DE2139261A1 - Tumimycin, seine Salze, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Antibiotikum

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Description

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DE2139261A1

Publication number: DE2139261A1
Application number: DE19712139261
Authority: DE
Inventors: Adorjan Princeton Robison Robert Selig North Brunswick Kraemer Nancy Virginia Cranford N J Henshaw Jo Ann New York N Y Gianmni Mary Suzanne New Brunswick N J Aszalos, (V St A ) C07g 11 00
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1970-08-06
Filing date: 1971-08-05
Publication date: 1972-02-17
Also published as: FR2102088A1; US3674867A; CH530467A

¹¹ Tumimycin, seine Salze, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Antibiotikum "

Priorität: 6. August 1970, V.St.A. ,· Nr. 61 564

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, genannt . Tumimycin, seine Salze, sowie ein Verfahren zu seiner Herstel- \ lung auf mikrobiologischem Wege. Tumimycin ist ein wertvolles Mittel zur Bekämpfung des Wachstums von Mikroorganismen. Es ist ein orange-rotes Pulver, das bei der Elementaranalyse folgende Durchschnittswerte aufweist: 0 66,85 ft, H 6,85 $, N 5,42 fc Sein IR-Spektrum ist in Fig. 1 und sein NMR-Spektrum in 3?ig. 2 gezeigt.

. Tumimycin wird durch Züchtung eines neuen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces unter kontrollierten Bedingungen gebildet. Dieser Mikroorganismus der Gattung Streptomyces wurde aus in Pekin, Illinois, V.St.A. gesammelter Abfallkohle gewonnen.

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Ein Stamm dieses Mikroorganismus wurde unter der Nummer 21^01 bei der A.T.C.C. in Rockville, Maryland, hinterlegt.

Streptomyces sp A.T.C.C. 21501 entwickelt sich gut in üblicherweise zur Züchtung von anderen Mikroorganismen der gleichen Gattung verwendeten Nährmedien. In einem Temperaturbereich von 20 bis 35°C, vorzugsweise bei etwa 25°C, wächst dieser Mikroorganismus in Schrägrohrchen auf einem Agar-Medium« Das Nährmedium wird aus 20 g Tomatenmark, 20 g Hafermehl und 500 ml kochendem Wasser hergestellt, und das Gemisch wird zu einem dünnen Schleim abgekühlt, filtriert, das Filtrat mit 15 g Agar in 500 ml Wasser versetzt und das entstandene Gemisch 20 Minuten bei 121⁰C und einem Dampfdruck von 1,05 atü sterilisiert. Auf diesem Medium bildet das Luftmyzel Konidien, die hellbraun gefärbt sind. Ausserdem bildet sich hellbraunes lösliches Pigment.

Die Erfindung schliesst auch alle Varianten und Mutanten des hier beschriebenen Mikroorganismus ein, die durch natürliche Auslese oder beispielsweise durch Behandlung des Mikroorganismus mit W-Strahlen, Röntgenstrahlen, Manganchlorid, Campfer oder Stickstofflost erhalten werden, sowie Polyploide der verschiedenen Mutanten,

Die zur Züchtung von Streptomyces sp A.T.C.C. 21501 nötigen Bedingungen und Nährstoffe sind ähnlich denen, die zur Herstellung von Antibiotika durch andere aerobe Mikroorganismen notwendig sind. Bei der aeroben Züchtung wird ein mit einer sterilen Kultur angeimpftes flüssiges Nährmedium auf Dreh-^V Schüttelmaschinen geschüttelt. Zur industriellen Herstellung

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ORIQlNAt INSPECT»

werden Metalltanks, verwendet, die im Inneren belüftet und mit Hilfe von Schaufeln gerührt werden. Tumimycin kann auch durch Oberfläehenzüchtung hergestellt werden. Der Mikroorganismus benötigt als Nährstoffe eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, stickstoffhaltige organische Substanzen und Mineralsalze. Die Züchtung wird am besten bei einem anfänglichen pH-Wert des Nährmediums zwischen 6,5 und 7»5 durchgeführt, wobei das pH-Optimum um 7,0 liegt.

Zu den zur Herstellung des Antibiotikums geeigneten Kohlenstoff-: quellen gehören unter anderem Zucker, wie Glucose, Lactose, Maltose und Saccharose, Dextrin, verschiedene Arten von Stärke, Glycerin und andere mehrwertige Alkohole, Inosit und tierische und pflanzliche Fette, sowie Ester dieser Verbindungen. Stickstoffhaltige organische Substanzen, die wachstumsfördernd wirken und die Bildung von Tumimycin begünstigen, sind z.B. Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl und andere pflanzliche Mehlarten ⁱ (nicht entfettet oder teilweise oder ganz entfettet), verschiedene Arten von Fleischmehl oder tierische Eingeweide, verschiedene Peptone, Caseinhydrolysate, Sojabohnenhydrolysate, Hefehydrolysate, Lactalbumin, Weizenglutine, lösliche Rückstände der' Alkoholde st illation, Maisquellv/asser, Harnstoff und Aminosäuren.

Mineralsalze, wie Chloride, Nitrate, Sulfate, Carbonate und Phosphate von Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium, sollen in· · geeigneten Konzentrationsverhältnissen in den Nährmedien enthalten sein. Die Nährmedien sollen auch eine Anzahl von Spurenelementen, wie Magnesium, Eisen, Kupfer, Mangan, Zink und Kobalt, enthalten.

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Unter den angegebenen Bedingungen erhält man bei einer Züchtungstemperatur von etwa 25°C innerhalb von etwa 2 bis 5 Tage in den Tanks eine maximale Tumimycinbildung.

Das Inokulum für die Züchtung kann aus Suspensionen von Sporen oder von lyophilisiertem Mycel, das mit einem inerten Substrat gefriergetrocknet wurde, gewonnen werden. Das Inokulum wird üblicherweise vor der endgültigen Züchtung einmal oder mehrmals in flüssige Hahrmedien übertragen.

™ Tumimycin hemmt das Wachstum von Bakterien und Pilzen. Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung von Tumimycin als Antibiotikum.

Es wird als Konservierungsmittel für Leder, Papier, Farben und insbesondere bei Kunststoffen und Stoffen verwendet, um sie gegen Schimmel- und Pilzbefall zu schützen. Beispielsweise können Stoffe zu ihrer Konservierung mit Tumimycin oder einem Salz dieses Antibiotikums durch Einweichen oder Einsprühen imprägniert ^ werden. Tumimycin kann auch als Pflanzenschutzmittel verwendet· werden. Zu diesem Zweck kann es auf die zu behandelnden Pflanzen gesprüht werden. Ein zum Versprühen geeignetes Präparat erhält man durch Behandeln von Tumimycin oder sines Salzes in einer Kugelmühle mit Wasser und vorzugsweise einem Netzmittel, z.B. einem Polyoxyalkylensorbitanester einer höheren Fettsäure, wie Tween 20, einem Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat.

Tumimycin kann auch als Oberflächendesinfektionsmittel verwendet werden. Zu diesem Zweck wird es vorzugsweise zusammen mit einem

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OBKMNAL INSPECTlO

Waschmittel oder einem anderen Reinigungsmittel in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 Gewichtsprozent, vorzugsweise 0,5 bis 1,0 Gewichtsprozent, gelöst. Solche Lösungen können dann ι als Waschflüssigkeiten zur Desinfektion von Böden, Wänden oder Tischen, sowie zur Reinigung von Anlagen zur Herstellung von Milchprodukten oder Nahrungsmitteln verwendet werden.

Isolierung von Tumimycin

Zur Herstellung von Tumimycin wird die Gärmaische nach der Züchtung abfiltriert. Das Filtrat wird verworfen, und der Filter- · kuchen wird mit einem unpolaren Lösungsmittel extrahiert» Das mit, dem unpolaren Lösungsmittel extrahierte Antibiotikum wird durch '<■ Ausfällung und Chromatographie weiter gereinigt. Eine endgültige Reinigung erhält man durch mehrmaliges Umkristallisieren aus _: verschiedenen Lösungsmitteln. ^:

Charakt erisierung [

1. Bei der Chromatographie auf Eastman Si-Gel-Chromagram unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus 10 Prozent Methanol und 90 Prozent CHCl* bildet 90 Prozent des Materials einen " Flecken mit einem R-'-Wert von 0,65 und 10 Prozent einen Flecken mit einem R^-Wert von 0,55.

2. Aussehen: orange-rotes Pulver;

3. F. oberhalb 300⁰C;

4. Löslichkeit: löslich in Säuren, Methanol, Essigsäureäthylester, Chloroform und Äther; unlöslich in Wasser und Hexen;.

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5. UV-Spektrum (in Äthanol) : _v

Absorption bei nm έΙ

243 623 . '

scharf 270 408

scharf 315 115

scharf 395 95

scharf 415 103

432 107

scharf 445 89

6. Elementaranalyse : C 66,90, 66,92, 66,67

H 7,02, 6,72, 6,80 <fo N 3,36 3,42 3,48 <f> keine Asche, Schwefel oder Halogene.

7. IR-Spektrum: Vgl. Pig. 1

8. NMR-Spektrum: Vgl. Pig. 2

9. Bei Basentitration in nicht wässrigem Medium erhält man ein lieutralisationsäquivalent von 470.

w 10. N-MethylbeStimmung: 4,8 ^; kein C-Methyl.

11. HCl-SaIz der Verbindung der Erfindung, hergestellt durch Lösen in Äther, Einleiten von trockenem HCl-Gas in die ätherische Lösung, Zentrifugieren, Waschen mit Äther und Trocknen:

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Chromatographie: Eastman Cellulose ITLC Lösungsmittel 3 Prozent Methanol - 97 Prozent Benzol: R_f~Wert 0,9.

12. Tumimycin bildet Salze bei der Umsetzung mit Säuren. Beispiele für solche Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Citronensäure, Oxalsäure und Essigsäure.

13. Eigenschaften des Acetats der Verbindung der Erfindung, das durch 16-stündige Behandlung bei 20 C mit Essigsäureanhydrid in Pyridin, anschliessendes Eingiessen in Eiswasser, Extraktion mit Äther, Trocknen der Ätherlösung und Umkristallisieren aus Äther/Hexen hergestellt wurde :

F. 145 bis 146⁰C

Elementaranalyse: CHN

64,85 1» 6,47 j> 2,71 # j

ITeutralisät ionsäquivalent bei Basentitration in nicht wässrigem Medium: 0;

IR-Spektrum: Vgl. Eig. 3j

Chromatographie: Eastman Si-Gel-Chromagram ITLC,

10 $ Methanol - 90 $ CHCl₃: R_f-Wert 0,68.

Antibiotisches Wirkungsspektrum

Tumimycin zeigt das folgende in vitro-Wirkungsspektrum :

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ORKMNAL IMSP^CTSD

Mikroorganismus

Staph.' aureus SC 1276
Escherichia coli SC 2975 Candida albicans SC 5314 Aspergillus niger SC 2828 Salmonella schottmuell'erie SC 3850 Pasteurella multocida SC 8739 Pseudomonas aeruginosa SC 3840 Proteus vulgaris SC 8504 Trichophyton mentagrophytes SC 2637

Minimale Hemmkonzentration,

f/ ml

0,6

9,4

1,2

6,3 18,7

6,3 12,5 50,0 25,0

Tumimycin unterscheidet sich von anderen bekannten Antibiotika. Als einziges Antibiotikum ist dem Tumimycin Iyomycin B^ ähnlich; vgl. Y. Sano, N. Kanda und T. Hata: J. Antibiotics, Tokyo, Bd. 17, Nr. 3 (1964), Seite 117. Iyomycin B- und Tumimycin sind sich in Elementaranalyse, TJV- und IR-Spektren und dem Schmelzpunkt ähnlich. Zwischen den beiden Antibiotika bestehen jedoch folgende Unterschiede :

a) Tumimycin weist in seinem IR-Spektrum bei 9,10 /u ein Absorptionsmaximum auf, das im IR-Spektrum von Iyomycin B- nicht vorhanden ist. Iyomycin B- v/eist ein Absorptionsmaximum bei 8,95 /Vl auf, das im Spektrum von Tumimycin fehlt.

b) Die e]-Werte der Absorptionsmaxima der UV-Spektren sind verschieden :

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	Iumimye in	"Ρ¹ 623	lyomycxn B₁
Absorption bei nm:	243	480	E₁ 500
	270·	96	330
	430-2	107

c) Bei Musen beträgt die DL₅₀ ^für Tumimycin 40 mg/kg bei intravenöser Injektion, für Iyomycin B₁ dagegen 5 mg/kg.

Das Beispiel erläutert die Erfindung_o

Beispiel Züchtung

Der Streptomyces-Stamm A.T.CO. 21501 wird 8 Tage auf einem Heinz-Baby-Hafermehl und Contadina-Tomatenmark enthaltenden Agar-Medium gezüchtet. Die Kultur wird dann in einer 0,01-prozentigen Lösung eines Netzmittels vom Alkoholsulfat-Typ suspendiert und in einen 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben mit 50 ml eines flüssigen Nährmediums übertragen. Dieses Nährmedium enthält 2,5 Prozent Maisquellwasser, 3,0 Prozent mit Lösungsmittel extrahiertes Sojabohnenmehl, 5,5 Prozent raffinierte Dextrose, 0,7 Prozent Calciumearbonat. Der pH-Wert wird vor der Sterilisation mit Natriumhydroxyd auf 7,0 eingestellt. Es wird 48 Stunden bei 25 C auf einer Drehschüttelmaschine gezüchtet. Die erhaltene Gärmaische wird quantitativ in einen 4 Liter fassenden Erlenmeyerkolben, der das oben genannte Nährmedium ent-

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hält, übertragen, und 0,025 Prozent eines Polyalkylenglykols. werden als schauin"brechendes Mittel zugesetzt. Nach 48 Stunden weiterer Züchtung bei 25 0 auf einer Drehschütte !maschine wird der Inhalt der Flasche zum Animpfen von 30 Liter des gleichen Hährmediums verwendet, das sich in einem 38 Liter,fassenden Fermentationstank aus korrosionsbeständigem Stahl befindet. Man züchtet bei 25⁰C und bei einer Oberflächenluft-Geschwindigkeit von 60 cm/min bei 0,7 atü und einem Bühräquivalent von 0,2 PS/440 Liter, lach 48 Stunden werden 1500 ml der entstandenen Gärmaische in einen 38 Liter fassenden Fern^ntationstank aus korrosionsbeständigem Stahl gebracht, der 30 Liter des oben verwendeten Nährmediums enthält. Zur Herstellung des Antibiotikums wird eine Temperatur von 25⁰C und eine Belüftungsgeschwindigkeit von 1,2 m/min Oberflächenluft und ein Rühräquivalent von 0,2 PS/440 Liter verwendet» Zur Schaumbrechung wird gegebenenfalls ein Polyalkylenglykol zugesetzt. Mit der Gewinnung des Antibiotikums beginnt man 96 bis 120 Stunden nach Züchtungsbeginn.

Isolierung

Nach 120-stündiger Züchtung wird die Gärmaische nach Zusatz von 5 Prozent Hyflo abfiltriert. Da der Grossteil des Antibiotikums sich im Filterkuchen befindet, wird das Filtrat verworfen. Der das Antibiotikum enthaltende Filterkuchen wird 8 mal mit Benzol extrahiert, wobei er während jeder Extraktion mindestens 1 Stunde lang gerührt wird. Der extrahierte Filterkuchen wird nach der Filtration verworfen. Die das Antibiotikum enthaltenden Benzolextrakte werden vereinigt und zur Iroekne eingedampft.

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An dieser Stelle "beträgt die Ausbeute aus 10 Liter Gärmaische 6 "bis 7 g eines roten, öligen Materials. Der rote, ölige Rückstand wird mit 1 Liter η-Hexen behandelt und 16 Stunden bei 5°C stehen gelassen. Der gebildete rote Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Die Ausbeute aus 10 Liter Gärmaische beträgt etwa 200 bis 300 mg Rohprodukt mit einem Gehalt von 10 bis 20 Prozent des Antibiotikums«, Das Rohprodukt wird in einem möglichst geringen Volumen Essigsäureäthylester gelöst und auf Eastman Si-Gel-Chromat.ographieplatten unter Verwendung eines Ißufmittels aus 10 Prozent Methanol und 90 Prozent Chloroform chromatographiert. Nach Entwicklung des Ghromatogramms erhält man mindestens 6 verschiedene Flecken. Der sichtbare gelbe und rot fluoreszierende Flecken mit einem R~-Wert von 0,65 wird aus dem Chromatogramm ausgekratzt und mit Essigsäureäthylester aus dem Si-GeI eluiert. Die Ausbeute beträgt etwa 40 bis 50 mg reines Antibiotikum. Es wrird zweimal aus Essigsäureäthylester/ Hexen umkristallisiert.

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oberhalb 300⁰C.

Elementaranalyse:

Pat entansprüche

Tumimycin und seine Salze, dadurch gekennzeichnet , dass es eine durchschnittliche Elementaranalyse von C 66,83 Prozent, H 6,85 Prozent und N 3,42 Prozent ergibt, einen Schmelzpunkt von über 300⁰C aufweist
und ein IR-Spektrum wie in Mg. 1 gezeigt und ein NMR-Spektrum wie in Pig. 2 gezeigt, besitzt.
2. Verfahren zur Herstellung von Tumimycin und seinen Salzen

nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine KuI-tür von Streptomyces A.T.C.C. 21501 unter aeroben Bedingungen in einem verwertbare Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen. und geeignete Mineralsalze enthaltenden Nährmedium züchtet, die G-ärmaische abfiltriert und aus dem Filterrückstand das
Antibiotikum isoliert und gegebenenfalls durch Umsetzen mit einer anorganischen oder organischen Säure in ein Salz
überführt.
3. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 als Antibiotikum.

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