DE2103137B2

DE2103137B2 - Verfahren und Reaktionsmittel zum Klären von Milch zwecks Zählung der darin enthaltenen Somazellen

Info

Publication number: DE2103137B2
Application number: DE2103137A
Authority: DE
Inventors: Karl B. New City Wrightman; Hans Pound Ridge Zehnder
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1970-01-29
Filing date: 1971-01-23
Publication date: 1974-02-21
Also published as: CA928197A; GB1295219A; DE2103137C3; BE761482A; NL7100738A; CH571223A5; JPS4929507B1; US3679365A; DE2103137A1; FR2077074A5; SE378142B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Klären von Milch zwecks Zählung der darin enthaltenen Sumazellen, bei dem die Milch zur Klärung behandelt und in der geklärten Milch die Somazellen gezählt werden. Ferner befaßt sich die Erfindung mit einem zur Klärung von Milch dienenden Reaktionsmittel.

Es besteht ein immer größer werdendes Bedürfnis, Milch vor dem Verbrauch durch den Menschen zu prüfen und zu bestimmen, ob die Milchkuh, von der die Milch stammt, mit Mastitis infiziert ist, bei der es sich um eine Infektionskrankheit der Milchkuhherden handelt. Milch, die von einer mit Mastitis infizierten Milchkuh stammt, ist für den Verbrauch durch den Menschen nicht geeignet. Die Gesundheitsbehorde der Regierung der V. St. A. hat im Juli 1970 in öffentlichen Gesundheitsnormen vorgeschlagen, daß bei jedem Melkvorgang eine Milchprobe von jeder Milchkuh zur Mastitisbestimmung überprüft werden soll, bevor die Milch dem Verbrauch durch den Menschen zugänglich gemacht wird, und daß, falls die Mastitisbestimmung positiv ausfällt, die betreffende Milch als ungeeignet für den Verbrauch durch den Menschen erklärt.

Die Maslitisbestimmung wird im allgemeinen dadurch vorgenommen, daß die Anzahl der Somazellen, die in der Milch in der Hauptsache aus weißen Blutzellen und Epithclzellen bestehen, bezogen auf ein vorgegebenes Milchvolumen, gezählt werden. Dieser Zählwert wird mit einem Normwert verglichen. So spricht beispielsweise ein Zählwcrt von O bis 500000, bezogen auf 1 cm³ Milch, dafür, daß die betreffende Milchkuh mit Mastitis nicht infiziert ist. Ein Somazellenzählwert von mehr als 1 000 000, bezogen auf 1 cm'¹ Milch, spricht hingegen dafür, daß die betreffende Milchkuh Mastitis hat.

Das herkömmliche Ziihlverfahren zum Bestimmen der Anzahl der in Milch enthaltenen Somazellen ist äußerst mühsam und wird im wesentlichen manuell

f>5 ausgeführt. Dabei müssen zahlreiche zeitraubende und die Aufmerksamkeit des Prüfers in Anspruch nehmende Milchbehandlungssehrittc vorgenommen werden. Nach diesen vorbereitenden Behandlung-

3 4

schritten werden die in der Milch vorhandenen Nach der Erfindung ist es somit möglich, an

Somazellen direkt optisch mit Hilfe eines Mikro- zahlreichen verschiedenen Milchproben eine sehr

skops gezählt. Diese Zählvorgänge sind langwierig schnelle Mastiüsbestimmimg durchzuführen. Dazu

und stellen an die Aufmerksamkeit und Geduld des wird vorzugsweise ein Strom aus aufeinanderfclgen-

Prüfers hohe Anforderungen. Da der Mensch auf 5 den Milchproben einer Behandlungs- und Analysier-

die Zählung direkt Einfluß nimmt, kann es bei man- vorrichtung zugeführt. Die Mischung des Milch-

gelnder Sorgfalt sehr leicht zu ungenauen oder voll- probenstroms mit dem Reaktionsmittel und dem

kommen falschen Ergebnissen kommen. Fixiermittel erfolgt ebenfalls automatisch. Nach ent-

Um beim Zählen größere Fehler durch mensch- sprechender Behandlung des Reaktionsmittel-Milchliches Versagen auszuschalten, ist es bekannt, das io proben-Fixiermittel-Gemisches ist es dann möglich, Mikroskop durch einen elektronischen Zellenzähler die in den geklärten Milchproben vorhandenen zu ersetzen. Eine solche Anordnung ist beispiels- Somazellen selbsttätig äußerst genau zu zählen. Das weise in dem Aufsatz »Electronic Counting of So- Zählergebnis wird vorzugsweise leicht lesbar und matic Cells in Milk« von R. B. Read in der Fach- reproduzierbar von einem Schreiber festgehalten,
zeitschrift »Journal of Dairy Science«, Mai 1967, 15 Bevorzugte Weiterbildungen der Erfindung sind Band 50, S. 669 bis 674, beschrieben. durch die Unteransprüche gekennzeichnet.

Ferner ist aus der USA.-Patentschrift 3 412 037 Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung

eine Zellenzählvorrichtung bekannt, mit der man werden an Hand von Zeichnungen beschrieben. Es

automatisch die Somazellen in mehreren aufeinander- zeigt

folgenden geklärten Milchproben zählen könnte. 20 Fig. 1 eine nach dem erfindungsgemäßen VerTrotz der bekannten Vorrichtungen mit elektro- fahren betriebene Vorrichtung,

nischen Zellenzählern ist es immer noch äußerst F i g. 2 einen Querschnitt durch einen Leitungszeitraubend und mühsam, die Milch derart vorzu- abschnitt der in der F i g. 1 dargestellten Vorrichtung bereiten, daß man in ihr die Somazellen mit Hilfe und

von elektronischen Zellenzählern zählen kann. So 25 Fig. 3 einen Querschnitt durch einen anderen

muß man nämlich nach wie vor zur Klärung der Leitungsabschnitt der in der Fig. 1 dargestellten

Milch verschiedenartige Arbeitsgänge, beispielsweise Vorrichtung.

Zentrifugieren, Verdünnen, Trennen von Hand, In der F i g. 1 ist eine Vorrichtung 10 gezeigt, die Waschen, Wiedersuspendieren usw., sorgfältig aus- zum Klären von Milch und Zählen der darin entführen. Diese mühsamen und zeitraubenden Arbeits- 3c haltenen Somazellen dient. Diese Vorrichtung entgänge führen zu einer vollkommenen Überlastung hält eine Probenzufuhrvorrichtung 12, eine Probenherkömmlicher Anlagen, wenn die gesamte, dem pumpe 14, eine Probenbehandlungsvorrichtung 16, menschlichen Verbrauch zugedachte Milch vorher eine Probenanalysiervorrichtung und eine das Proüberprüft werden soll. benanalysierergcbnis festhaltende Aufzeichnungsvor-

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Milch 35 richtung 20.

zur nachfolgenden automatischen Zählung der darin Die Probenzufuhrvorrichtung 12 kann beispiels-

enthalter.en Somazellen ohne Anwendung physika- weise einen Drehtisch 22 enthalten, auf dem in der

lischer Trennungsmittel zu klären. gezeigten Weise Probenbehälter 24 angeordnet sind.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist das eingangs be- Ein Waschflüssigkeitsbehälter 26, der eine geeignete

schriebene Verfahren nach der Erfindung dadurch 40 Waschflüssigkeit, beispielsweise klinisch reines Was-

geeignet, daß die Milch mit einem die Solubilisierung scr, enthält, ist neben dem Drehtisch 22 angeordnet,

der Somazellen hemmenden Fixiermittel versetzt wie es gezeigt ist.

wird und danach mit einem die fettigen und anderen Eine Probenentnahmevorrichtung 28 enthält ein organischen Matrizen, mit Ausnahme der Soma- Probenentnahmerohr 30, das von einer Antriebsvorzellen, solubilisierenden Reaktionsmittel durchmischt 45 richtung 32 von der eingezeichneten Stellung, in der wird, so daß praktisch nur noch die Somazellen als das Einlaßende des Entnahmerohrs 30 in einen einziger ungelöster Bestandteil in der geklärten Probenbehälter 24 eingetaucht ist, in eine andere Milch vorhanden sind. Stellung, in der das Einlaßende des Entnahmerohrs

Ein zur Klärung der Milch geeignetes Rcaktions- 30 in den Waschflüssigkeitsbehälter 26 eingetaucht

mittel zeichnet sich nach der Erfindung dadurch aus. 50 ist, bewegt werden kann, und umgekehrt,

daß es in einem wäßrigen alkoholischen Mittet ein Während des Betriebs wird der Drehtisch 22

Verscifungsmittel, ein Chelationsmittel, das in der schrittweise weitergedreht oder weitergeschaltet, so

Lage ist, die Calcium- und anderen Schwermetall- daß die Probenbehälter 24 der Reihe nach dei

salze der Fettsäuren und die in der Milch vorhandc- Probcnentnahmevorrichtung 28 angeboten werden

nen Proteine zu komplexicrcn und zu soliibilisieren, 55 Dabei wird die Vorrichtung 28 derart betrieben, daß

und ein Dispersionsmittel enthält. das Einlaßende des Entnahmerohrs 30 für eine vor-

Mit den crfindungsgcinäßcn Mitteln ist es mög- gegebene Zeitperiode in den gerade dargebotener

lieh, zahlreiche aufeinanderfolgende Milchprobcn in Probenbehälter eingetaucht wird, um ein vorgege·

einer selbsttätig arbeitenden Vorrichtung zu klären benes Probenvolumen anzusaugen, daß danach da; und im Anschluß daran die in den geklärten Milch- 6° Einlaßende des Emnahmcrohrs durch die Um·

proben enthaltenen Somazellen zu zählen. Neben gcbungsluft zu dem Waschflüssigkeitsbehällcr ge·

einer sehr hohen Milehprobenverarbeitungsgeschwin- schwenkt wird, in den das Einlaßende für eine vor·

digkeit werden dabei sehr genaue Zählergebnissc gegebene Zeitperiode eingetaucht bleibt, um zunächs

erzielt, da die in der nach dem errmdungsgemäßen ein vorgegebenes Volumen der Umgcbungslul't iiir/u·

Verfahren geklärten Milch enthaltenen Somazellen R5 saugen, der ein vorgegebenes Waschflüssigkeitssehr leicht erkannt werden können und während des volumen folgt, und daß anschließend das Einlaßcndi Klärcns die interessierenden Somazellen nicht /er- des Enlnahmcrolirs wiederum durch die Umgcbungs

stört werden. luft zu dem nächsten dargebotenen Piobenbehältc

analysiercrgebnis festhaltende Aufzeichnungsvorrichtung 20 darstellt. Ein solcher Streifenschreiber kann eine anget'iebcnc Streifenkarte 104 enthalten, auf die mit einer Schreibfeder oder einem Schreibstift 106 die Prabcnanalysicrergebnissc aufgetragen werden.

Die FlüssigkeitsauslaßleiUmg 66 des T-Paßslücks 58 ist über eine Leitung 108 an den Einlaß der Durehllußzellc 84 angeschlossen. Der Auslaß der

24 geschwenkt wird, in den das Einlaßende wiederum für eine vorgegebene Zeitperiode eintaucht, um zunächst ein weiteres vorgegebenes Umgebungsluflvolumen und darauf folgend ein vorgegebenes Volumen der nächsten Probe anzusaugen.

Die Pumpe 14 kann beispielsweise nach Art einer Schlauchquctschpumpc aufgebaut sein und eine Reihe von zusammendrückbar! oder zusammenquctschbarcn elastischen Pumpenschläuchen 34, 36,

38, 39, 40, 42, 44 und 46 enthalten, die von etwa io Durchllußzcllc ist über eine Leitung 110 an den gleichmäßig beabstandelen Pumpenrollen (nicht ge- Einlaß des Pumpcnschiauchs 36 angeschlossen. Der zeigt) in einer in der F i g. 1 von rechts nach links Auslaß des Pumpcnschlauchs 36 führt zum Abfluß, fortschreitenden Richtung zusammengcquclschl wer- wie es gezeigt ist. Die Gasauslaßleitung 64 des T-Paßden, um Strömungsmedien durch die Pumpen- Stücks 58 ist in der gezeigten Weise über die Leitung schläuche mit etwa konstanten vorgegebenen Durch- 15 113 an den Einlaß des Pumpcnschlauchs 34 angcflußwerten, die im einzelnen von dem Innendurch- schlossen, dessen Auslaß zur Atmosphäre führt,
messer der Pumpcnschläuchc abhängen, zu pumpen. Das Einlaßende des Pumpcnschlauchs 42 ist an

Der Auslaß des Pumpcnschlauchs 46 ist an den das Auslaßendc des Probenentnahmerohrs 30 ange-Einlaß des WaschHüssigkeitsbehälicrs 26 angeschlos- schlossen. Das Einlaßende des Pumpcnschlauchs 40 sen. Der Auslaß des Waschllüssigkcitsbchältcrs 26 20 ist zur Atmosphäre hin offen.

ist an den Einlaß des Pumpenschlauchs 44 auge- Der Einlaß des Pumpcnschlauchs 46 ist in einen

Hchäller 112 getaucht, in dem sich eine geeignete Waschflüssigkeit befindet. Der Einlaß des Pumpenschlauchs 39 ist in einen Behälter 114 getaucht, in dem sich ein geeignetes Fixiermittel befindet. Der Einlaß des Pumpcnschlauchs 38 ist in einen Behälter 116 getaucht, in dem sich ein geeignetes Reaktionsmittel befindet. Die Funktion des Fixicrmittels besteht darin, die beschleunigung der Lysis oder den

Der Auslaß des Pumpenschlauchs 38 wird, wie ge- 3« Abbau der Somazellen zu verhindern, der sonst aufzeigt, über eine Leitung 53 und ein Verbindungs- treten könnte, wenn man den Milchproben das oder T-Paßstück in die Leitung 52 geführt. Ein Reaktionsmitkl zugibt.

Wärmebad 54 enthält eine Tempcraturrcgcleinrich- Das derzeit bevorzugte Reaktionsmittcl ist eine

tung, um die Temperatur des Wärmebades auf einem Mischung aus einem Vcrseifungsreagenz, das wicderetwa konstanten vorgegebenen Wert zu halten. Der 35 um eine Verbindung aus einem Amin und einer Einlaß des Wärmebades 54 ist über eine Leitung 56 starken Base ist, aus einem Chelationsmiltcl und aus an den Auslaß der Mischschlange 48 angeschlossen.
Ein T-Paßstück 58 dient als Entlüftungs- oder
Entgasungseinrichtung und enthält eine Einganus-IciUing 60, die über eine Leitung 62 an den Auslaß 40
des Wärmebades 54 angeschlossen ist.

Eine Ciasauslaßleitung 64 des T-Paßstüeks 58 ist über eine Leitung 113 an ilen Einlaß des PumpiMisclilauchs 34 angeschlossen, dessen Auslaß zur Atmosphäre führt. Ferner weist das T-Paßstück eine Flüssigkeitsauslaßleitung 66 auf.

Eine Probenanalysiervorrichtung 18 ist vorzugsweise nach Art einer Umkehrdimkclfeld-Zählvorrichiung aufgebaut, die schematisch in der Fig. 1 dargestellt ist. Diese Zählvorrichtung enthält eine Lichtquelle 70 und eine Lichtfokussicrvorrichtung

schlossen, dessen Auslaß zum Abfluß führt.

Die Auslässe der Pumpenscliläuchc 39, 40 und 42 werden mit VcrbindungslciUingen oder T-Paßstücken 43 und 45 zu einer Leitung 50 zusammengeführt.

Die Probenbehandlungsvoi richtung 16 enthält Mischschlangen 47 und 48, die über eine Leitung 52 hintereinandergeschallet an die Auslässe der Pumpenschläuchc 39, 40 und 42 angeschlossen sind.

einem Dispersionsmittel. Die Anteile der Mischung setzen sich vorzugsweise wie folgt zusammen:

Verseif ungsrcagenz

A. Hydroxylaminhydrochlorid (H.,NOH · I ICI), etwa 12" ο in absoluicm Methanol;

72. die eine Kondensorlinse 74, eine Lochblende 76, eine Schirmblendc 78 und ein Mikroskopobjektiv 79 mit Linsen 80 und 82 und einen Verkleinerungsgrad von 5 : 1 aufweist.

Eine Durchllußzelle 84, die zum Zählen der Probenteilchen dient und aus einem geeigneten durchsichtigen Material, beispielsweise Glas, hergestellt ist, weist ein Probenuntersuchungsvolumen 86 von genau vorgegebenen Abmessungen auf.

Zcntrisch zu Sammellinsen 88 und 90 ist eine Dunkelscheibe 92 angeordnet. Hinter den Sammellinsen befindet sich ein Fotoelektronen-Vcrvielfachcr 94 und eine dazwischengeschallete Lochblende 96.

Dem Fotoelektronen-Vervielfacher 94 ist eine Pulsformerschaltung 98, eine Meßschallung 100 und ein gleichspannunasbetriebener Streifenschreiber 102 mil Nullabgleich nachgcschaltet, der die das Proben-

B. Kaliumhydroxid (KOH), etwa 35 'Vo in absolutem Methanol;

C. Η.,ΝΟΗ-KOH-Reagenz,

verbinde etwa 2 Volumenanteile von etwa 35'Voigcm KOH (wie B) mit etwa 5 Vohimcnantcilcn von etwa 12ⁿ/«igem Η,,ΝΟΗ · HCI (wie A). Gib einige Tropfen von 35°/i.igen\ KOH hinzu, um eine vollständige Ausfällung sicherzustellen, und filtriere.

Chclationsmittel

D. (Athylcndinitrolo)-Tetracssigsäure, Tetranatriumsalz (EDTA .j 6bfskp unilhw umlhw uml res Na), etwa 2()^fl/« in Wasser.

Dispersionsmittel

E. Octylphcnoldecaäthylenglycolälher, insbesondere lsooctylphenoxypolyäthoxyäthanol mit 10 Mol Athylenoxid, etwa 50" υ in Methanol.

Abweichend von den obigen Angaben kann das Verseifungsrcagenz auch wie folgt zusammengesetzt und hergestellt werden:

Verseif imgsrcagenz

A. Hydioxylaniinhydroehlorid(Η.,ΝΟΗ-HCl),etwa 12"Ό in absolutem Methanol;

B. Nalriumhvdroxid (NaOH), etwa 50 ".■■« in absolutem Methanol;

C. ILNOH-NaOH-Reagenz,

verbinde 2 Volumcnanteilc von etwa 50"/«igem NaOH (wie B) mil etwa 5 Volumenanteiien etwa 12"/oigcr FLNOH-HCI (wie A). Gib einige Tropfen von 5()%igem NaOH hinzu, um eine vollständige Ausfällung sicherzustellen, und filtriere.
Abweichend von der obigen Angabe kann man

das Chelationsmittel wie folgt zusammensetzen tnid herstellen:

Chelalionsmittel

D. Mercaploessigsäure, etwa 2?*".'« i:i Wasser, oder Ascorbinsäure, etwa 20°,Ό in Wasser.

Hin zufriedenstellendes Reaktionsmittel erhält man, wenn man etwa 3 bis 9 Volumenteile des Vcrseifungsreageiizes. etwa 2 bis 4 Volumenteile des Chelationsmittels und etwa 2 bis 4 Volumenteile des Dispcrsionsmittels zusammengibl. Vorzugsweise wird das Reaktionsmitlei aus clv a 5 bis 7 Volumenteilen des Verseifungsreagcnz.es, e!wa 2.5 His 3.5 Volunienteilen des Chelaiionsniitiels und eiwa 2,5 bis 3.5 Voiumcnteüjn des Dispersionstniltcls hergestellt. Am besten ist eine Mischung aus etwa (> Volunieiileilen des Verscifungsreagenze:.. etwa 3 V'oliiinenleilen des Chelationsmittels und etwa 3 Volumenteilen des Dispersionsmillcls.

Das Fixiermittel wird vorzugsweise- wie lolgi /usammengesel/t und hergesiclli:

Fixicrnüiicl

O,25"i. von liiuiaraiiieind in uesiiilieiiein Wasser.

Die Klärung der Milchprobc!: '^rJi das Reaktionsmittel ist im allgemein, η d.iiii' verbunden, daß sich die Milchprobc von emei l-ir.i,:¹ ion in eine verii.iltnismäßg klare Löm.u.j ander', s,, l;:l'» die in ihr ¹orhandenen somalischen Ai! r >'.i-·: Soiiiazellen "■•on dem Zellenzähler 18 ι·,:/ϋ ι v. :,!,i> können. I'ic Klärimg umfaßt in er·.Ur Ι.'::!·.. >!>.. \Yr-eitung und Kompfexbildiing der Mikhp:-·^. π durch das \ erseil'ungsreageii/. Dadunli w ü,l eirciCh!. dall die V-'llenziihlervorriehiung IS die hr.n oder fetthaiti- ; ii und tlie anderen ori.'.ini-.-lien Ni.απ/en nicht ihrnimmi und nicht n;u h»··. i»-i. -o .ii^;: die..¹ Mib-

•-•.•inzen die Cienauigkeii iie- !-i^ioi-c· l>ei der

' ihlung der Somazellen ilurch eh. /el!: n/.ihlep.'or-

.•Immg nicht nachteilig lu-einiia. huecn I )■< Chlorid-

• .:lze in Methanol unlöslich viini und .lul'erdem die i endenz haben. Prolein aiiv/ü-.il/cn . wild das HC I -is dem Η.,ΝΟΙΙ IK! iall«ci-e d..ieh \ü lallen mit

KOH oder NaOH enlleini H. NOlI-KOlI oder if NOH-NaOH verseifen in eiMci 1 'ine die Vlilchpiobenfette.

Das Dispersionsmittel arbeilel in ersier Linie als "»'erseil'ungsreagenzlräger über den l-ettkügelchenii'iemhianen. um diese wirksam zu diMiereieren und «lic Feitkügelchcn in kleinere Kügelclien aufzubrechen, so daß leichler angreifbare Teilchen cnl-Mehen und dadurch die Reaktion des Verseilungsreagenzes mit diesen Teilchen gefördert wird.

Das Chelationsmittel verhindert vor allem tlk Ausscheidung der unlöslichen Calciumsalze der Fettsäuren, die in den Milchproben vorhanden sind. IZ? bestellt daher keine Gefahr, daB von dem Zellenzähler Salze dieser Art entdeckt und gezählt werden

Betriebsweise

Zur Klärung von Milch, deren Somazellen auto-

ίο mutisch gezählt werden sollen, um festzustellen, öl" eine Milchkuhherde an Mastitis erkrankt ist, wire: jeder Probenbehälter 24 mit einer Milchprobe von einer anderen Milchkuh gefüllt. Vorzugsweise wire jede der Milchprobcn unmittelbar nach dem Melker der Kuh mit einem geeigneten Fixiermittel fixiert um eine sonst bald nach dem Melken auftretende Autolyse oder Selbstauflösung der Somazellen zi verhindern. Auf diese Weise wird die Genauigkeit der nachfolgenden Somazellcnbrviirnmung verbessert

Die Arbeitsweise der Vorrichtung nach der Erfindung beginnt mit der gleichzeitigen Betätigung dei Probenzufuhrvorrichtung 12 und der Schlauchquetschpumpc 14. Sobald sich stationäre Betriebsverhältnisse eingestellt haben, wird ein in der F i g. 2

dargestellter Strom S vom Piimpcnschlauch 42 demjenigen Teil der Leitung 50 zugeführt, der gerade stromabwärts der Verbindungsleitung 43 liegt. Dei StKim .V besieht aus aufeinanderfolgenden Milchproben M. die aus aufeinanderfolgenden Probenbehäl-

tern 24 stammen und jeweils durch einen Waschflüssigkeitsschub W aus dem Waschflüssigkeitsbehälter 26 und jeweils einem zu beiden Seiten de» Waschflüssigkeitsschubs angeordneten Luflschub A gelrennt sind. Der Waschlliissigkeitsschub W um:

die beiden Luftschübe A zwischen zwei Milchproben· Schüben M dienen zum Reinigen der Vorrichtung und verhindern, daß die nachfolgende Milchprobe durch Rückstände der vorangegangenen Milchprobt verunreinigt wird. Dadurch werden gleichbleibcnc

genaue Analysenergebnisse erzielt.

Gleichzeitig trilft in der Leitung 50 ein durch Luflschübe untertcililer Fixiermittelstrom mit dem Strom .V zusammen. Das Fixiermittel wird vom Behälter 114 über den Pumpenschlauch 39 angeliefert.

Die Luftschübe werden über den Pumpenschlauch Ai) zugegeben. Die jetzt vereinigten Milchproben-Fixiermittel-Ströme fließen durch die Mischschkmec

47. um eine vollständige Mischproben-Fixierniittel-Mischung herzustellen.

,50 Der in der Leitung 50 flielAendo Milchprobcn-Fixiermittcl-Strom S wird an der Verbindiingslcitunu 53 mit einem Rcaktionsniittclstrom vereinigt, der über den Pumpenschlauch 38 vom Reaktionsmittelbchälter 116 zugeführt wird. Die auf diese Weise

vereinigten Ströme fließen durch die Mischschlancc

48. so daß eine vollständige Milchproben-Fixiermiltcl-Reaktionsmittel-Mischung entsteht. Von dori Hießt der Probenstrom S, in dem das Reaktionsmittcl und das Fixiermittel in geeigneter Weise mit den

Milchprobcn gemischt sind, durch die Leitung 56 zu dem Wärmchad 54, in dem eine gecitznctc Milchprobenklärung durch Vervollständigung" der Verseifung und damit verwandter Reaktionen, die bereits oben beschrieben sind, vorgenommen wird.

Der jetzt geklärte Milchprobenstrom fließt vom Auslaß des Wärmebades 54 durch die Leitung 62 zu der Fntgasungs- oder Entlüftungsvorrichtung 58. In dieser Vorrichtung vi-erden die Luftschübe A über

9 10

die Gasauslaßleitung 64, die Leitung 113 und den äußerst genau dadurch steuern, daß der Innendurch-

Puinpenschlauch 34 an die Atmosphäre abgegeben. messer der einzelnen Pumpenschläuchc genau vor-

Der jetzt gasfreie und geklärte Milchprobenstrom S, gegeben wird.

der in der F i g. 3 dargestellt ist, enthält noch die Das volumetrische Verhältnis des Fixiermittels

zwischen die Milehprobcn eingeschobenen Wasch- 5 zur Milchprobe beträgt vorzugsweise etwa 0,05 bis

flüssigkcitsschübc W, die die Milehprobcn M gegen- 0,5 ml Fixiermittel auf etwa 7 bis 13 ml Milchprobe,

einander abgrenzen und zwischen den Milchproben Äußerst zweckmäßig ist ein vokimetrischcs Verhält-

den zur Teilchenzählung vorgesehenen Durchfluß- nis von etwa 0,1 ml Fixiermittel auf etwa 10 ml

zellenraum 86 reinigen, um eine Verschmutzung Milchprobe.

oder Verunreinigung der nachfolgenden Probe durch :o Das volumetrische Verhältnis des Reaktionsmittels

die vorangegangene Probe zu vermeiden, und strömt zur Milchprobe beträgt etwa 15 ml bis zu einer nahc-

von der Entgasungsvorrichtung 58 über die Flüssig- zu unendlichen Menge an Rcaktionsmittel auf etwa

keitsauslaßleitung 66 und die Leitung 108 an die 1 ml Milchprobe. Zweckmäßig ist ein volumctrisches

angeschlossene Durchflußzellc 84, die zum Zählen Verhältnis von etwa 20 ml Reaktionsmitlei auf etwa

der Teilchen dient. 15 1 ml Milchprobc.

Der Milchprobenstrom S strömt durch den Meß- Bei der Bestimmung des Milchprobcn-Reaktions-

raum oder das Meßvolumen 86 der Durchflußzelle mittel-Verhältnisses oder des Verdünnungsfaktors

84 und wird von dort über die Leitung HO und den wird versucht, in dem Reaktionssystem ein Gesamt-

Pumpenschlauch 36 zum Abfluß gepumpt. gleichgewicht zu erreichen, und zwar dadurch, daß

Wenn die einzelnen geklärten Milehprobcn M auf- 20 die niedrigste Konzentration des Reaktionsmiltels einandcrfolgcnd durch den Meßraum oder das Meß- verwendet wird, die mit der Genauigkeit, Zuverlässigvolumen 86 der Durchflußzelle 64 strömen, streuen keit und zeitlich abgestimmten Arbeitsweise der Vorin jedem Fall die Somazellen jeder Milchprobe das richtung 10 verträglich ist. Eine zu hohe Konzentra-Licht von der Lichtquelle 70 über den Rand der tion des Reaktionsmittels kann beispielsweise im Dunkelscheibe 92 hinaus, so daß dem Fotoelektro- 25 Hinblick auf die Arbeitsweise der Vorrichtung beim nen-Vervielfacher 94 ein Lichteingangssignal züge- Mischen und Pumpen zu Schwierigkeiten führen und führt wird. Der Vervielfacher 94 gibt einen Impuls- eine zu hohe Korrosion verursachen. Ferner wird im zug ab, der die Anzahl der Somazellen in der inter- Hinblick auf das Reaktionsvermögen die Möglichkeit essierenden Milchprobe anzeigt. Der Impulszug setzt. erhöht, daß durch das Reaktionsmittel Somazellen sich aus Impulsen unterschiedlicher Amplitude, 30 zerstört werden. Andererseits kann eine verhältnis-Dauer und Frequenz zusammen. Dieser Impulszug mäßig niedrige Konzentration des Reaktionsmittels wird zur Impulsformung der Impulsformerschaltung eine langsamere Auflösung der Fettkügelchen zur 98 zugeführt. Dieser Schaltung ist eine Meßschaltung Folge haben, so daß es erforderlich ist, die Aufent- 100, bei der es sich vorzugsweise um eine Impuls- haltszeit der Milchproben-Reaktionsmittel-Mischung folgefrequenz-Meßschaltung handelt, nachgeschaltet, 35 im Wärmebad und bzw. oder die Wärmebadtemperaderen Ausgangssignal dem Streifenschreiber 102 zu- tür zu erhöhen, wodurch wiederum die Möglichkeit geführt wird. Der Schreiber schreibt das Meßergebnis der Somazellenzerstörung erhöht wird und bzw. oder auf dem Schreiberstreifen 104 in einer lesbaren und beim Reinigen mit den zwischengeschalteten Waschreproduzierbaren dauerhaften Aufzeichnung 120 auf. fiüssigkeitsschüben Probleme auftreten können.
Dabei wird die Anzahl der Somazellen in jeder der 40 Die Durchlaufzeit des Milchproben-Reaklioiisaufeinanderfolgenden Milchproben, die beispiels- mittel-Fixiermittel-Stroms durch das Wärmebad 54 weise in der Fig. 3 mit M3, M4, M 5 und M6 be- kann man in Abhängigkeit vom Durchfluß durch die zeichnet sind, klar und genau durch aufeinander- Leitung 56 durch geeignete Wahl der Länge und bzw. folgende Spitzenwerte angezeigt, die in der F i g. 1 oder des Innendurchmessers des Strömungsweges mit m 3, m4, mS und mfi bezeichnet sind. 45 durch das Wärmebad einstellen. Die Temperatur des

Die Vorrichtung nach der Erfindung arbeitet fort- Wärmebades kann man regeln. Im allgemeinen sind laufend und kontinuierlich, bis aus jedem der Pro- die Durchlaufzeit und die Temperatur nicht kritisch, benbchälter 24 eine Milchprobe M mit einem vor- Grundsätzlich kann man sagen, daß bei einem größegegebenen Volumen entnommen, behandelt, analy- ren Verdünnungsfaktor, also bei einem größeren siert und auf dem Streifen 104 in Form einer Auf- 5" Reaktionsmittelvolumen pro Milchprobenvolumen, zeichnung 120 festgehalten ist. Die Aufzeichnung 120 die Wärmebaddurchlaufzeit kurzer und die Wärmeist daher eine Darstellung von aufeinanderfolgenden badtempcratur geringer sein kann.
Meßergebnissen jeder behandelten und analysierten So kann beispielsweise bei den obengenannten MilchprobeM, und zwar in der gleichen Reihenfolge, volumetrischen Milchproben-Reaktionsmittel-Verin der die Probenbehälter 24 angeordnet sind. Zur 55 hältnisbereichen die Durchlaufzeit etwa 4 bis 12 Mi-Auswertung der aufgezeichneten Meßergebnisse ist nuten bei einer Temperatur von etwa 55 bis 75 C es lediglich notwendig, die aufeinanderfolgenden betragen. Hierbei erhält man, je nach dem benutzten Spitzenwerte der Aufzeichnung 120 richtig zu inter- volumetrischen Verhältnis, hinreichend gute Ergcbpretieren, um zu bestimmen, ob in jeder einzelnen nisse. Bei einem bevorzugten Reaktionsmittei-Milch-Milchprobc der Gehalt an Somazellen einen vorge- 60 proben-Volumenverhältnis von 20:1 beträgt die gcbenen minimalen Wert überschreitet oder nicht Wärmebaddurchlaufzeit vorzugsweise etwa6 Minuten überschreitet, der anzeigt, ob die betreffende Milch- und die Wärmebadtemperatur etwa 60° C.
kuh an Mastitis erkrankt ist oder nicht. Die folgende Tabelle A veranschaulicht an einer

In der Vorrichtung 10 nach der Erfindung kann Reihe von Beispielen die Genauigkeit und Zuvcrläsman das Verhältnis der einzelnen Volumen, also das 65 sigkeit des beschriebenen Verfahrens und der beVolumen der Milchprobe, des Fixiermittcls un:l des schriebenen Vorrichtung zum automatischen Zählen Rcaktionsmittels, die über die Pumpenschläuchc 42, von Somazellen in aufeinanderfolgenden Milchpro-39 und 38 zugeführt werden, in einfacher Weise ben. Jedes der Beispiele bezieht sich auf eine cinzicc

Milchprobe. Der Somazcllcnzählwert, der nach dem Verfahren und der Vorrichtung nach der Erfindung ermittelt wurde, trägt die Überschrift »Optischer Somazellcnzählwcrt mal 10"«. Der Somazcllcnzählwert, der in herkömmlicher Weise mit dem Mikroskop und Lichtbild erzielt wurde, trägt in der folgenden Tabelle die Überschrift »Direkter mikroskopischer Somazellcnzählwcrt mal 10⁽ⁱ«.

Obgleich die beschriebene Zellenzählervorrichtung 18 nach Art eines optischen Zellenzählers mit umgekchrtem Dunkclfcld aufgebaut ist, kann man das beschriebene Verfahren und die beschriebene Vorrichtung zusammen mit dem neuen Reaktionsmittel auch in Verbindung mit anderen Zcllcnzählervorrichtungen benutzen, die in der Lage sind, die Anzahl der Somazellen in den geklärten Milchproben zu zählen.

Obwohl in dem vorliegenden Fall die Reaktionsmittelmischung in einem einzigen Schritt von dem Behälter 116 über den Pumpcnschlauch 38 eingeleitet wird, ist es auch möglich, das Verscifungsrcagenz, das Chelationsmittel und das Dispersionsmittel auf getrennten Wegen in den oben beschriebenen Verhältnissen aus getrennten Behältern über getrennte Pumpenschläuche einzuleiten.

Weiterhin kann man das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung mit dem neuen Reaktionsmittel zur Bestimmung des Somazellengehaltes von Milch oder ähnlichen Flüssigkeiten benutzen, die nicht von Milchkühen stammen.

Tabelle A

Milchproben- Nummer	Optischer Somazellenzählwert	Direkter mikroskopischer Somazellenziililwert
	mal 10^u	mal 10"
1	0,4050	0,3800
2	1,87	1,65
3	7,05	7,34
4	6,75	6,74
5	0,54	0,59
6	1,94	1,64
7	0,94	0,84
8	0,39	0,32
9	2,92	2,24
10	4,20	3,30

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Klären von Milch zwecks Zählung der darin enthaltenen Somazellen, bei dem die Milch zur Klärung behandelt und in der geklärten Milch die Somazellen gezählt werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Milch mit einem die Solubilisierung der Somaze'len hemmenden Fixiermittel versetzt wird und danach mit einem die fettigen und anderen organischen Matrizen, mit Ausnahme der Somazellen, solubilisierenden Reaktionsmittel durchmischt wird, so daß praktisch nur noch die Somazellen als einziger ungelöster Bestandteil in der geklärten Milch vorhanden sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Reaktionsmittel ein Gemisch aus einem Verseifungsmittel, einem Chelationsmittel, das in der Lage ist, die Calcium- und anderen Schwermetallsalze der Fettsäuren sowie die in der Milch vorhandenen Proteine zu komplexieren und solubilisieren, und einem Dispersionsmittel verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Verseifungsmittel ein Gemisch aus einem Hydroxylamin und einer starken anorganischen Base verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichet, daß als Chelationsmittel ein Stoff aus der Gruppe EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure bzw. deren Natriumsalz), Mercaptoessigsäure und Ascorbinsäure verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Dispersionsmittel Octylphenoklecaäthylenglycoläther verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Verseifungsmittel ein Stoff aus der Gruppe H₂NOH-KOH und H₂NOH-NaOH verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6. dadurch gekennzeichnet, daß als Fixiermittel Glutaralaldehyd verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Milch-Reaktionsmittel-Gemisch für etwa 4 bis 12 Minuten auf eine Temperatur von etwa 55 bis 75°C erhitzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Milch-Reaktionsmittcl-Gcmisch für etwa 6 Minuten auf eine Temperatur von etwa 60° C erhitzt wird.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus aufeinanderfolgenden unterschiedlichen Milchproben zusammengesetzter Strom mit einem Strom aus dem Fixiermittel zusammengeführt wird und daß anschließend der Milchproben-Fixiermittel-Stmm mit einem kontinuierlichen Strom mis dem Reaktionsmiltel zusammengeführt wird.

11. Rcaklionsmittcl zur Klarimg von Milch zwecks Zählung der darin enthaltenen Somazellen, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem wäßrigen alkoholischen Mittel ein Verseifungsmittel, ein Chelationsmittel, das in der Lage ist.

die Calcium- und anderen Schwermetallsalze der Fettsäuren und die in der Milch vorhandenen Proteine zu komplexieren und zu solubilisieren, und ein Dispersionsmittel enthält.

12. Reaktionsmittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Verseifungsmittel ein Gemisch aus einem Hydroxylamin und einer starken anorganischen Base ist.

13. Reaktionsmittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Verseifungsmittel ein Stoff aus der Gruppe R₁NOH-KOH und H₂NOH-NaOH ist.

14. Reaktionsmittel nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Chelationsmittel ein Stoff aus der Gruppe EDTA-(Äthylendiamintetraessigsäure bzw. deren Natriumsalz), Mercaptoessigsäure und Ascorbinsäure ist.

15. Reaktionsmittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Dispersionsmittel Octylphenoldecaäthylenglycoläther ist.