivats.

Beispiel 21 Carbobenzoxv-L-asparaqinvlqlvcin-fe/t-butylester

2.32 g (6.00 mmol) Carbobenzoxy-L-asparagin-para-nitrophenylester und 1.01 g (6.00 mmol) Glycin-fert-butylester Hydrochlorid werden in 12 mL N,N-Dimethylformamid gelöst und bei 0 ⁰C mit 660 &mgr;&Igr; (6.00 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Man rührt noch 2 h bei 0 ⁰C und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur. Die gelbe Suspension wird in 100 mL Eiswasser eingerührt, der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und mit 0.1 M HCI und Wasser gewaschen. Nach Trocknen über Phosphorpentoxid wird aus wässr. Methanol umkristallisiert. Man erhält 1.32 g (58 %) Dipept/dylester.

¹H-NMR ([De]-DMSO):

&dgr; [ppm] = 1.40 (s, 9H₁ (JBu)); 2.35-2.55 (m, 2H, CH₂); 3.60-3.80 (m, 2H₁ CH₂); 4.39 (m, 1H₁ CH); 5.02 (S₁ 2H₁ CH₂ (Z)); 6.90 (S₁ 1H₁ NH₂); 7.28 (s, 1H₁ NH₂); 7.30-7.38 (m, 5H₁ C₆H₅ (Z)); 7.44 (d, 1H₁ NH); 8.16 (t, 1H₁ NH).

Beispiel 22 Carbobenzoxv-B-fN-carbamovD-L-aminoalanvlqlvcin-tert-butvlester

312 mg (0.823 mmol) Carbobenzoxy-L-asparaginylglycin-fe/i-butylester und 387 mg (0.900 mmol) [Bis-(trifluoracetoxy)iod]benzol werden unter Rühren in 20 mL Acetonitril/H₂0 (1:1) gelöst. Nach Zugabe von 245 pL Pyridin rührt man über Nacht. Anschließend wird Acetonitril i.Vak. vollständig abgezogen, und die verbleibende wässrige Lösung wird dreimal mit je 10 mL Diethylether extrahiert. Nach Ansäuern der wässrigen Phase mit 10 % Essigsäure auf pH 2.8 gibt man 214 mg (3.30 mmol) Natriumcyanat bei Raumtemperatur zu und rührt 2 d. Extraktion mit Ethylacetat, Trocknen über Na₂SO₄ und Abdestillieren des Lösungsmittels ergibt 102 mg (31 %) eines farblosen, kristallinen Feststoffs.

¹H-NMR ([De]-DMSO):

&dgr; [ppm] = 1.41 (S₁ 9H₁ (ffiu)); 3.09 (m, 1H₁ CH₂); 3.40 (m, 1H, CH₂); 3.72 (m. 2H₁ CH₂); 4.03 (m, 1H₁ CH); 5.04 (s, 2H₁ CH₂ (Z)); 5.67 (s, 2H, NH₂); 6.02 (t, 1H, NH); 7.30 - 7.40 (m, 5H₁ C₆H₅ (Z)); 7.46 (d, 1H₁ NH); 8.27 (t, 1H, NH).

ESI - MS (MeOH): m/z = 395.2 (M+H)⁺; 417.2 (M+Na)⁺; 433.1 (M+K)⁺; 811.4 (2M+Na)⁺.

Beispiel 23
Carbobenzoxv-ß-urevl-L-alanvlqlvcin

102 mg (0.259 mmol) Carbobenzoxy-ß-iN-carbamoyO-L-aminoalanylglycin-tert-butylester löst man bei Raumtemperatur in 5 mL Trifluoressigsäure und rührt noch 30 min bei die-

ser Temperatur. Die Lösung wird bei 40 ⁰C i. Vak. auf ca. 1 mL eingeengt, mit 5 mL Diethylether digeriert und über Nacht auf -20 ⁰C gekühlt.

Die Kristalle werden abgesaugt und mit wenig eiskaltem Diethylether gewaschen. Trocknung an der Luft ergibt eine Ausbeute von 64 mg (73 %) farblosem Feststoff.

¹H-NMR ([De]-DMSO):

&dgr; [ppm] = 3.05-3.15 (m, 1H, CH₂); 3.30-3.45 (m, 1H, CH₂); 3.69-3.78 (m, 2H, CH₂); 4.04 (m, 1H, CH); 5.03 (s, 2H₁ CH₂ (Z)); 5.64 (s, 2H, NH₂); 6.00 (t, 1H, NH); 7.28-7.40 (m, 5H, C₆H₅ (Z)); 7.45 (d, 1H, NH); 8.22 (t, 1H, NH); 12.58 (s, 1H, CO₂H).

ESI - MS (MeOH): m/z = 339.2 (M+H)⁺; 361.1 (M+Na)⁺

Beispiel 24 Carbobenzoxv-L-iteft-butvQqlutamvlglycinbenzvlester

5.00 g (11.5 mmol) Carbobenzoxy-L-iterf-butyOglutaminsäure-N-hydroxy-succinimidester werden unter Rühren in 20 mL Tetrahydrofuran gelöst. Man gibt eine Lösung von 2.32 g (11.5 mmol) Glycinbenzylester Hydrochlorid in 25 mL 1 M NaHCO₃ zu und rührt über Nacht bei Raumtemperatur.

Anschließend wird das Lösungsmittel abdestilliert. Das ölige Produkt wird in 50 mL
Ethylacetat aufgenommen, und die wässrige Phase wird zweimal mit je 25 mL Ethylacetat extrahiert. Die vereinten organischen Phasen werden über Na₂SO₄ getrocknet. Nach Abziehen des Lösungsmittels erhält man 5.54 g (99 %) eines farblosen Öls. Dieses Rohprodukt wird mit 4 mL Diethylether digeriert und zur Kristallisation einige Stunden auf -20 ⁰C gekühlt. Die farblosen Kristalle werden abgesaugt, mit wenig eiskaltem Ether gewaschen und an der Luft getrocknet. Ausbeute: 4.01 g (72 %).

¹H-NMR ([De]-DMSO):

&dgr; [ppm] = 1.38 (s, 9H, ffiu); 1.65-1.82 (m, 1H, CH₂); 1.82-1.98 (m, 1H, CH₂); 2.27 (t, 2H, CH₂); 3.80-4.02 (m, 2H, CH₂); 4.00-4.10 (m, 1H, CH); 4.97-5.09 (m, 2H, CH₂ (Z)); 5.12
(s, 2H, CH₂ (BzI)); 7.28-7.40 (m, 1OH, C₆H₅ (Z₁BzI)); 7.49 (d, 1H, NH); 8.39 (t, 1H₁ NH).

Beispiel 25 Carbobenzoxv-L-qlutamvlqlycinbenzvlester

2.63 g (5.43 mmol) Carbobenzoxy-L-ite/i-butyOglutamylglycinbenzylester werden unter Rühren in 5 mL wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Anschließend tropft man über einen Zeitraum von 5 min 20 mL Trifluoressigsäure zu und rührt für weitere 25 min. Im Anschluß wird die Lösung bei 40 ⁰C i. Vak. auf 2-3 mL eingeengt. Den Rückstand versetzt man mit 15 mL Diethylether, wobei bereits bei Abkühlung auf Raumtemperatur Kristallisation eintritt. Zur Vervollständigung der Kristallisation kühlt man die Suspension einige Stunden auf- 20 ⁰C.

Nach Absaugen und Waschen der Kristalle mit mehreren Portionen eiskaltem Diethylether wird an der Luft getrocknet. Man erhält 2.18 g (94 %) farblosen, kristallinen Feststoff.

¹H-NMR ([De]-DMSO):

&dgr; [ppm] = 1.70-1.85 (m, 1H, CH₂); 1.85-2.00 (m, 1H, CH₂); 2.30 (t, 2H, CH₂); 3.92 (m, 2H₁ CH₂); 4.08 (m, 1H, CH); 4.97-5.09 (m, 2H, CH₂ (Z)); 5.14 (m, 2H, CH₂ (BzI)); 7.30 - 7.42 (m, 10H, C₆H₅ (Z₁BzI)); 7.52 (d, 1H, NH); 8.41 (t, 1H, NH).

Beispiel 26 Carbobenzoxv-L-e-diazo-S-oxonorleucinvlqlvcinbenzylester

1.01 g (2.33 mmol) Carbobenzoxy-L-glutamylglycinbenzylester löst man in 10 mL trockenem Tetrahydrofuran und kühlt die Lösung auf- 20 ⁰C. Nach Zugabe von 312 &mgr;&igr; (328 mg, 2.40 mmol) Isobutylchlorformiat und 264 &mgr;&igr; (243 mg, 2.40 mmol) N-Methylmorpholin wird 15 min bei < - 20⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend langsam zu einer etherischen Diazomethan - Lösung (50 mL) getropft, so daß die Temperatur 0 ⁰C nicht übersteigt. Nach 30 min bei 0 ⁰C wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Lösungsmittel i. Vak. abgezogen wurde, erhält man das rohe Diazomethylketon als braunes Öl, welches an Kieselgel 60 chromatographiert wird (Eluent: n-Hexan/Ethylacetat2:1). Ausbeute: 516 mg (47 %) farblose Kristalle.

Beispiel 27 Carbobenzoxv-L-e-chloro-S-oxonorleucinvlqlvcinbenzvlester

1.20 g (2.80 mmol) Carbobenzoxy-L-glutamylglycinbenzylester löst man in 10 mL wasserfreiem Tetrahydrofuran und kühlt auf < -20 ⁰C. Nach Zugabe von 375 &mgr;&igr; (292 mg, 2.88 mmol) Isobutylchlorformiat und 317 &mgr;&igr; (292 mg, 2.88 mmol) N-Methyl-morpholin wird 15 min bei < - 20 ⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend langsam (über 10 min) zu einer Diazomethan-Lösung in Ether (60 mL) getropft und noch 30 min bei 0 ⁰C und 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Zu dieser Lösung tropft man so lange eine 1M HCI - Lösung (in Ether), bis ein pH-Wert von 3 erreicht ist. Die Lösung wird schließlich rasch mit gesättigter NaHCO₃ - Lösung behandelt und die etherische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels erhält man das Chlormethylketon als farbloses Öl (890 mg, 69 %).

Beispiel 28 &ggr;-Semialdehyd von Carbobenzoxy-L-glutamylglycin

Eine gerührte Lösung von 1.13 mL (2.26 mmol) Oxalylchlorid in 10 mL wasserfreiem Dichlormethan wird auf- 78 ⁰C gekühlt und langsam mit 0.35 mL Dimethylsulfoxid versetzt. Nach 5 min wird zunächst eine Lösung von 765 mg (2.26 mmol) L^-Carbobenzoxyamino-S-hydroxyvalerylglycinmethylester in 2 mL Dichlormethan und anschließend eine Lösung von 1.5 mL Triethylamin in Dichlormethan tropfenweise zugegeben. Nach weiteren 5 min bei - 78 ⁰C lässt man das Reaktionsgemisch auf 0 ⁰C erwärmen und verteilt zwischen Dichlormethan und Wasser. Die organische Phase wird über Na₂SO₄ getrocknet das Lösungsmittel abdestilliert. Als Rückstand erhält man den Aldehyd (350 mg, 46 %) als farbloses Öl.

Beispiel 29 Inhibieruna von bakterieller Transalutaminase und von Gewebetransqlutaminase

Die Inhibitoren werden in einer Konzentration von 100 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Durch Verdünnung mit Transglutaminase-Puffer (50 mM Tris-HCI, pH 7.0, 5 mM CaCI₂, 2 mM DTT) werden Lösungen mit Konzentrationen von 10 mM, 1 mM und 0.1 mM hergestellt. Anschließend erfolgt die Inhibierung durch Inkubation (20 min bei 37 ⁰C) von 25 &mgr;/ einer Transglutaminase-Lösung (bakterielle Transglutaminase bzw. Meerschwein-

chenlebertransglutaminase) mit 25 &mgr;&Igr; der jeweiligen Inhibitorlösung. Unmittelbar nach Ablauf der Inkubationszeit werden 100 &mgr;&Igr; Substratlösung (0.1 mM Hydroxylamin, 30 mM CBZ-GIn-GIy-OH, 2 mM DTT, 5 mM CaCI₂ in 50 mM Tris-HCI, pH 7,0) zugegeben und 10 min bei 37 ⁰C inkubiert. Die Reaktion wird mit 100 &mgr;&Igr; einer Lösung aus 4 % (w/v) HCI, 1.7 % (w/v) FeCI₃ und 4 % (w/v) Trichloressigsäure abgestoppt [vgl. Grossowicz et al., J. Biol. Chem. 187, 111-125, 1950]. Nach Zentrifugation (10 min, 10,000xg) wird die Extinktion der überstehenden Lösung bei 492 nm im Mikrotiterplattenlesegerät und damit die verbliebene Aktivität der Transglutaminase bestimmt.

Testsubstanz	Inhibierung ve einer In 5mM	in Gewebetransgi hibitorkonzentrat 0,5 mM	utaminase bei ion von 0,05 mM
Carbobenzoxy-L-serinylglycin-ß- formylester	56%	0%	0%
Carbobenzoxy-L-serinylglycin-ß- acetylester	0%	0%	0%
Carbobenzoxy-L-serinylglycin-ß- chloracetylester	91 %	43%	1 %
Carbobenzoxy-L-(O- formyl)serinylglycinethyester	0%	0%	0%
Carbobenzoxy-L-(O- acetyl)serinylglycinethylester	0%	0%	0%
Carbobenzoxy-L-(O- chloracetyl)serinylglycinethylester	76%	7%	2%
Carbobenzoxy-L-(O- carbamoyl)serinylglycinethylester	0%	0%	0%
Carbobenzoxy-L-(N-carbamoyl)- ß-aminoalanylglycin-tert- butylester	0%	0%	0%
Carbobenzoxy-ß-ureyl-L- alanylglycin	35%	0%	0%

Testsubstanz	Inhibierung von einer In 5mM	bakterieller Trans hibitorkonzentrat 0,5 mM	iglutaminase bei ion von 0,05 mM
Carbobenzoxy-L-serinylglycin-ß- formylester	72%	7%	5%
Carbobenzoxy-L-serinylglycin-ß- acetylester	34%	2%	3%
Carbobenzoxy-L-serinylglycin-ß- chloracetylester	99%	98%	29%
Carbobenzoxy-L-(O- formyl)serinylglycinethyester	30%	17%	7%
Carbobenzoxy-L-(O- acetyl)serinylglycinethylester	31 %	15%	6%
Carbobenzoxy-L-(O- chloracetyl)serinylglycinethylester	100%	88%	16%
Carbobenzoxy-L-(O- carbamoyl)serinylglycinethylester	22%	12%	3%
Carbobenzoxy-L-(N-carbamoyl)- ß-aminoalanylglycin-tert- butylester	0%	14%	7%
Carbobenzoxy-ß-ureyl-L- alanylglycin	49%	0%	0%

Beispiel 30 Inhibierunq von humanem Faktor XIII

Die Inhibierungsversuche werden direkt in mit N, N' Dimethylcasein (10 mg/ml in 8.1 mM Na₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO₄, 0.14 M NaCI und 2.7 mM KCI, pH 8) beschichteten Mikrotiterplatten durchgeführt. Nach Waschen werden die Platten zusätzlich mit 200 &mgr;110 mg/ml Serumalbumin (in 0.04 M Tris, 0.15 M NaCI, pH 8.3) behandelt und erneut gewaschen (0.04 M Tris, 0.15 M NaCI und 5 mM CaCI₂, pH 8.3; &ldquor;TGase-Puffer"). Anschließend werden jeweils 0.6 &mgr;g rekombinanter humaner FXIII in 50 &mgr;&Igr; TGase- Puffer mit 50

&mgr;&Igr; Thrombin (0.215 mg/ml in TGase-Puffer) aktiviert (15 min bei 25 ⁰C). Nach Zugabe von 50 &mgr;&Igr; Inhibitorlösung (5mM) in 5 % DMSO / TGase- Puffer erfolgt die Inhibierung für die Dauer von 15 min bei 25 ⁰C. Anschließend werden 50 &mgr;&Igr; Substratlösung (6 mM Biotinylcadaverin, 40 mM Dithiothreitol) zupipettiert und 1 h bei 25 ⁰C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 40 &mgr;&Igr; einer 0.2 M EDTA-Lösung beendet. Nach erneutem Waschen (0.1 M Tris, 0.1 M NaCI und 10 mM MgCI₂, pH 9,5) wird zum Nachweis des gebundenen Biotins 200 &mgr;&Igr; 2 &mgr;g/ml Streptavidin- alkalische Phosphatase zugegeben und h bei 37 ⁰C inkubiert.

Nach erneutem Waschen (0.1 M Glycin, 1 mM MgCI₂ und 1 mM ZnCI₂, pH 10.4) wird die enzymatische Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat bei 405 nm und damit die Transglutaminaseaktivität bzw. die Inhibierung bestimmt.

Wenn als Inhibitor der Chloracetylester des Heptapeptids pEEGSQIV verwendet wird, resultiert eine Inhibierung des Faktors XIIIa von 85%.

Beispiel 31

Inhibierung von Meerschweinchenleber-Transglutaminase und Factor XIIIa durch den &ggr;-Semialdehyd von Carbobenzoxy-L-Glutamylglycin

Factor XIIIa: Die Inhibitorversuche wurden in Mikrotiterplatten durchgeführt (0.2 ml). Hierbei wurde die Fähigkeit der Plasma-Transglutaminase untersucht, die Gerinnung von Fibrin mit und ohne Inhibitor zu katalysieren [modifiziert nach Tymiak et al., J. Antibiot., 46, 204-206 (1993)].

40 &mgr;&Igr; Rinder-Fibrinogen (3 mg/ml, Sigma) in 25 mM Tris-HCI mit 100 mM NaCI und 2.5 mM Ca²⁺, pH 7.5, wurden mit 2 U/ml Rinder-Thrombin (Sigma) für 10 min bei 25°C inkubiert.

Parallel hierzu wurde in einem zweiten Ansatz zu 20 &mgr;g/ml FXIII in 25 mM Tris-HCI mit 100 mM NaCI und 2.5 mM Ca²⁺, pH 7.5, ebenfalls mit 2 U/ml Rinder-Thrombin (Sigma) versetzt und für 10 min bei 25°C inkubiert. Anschließend wurde die &ggr;-Semialdehyd-Inhibitor Konzentration so eingestellt, dass die Messwerte einen Konzentrationsbereich von 0 bis 10 &mgr;&Mgr; erfassten. Der Reaktionsansatz wurde für 15 min bei 25 ⁰C inkubiert.

•I···» «t

Die beiden Ansätze wurden vereinigt, und nach einer Inkubation von 15 min bei 3O⁰C wurden 150 &mgr;&Igr; Harnstoff (8 M) hinzugefügt. Die Absorption der Gerinnsel wurde bei 405 nm gemessen.

Danach ließ sich Faktor XIIIa nicht durch &ggr;-Semialdehyd von Carbobenzoxy-L-Glutamylglycin inhibieren.

Meerschweinchenlebertransglutaminase:

Die Durchführung der Inhibitorversuche erfolgte analog dem FactorXIII-Test in Mikrotiterplatten. Hierbei wurde der Einbau von Hydroxylamin in Carbobenzoxy-L-glutaminylglycin (CBZ-GIn-GIy) untersucht [modifiziert nach Grossowicz et al., J.

Biol. Chem., 187, 111-125(1950)].

Zu 25 &mgr;&Igr; (5,0 U/ml) Meerschweinchenlebertransglutaminase (Sigma) wurden 25 &mgr;&Igr; (0-10&mgr;&Mgr;) Inhibitor gegeben und 15 min bei 25 ⁰C inkubiert. Anschließend wurden 100 &mgr;&Igr; 0,2 M Tris-Acetat-Puffer, pH 6,0, mit 30 mM CBZ-GIn-GIy, 0,1 M Hydroxylamin und 10 mM Glutathion zupipettiert. Nach 10 min bei 37°C wurde die Absorption bei 492 nm mit dem Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen.

Meerschweinchenlebertransglutaminase wird bereits bei 1 &mgr;&Mgr; &ggr;-Semialdehydes des Carbobenzoxy-L-Glutamylglycins inhibiert.

Beispiel 32

Inhibierung von Factor XIIIa durch den &ggr;-Semialdehyd von tert-Butyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-glutaminyl-L-isoleucinal-L-valin

Die Durchführung des Tests erfolgte wie in Beispiel 31 (Faktor XIIIa) beschrieben. Die Fibrinvernetzung konnte durch das Tetrapeptid unterbunden werden. Damit ist der &ggr;-Semialdehyd von ferf-Butyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-glutaminyl-L-isoleucinal-L-valin ein effektiver Faktor XIIIa Inhibitor.

Claims

1. Chemische Verbindung der Formel (I):

worin R¹ bedeutet:

oder

R² H, Alkyl, das wahlweise mit Halogen oder N₂ substituiert sein kann, oder NH₂ bedeutet;
m und o 0 bis 3 und n 0 oder 1 bedeuten;
a_p, b_q und c_r Aminosäureketten und p, q und r die Anzahl der Aminosäuren bedeuten, wobei a und/oder b und/oder c ebenfalls mindestens eine Seitenkette, dargestellt durch (CH₂)_mY_n(CH₂)_oC(Z)R², enthalten können, wobei Y, Z, R², m, n, und o die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) besitzen, und p, q und r gleich oder unterschiedlich sein können und eine ganze Zahl von 0 bis 1000 bedeuten;
R³ und R⁴ unabhängig voneinander H, Alkyl, Aryl, einen Heterozyklus, eine Aminoschutzgruppe oder eine Carboxyschutzgruppe bedeuten;
R⁵ und R⁵ unabhängig voneinander Alkyl, das mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus N, O und S, enthalten kann, Aryl oder einen Heterozyklus bedeuten;
X eine Methingruppe, ein Stickstoff- oder Phosphoratom bedeutet;
Y ein Sauerstoffatom, Schwefelatom oder eine NH-Gruppe bedeutet; und
Z ein Sauerstoffatom, Schwefelatom oder eine NR'-Gruppe bedeutet, wobei R⁷ H, Alkyl, Aryl, einen Heterozyklus, O-Alkyl, O-Aryl, O-Heterozyklus, NR₂ oder NHCONR₂ bedeutet, wobei R H, Alkyl, Aryl oder einen Heferozyklus bedeutet;
mit der Maßgabe, dass

wobei R1 wie vorstehend definiert ist, und

nicht umfasst sind.

2. Chemische Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass m 1 bedeutet, n 0 oder 1 bedeutet und o 0 oder 1 bedeutet.

3. Chemische Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn Z ein Sauerstoffatom bedeutet, R² H, Me, CH₂Hal oder CHN₂ bedeutet.

4. Chemische Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn Z ein Schwefelatom bedeutet, R² H, Me, CH₂Hal oder CHN₂ bedeutet.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die chemische Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, sowie mindestens eine weitere Komponente, ausgewählt aus mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Antikoagulanz, weiteren Wirkstoff und/oder Inhibitor.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ein fibrinolytischer, fibrinogenolytischer oder thrombolytischer Wirkstoff aus der Gruppe, bestehend aus tPA, uPA, Piasmin, Streptokinase, Eminase, Hementin, Hementerin, Staphylokinase und bat-PA, ist.

7. Chemische Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung als Medikament.