DE2134910A1

DE2134910A1 - Verfahren zur analytischen Bestimmung von Leukozyten im Blut sowie Farbstoff zum Anfärben von Leukozyten

Info

Publication number: DE2134910A1
Application number: DE19712134910
Authority: DE
Inventors: Lawrence R. Shenorock; Kamentsky Louis A. Briarcliff Manor; N.Y. Adams (V.StA.)
Original assignee: BIO PHYSICS SYSTEMS Inc
Current assignee: BIO PHYSICS SYSTEMS Inc
Priority date: 1970-07-13
Filing date: 1971-07-13
Publication date: 1972-01-27
Also published as: IE35449B1; IE35449L; GB1319710A; US3684377A; DE2134910C2

Description

Pcrienicmwölie

Dr.-Ing. Willielm Reichel
Dipl-Ing. Woligang Reiche!

6 Frankfurt a. M. 1 . ■

Parkslxaße 13 . . 6711

ΒΙΟ/PHYSICS SYSTEMS, INC. Baldwin Place, New York, VStA

Verfahren zur analytischen Bestimmung von Leukozyten im Blut sowie Farbstoff zum Anfärben von Leukozyten

Die Erfindung betrifft einen Farbstoff zum Anfärben weißer Blutzellen sowie ein Verfahren zur analytischen Bestimmung von weißen Blutzellen im Blut.

Weiße Blutzellen (weiße Blutkörperchen, Leukozyten) existieren normalerweise im Blut in verschiedenen Formen," die in Hauptgruppen eingeteilt werden können, wobei ^jede Gruppe einen prozentualen Anteil der Gesamtmenge innerhalb bekannter Grenzen bildet.

Wesentliche Änderungen im Anteilsverhältnis der verschiedenen Arten von Leukozyten im Blut haben sich als charakteristische Merkmale für bestimmte Krankheiten erwiesen. Somit ist die' differentielle Blutauszählung, eine Auszählung, bei der die relativen prozentualen Anteile der verschiedenen Arten von Leukozyten im Blut festgestellt werden, ein äußerst wertvolles diagnostisches und für die medizinische Forschung geeignetes Verfahren, ·

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" ²~ 2134S10

Das übliche Verfahren zur Erzielung einer Differentialanalyse von Leukozyten aus einer Blutprobe besteht in der optischen Untersuchung des Blutes durch ein Mikroskop mit dem menschlichen Auge. Es ist ein schwieriges und zeitraubendes ¥erfahren, das Ergebnisse von fragwürdiger Genauigkeit liefert, da sie menschlichem Irrtum unterliegen. Außerdem werden bei der üblichen Methode notwendigerweise tote Zellen statt lebender untersucht, wodurch die Genauigkeit der Ergebnisse weiter eingeschränkt wird.

Es wurde nun ein Farbstoff gefunden, der eine klare Grundlage zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Arten von Leukozyten bei maschineller Bestimmung liefert«

Aufgabe der Erfindung ist ein automatisches„ maschinelles Verfahren zur Differentialanalyse von Leukozyten, das billig arbeitet und Ergebnisse mit einem hohen Genauigkeitsgrad liefert.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Blutanalyse _gwobei Leukozyten von anderen Teilchen in einer Blutprobe unterschieden werden,das dadurch gekennzeichnet ist,daß man unter Aufrechterhaltung physiologischer Bedingungen eine frische Blutprobe mit einem Acridinorange enthaltenden Farbstoff einer Kernanfärbung unterzieht, die angefärbte Blutprobe mit einer Lichtquelle bestrahlt, die einen Spektralanteil enthält» der von dem angefärbten Kernmaterial absorbiert wird, vnd die sich ergebende Fluoreszenzstrahlüng bei der Farbe des angefärbten Kernmaterials bestimmt. '

Physiologische Bedingungen werden aufrechterhalten, um die Blutzellen lebend zu erhalten. Der angewandte Farbstoff Acridinorange kann das Kernmaterial der Leukozyten anfärben und ist in der Lage, in diesem angefärbtem Kernmaterial eins Floureszenz bei einer bestimmten Farbe hervorzurufen, die sich von der Fluoreszenz irgendeines anderen im Blut voriiaä« denen Teilchens unterscheidet. ■

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ORiGlNAL INSPECTED

... ■ ■ 'ϊ ■ „*

! Die Erfindung soll im folgenden an Hand von Zeichnungen näher * \

erläutert werden, worin \V,*

Fig. 1 ein Punktanhäufungsbild, das bei der Durchführung f;

des" erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden kann, "^ ",**

Fig. 2 ein Histogramm, das bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden kann, und «*"* ^τ

Fig. 3 · eine schematische Darstellung einer Vorrichtung, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens

verwendet werden kann, '^

darstellen. -*'. 1

Der Farbstoff Acridinorange, der einen wichtigen Bestandteil , des erfindungsgemäßen Färbemittels darstellt, ist 3,6-bisdimethylaminoacridiniumchlorid (vgl. "COLOR INDEX", 2.Auflage, 1956 und 1957, herausgegeben von der Society of Dyers and Colourists of Great Britain und der American Association of Textile Chemists and Colorists, Lowell, Massachusetts, U.S.A., Spezifikation 46005). Wie bereits erwähnt, besteht das Färbemittel im wesentlichen aus Acridinorange in einer wässerigen

—7 —5 Lösung in einer Konzentration zwischen 10 und 10 g je Kubikzentimeter Lösung. Die Lösung enthält noch Zusatzstoffe, " um einen pH-Wert und eine Osmolalität innerhalb der normalen . ' physiologischen Bereiche für menschliches Blutplasma aufrecht ; zu erhalten. Bei den bevorzugten Konzentrationen für die " ^" Acridinorangelösung ist das Gemisch keine echte Lösung, sondern *" ^ eine kolloide Lösung oder kolloide Dispersion, in der äußerst "_; ^ kleine nicht gelöste Teilchen in der Flüssigkeit suspendiert sind. Im folgenden wird jedoch diese kolloidale Dispersion \' * als Lösung und das Gemisch aus der Acridinorangelösung mit einer Blutprobe als Suspension bezeichnet. Auf diese Weise wird die kolloide Dispersion des Farbstoffes besser von der flüssigen Suspension, die nach Zugabe der Blutprobe entsteht, unterschieden. < .

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Der normale physiologische pH-Wert für menschliches Blut beträgt im allgemeinen 7,40 plus minus 0,05. Da es zweckmäßig ist, eine physiologische Umgebung für die Blutprobe aufrecht zu erhalten, so daß die Zellen nicht beschädigt oder abgetötet werden, wird der pH-Wert der Lösung vorzugsweise und innerhalb praktischer Grenzen auf 7*4 plus minus 0,01 einreguliert. Analog wird die Osmolalität, die eine Punktion der Konzentration von Salzen in der Lösung ist, auf den physiologischen Wert von etwa 0,30 Osmolalitätseinheiten eingestellt. Dies geschieht vorzugsweise mit Natriumchlorid, da natürliches Blutplasma selbst salzhaltig ist.

Beispiel I

Zur Herstellung eines Färbemittels gemäß der Erfindung ging man von einer wässerigen Lösung mit einer Konzentration von 10 g Acridinorange Je Kubikzentimeter aus, deren Osmolalität durch Zugabe von 0,85$oiger Kochsalzlösung eingestellt war und die auf einen pH-Wert von 7,40 mit einem Phosphatpuffer, wie beispielsweise einer Kombination aus Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat, mit einer kombinierten Phosphatmolalität von 0,0025 gepuffert war.

Die Reihenfolge der Herstellungsschritte kann dabei folgendermaßen sein; Ein Einliterbehälter wird teilweise■mit destilliertem Wasser gefüllt, wozu 8,5 g Natriumchlorid zusammen mit 0,090 g NaH₂PO^H₂O und 0,496 g Na₂HPO^'7H₂O hinzugegeben werden. Das Gemisch wird danach gerührt oder bewegt* bis die Salze in Lösung gegangen sind, und der Behälter wird anschließend auf ein Gesamtvolumen von einem Liter mit destilliertem Wasser aufgefüllt. In einem getrennten Behälter werden 100 Milligramm Acridinorangepulver mit so viel destilliertem Wasser versetzt, daß 100 cm AcridinorangelÖsung erhalten werden. Das Ganze wird gerührt oder geschüttelt, bis sich das Acridinorange in dem Wasser gelöst hat. Man erhält ein© klare Lösung mit einem rötlich orangefarbenen Stich. Von den 100 cm AcridinorangelÖsung wird anschließend 1 cnr zu einem Liter der vorher gemischten " Salz/Puffer-LÖsung hinzugegeben, wobei die "oben beschriebene .

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Acridinorangefarblösung erhalten wird. Offensichtlich führt die Kombination mit einem Salzpuffer zur Bildung einer kolloidalen Suspension aus einem Teil des Acridinorange.

Vorzugsweise wird die fertige Lösung mit einem pH-Wert Meßgerät untersucht und, sofern eine weitere Einstellung ''erforderlich ist, mit einem oder zwei Tropfen zehntel-normaler ■ Salzsäure versetzt, um den pH-Wert zu senken, bzw. mit einem oder zwei Tropfen zehntel-normaler Natronlauge, um den pH-Wert zu erhöhen. . · ·

Die so erhaltene Farblösung wurde erfindungsgemäß verwendet \.& und lieferte sehr zufriedenstellende Ergebnisse. jl

! Beispiel II j

Beispiel I wurde mit der Abweichung wiederholt, daß anstelle j des Phosphatpuffers ein Puffer aus N-2-Hydroxyäthylpiperazin- { N'-2-äthansulfonsäure mit einer Molalität von 0,005 verwendet wurde.

Auch diese Färbelösung führte zu befriedigenden Ergebnissen.

Beispiel III

Beispiel I wurde mit der Abweichung wiederholt, daß statt des Phosphatpuffers und Salzes ein Puffer verwendet wurde, der aus 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol mit einer Molalität von 0,15 bestand.

Auch diese Färbelösung führte zu befriedigenden Ergebnissen.

Beispiel IV

Beispiel I wurde mit der Abweichung wiederholt, daß die Menge an Acridinorange vervierfacht wurde, So daß eine Konzentration ___ von 4x10" g $e Kubikzentimeter erzielt wurde. Bei dieser Konzentration wurden sehr gute Ergebnisse erzielt. .

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Beispiel V "

Beispiel I wurde mit der Abweichung wiederholt, daß die Kon-

—5
zentration von Acridinorange auf 10 g je Kubikzentimeter Lösung erhöht wurde, während sämtliche anderen Bedingungen unverändert gelassen wurden. Die Färbelösung führte zu befriedigenden Ergebnissen, war jedoch nicht so wirksam wie diejenigen mit den niedrigeren Acridinorangekonzentrationen, die in den vorhergehenden Beispielen beschrieben wurden. Somit führte das vorliegende Beispiel zur Festlegung der ungefähren Obergrenze der Acridinorangekonzentration, mit der noch zufriedenstellende Färbeergebnisse erzielt werden. Bei der hohen Konzentration von Acridinorange ist der Anfärbeeffekt offensichtlich zu groß, als daß noch eine gute Differenzierung zwischen den verschiedenen Klassen von Leukozyten erreicht werden könnte.

Beispiel VI

Beispiel I wurde mit der Abweichung wiederholt, daß die Acridinorangekonzentration auf 8 χ 10 - g je Kubikzentimeter Lösung verringert wurde, während alle übrigen Bedingungen gleich gehalten wurden«

Auch mit diesem Färbemittel wurden zufriedenstellende Ergebnisse erzielt, d.h. die Leukozyten und die anderen Blutteilciien ließen sich klar voneinander unterscheiden. Jedoch war die ünterscheidbarkeit verschiedener Leukozytengruppen voneinander etwas weniger gut als gemäß Beispiel I. Somit stellt die im folgenden Beispiel angewandte Konzentration von Acridinorange die untere Grenze des bevorzugten Konzentrationsbereiciss dar.

Beispiel VII

Beispiel I wurde mit der Abweichung wiederholt, daß die Aeridinorangekonzentration auf 10 g je Kubikzentimeter Lösung verringert wurde, während alle anderen Bedingungen wie in Beispiel I gehalten wurden.

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Mit dieser Färbelösung erhielt man nicht in sämtlicher Hinsicht zufriedenstellende Ergebnisse. So wurden Leukozyten und andere Blutteilchen klar voneinander unterschieden, jedoch war die ünterscheidbarkeit einzelner Leukozytengruppen voneinander stark beeinträchtigt. Somit stellt die im vorliegenden Beispiel angewandte Acridinorangekonzentration die, Mindestkonzentration dar, die in dem erfindungsgemäßen Anfärbeverfahren angewandt werden kann.

In sämtlichen Beispielen II bis VII bildet das Acridinorange offensichtlich ein Kolloid, wenn es zu der Salz/Puffer-Lösung zugesetzt wird, wie bereits in Beispiel I beschrieben.

Beispiel VIII . ■

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden 0,20 Milliliter einer frischen Blutprobe zu 5 Milliliter der in Beispiel I beschriebenen Acridinorangelösung hinzugegeben. Die erhaltene Suspension wurde von Zeit zu Zeit leicht geschüttelt und etwa zehn Minuten lang stehengelassen, um den Farbstoff von den Leukozyten der Blutprobe aufnehmen zu lassen. Anschließend wird die Probe in eine Vorrichtung mit einem Strömungssystem eingebracht, das die Blutprobe in einer äußerst dünnen Strömung durch eine optische Kammer treten läßt. Die dünne Strömung ist außerdem so schmal bemessen, daß sie den Durchfluß der einzelnen Zellen (sowohl Erythrozyten als auch Leukozyten) derartig begrenzt, daß sie normalerweise einzeln hintereinander, also in einer Einerreihe, strömen. In der optischen Kammer werden die Zellen durch ein gleichförmiges Lichtfeld treten gelassen, das von einem blauen Laserstrahl, vorzugsweise einem Argonionenlaser bei einer Wellenlänge von 4880 S, gebildet wird. Das gleichförmige Lichtfeld von dem Laser besitzt vorzugsweise eine sehr geringe Ausdehnung in 4er Richtung der Wanderung der Zellproben. Diese Ausdehnung ist von derselben Größenordnung wie die maximale Ausdehnung einer einzelnen Zelle, so daß die Zellen jeweils nur einzeln, d.h. zu einem Zeitpunkt immer nur eine Zelle, bestrahlt werden.

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Die grüne Fluoreszenzstrahlung von den Leukozyten in einem Wellenlängenbereich um etwa 5300 S, die von der optischen Anregung der Leukozyten durch den Argonlaserstrahl herrührt, wird dann bestimmt, und die Gesamtzahl der Leukozyten wird in Form von optischen Impulsen geringer Fluoreszenz ausgezählt. Diese Auszählung wird für ein sorgfältig abgemessenes Volumen der Suspension durchgeführt, so daß man je Volumeneinheit eine genaue Auszählung der Leukozyten' erhält.

Es wurde gefunden, daß bei den oben erwähnten Acridinorange- . konzentrationen von den Erythrozyten mit einer einzigen, weiter unten erwähnten Ausnahme praktisch keinerlei Acridinorange aufgenommen wird, so daß die roten Zellen bei der oben beschriebenen Bestimmungsmethode praktisch unsichtbar bleiben. Im Gegensatz dazu nimmt jeder Leukozytenkern Acridinorangefarbstoff auf, was zu einer praktisch gleichförmigen, grünen Fluoreszenzemissionscharakteristik führt. Man erzielt auf diese Weise eine schnelle und genaue Auszählung der Leukozyten. Unreife Erythrozyten, sog. Retikulozyten, nehmen zwar auch bedeutende Mengen Acridinorange auf, jedoch wird der Farbstoff in einer derartigen Weise aufgenommen, daß praktisch keinerlei grüne Fluoreszenzemission von den Retikulozyten ausgeht. Somit ist die grüne Fluoreszenzemission eine genaue Grundlage zur Unterscheidung von Leukozyten von allen anderen Blutteilchen.

Beispiel IX

Das Verfahren gemäß Beispiel 8 wurde mit der Abweichung wiederholt, daß zusätzlich zur Bestimmung der grünen Fluoreszenzcharakteristik die rote Fluoreszenz, von jeder Zelle bei einem Wellenlängenbereich von der Größenordnung von 6500 Ä bestimmt wurde. Rote und grüne Signale wurden optisch mit Hilfe eines 'dichroitischen Spiegels und geeigneter Filter getrennt und durch besondere photomultiplier Röhren verstärkt. Die grünen Signale wurden danach zur Ermittlung der Gesamtzahl an Leukozyten und die roten Signale zur Herstellung eines Musters auf einer Katodenstrahlröhre verwendet. Vorzugsweise werden die

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grünen Signale auch dazu verwendet, um den Katodenstrahl zu verstärken, so·.." daß für jede Zelle ein einzelner Bildpunkt erscheint, und um ein zugeordnetes Signal (coordinate signal) auf dem Katodenstrahlröhrenbildschirm zu erzeugen. Auf diese V/eise kann das grüne Signal als vertikale Verschiebungskoordinate und das rote Signal als die horizontale Verschiebungskoordinate für einen einzelnen Bildpunkt auf der Katodenstrahlröhre für jedes weiße Blutkörperchen verwendet werden. Somit werden auf der Katodenstrahlröhre verschiedene Amplituden \ von roter Fluoreszenz von den verschiedenen Leukozyten abgebildet. Man nimmt an, daß die verschiedenen Amplituden der roten Fluoreszenz den unterschiedlichen Eigenschaften der u verschiedenen Arten von Leukozyten zuzuschreiben sind, wobei * diejenigen Leukozyten, die die größte Anzahl von Granula im · Cytoplasma besitzen, das größte Rotfluoreszenzsignal ergeben. j Es wurde gefunden, daß jede Blutprobe ein Bildmuster liefert, | das bestimmte Punktansammlungen besitzt, die die Verteilung der verschiedenen Arten von Leukozyten wiedergeben. Durch \ Vergleich der Muster, die durch Blutproben normaler Individuen ' erzeugt werden, mit Mustern, die durch Blutproben von Individuen erzeugt werden, die an Krankheiten oder Infektionen leiden, die Abnormitäten in der Gleichgewichtsverteilung der Leukozyten verursachen, wurde ermittelt, daß es sehr praktisch j ist, die Differenzen nachzuweisen und Zustände von Ungleichge- [ wichten zwischen den verschiedenen Leukozytenarten, die für bestimmte Krankheiten oder Infektionen charakteristisch sind, schnell zu erkennen. Wenngleich das grüne Signal in weit geringerem Ausmaß Veränderungen unterworfen ist als das rote, so gibt es doch bestimmte individuelle Verschiedenheiten auch bei dem grünen Signal. Somit wird ein zweidimensionales Bildmuster auf dem Schirm der Katodenstrahlröhre erzeugt, das eine qualitative Information über die Verteilung der weißen Blutzellen in der Probe liefert.

Das abgebildete Muster wird vorzugsweise fotografiert, um auf _ diese Weise eine dauerhafte Information zu erhalten, die analysiert und studiert werden kann, und die mit früheren Versuchsaufnahmen von demselben Patienten vergleichen werden kann.

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Beispiel X

Beispiel IX wird mit der Abweichung wiederholt, daß Schwellenkreise (threshold circuits) angewandt werden, um Rotfluoreszenzsignale innerhalb individueller, schmaler Felder von Bildpunktansammlungen zu selektieren, und diese Signale werden individuell ⁱ für eine vorgewählte Leukozytengesamtzählprobe (pre-selected total white cell count sample) ausgezählt. Die Methode wird anschließend für anders eingestellte Schwellenkreise wiederholt, um nacheinander verschiedene Punktansammlungsbereiche entsprechend den verschiedenen Leukozytenklassen auszuzählen. Auf diese Weise werden individuelle Zählungen der Mengen von Leukozyten aller unterschiedlichen Arten erhalten. Somit wird das Verhältnis von jeder Leukozytenart zur Gesamtzähl von Leukozyten erhalten» Derartige Verhältnisse werden vorzugsweise in Prozent;^:ausgedrückt.

Fig. 1 stellt ein KatodenstrahlröhrenMld aus einer Signalgruppe aufgrund einer Leukozytenanalyse dar, die gemäß den beschriebenen Methoden,? insbesondere im Hinblick auf Beispiele IX und X, erhalten wurde. In diesem Bild wurden die Signale für grüne Fluoreszenz für die vertikale Verschiebung vom unteren Rand aus und die Rotfluoreszenzsignale für die horizontale Verschiebung nach rechts von der Ursprungslinie am linken Rand aus verwendet. Typische Ansammlungen heller Signalpunkte für Zählgruppen sind bei 9, 11 und 13 zu sehen. Die Punktansammlung 9 mit dem niedrigsten Rotfluoreszenzwert stellt die Gruppe der Lymphozyten dar. Die Ansammlung 11 mit einem etwas höheren Rotsignalwert stellt die Zwischengruppe dar und die Ansammlung 13 mit dem höchsten Wert und breitesten Bereich für rote Fluoreszenz die polymorphonuklearen Leukozyten (Granulozyten). In bestimmten Fällen erwies es sich als möglich, Untergruppen innerhalb dieser Ansammlungen zu unterscheiden, insbesondere, wenn die horizontale Verstärkung der Oszilloskopverschiebungskreise (oscilloscope deflection circuits) erhöht wird. ■ \

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Um die Möglichkeit der Registrierung falscher Signale zu vermeiden, wird der Signalkreis für die Bestimmung der grünen Fluoreszenz vorzugsweise mit einem Schwellenkreis durchgeführt, wie beispielsweise durch die horizontale Schwellenlinie 17 angedeutet, so daß lediglich diejenigen Signale, die einen so hohen Wert für das grüne Fluoreszenzsignal besitzen, daß die Schwellenlinie 17 überschritten wird, registriert und in dem visuellen Bild angezeigt werden. Analog kann eine obere Schwelle eingerichtet Werden, wie bei 19 gezeigt. Durch Verwendung zusätzlicher Schwellenwerte an den Stellen der Linien 21, 23, 25 und 27 können bestimmte einzelne Punktanhäufungen herausgegriffen und allein dargestellt £ oder, wie in Beispiel X erwähnt, ausgezählt werden. Beispiels- , weise kann die Punktansammlung 9 durch Festsetzen der oberen Grenze bei 23 und der unteren Grenze bei 21 herausgegriffen werden. Analog kann die Punktansammlung 11 durch Setzen der Obergrenze bei 25 und der Untergrenze bei 23 ausgewählt werden.

Beispiel XI

Mit der Acridinorangefärbelösung gemäß Beispiel IV wurde das Verfahren gemäß Beispiel IX wiederholt, wobei die Probe frischen Blutes 16 Minuten lang in der Acridinorangelösung in Suspension gehalten wurde, bevor man sie in die optische Kam- J mer einbrachte und dem Laserstrahl aussetzte. Als Ergebnis wurde das Bild gemäß Fig. 1 erhalten, das sehr bestimmte Punktanhäufungen für einzelne Zellen aufweist. Die mittlere Punktanhäufung 11 war, wie üblich, nicht so prägnant ausgeprägt wie die Anhäufungen 9 und 13.

Beispiel XII

Beispiel XI wurde mit der Abweichung wiederholt, daß die Einwirkungszeit der Acridinorangelösung auf die Blutprobe vor der optischen Untersuchung auf 11 Minuten verringert wurde. Die Punktanhäufungen waren praktisch genau so gut umrissen wie in Beispiel XI.

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Beispiel XIII

•Beispiel XI wurde mit der Abweichung wiederholt, daß die Zeitdauer für die Einwirkung der AcridinorangelÖsung auf die
Blutprobe vor der optischen Untersuchung auf 7 1/2 Minuten
verringert wurde. Die Begrenzung.der Punktansammlungen war
etwas verschlechtert.

Beispiel XIV -

Beispiel XI wurde mit der Abweichung wiederholt, daß die Zeitdauer der Einwirkung der AcridinorangelÖsung auf die Blutprobe vor der optischen Untersuchung auf 3 Minuten verringert
wurde. Die Umschreibung der Anhäufungen war wesentlich verschlechtert

Bei jedem der letzten Beispiele betraf die Verschlechterung
in der Umschreibung der Punktanhäufungen in erster Linie die
mittlere Anhäufung 11, die die Monozyten darstellt.

Beispiel XV

Das Verfahren gemäß Beispiel IX wurde unter Verwendung der

AcridinorangelÖsung gemäß Beispiel V mit einer Konzentration

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von 10 g Acridinorange je cm Lösung wiederholt. Die Leukozyten nahmen die Farbe sehr gut an und ergaben eine sehr starke grüne Fluoreszenz sowie starke Rotfluoreszenzsignale. Jedoch waren infolge der hohen Aufnahme des Farbstoffes durch
die Zellen der Ergebnisse im Hinblick auf die Erzeugung roter Signale mit der Eignung zur Bildung genau umschriebener Punktanhäufungen und damit zur Differenzierung der verschiedenen
Zellarten beeinträchtigt. So war die mittlere Punktanhäufung
11 wiederum nicht von den anderen Anhäufungen getrennt .

Beispiel XVI

Das Verfahren gemäß Beispiel XV wurde mit der einzigen Abwei*- chung wiederholt, daß die Einwirkungsdauer der AcridinorangelÖsung auf das frische Blut vor der optischen Analyse auf

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18 Minuten erhöht wurde. Es ergab sich, daß die Farbaufnahme durch die Zellen noch vollständiger und die Fluoreszenzsignale noch intensiver waren, jedoch war das Endergebnis im wesent-v:> liehen gleich.

Beispiel XVII

Das Verfahren gemäß Beispiel IX wurde unter Verwendung einer Acridinorangefarblösung mit einer Konzentration von 4x10 g/cm Lösung wiederholt. Die Acridinorangelösung wurde auf die Blutprobe vor der optischen Untersuchung 13 Minuten einwirken gelassen. Es wurde eine verhältnismäßig geringe Farbaufnahme durch die Zellen erzielt, die sich in verringerten roten und grünen Signalen und in einer leichten Verschlechterung beim Auftrennen und Identifizieren der verschiedenen Punktanhäu- ■■ fungen, insbesondere des mittleren Punkthaufens 11, bemerkbar machte.

Beispiel XVIII

Das Verfahren gemäß Beispiel XVII wurde mit der Abweichung wiederholt, daß die Einwirkungsdauer der Acridinorangelösung auf die frische Blutprobe vor der optischen Untersuchung auf 24 Minuten erhöht wurde. Das Ergebnis war etwas besser, jedoch nicht so gut wie die vorhergehenden Untersuchungen, wie beispielsweise di^gemäß Beispiel IX, bei der eine höher konzentrierte Acridinorangelösung verwendet wurde.

Beispiel XIX

Das Verfahren gemäß Beispiel IX wurde unter Verwendung der in Beispiel II angegebenen Acridinorangelösung mit der Abweichung wiederholt, daß die Konzentration des Acridinorange auf 2 χ 1O" g je Kubikzentimeter Lösung verdoppelt wurde und die Einwirkungsdauer der Lösung auf die Blutprobe vor der optischen Untersuchung 13 Minuten betrug. Es wurden ausgezeichnete Ergebnisse erhalten.

1 Q 9 H B 5 ■' i 7 '! C) BAD ORIGtNAL

Beispiel XX

Das Verfahren gemäß Beispiel IX wurde mit der Abweichung wiederholt, daß nicht eine frische Blutprobe, sondern eine Blutprobe verwendet wurde, die mit dem gleichen Volumen einer 10%igen wässerigen Formalinlösung versetzt wurde, die mit einem Acetatpuffer, der aus einem Gemisch aus Natriumacetat und Essigsäure bestand, auf einen pH-Wert von 7»O abgepuffert war. Das Gemisch aus Formalin und Blut wurde eine Stunde stehengelassen. Die Zugabe des Formalins bewirkte, daß keine der Zellen am Leben blieb. .

Danach wurde das Verfahren gemäß Beispiel IX durchgeführt mit der- Abweichung, daß das Formalin/Blut-Gemisch anstelle des frischen Blutes verwendet wurde. Es ergab sich, daß sehr wenig Acridinorangefarbstoff von den Zellen auf genommen wurde und demgemäß eine nur sehr geringe grüne Fluoreszenz auftrat, die in den vorhergehenden Beispielen zur Unterscheidung der weißen Blutkörperchen von anderen Blutteilchen diente. Außerdem waren die Rotfluoreszenzsignale sehr schwach und unbestimmt und ergaben keine Grundlage zur Unterscheidung eines weißen Blutkörperchens von dem andern. Praktisch kann man sagen, daß im wesentlichen kein Farbstoff von den Zellen aufgenommen wurde.

- Beispiel XXI

Beispiel IX wurde mit einem Helium/Cadmium-Laser statt eines Argonlasers durchgeführt. Die Ergebnisse -waren noch eben befriedigend, die Klarheit der ersten und dritten Punktansammlung war erhalten geblieben, Jedoch war der zweite Punkthaufen nicht ebensogut von dem ersten abgetrennt.

Die bevorzugte Acridinorangekonzentration liegt also in der Nachbarschaft von 1O~ g je Kubikzentimeter wässerige Lösung, wobei sich der Bereich etwa von 8 χ 10 bis 4 χ 10~ g je Kubikzentimeter Lösung erstrecken kann. ·

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Fig. 2 stellt ein Histogramm' (Häufigkeitskurve) dar, das sich aus den gleichen Daten, wie sie in Fig. 1 dargestellt sind, ergibt.. Die vertikale Koordinate gibt ein Maß für die Zellenzahl für jede der auf der horizontalen Achse aufeinanderfolgen- ' den Positionen an. Die Amplitude der roten Fluoreszenz wird wiederum auf der horizontalen Achse aufgetragen. Es ergibt sich, daß der Peak der Kurve bei 9A den Mittelpunkt des Haufens 9 gemäß Fig. 1 entspricht. Die Tatsache, daß dieser Peak sehr hoch ist, zeigt an, daß in dieser 'Anhäufung innerhalb eines sehr engen Bereiches roter Fluoreszenz eine große Zahl einzelner Zellen abgebildet sind. Im Gegensatz dazu zeigt der Peak 11A, der der Anhäufung 11 gemäß Fig. 1 entspricht, mit seinem niedrigeren Wert an, daß eine geringere Zellen- % zahl mit roter Fluoreszenz in den Mittelpunkt der Anhäufung 11 fällt. Der Peak 13A besitzt eine breite Form, was zeigt, daß eine verhältnismäßig große Zahl von Zellen in praktisch den gesamten Bereich der Anhäufung 13 fällt und praktisch die gesamte rote Fluoreszenz innerhalb dieser Anhäufung liegt. Das Histogramm gibt sehr wertvolle und einzigartige Informationen für jeden einzelnen, dessen Blut untersucht wird, wobei die Form des Histogramms für jeden einzelnen charakteristisch ist und individuelle physiologische Eigenheiten innerhalb des normalen Bereichs oder pathologische Abweichungen von der Norm für ein bestimmtes Individuum erkennen läßt.

Während bisher das Ziel der Unterscheidung der Leukozyten von allen anderen Blutteilchen und der Herleitung nützlicher Information über die Leukozyten betont wurde,/wurde jedoch auch gefunden, daß gemäß der Erfindung andere wichtige Informationen über das Blut zu erhalten sind. Beispielsweise kann nach der Erfindung die Anzahl der Retikulozyten je Volumeneinheit Blut bestimmt werden. Retikulozyten sind rote Blutkörperchen, die ein Netzwerk aus Körnern oder Fäden enthalten, die einen unreifen Entwicklungszustand anzeigen. Retikulozyten machen normalerweise etwa 1% der Gesamtmenge der roten Blutkörperchen aus, doch kann der Prozentsatz an Retikulozyten unter abnormen Bedingungen dramatischen Veränderungen unterworfen sein, und eine derartige Veränderung kann für eine Krankheit symptoma-

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tisch sein.

Es wurde gefunden, daß die Retikulozyten Acridinorange unter den in den obigen Beispielen angegebenen Bedingungen zu einem weit größeren Ausmaß aufnehmen als die anderen roten Blutkörperchen. Die Aufnahme von Acridinorange durch die anderen roten Blutkörperchen ist unbedeutend, jedoch nehmen die Retikulozyten genug Farbe auf, daß sie ein Rotfluoxeszenzsignal erzeugen, das praktisch die gleiche Größe hat wie das der Lymphozyten unter den weißen Zellen. Jedoch liefern die Retikulozyten keine bedeutenden Grünfluoreszenzsignale. Somit ist es möglich, Retikulozyten von allen anderen Blutteilchen durch Anfärben einer Blutprobe mit physiologischer Acridinorangelösung und·anschließender Ausschließung sämtlicher grünfluoreszierender weißer Blutkörperchen von der Messung und Messung der übrigbleibenden Zellen , die eine bedeutende rote Fluoreszenz aufweisen, zu unterscheiden.

Eine bevorzugte Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere im Hinblick auf die optische Kammer, das Probenströmungssystem und das optische System

ist Gegenstand der deutschen Patentschrift

(Patentanmeldung P 21 01 358.1)-.

In Fig. 3 ist ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung dargestellt, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann. Die Vorrichtung besteht aus einer optischen Kammer TO, durch die ein Strom 12 aus in Suspension gehaltenen Zellen über ein Rohr 14 aus einem Reservoir 15 geleitet werden kann. Die Suspension ist vorzugsweise von einer Wasserhülle umgeben,' um die Teilchen (Zellen) zu einem sehr dünnen Strom einzuengen. Wenn der Strom 12 aus Teilchen durch die Kammer 10 hindurchtritt, passiert er einen schmalen Lichtstrahl 20, der aus einer Lichtquelle 22 stammt. Die Lichtquelle 22 ist vorzugsweise ein Argonlaser und kann eine zylindrische Linse 22A zum Formen und Richten des Lichtbündels enthalten,

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Unterschiedliche optische Reaktionen der einzelnen Blutzellen auf den Lichtstrahl 20 werden in Form von Fluoreszenzstrahlung aus jeder Zelle durch fotoelektrische Abtastelemente 24 und 26, die vorzugsweise Photomultiplierrohren sind, erfaßt. Die Signale, die von den lichtempfindlichen Abtastele-' menten 24 und 26 gegeben werden, werden von ihnen in elektrische Signalimpulse umgesetzt, die durch Verbindungsleitungen 30 und 32 an einen Auswertungskreis 34 weitergegeben werden. Das Abtastelement 24 ist so angeordnet, daß es auf die Rotfluoreszenzsignale, das Element 26 so, daß es auf die Grünfluoreszenzsignale anspricht. Die Übertragung der optischen' Fluoreszenzsignale auf die Abtastelemente wird durch einen Reflektor 16 und eine Linse 18 begünstigt. Ein Filter 18A kann außerdem vorgesehen sein, der sämtliches Licht hindurchläßt,, das Wellenlängen über etwa 5000 α besitzt. Auf diese Weise wird praktisch sämtliche Strahlung ausgeschlossen, die von dem Argonlaser bei der Wellenlänge 4880 A reflektiert wird. Das Filter 18A trägt somit dazu bei, sicherzustellen, daß sämtliche von den Abtasteinheiten 24 und 26 aufgenommene Strahlung aus der Fluoreszenzstrahlung der Zellen stammt. Ein dichroitischer Spiegel 28, der eine nominale Grenzwellenlänge (nominal cut-off wave length) für Licht bei etwa 5800 A besitzt, ist ebenfalls vorgesehen. Er reflektiert das Licht sämtlicher Wellenlängen unterhalb dieser Grenze durch ein Filter 26A hindurch auf das Abtastelement 26. Sämtliche optisehen Signale oberhalb 5800 £ Wellenlänge werden durch den dichroitischen Spiegel 28 und durch ein optisches Filter 24A zu dem Abtastelement 24 hindurchgelassen. Das Abtastelement empfängt die Rotfluoreszenzsignale, und das Filter 24A läßt ein rotes Strahlungsband um 6300 % hindurch. Analog läßt der Grünfilter 26A ein grünes optisches Signalband in dem Bereich um 5300 % durch.

Die Analyse der optischen Reaktionssignale im Kreis 34 veranlaßt, daß der Kreis zwei Zählwerke 36 und 38 erregt. Das Zählwerk 36 gibt die Gesamtzahl an Teilchen in einer bestimmten Probe und da,^:; Zählwerk 38 die Anzahl νοϊΐ Hellenen innerhalb

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der Probe an, die eine bestimmte zu bestimmende Eigenschaft besitzen* wie beispielsweise einen bestimmten Amplitudenbereich für Rotfluoreszenzsignale aufweisen. Der Kreis 34 ist außerdem vorzugsweise mit einem Katodenstrahloszilloskop 40 verbunden/ um Signale dorthin zu liefern.

Die flüssige Probe, die die zu analysierenden Teilchen enthält, kann aus einer Quelle 15 durch die Leitung 14 herangeführt werden. Um eine genaue Volumenabmessung für ein bestimmtes flüssiges Probenvolumen, das analysiert werden soll, zu erhalten, sind Fotozellen 46 und 48 an voneinander beabstandeten Punkten längs des Rohres 14 vorgesehen, das vorzugsweise aus Glas ist, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Flüssigkeit an den entsprechenden Stellen gegenüber den Fotozellen zu bestimmen. An den entsprechenden Fotozellen sind davon getrennte Lichtquellen 50 und 52 vorgesehen. Befindet sich Flüssigkeit in dem Rohrabschnitt zwischen Lichtquelle und Fotozelle 46, so fokussiert die Flüssigkeit das Licht aus der Lichtquelle 50 auf die Fotozelle 46 und führt zu einem Signal von größerer Intensität. Wenn jedoch dieser Abschnitt des Rohres 14 leer ist und nur von Luft erfüllt, wird die Beleuchtung defokussiert und das optische Signal zur Fotozelle 46 hin entsprechend verringert. Der Wechsel in der Signalintensität bei der Fotozelle 46 wird innerhalb des Krei- W - ses 34 angezeigt. Die Fotozelle 48 reagiert in analoger V/eise auf die Beleuchtung von der Lichtquelle 52. Der Abschnitt von Rohr 15 zwischen den Fotozellen 46 und 48 kann als länglicher Behälter aufgefaßt werden, der einen Einlaß bei der Fotozelle 46 und einen Auslaß bei der Fotozelle 48 aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform veranlaßt der Kreis 34 dann, wenn die Fotozellen 46 und 48 beide die Anwensenheit von Flüssigkeit im Rohr 14 anzeigen, beide Zählwerke 36 und 38 auf Nullstellung zurückzugehen. Wenn das Schwanzende der Teilchenprobe die obere Fotozelle 46 passiert, so daß die Anwesenheit von Luft statt Flüssigkeit angezeigt wird, wird die Zählung der Teilchen begonnen gelassen» Wenn das Schwanzende der

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Flüssigkeitsprobe die untere Fotozelle 48 passiert, wird die
Übertraglang von weiteren Zählimpulsen zu den Zählwerken 36
und 38 gestoppt. Auf diese Weise sind die Zählergebnisse, die in den Zählwerken 36 und 38 gespeichert sind, auf ein Volumen an teilchenführender Flüssigkeit bezogen, das genau dem Flüssigkeitsvolumen zwischen den entsprechenden Fotozellen* 46
und 48 innerhalb der Röhre 14 vorhanden ist, entspricht.

Einzelheiten über den Kreis 34 sind der deutschen Patentschrift zu entnehmen.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Blutarialyse, wobei Leukozyten von anderen Teilchen in einer Blutprobe unterschieden werden, dadurch gek ennzeichnet, daß man unter Aufrechterhaltung physiologischer Bedingungen eine frische Blutprobe mit einem Acridinorange enthaltenden Farbstoff einer Kernanfärbung unterzieht, die angefärbte Blutprobe mit einer Lichtquelle bestrahlt, die einen Spektralanteil enthält, der von dem angefärbten Kernmaterial absorbiert wird, und die sich ergebende Fluoreszenzstrahlung bei der Farbe des angefärbten Kernmaterials bestimmt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet', daß man als Färbemittel einen Farbstoff verwendet, der Bereiche des Cytoplasmas anfärbt, so daß sie bei einer Farbe fluoreszieren, die sich von der Fluoreszenzfarbe des Kernmaterials unterscheidet, und daß man die Amplituden der Cytoplasmafluoreszenz für die einzelnen Zellen bestimmt und die Amplitudendifferenz zur Klassifizierung der Zellen verwendet.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,

daß man die frische Blutprobe zum Anfärben mit einer wässerigen W Lösung aus Acridinorange unter Bildung einer Suspension vereinigt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, daß man die physiologischen Bedingungen dadurch aufrechterhält, daß man pH-Wert und Osmolalität der Lösung auf Werten hält, die erforderlich sind, um pH-Wert und Osmolalität der Suspension innerhalb der normalen physiologischen Bereiche für menschliches Blut zu halten, und daß man den Anfärbevorgang etwa zehn Minuten lang ablaufen läßt und anschließend die Suspension der Strahlung eines blauen Lasers unterwirft und die

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Leukozyten aus einem abgemessenen Volumen der Suspension auf der Grundlage der Bestimmung der grünen Fluoreszenz, die von dem angefärbten Kern jedes einzelnen weißen Blutkörperchens emittiert wird, auszählt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß man als blaue Laserstrahlung die von einem Argonionenlaser oder Helium/Cadmium-Laser ausgehende Strahlung verwendet.
6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5_? dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung einer differentiellen Blutanalyse von Leukozyten außerdem die Leukozyten auf der Grundlage der Unterschiede in der Stärke der roten Fluoreszenz, die von den einzelnen Leukozyten in Abhängigkeit von der Anregung durch die blaue Laserstrahlung ausgeht, klassifiziert.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet, daß man durch Umwandeln der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlungsemissionen der einzelnen Leukozyten im roten Anteil des sichtbaren Spektrums in elektrische Signale ein Histogramm erzeugt, wobei die Frequenz, mit der die Intensitäten der roten elektrischen Signale in einen bestimmten engen Bereich fallen als vertikale Größe eines individuellen Histogramms angezeigt werden, bei dem die horizontale Verschiebung dem Wert der Intensität der roten Strahlungsemission entspricht, deren Frequenz gemessen wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlungsemissionen jeder Zelle im roten Anteil des sichtbaren Spektrums durch Umwandlung der roten optischen Signale in elektrische Signale bestimmt und diese auf dem Schirm einer Katodenstrahlröhre abbildet, wobei die Intensität der roten Signale durch Ablenkung des Katodenstrahlröhrenstrahls längs einer Achse angezeigt

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wird, die grünen optischen Signale in elektrische Signale umgewandelt und zur Steuerung der Ablenkung des Katodenstrahlröhrenstrahls längs der anderen Achse verv/endet werden und die grünen Signale außerdem als elektrische Strahlaufhellungssignale verwendet werden,
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, . dadurch gekennzeichnet, daß man Spannungsschwellwerte anwendet, um Rotfluoreszenzsignale innerhalb eines engen Feldes auszuwählen, und die Signale aus dem engen Feld für ein bestimmtes Blutprobenvolumen einzeln gezählt werden.
10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die grünen Fluoreszenzsignale oberhalb einer bestimmten Schwelle zur Bestimmung des Durchtritts der Zahl der weißen Blutkörperchen entsprechend einem vorherbestimmten Zählwert bis zu diesem Zählwert auszählt, daß man Spannungswellen zur Auswahl roter Fluoreszenzsignale innerhalb eines engen Feldes anwendet und rote Fluoreszenzsignale au§Üem engen Feld während der Dauer der Auszählung der grünen Fluoreszenz individuelle auszählt.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Retikulozyten von anderen roten Zellen und von allen anderen Teilchen in der Blutprobe dadurch unterscheidet, daß der Acridinorange enthaltende Farbstoff die Retikulozyten in der Blutprobe färbt und eine Fluoreszenz der Retikulozyten in roter Farbe erzeugt, die eine wesentlich größere Größenordnung hat als irgendeine rote Fluoreszenz von den übrigen roten Zellen, daß man die gefärbten Zellen einer Strahlung eines blauen Laserlichtes aussetzt und die Retikulozyten beobachtet und unterscheidet,indem man die weißen Zellen,die grüne Fluoreszenz ergeben, ausschließt und nur die übrigen Zellen, die eine rote Fluoreszenz ergeben, einschließt.

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12. Farbstoff zur Ausführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Zusammensetzung, die im wesentlichen Acridinorange

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in wässeriger Lösung in einer Konzentration zwischen 10 und

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10 g Acridinorange pro Kubikzentimeter der Lösung enthält, wobei die Lösung einen pH-Faktor und eine Osmolalitat innerhalb der normalen physiologischen Grenzen des menschlichen Blutplasmas aufweist*
13. Farbstoff nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung innerhalb des physiologischen Bereichs durch M Hinzufügung von Phosphaten auf einen pH-Wert gepuffert ist und daß die Osmolalitat innerhalb des normalen physiologischen Bereichs durch Hinzufügung von Natriumchlorid eingestellt ist.
14. Farbstoff nach Anspruch 13,

dadurch gekennzeichnet, daß die Phosphate im wesentlichen aus einer Kontoination von NaHpPO^ und Na₂HPO. bestehen und daß das Natriumchlorid in einer Menge hinzugefügt ist, die ausreicht, um eine 0,85#ige Lösung zu erzeugen.
15. Farbstoff nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 14, dadurch -gekennzeichnet-, daß die Konzentration des Acridinorange zwischen 8 χ 1Q- und 4 χ 10~ g Acridinorange pro Kubikzentimeter der Lösung liegt.

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