DE2017571B2

DE2017571B2 - Verfahren zum verbessern der stabilitaet von enzymen

Info

Publication number: DE2017571B2
Application number: DE19702017571
Authority: DE
Inventors: Oscar Samuel Fort Lauder dale Fla Gray (V St A)
Original assignee: Gray Industries Inc
Current assignee: Gray Industries Inc
Priority date: 1969-04-17
Filing date: 1970-04-13
Publication date: 1973-03-01
Also published as: CH525914A; DE2017571C3; FR2039250A1; IL34291A; NL7005554A; BE749082A; TR16728A; IL34291A0; US3645849A; AT295453B; AU1362570A; DE2017571A1; GB1267475A; SE355817B; CA920524A; ES378692A1

Description

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn- pH-Werts, abhängt.

zeichnet, daß die Mikrowellenenergie eine Fre- So wird beispielsweise bei automatischen, elektro-

quenz von etwa 2400 bis etwa 2500 MHz besitzt. nischen Diagnose-Methoden zur Untersuchung von

5. Verfahren nach einem der vorstehenden An- 35 Körperflüssigkeiten, wie Blut, Blutplasma, Blutserum sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das und Urin, ein Kontrollblutserum benötigt, das dem behandelte Enzym in dem Behälter nach dem Aus- frischen natürlichen und normalen Blutserum so nahe setzen der Mikrowellenenergie weiterhin der Ein- wie möglich sein sollte. Blutserum enthält aber nun wirkung des Kühlgases unterwirft. viele Enzyme. Es ist daher in der Vergangenheit ποίο. Verfahren nach einem der vorstehenden An- 40 wendig gewesen, das für diesen Zweck in den Handel

sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym gebrachte Blutserum zu lyophilisieren. Vor der Ver-

im wäßrigen Medium mindestens eines derjenigen wendung bei den genannten Analysen-Verfahren

im Blutserum ist. mußte dann das lyophilisierte Material mit Wasser

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wieder rekonstituiert werden. Dieses Vorgehen war dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym im 45 mit Einschränkungen verbunden und brachte Nachwäßrigen Medium Blutserum ist. teile mit sich. Die Lyophilisierung kann bereits das

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn- empfindliche Gleichgewicht der Bestandteile des zeichnet, daß man das Blutserum vor dem Aus- Serums in Unordnung bringen. Die Rekonstitution setzen der Mikrowellenenergie auf eine Temperatur der lyophilisierten Materialien führte somit oftmals von etwa 1,67 bis etwa 7,22°C abkühlt. 50 zu schwerwiegenden Fehlern. Es ,war bisher not-

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch wendig gewesen, oftmals eine Vielzahl von vergekennzeichnet, daß die Temperatur des Blut- schiedenen lyophilisierten Blutserum-Produkten herserums während des Aussetzens der Mikrowellen- zustellen, aus welchen dann entsprechend der jeenergie 51,7'C nicht übersteigt. weiligen durchzuführenden Analyse eines oder mehrere

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, 55 ausgewählt wurden. Darüber hinaus hatte das rekondadurc'i gekennzeichnet, daß man das Blutserum stituierte Material nur eine begrenzte Lagerungsdauer, nach dem Aussetzen der Mikrowellenenergie auf so daß eine frische Packung des lyophilisierten Maunterhalb etwa 10,0⁰C abkühlt. terials normalerweise täglich rekonstituiert und ver-

U. Verfahren nach einem der vorstehenden An- wendet werden mußte.

sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im wesent- 60 Die vorstehenden Ausführungen veranschaulichen liehen alle der für Mikrowellen durchlässigen die Probleme, die durch die Instabilität der Enzym-Hauptwände des Behälters direkt der Mikrowellen- präparate bedingt sind. Diese Probleme wurden ausenergie ausgesetzt werden. führlich beschrieben, da das Blutserum ein sehr emp-

12. Blutserum, dai,_ui_h gekennzeichnet, daß es findliches und instabiles Enzymmaterial ist, auf welches

nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 65 das Verfahren der Erfindung besonders gut anwendbar

7 bis 11 erhalten worden ist. ist. Die Erfindung ist aber auch auf Enzyme im allgemeinen anwendbar, und zwar ungeachtet, ob sie in ihrem natürlichen Lösungsmittel (nach Entfernung

von den lebenden Zellen) vorliegen oder ob sie rekonstituiert sind.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Verbessern der Stabilität von Enzymen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Enzym im wäßrigen Medium auf unterhalb 10,0° C abkühlt und hierauf in rascher Aufeinanderfolge (a) das Enzym in einem geschlossenen, für Mikrowellen durchlässigen Behälter in einer Behandlungszone durch eine sich bewegende Atmosphäre eines Kühlgases einen für eine Inaktivierung zu kurzen Zeitraum einer Mikrowellenenergie aussetzt, wobei die sich bewegende Atmosphäre in direktem Kontakt mit den für Mikrowellen durchlässigen Wänden des Behälters steht, jedoch keinen direkten Kontakt mit dem Enzym hat und nach ihrem Eintritt in die Behandlungszone eine Temperatur unterhalb von etwa 15,6°C aufweist, <'>) am Ende dieses Zeitraumes das Aussetzen des ivizyms der Mikrowellenenergie abbricht, und daß ri?.!¹. (c) das Enzym abkühlt.

Die Zirkulierung des Kühlgases wird vorzugsweise nach dem Abbrechen des Aussetzens gegenüber der Mikrowellenenergie einen Zeitraum weitergeführt, um mindestens einen Teil des Kühlens vorzusehen. Das ilnzymmaterial wird somit also vorzugsweise auf innerhalb 10,0⁰C abgekühlt, wobei mindestens der letztere Teil dieses Abkühlungsvorgangs durch andere Mittel erzielt werden kann, beispielsweise dadurch, <Jaß man einen Behälter des Enzymmaterials mit einer Ί ilien Flüssigkeit, z. B. kaltem Wasser, in Berührung '■.•ringt. Es wird auch bevorzugt, den Behälter des nii/.ymmaterials als während des Aussetzens gegenüber tier Mikrowellenenergie mit einer solchen Geschwindigkeit rotieren zu lassen, daß während des Aussetzens mindestens eine komplette Drehung von 360°, vorzugsweise eine Vielzahl von Drehungen um 360 C, erfolgt, um den Einfluß der Mikrowellenenergie auf alle Hauptwände des Behälters zu gewährleisten.

Die Erfindung stellt auch ein Blutserum zur Verfügung, das gegenüber einer Zerstörung im Vergleich zu unbehandeltem Blutserum eine verbesserte Stabilität besitzt.

Es wurde gefunden, daß die vorstehende Behandlung dazu geeignet ist, die Stabilität des behandelten Enzyms gegen eine Zerstörung, d. h. gegen permanenten Aktivitätsverlust, beträchtlich zu erhöhen. Es ist bekannt, daß Enzyme sogar permanent entaktiviert werden können, wenn man sie drastischeren thermischen Behandlungen einschließlich einer Behandlung mit Mikrowellenenergic unterwirft. Die gemäß der Erfindung erfolgende Behandlung verhindert nun durch die Wirkungen des Vorkühlens und des raschen Nachkühlens, in Kombination mit den Wirkungen des Kühlgases während des Aussetzens gegenüber der Mikrowellenstrahlung und durch das begrenzte Ausmaß der letzteren, die Entaktivierung des Enzyms, während zur gleichen Zeit seine Stabilität erhöht wird. Die gemäß der Erfindung erfolgende Stabilisierung wird sehr rasch — in Sekunden — erreicht und ist einfach und wirtschaftlich durchzuführen. Die Bedingungen können für ein beliebiges Enzym oder ein Enzymgemisch standardisiert werden, um von Zeit zu Zeit reproduzierbare Ergebnisse zur Verfugung zu stellen. Somit kann jede Partie oder jeder Ansatz nach den für ein derartiges Enzym spezifischen Methoden untersucht werden.

Soweit derzeit bekannt ist, können alle Enzyme hinsichtlich ihrer Stabilität verbessert werden, wenn man das erfindungsgemäße Verfahren zur Anwendung bringt. Enzyme sind Proteine, mit Einschluß von Metailo-Proteinen und konjugierten Proteinen, die durch lebende Zellen gebildet werden. Nach der allgemein akzeptierten Klassifizierung von Webb in Biochemical Engineering, D. Van Nostrand Co., Inc., Princeton, N. J., 1964 (s. Encyclopedia of Chemical Technology, Kirk — Othmar, Second Ed., Vol. 8) werden Enzyme folgendermaßen unterteilt:

1. Hydrolysierende Enzyme — Proteasen und Peptidasen, wie Pepsin, Rennin u. dgl.; Carbohydrasen, wie Amylasen, Esterasen, z. B. Lipasen, Phosphatasen u.dgl.; Urease; Desaminase usw.;

2. Übertragungs-Enzyme — Dehydrogenasen, wie Milchsäure-Dehydrogenase; Oxidasen; Transaminasen, wie Glutaminsäure — Transaminasen; Kinasen, wie Kreatin-Phosphokinase;

3. Additions- und Subtraktions-Enzyme wie Aconitase, Enolase, Carboxylase und Aldolase.

4. Isomerasen — wie Alaninracemase;

5. Synthetasen — wie Glutaminsynthetase und
6. Nukleasen — wie Desoxyribonuklease.

Wie bereits zum Ausdruck gebracht, ist das Verfahren der Erfindung besonders zur Behandlung der Enzyme im Blutserum geeignet, das Phosphotasen, Transaminasen, Dehydrogenasen und Phosphokinase enthält. Aus dem Blutserum können beliebige Enzyme oder alle isoliert und nach der Rekonstitution, -..um notwendig, getrennt behandelt werden. Man kann auch das Blutserum als solches behandeln. Blutserum, das die klare Flüssigkeit darstellt, die nach Entfernung der Zellelemente (rote und weiße Zellen und Plättchen) und des Koagulierungsmechanismus (Fibrinogen) aus dem gesamten Blut zurückbleibt, stellt eines der besonders bevorzugten Materialien dar, das gemäß der Erfindung behandelt werden kann.

Das gemäß der Erfindung behandelte Enzym liegt in einem wäßrigen Medium vor, d. h., es ist nicht trocken. Es kann in seinem natürlichen Lösungsmittel vorliegen, und zwar in konzentrierter oder nicht konzentrierter Form, oder es kann durch Suspendierung oder Auflösung in einem vorher bereiteten wäßrigen Medium rekonstituiert sein, nachdem es aus seinem natürlichen Lösungsmittel isoliert wurde oder darin konzentriert wurde. Die Menge des mit dem Enzym verbundenen wäßrigen Mediums ist nicht kritisch, solange genügend Wasser vorhanden ist, um das Enzym zu befeuchten. Die Menge kann sehr gut von dem Endzweck des Produkts oder von Gesichtspunkten, die die Handhabung betreffen, abhängig gemacht werden. So ist es z. B. oftmals am angenehmsten, mit einer wäßrigen Suspension oder Lösung zu arbeiten.

Bekanntlich ist Mikrowellenenergie die elektromagnetische Wellenenergie der Wellenlängen, die in

die Mikrowellengegend des elektromagnetischen Spektrums fallen.

Für die Zwecke der Erfindung wird eine Mikrowellenenergie in einem Zwischenbereich mit einer Frequenz von etwa 1000 bis etwa 5000, insbesondere

von etwa 2000 bis etwa 3000MHz bevorzugt. Die Mikrowellenenergie wird von einer geeigneten Hochfrequenzquclle, 7. B. einem Magnetron, erzeugt.
Ein Merkmal des Verfahrens der Erfindung ist die

Vorkühlung des Enzymmaterials. Somit sollte das Temperatur für den Eintritt in die Behandlungszone Material zu der Zeit, bei welcher es erstmals der verringert werden.

Mikrowellenenergie augesetzt wird, eine Temperatur Da es die Hauptfunktion des Kühlgases ist, die

gut unter Raumtemperatur, d. h. etwa unterhalb Wände des Behälters auf einer Temperatur zu halten, 10,0° C, aufweisen. Obgleich es tatsächlich gefroren 5 die gut unterhalb derjenigen des zu behandelnden werden kann, da es nach dem Aussetzen gegenüber Enzymmaterials liegt, bringt ein zwangsweises Hineinder Mikrowellenenergie auftaut, besteht doch keine führen des Kühlgases in die Behandlungskammer und Notwendigkeit für diese Maßnahme, so daß man im entlang der Wände des Behälters unter mindestens Interesse einer besseren Handhabung eine Temperatur einem gewissen positiven Druck (der mindestens etwas oberhalb des Gefrierpunkts bevorzugt. Eine Tempe- io über Atmosphärendruck liegt) eine wirksamere Gesamtratur im Bereich von etwa 1,67 bis etwa 7,22° C ist kühlung mit sich, ohne daß bestimmte Flächen der besonders zufriedenstellend. Das Enzymmaterial kann Wände unzureichend gekühlt werden. Es wurde schon außerhalb der Behandlungskammer oder -Zone vor- bei Drücken gearbeitet, die so niedrig, wie 0,21 · gekühlt werden oder es kann innerhalb der Behänd- 10~² kg/cm² liegen. Drücke bis etwa 3,52 kg/cmlungskammer oder -zone vorgekühlt werden, indem 15 können zweckmäßig sein. Luft ist besonders bei vor dem Aussetzen gegenüber der Mikrowellen- niedrigen positiven Drücken zufriedenstellend, wähenergie ein vorhergehender Stromfk-ß des Kühlgases rend im wesentlichen sauerstofffreie Gase, insbesondere vorgesehen wird. Stickstoff, bei höheren Drücken bevorzugt werden.

Ein weiteres Merkmal des Verfahrens der Erfindung Die genaue Dauer der Behandlung mit der Mikro-

ist, daß das zu behandelnde Material während der 20 wellenenergie kann etwas in Abhängigkeit von dem Behandlung in einem abgeschlossenen Behälter ge- jweiligen zu behandelnden Enzym, dem Volumen des halten wird. Die Wände des Behälters können aus den Enzymmaterials, der Konzentration des Enzyms in herkömmlichen, im wesentlichen gasundurchlässigen dem Material und der Energie des Mikrowellensenders Packmaterialien gefertigt sein und z. B. aus Glas, variieren. Im allgemeinen ist die erforderliche Zeit-Polymethylacrylat, Polystyrol und Polyäthylen be- 25 spanne direkt dem Volumen des Enzym enthaltenden stehen. Die Behälter können die Form beispielsweise Materials und der Konzentration des Enzyms darin von Flaschen, Kolben und Beuteln besitzen. Sie sind proportional und der Energie des Mikrowellensenders im wesentlichen gasdicht. umgekehrt proportional. Es wurde gefunden, daß die

Der das Enzymmaterial enthaltende Behälter wird Aussetzungszeit in jedem Fall mindestens etwa 1 Sein einer größeren Behandlungskammer oder -zone 30 künde betragen soll. Es ist gleichfalls festgestellt gehalten, in welchem die Mikrowellenenergie so ge- worden, daß ein übermäßiges Aussetzen zu einer vollrichtet ist, daß sie die für Mikrowellen durchlässigen ständigen Inaktivierung des Enzyms führt. Da dies Wände des Behälters durchdringen und in das Enzym nicht bezweckt werden soll, wird die Gesamtauseintreten. setzungszeit so kurz bemessen, daß keine derartige

Ein weiteres Merkmal des Verfahrens der Erfindung 35 vollständige Inaktivierung erfolgt. Da diese Zeitist die Zirkulation des Kühlgases durch die Behänd- spanne aus den oben angegebenen Granden differiert, lungskammer oder -zone und um die Wände des kann es erforderlich sein, Vorversuche durchzuführen, Behälters herum, der das Enzymmaterial enthält. um das Ausmaß zu bestimmen, zu welchem das je-Das verwendete Kühlgas kann jedes im wesntlichen weilige Enzym der Mikrowellenenergie ausgesetzt inerte Gas (das mit der Umgebung in Anwesenheit von 40 werden kann, ohne daß es vollständig inaktiviert wird. Mikrowellenenergie nicht reagiert) sein, welches bei Jedej Enzym besitzt seine eigene Analyse, so daß ohne den Arbeitstemperaturen gasförmig ist. Insbesondere weiteres festgestellt werden kann, ob eine behandelte werden Luft, Stickstoff und Kohlendioxid in Betracht Probe davon vollständig inaktiviert worden ist oder gezogen. Obgleich weitere Gase, wie Argon, Helium, nicht. In jedem Fall ist die Zeitspanne kurzer als die-Neon, Krypton, Xenon und Äthylenoxid bzw. deren 45 jenige, die in dem Enzymmaterial einen Temperatur-Gemische u. dgl. gleichwertig sind, sind sie doch auf anstieg auf die Temperatur der permanenten Inakti-Grund ihrer Kosten weniger erwünscht. vierung des Enzyms bewirkt. Im allgemeinen ist die

Die Temperatur des Kühlgases, das in die Behänd- Zeitspanne nicht größer als diejenige, die in dem lungszone eintritt, sollte unterhalb etwa 15,6³C liegen Enzymmaterial einen Temperaturanstieg von etwa und beträgt vorzugsweise etwa 1^,8°C. Obgleich 50 70,4 bis 72,2°C (125 bis 130"F) bewirkt. In den meisten Temperaturen bis—17,8° C verwendet weiden können, Fällen beträgt der Temperaturanstieg etwa 55,5 bis liegt doch kein Vorteil darin, mit der Temperatur 66,6⁰C (etwa 100 bis etwa P.0°F). Das Enzym kann unter etwa —6,67 C herunterzugehen. Bei derart bei dem Verfahren der Erfindung der Mikrowellenniedrigen Temperaturen können nämlich Probleme energie auf einmal oder in mehreren Stufen ausdurch ein Einfrieren auftreten, wenn ein Enzym- 55 gesetzt werden.

material in der Behandlungszone zurückgelassen wird, Ein Merkmal des bevorzugten Verfahrens der Er-

die das kalte Gas längere Zeiten nach dem Abstellen findung liegt darin, daß sämtliche Hauptwände des der Quelle für die Mikrowellenenergie enthält. Behälters, der das Enzymmaterial enthält, direkt dei Temperaturen des eintretenden Gases zwischen etwa Mil, !(wellenenergie dargeboten werden. Dies ge- -1,11° C und etwa 10,0° C haben sich als besonders 60 schieht am besten dadurch, daß bei Verwendung geeignet erwiesen. Das Kühlgas wird während seiner einer aufrechten Flasche als Behälter die Flasche uir Wanderung durch die Behandlungszone erwärmt, ihre Längs(vertikal)achse mindestens einmal (360^G und zwar insbesondere durch den Kontakt mit den und vorzugsweise mehrmals gedreht wird, währenc Wänden des Behälters, der das Enzymmaterial enthält. die Flasche der Mikrowellencnergie ausgesetzt wird Das erwärmte Gas wird aus der Behandlungszone 65 die in einer im allgemeinen horizontalen Richtung entfernt und macht dem eintretenden Kühlgas Platz. d. h. in einer im allgmeinen zu den Hauptwänden de: Wenn das Gas für den Wiedergebrauch rezirkuliert Behälters senkrechten Richtung, gerichtet ist. Dadurcl wird, dann muß seine Temperatur auf die gewünschte wird erreicht, daß alle Hauptseitenwände des Behälter

sr

direkt der Mikrowellenstrahlung dargeboten werden, ob diese nun einen kreisförmigen, quadratischen, rechteckigen oder polygonalen Querschnitt aufweisen.

Nach dem Aussetzen gegenüber der Mikrowellenenergie über die gewünschte Zeitspanne wird die Mikrowellenenergie abgestellt, und das Enzymmaterial wird rasch abgekühlt. In dieser Hinsicht wird es bevorzugt, die Kühlung mit dem Kühlgas auch nach dem Abstellen der Mikrowellenenergie fortzuführen, um das behandelte Enzymmaterial abzukühlen oder abzuschrecken, was vorzugsweise bis auf eine Temperatur von mindestens etwa 28,4° C erfolgt. Dies kann dadurch erfolgen, daß der Behälter des Enzymmaterials in der Behandlungszone, durch welche das Kühlgas geleitet wird, belassen wird, auch nachdem der Mikrowellensender abgestellt worden ist. Im Falle einer kontinuierlich sich bewegenden Reihe von Behältern des Enzymmaterials kann dies dadurch geschehen, daß die Bewegung über das Feld des direkten Aussetzens den Mikrowellen gegenüber ausgedehnt wird, während der Fluß des Kühlgases in Kontakt mit den Behältern fortgeführt wird. Das Enzymmaterial kann auch au» andere Art und Weise abgekühlt werden, und zwar in Ergänzung oder an Stelle des vorstehend beschriebenen Vorgehens, beispielsweise dadurch, daß man die Wände des Behälters mit einer kalten Flüssigkeit, z. B. kaltem Wasser, in Berührung bringt, oder indem man den Behälter in einen Kühlschrank überführt. In jedem Fall ist es vorzuziehen, das behandelte Enzymmaterial auf eine Temperatur unterhalb 10,0⁰C abzukühlen.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

betrug etwa 48,9° C. Nach dem Abschalten des Magnetrons (nach einem Betrieb von 62 Sekunden) wurde die Zirkulierung des kalten Stickstoffgases eine kurze Zeitspanne lang weitergeführt, bis die Lösung sich auf etwa 26,7° C abgekühlt hatte. Die Rotation der Zusammenstellung wurde abgebrochen, die Kammer geöffnet und die Flaschen aus der Kammer entfernt und unmittelbar darauf in einem Eis-Wasserbad auf 4,44°C abgekühlt. Die behandelten ίο Proben wurden zusammen mit unbehandelten Kontrollproben bei verschiedenen Temperaturen gelagert und von Zeit zu Zeit untersucht, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

Behandeltes Material

4_T44°C — nach 13 Tagen: 583 Einheiten/ml, nach 20 Tagen: 375 Einheiten/ml;

21,1°C — nach 13 Tagen: 497 Einheiten/ml, nach 20 Tagen: 375 Einheiten/ml;

37,8⁰C — nach 13 Tagen: 520 Einheiten/ml, nach 20 Tagen: 400 Einheiten/ml.

Kontrollversuch

Beispiel 1

Milchsäuredehydrogenase (»LDH«) wurde in einer phosphatgepufferten wäßrigen Nicht-Serum-Grundlage (pH etwa 7,2) aufgelöst, wodurch 627 Einheiten/ml erhalten wurden. Die Lösung wurde durch ein Bakterienfilter filtriert. Kleine sterilisierte Glasnaschen (7 ml Nenninhalt) wurden mit der Lösung gefüllt, zugestöpselt und auf 4,44⁰C abgekühlt. Von diesen Flaschen wurden 48 sodann in eine Druckkammer überführt, die mit einem 2-kW-Magnetron ausgerüstet war. Dieses war an eine 220-V-Wechselstromquelle angeschlossen und sendete in die Kammer eine Mikrowellenenergie mit etwa 2450 MHz. Die Flaschen wurden in Gruppen zu dritt aufgeteilt und jede Gruppe auf einem kleinen einzelnen Drehteller gehalten. Alle kleinen einzelnen Drehteller wurden auf einem größeren Drehteller gehalten, so daß beim Umdrehen des größeren Drehtellers mit 24 UpM die kleineren, einzelnen Drehteller mit 60 UpM sich drehten; d. h., die kleinen, einzelnen Drehteller rotierten für jeden Umlauf des großen Drehtellers 2,5mal. Diese Zusammenstellung der Drehteller war aus Polymethylmethacrylat gefertigt. In die Kammer und durch diese hindurch und wieder heraus wurde kaltes Stickstoffgas mit einem Druck von 0,18 kg/cm² strömen gelassen. Die Eintrittstemperatur betrug etwa 1,67 ⁰C. Das Magnetron wurde sodann 62 Sekunden in Betrieb genommen. Das Magnetron und die damit verbundenen Wellenführungen waren so angeordnet, daß die Mikrowellenenergie in horizontaler Richtung gegen die Seitenwände der Flaschen gerichtet wurde. Die von der Lösung erreichte Maximaltemperatur 4,44"C — nach 1 Woche: 315 Einheiten/ml,

nach 13 Tagen: 0; 21,1°C —nach 1 Woche: 0; 37,8°C — nach 48 Stunden: 0.

Beispiel 2

Serum-Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase (»SGOT«) wurde in einer phosphatgepufferten, wäßrigen Nicht-Serum-Grundlage (pH etwa 7,2) aufgelöst, wodurch 37 Einheiten/ml erhalten wurden. Sodann wurde ein Bakterienfilter filtriert. Die Lösung wurde wie im Beispiel 1 in Flaschen abgefüllt, behandelt, gelagert und untersucht. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse erhallen:

Behandeltes Material

4,44'

2i,r

37,8'

C — nach 13 Tagen
nach 20 Tagen

26,7 Einheiten/ml. 20 Einheiien/inl, 13 Einheken/ml, 10 Einheiten/ml; 16 Einheiten/ml, 3 Einheiten/ml.

Kontrollversuch

4,44⁰C — nach 1 Woche: 0, 21,1°C — nach 4 Tagen: 0,
37,8⁰C — nach 48 Stunden: 0.

Beispiel 3

5 mg Desoxyribonuclease aus Ochsen-Pankreas wurden mit 1 ml destilliertem Wasser rekonstituiert und hierauf mit destilliertem Wasser auf 800 ml verdünnt. Die Lösung wurde durch ein Bakterienfilter filtriert. Die Anfangsaktivität nach der Filtration betruf 786 Einheiten/mg. Kleine sterilisierte Glasflascher (7 ml Nenninhalt) wurden mit der Lösung gefüllt zugestöpselt und auf 4,44° C abgekühlt. Verschieden! Proben (24 Flaschen pro Partie) wurden sodann wie in Beispiel 1, jedoch verschiedene Zeitspannen lang be

10

handelt. Dabei
erhalten:

wurden die folgenden Ergebnisse

Probe	Aussetzungszeit (Sekunden)	Spitzentemperatur der Probe
A B C	60 68 74	etwa 44,4⁰C etwa 46,1⁰C etwa 50.0°C

während das behandelte Material nach 3wöchigem Stehenlassen so aktiv wie das ursprüngliche Material war. Am Ende dieser 3 Monate betrug der Aktivitätsverlust der behandelten Proben weniger als 1O°/o-

Beispiel 6

Eine wäßrige Amylase-Lösung (1000 Einheiten/ml) ίο wurde hergestellt und durch ein Bakterienfilter filtriert. 10-ml-Portionen davon wurden in 6 kleine, sterilisierte

Nach Herausnahme aus der Kammer bei etwa Glasflaschen (10 ml Nenninhalt) abgefüllt, die sodann 26,7⁰C und Abkühlung auf 4,44° C in einem Eis- zugestöpselt wurden. Die 6 Flaschen wurden hierauf Wasserbad wurden die behandelten Proben zusammen auf 4,44°C abgekühlt, und 3 davon wurden in eine mit den unbehandelten Kontrollversuchen 21 Tage 15 Druckkammer überführt, die mit einem 2-kW-bei 25,0°C gelagert. Bei sämtlichen Proben wurde Magnetron eingerichtet war. Letzteres war an eine sodann die optische Dichte nach dem Analysen- 200-V-Wechselstromquelle angeschlossen und sendete Verfahren von Kunitz, M., J. Gen. Physiol., 33, in die Kammer Mikrowellenenergie mit etwa 2450 MHz 349 (1950), unter Verwendung eines Beckman-DU- aus. Jede Flasche wurde auf einem kleinen, einzelnen Spektrophotometers mit Wellenlängen im ultravioletten 20 Drehteller gehalten, von denen jeder auf einem Bereich untersucht. Dabei wurden folgende Ergebnisse größeren Drehteller gehalten wurde, so daß beim

Ri d

erhalten:

Probe	A	Analyse* (Einheiten/mg)
B	475
C	520
Kontrollversuch	450
200

* Durchschnittswerte von 2 Flaschen von jeder Behandlung, drei separate Proben aus jeder Flasche.

Beispiel 4

Rotieren des großen Drehtellers auch die kleinen, einzelnen Drehteller und die darauf befindlichen Flaschen rotierten. Die Zusammenstellung war aus

S5 Polymethylmethacrylat gefertigt. Der große Drehteller und die kleinen, einzelnen Drehteller wurden mit 30 UpM drehen gelassen. Sodann wurde kaltes Stickstoffgas mit einem Druck von 0,18 kg Vm² in die Kammer hinein und durch diese hindurch- und hinausgeleitet. Die Eintrittstemperatur betrug etwa 1,67°C. Sodann wurde das Magnetron 7 Sekunden angeschaltet. Das Magnetron und die da:nit verbundenen Wellenführungen wurden so angeordnet, daß die Mikrowellenenergie in horizontaler Pachtung

gegen die Seitenwände der Flaschen gericlii-l wurde. Nach dem Abschalten des Magnetrons tir.-h 7 Sekd) d Zil

kunden) wurde das kalte Stickstoffgas k
Milchsäuredehydrogenase-Isoenzym der Leberfrak- weiter zirkulieren gelassen, bis die Amyl;i-e
tion, das aus Ochsenherz extrahiert worden war, wurde in den Flaschen sich auf etwa 26,7 C abgekiiii
in sterilem, destilliertem Wasser zu 1 Einheit/ml auf- 40 Sodann wurde die Zusammenstellung abu^
gelöst, und die Lösung wurde durch einen Bakterien- und die Flaschen aus der Kammer herausgen
filter filtriert. Mit dieser Lösung wurden kleine sterilisierte Glasflaschen (7 ml Nenninhalt) gefüllt, zugestöpselt und auf 4,44°C abgekühlt. Von diesen

e Zeil ösung hatte.

und unmittelbar darauf in einem Eis-Wasser 4,44⁰C abgekühlt. Das gleiche wurde mit 3 ^ delten Kontrollflaschen durchgeführt, die 4s f 444°C hl

mmer ad aul

gp aschen durchgeführt, die

Flaschen wurden 48 sodann in einem kalten Stickstoff- 45 auf 4,44°C gehalten worden waren. Sämtücl
ill Nh H

strom der Mikrowellenenergie ausgesetzt. Nach Herausnahme aus der Kammer bei einer Temperatur von etwa 26,7 ⁰C und nach Abkühlung auf 4,44 ⁰C wurden die behandelten Proben, zusammen mit den unbehandelten Kontrollproben, bei Raumtemperatur gelagert. Die Kontrollproben wurden nach dem Stehenlassen über Nacht vollständig inaktiv, während das behandelte Material nach 3wöchigem Stehenlassen so aktiv wie das ursprüngliche Material war. Am Ende dieser 3 Monate war in dem behandelten Material nur

Hinder !'reiber

wurden sodann auf ihre Amylase-Aktivität υ η i ersucht Dabei wurden die folgenden Ergebnisse erhaltet (Durchschnittswerte):

Behandeltes Material 800 Einheilen HiI

Kontrollmaterial 200 Einheiten/ml

Beispiel 7 Beispiel 5

ein Aktivitätsverlust von weniger als 10% festzustellen.

Frisches menschliches Blutserum wurde durch eine Bakterienfilter filtriert und in sterile Glasflaschen at gefüllt. In die einzelnen Flaschen wurden 30 ml ge So geben. Die Flaschen wurden zugestöpselt und ai 4,44° C abgekühlt. Von diesen Flaschen wurden 3 se dann in strömendem Stickstoffgas unter dem Druc des Beispiels 6, jedoch 15 Sekunden lang, der Mikrc wellenenergie ausgesetzt. Nach dem Herausnehme

Milchsäuredehydrogenase-Isoenzym der Herzfraktion, das aus dem Kaninchenmuskel extrahiert worden war, wurde in sterilem, destilliertem Wasser zu

1 Einheit/ml aufgelöst, und die Lösung wurde durch ein _

Bakterienfilter filtriert. Nach dem Abfüllen und Zu- 65 aus der Kammer bei "etwa ΊΣ2 bis 23 9° C wurden di stöpseln wurde das Material wie im Beispiel 4 be- Flaschen sofort in einem Eis-Wasserbad auf 4,44°' handelt und gelagert. Die Kontrollproben wurden abgekühlt. Die Flaschen wurden sodann mit unb( nach den. Stehenlassen über Nacht vollständig inaktiv, handelten Kontrollproben bei 4 44° C gelagert un

11

von Zeit zu Zeit untersucht. Am Ende ditser beiden Wochen hatten die biochemischen Analyseuwerte der Kontrollproben sich so verändert, daß sie nicht mehr länger innerhalb der normalen Bereiche für die Enzyme 12

lagen. Das behandelte Material wurde nach di kontinuierlichen Lagerung bei 4,44°C von Zeit Zeit über einen Zeitraum von 9 Monaten untersuch Dabei wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Tabelle

Bestandteil

30 Werte nach den angegebenen Tagen 90 I 150 I

270

Natrium

Kalium

Glukose

Alkalische Phosphatase .

SGOT*

SGPT*

LDH* (Gesamt)

LDH-Fraktionierung ...
Isoenzyme Leberfraktion
(LDH₁)

Herzfraktion (LDH₆) ...

Zurückbleibende Fraktion
(LDH..S.4)

Amylase

Kreatinphosphokinase ...
(K. P. K.)

Gesamtprotein

Albumin

Globulin

obere Grenze Durchschnitt untere Grenze

145

141,8

140

4,3 4,0 3,9

101 98,8 90,5

34,1 32,9 30,0

27,0 25,1 22,5

21,0 20,2 19,5

210 200 190

23,4 22.5 21,2

46,5 44,6 40,8

134

132,5

130,6

68 65 62,5

6,1 5,3 4,8

7,5 7,2 6,9

4,00 3,82 3,42

3,00 2,80 2,55 143 140,8 139

4,4 4,0 3,8

100,4 99,0 93,6

34,5 33,2 30,2

25,7 24,5 21,8

20,7 19,0 18,4

204 196 192,2

22.6 21,5 20,4

45,8 44,0 41,8

134 132,4 130,2

67 64 61,8

5,8 5,4 4,5

7,5 7,4 7,0

4,25 3,87 3,44

3,02 2,90 2,66

142

140,9

139,5

4,3 4,0 3,92

102 98,8 93,5

35,0 33,4 31,0

25,0 24,0 21,0

20,0 19,2 18,3

204 196 192

22,8 21,3 20,0

44,0 43,2 41,0

13« 132 129,5

65

63,6

61,3

5,7 5,0 4,2

7,5 7,3 7,1

4,12 3,90 3,56

3,00 2,88 2,61

142,5

141

139,7

4,4 4,3 3,94

100 97,5 93,2

34,0 33,0 30,9

24,0 23,8 20,0

20,0 19,0 18,0

201 196 190

22,1 21,4 19,4

43,6 42,9 40,2

132

131,4

129,2

66,5 63,7 61,6

7,5 7,3 7,0

4,19 3,87 3,51

2,94 2,91 2,60

142

141,5

139

100 97,5 91,4

34,1 33,0 30,5

23,5 22,8 20,0

19.0 18,7 17,8

198 190 188

22,5 21,2 19,0

43,1 42,6 40,3

132

130.2

128

65

62,6

61,4

* SGOT bedeutet Serum-Glutaniinsäure-Oxalessigsäure-Transaminase, SGPT bedeutet Serum-Glutaininsäure-Brenztraubensäure-Transaminase, LDH bedeutet Milchsäure-dehydrogenase.

** Es wurden keine weiteren Versuche durchgeführt.

13

14

Das behandelte Material zeigte während des Untersuchungszeitraumes ein normales elektrophoretisches Verhalten. Die Normalwerte für diese Bestandteile sind wie folgt:

Tabelle 2

Bestandteile Normalwerte

Natrium

Kalium

Glukose

Alkalische Phosphatase ...

SGOT

SGPT

LDH (Gesamt)

LDH-Leberfraktion

LDH-Herzfraktion

LDH Restliche Fraktionen

Amylase

Kreatin-phosphokinase ...

Gesamt-Protein

Albumin

Globulin

135 bis 145 mÄq./l 3,5 bis 5,0 mÄq./l
65 bis 110 mg^o/_o

5 bis 35 Einheiten (International) 5 bis 40 Einheiten (International) 5 bis 35 Einheiten (International) 150 bis 500 Einheiten (International) 10 bis 20% der Gesamtmenge 20 bis 40 ^tt/₀ der Gesamtmenge 35 bis 55°/„ der Gesamtmenge 50 bis 160 Einheiten (Diatase) bis zu 35 Einheiten (International) 6,8 bis 8,0 mg°/₀
3,25 bis 5,70 gm°/₀ 1,5 bis 3,0 gm°/₀

Claims

2 017 751 ι Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Patentansprüche: Verbessern der Stabilität von Enzymen. Enzyme sind im allgemeinen in einem flüssigen,

1. Verfahren zum Verbessern der Stabilität von wäßrigen Medium instabil, und zwar ungeachtet, ob Enzymen, dadurch gekennzeichnet, 5 sie in ihrem natürlichen Lösungsmittel (nach Entdaß man das Enzym im wäßrigen Medium auf fernung von der lebenden Zelle, die die Quelle hierfür unterhalb 10,0⁰C abkühlt und hierauf in rascher bildet) oder nach der Isolierung aus ihrem natürlichen Aufeinanderfolge Lösungsmittel und nach Wiedersuspendierung oder

a) das Enzym in einem geschlossenen, für Mikro- Wiederauflösung (Rekonstitution) in einem,vorher wellen durchlässigen Behälter in einer Be- ¹⁰ hergestellten wäßrigen Medium vorhegen. Hände handlungszone durch eine sich bewegende ^ubu(*^e Enzyme d h Enzyme, die fur industrielle Atmosphäre eines Kühlgases einen für eine ^Zwe<*^e' einschließlich medizinische Z^wecke her-Inaktivierung zu kurzen Zeitraum einer Mikro- g^estellt, ^{und in den} ^"del gebracht werden werden wellenenergie aussetzt, wobei die sich bewe- normalerweise getrocknet, obgleich es auch FaUe gibt, gende Atmosphäre in direktem Kontakt mit ¹S bei denen bestimmte Enzympräparat« als konzentrierter den für Mikrowellen durchlässigen Wänden ^S'™P ^{)n den H}*^ndel ^bracht werden können Wahdes Behälters steht, jedoch keinen direkten ^{rend der Zeit}'.^{die zu} f^ vollständigen Trocknung Kontakt mit dem Enzym hat und nach ihrem ^oder Konzentrierung erforderlich ist, kann e.ne gewisse h.ntnti in die Behandlungszone eine Tempe- Zerstörung der Enzyme erfolgen. Fur den Endratur unterhalb von etwa 15,6* C aufweist, ²° gebrauch werden die entwasserten oder die konzen-

b) am Ende dieses Zeitraumes das Aussetzen des ^{tnerten Enz}y^{me oftmal} _o ^s .^durc^ Suspendierung oder Enzyms der Mikrowellenenergie abbricht und Auflösung in e.nem wäßrigen Medium rekonst.tu.ert. daß man ^Diese Rekonstitution bringt die Möglichkeit von Irr-

c) das Enzym abkühlt ^{tümern mit sich}' ^{und zwar} insbesondere dann, wenn

»5 das rekonstituierte Material pro Gewichts- oder

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Volumeinheit einen bestimmten Aktivitätswert haben zeichnet, daß die Mikrowellenenergie eine Frequenz muß. Darüber hinaus ist das rekonstituierte Enzym von etwa 1000 bis etwa 5000 MHz besitzt. einer Zerstörung unterworfen, deren Geschwindigkeit

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- und Ausmaß von verschiedenen Faktoren, wie der zeichnet, daß die Mikrowellenenergie eine Fre- 30 Temperatur, der Konzentration, der Zeit und der quenz von etwa 2000 bis etwa 3000 MHz besitzt. Natur des rekonstituierenden Mediums, z. B. des