DE2360794C2 - Verfahren zur Herstellung von Peptiden - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Peptiden

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Description

A) aus einer Lösung in Halogenkohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid. Pyridin, Eisessig, Trifluoressigsäure, cyclischen Äthern, Alkoholen, Estern, Ketonen oder Mischungen dieser Lösungsmittel durch Zugabe von Äthern oder Kohlenwasserstoffen kristallin ausfällt und/oder
B) aus Alkoholen, Ketonen, Essigester, Tetrachlorkohlenstoff oder Mischungen dieser Lösungsmittel direkt umkristallisiert.
Es ist bekannt, daß man Polyäthylenglykol als Esterkomponente in der Peptidchemie verwenden kann (Nature 237,1972, Seite 512—513). Hierbei wurde die gute Löslichkeit dieser Polymeren in Wasser wie auch in organischen Lösungsmitteln benutzt. Die Reaktionen am Polymer wurden in organischer Phase durchgeführt. Zur Reinigung von Ausgangsmonomeren, die im Überschuß eingesetzt werden, benutzte man die Wasserlöslichkeit, verbunden mit der Ultrafiltration. Die Monomeren können auf diese Weise abgetrennt werden. Ein gravierender Nachteil dieser Methode ist der stete Wechsel von organischer und wäßriger Phase und die oft langen Zeiten bei oder Ultrafiltration.
Es wurde nun gefunden, daß die Ester von Aminosäuren und Peptiden mit Polyäthylenglykol (PEG) oder Polypropylenglykol (PPG) praktisch unabhängig von den Eigenschaften des Peptidanteils außerordentlich leicht durch Kristallisation aus einem der im Patentanspruch aufgeführten Lösungsmittel gereinigt werden, d. h.. vor allem von überschüssigen Reaktionspartnern befreit werden können.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch Kondensation von Aminosäuren oder Peptiden, die über eine Esterbindung an die freien OH-Gruppen eines gegebenenfalls monoalkylierten, verätherten oder veresterten Polyäthylenglykols oder Polypropylenglykols vom durchschnittlichen Molekulargewicht 2000 bis 20 000, gebunden sind, mit weiteren Aminosäuren oder Peptiden und anschließende Abspaltung des erhaltenen Peptides von dem Polyglykol, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die an das Polyg)ykol gebundenen Peptide vor ihrer Abspaltung vom Polyglykol und/oder in vorangehenden Verfahrensstufen wenigstens einmal
A) aus einer Lösung in Halogenkohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin, Eisessig, Trifluoressigsäure, cyclischen Äthern, Alkoholen, Estern, Ketonen oder Mischungen dieser Lösungsmittel durch Zugabe von Äthern oder Kohlenwasserstoffen kristallin ausfällt oder/und
B) aus Alkoholen, Ketonen, Essigester, Tetrachlorkohlenstoff oder Mischungen dieser Lösungsmittel direkt umkristallisiert.
Die Polyäther können homopolymer aus den gleichen Glykolen, nämlich Polyäthylenglykol (PEG) oder Polypropylenglykol (PPG) aufgebaut sein. Sie können auch verschiedene Glykole als Grundbausteine enthalten. Wesentlich ist, daß neben den Äthergruppierungen mindestens noch eine Hydroxylgruppierung je Molekül Polyäther vorhanden ist, um die Aminosäure binden zu können.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird so ausgeführt, daß an einer funktionellen Gruppe des Polyäthers, z. B. einer Hydroxylgruppe, die erste Aminosäure über die Carboxylgruppe nach bekannten Verfahren als Ester gebunden wird. Der Aminosäurepoly-ätherester wird durch Zusatz der im Patentanspruch aufgeführten organischen Lösungsmitte! unter solchen Bedingungen kristallin ausgefällt, daß überschüssige Aminosäure bzw. Aminosäurederivat und Kondensationsmittel in Lösung verbleiben und dadurch einfach und schnell abgetrennt werden können. Zum Beispiel lassen sich die Polymere mit Äthern, bevorzugt mit Diäthyläther oder Diisopropyläther oder auch mit Kohlenwasserstoffen, wie Petroläther, aus einer der im Patentanspruch aufgeführten Lösungen, kristallin ausfällen. Als Lösungsmittel kommen hierfür in Betracht Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Chlor-
bo benzol, Toluol, Äthylbenzol oder Xylol ferner Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin, Eisessig, Trifluoressigsäure, cyclische Äther wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, Alkohole wie Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, Trifluoräthanol, Methylglyco! oder Butylglycol, Ester wie Essigester und Ketone wie Aceton, Methylethylketon und Cyclohexanon oder Mischungen dieser Lösungsmittel.
Die Polymere lassen sich auch aus Alkoholen wie Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol oder n-Butanol, Ketonen wie Aceton oder Methylethylketon sowie Essigester und Tetrachlorkohlenstoff bzw. Mischungen dieser Lösungsmittel direkt Umkristallisieren.
Die erfindungsgemäße Kristallisation muß nicht nach jedem Reaktionsschritt durchgeführt werden. Es erweist sich manchmal zweckmäßig, eine der Kristallisationen durch eine andere Reinigungsmethode zu ersetzen.
Die Reaktionsprodukte fallen sofort in reiner Form an und können unmittelbar für die nächste Reaktionsstufe verwendet werden. Falls erforderlich, kann die Kristallisation ohne wesentlichen Zeitverlust wiederholt werdea
Die eigentliche Synthese der Peptide unterscheidet sich nicht von der üblichen Technik in homogener Phase. Die einzelnen Reaktionsschritte, die verwendeten Schutzgruppen, Abspaltung- und Kondensationsmethoden sind z. B. in Schröder-Lübke, The Peptides, New York 1964/65 beschrieben und Gegenstand zahlreicher späterer Obersichtsreferate.
Zur Kupplung von Aminosäuren an das Polymer können alle bekannten Methoden der Peptidchemie angewendet werden. Um bei der Kupplung von Acylpeptiden an das Polymer die Racemisierung zu vermeiden, werden zweckmäßig solche Methoden verwendet, die nur minimale Racemisierung zeigen. Die Kupplungsreaktionen werden vorzugsweise in Lösungsmitteln wie Methylenchlorid, Chloroform, Dimethylformamid oder Pyridin vorgenommen.
Alle Schutzgruppen, die sieh selektiv gegenüber der Esterbindung abspalten lassen, sind geeignet, z. B. läßt sich der Carbobenzoxyrest hier auch durch katalytische Hydrierung abspalten, was z. B. bei Styrolharzen als Träger nicht möglich ist
Das durch stufenweisen Aufbau oder durch Fragmenlkupplung synthetisierte Peptid kann vom Polymer durch alkalische Hydrolyse, Umesterung, Ammonolyse oder Hydrazinolyse abgespalten werden. Ist das abgespaltene Peptid wasserunlöslich, so wird das Polymer durch behandeln mit Wasser in Lösung gebracht und das Peptid abfiltriert Ist das abgespaltene Peptid in Alkohol löslich, so kann das Polymer aus Alkohol ausgefällt werden und das Peptid durch Einengen des Filtrats gewonnen werden. Wenn das abgespaltene Peptid wasserlöslich ist, kann man zwischen Methylenchlorid bzw. Chloroform und Wasser verteilen. Das Peptid geht in Wasser, während das Polyäthylenglykol oder Polypropylenglykol in der organischen Phase bleibt.
Weitere Methoden zur Trennung von polymeren Trägern sind Gegenstromverteilung, Säulenchromatographie und Ultrafiltration.
Zwar wußte man, daß z. B. PEG etwa 60% Helixstruktur besitzen kann und damit kristalline Bereiche aufweist Es war jedoch völlig überraschend, daß Verbindungen, in denen infolge ihres Aminosäure- oder Peptidgehalts sehr unterschiedliche zwischenmolekulare Kräfte zur Wirkung kommen, unabhängig vom Pepiidanteil aus den im Patentanspruch aufgeführten Lösungsmitteln außerordentlich leicht und rasch kristalline Niederschläge bilden, die leicht filtrierbar sind.
Damit ist die bisher limitierende Schwierigkeit bei der Peptidsynthese in homogener Phase überwunden, die Produkte der einzelnen Reaktionsschritte in bequemer Weise zu reinigen. Die Ausfällung von Peptiden und ihren Derivaten aus dem Reaktionsmedium führte fast immer zu schmierigen, harzigen oder öligen Produkten, oder beim Ausfällen in fester Form wurden immer Verunreinigungen eingeschlossen.
Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist, daß Peptide, die normalerweise wasserlöslich sind, keine große Kristallisationstendenz haben und durch die üblichen Verteilungsmethoden zwischen organischem Lösungsmittel und wäßrigen Lösungen nicht gereinigt werden können, als Ester der erfindungsgemäßen Polymere jedoch nunmehr einfach zu handhaben und zu reinigen sind. Auch das Problem der Schwerlöslichkeit vieler Peptide wird durch diese Methode beseitigt.
Die Vorteile der Peptidsynthese in homogener Phase, hohe Umsatzquote, lineare Kinetik und leichte Reaktionskontrolle bleiben bei dem erfindungsgemäßen Verfahren voll erhalten.
Die Peptidsynthese unter Einfluß des erfindungsgemäßen Verfahrens kann automatisiert werden, weil alle Reaktionsstufen einschließlich der Abtrennung überschüssiger Reaktionspartner durch die erfindungsgemäße Kristallisation der Peptid-Polymerverbindungen stets in gleicher Weise und ohne Abweichung verlaufen.
Durch Verwendung geeigneter Schutzgruppen und Kondensationsmethoden kann das Verfahren darüber hinaus zu einem ausgesprochenen Schnellverfahren gemacht werden. So ist z. B. die Boc-Schutzgruppe nach etwa 10—15 Minuten abgespalten. Das Entfernen überschüssigen Lösungsmittels und die erfindungsgemäße Kristallisation durch Zusatz eines Äthers wie Diäthyl- oder Diisoproyläther und das Abfiltrieren nimmt ebenfalls nur 10—15 Minuten in Anspruch.
Die nach diesem Verfahren hergestellten Peptide können als Therapeutica oder Diagnostica Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer therapeutisch und diagnostisch wertvoller Peptide, wie z. B. Oxytocin, Vasopressin, Glucagon, Sekretin, ACTH, Thyrocalcitonin, Gastrin, TRH, LH-RH, Substanz P oder Insulin eingesetzt werden.
Beispiel 1
Synthese des Tetrapeptids H-Leu-Ala-Gly-VaI-OH an Polyäthylenglykol (PEG) MG 2000
a) Veresterung von Boc-Val-OH mit PEG MG 2000
2 g PEG MG 2000, 4,34 g 3oc-VaI-OH und 4,12 g DCCl (Dicyclohexylcarbodiimid) werden in 20 ml CH2Ci2 gelöst und bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit 7 Tage gerührt. Danach wird vom ausgefalle- ω nen DC-Harnstoff abgesaugt und die Lösung auf ca. 10 ml eingeengt, auf 00C bis -10°C abgekühlt und tropfenweise mit kaltem Diäthyläther versetzt, bis die Ausfällung von Boc-VaI-PEG vollständig ist. Der Niederschlag wird abgesaugt, in ca. 10 ml CH2Cl2 aufgenommen, und erneut bei tiefer Temperatur (-100C) mit Äther ausgefällt. Der Niederschlag wird wieder abgesaugt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 2,05 g Boc-Val-PEG, Beladung: 70% resp. 0,7 mM/g (Aminosäureanalyse). b5
Zur Abspaltung der Schutzgruppe (Boc) wird das Boc-Val-PEG mit 20 ml einer Mischung aus CH2Cb Trifluoressigsäure (TFA) (1 : 1) während 20 Minuten bei Raumtemperatur behandelt, anschließend die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt (auf ca. 5 ml) und durch Zutropfen von kaltem Äther das H-VaI-PEG ausgefällt.
Der Niederschlag wird abgesaugt in wenig CH2Cl2 aufgenommen, erneut mit Äiher ausgefällt und der Rückstand L V. getrocknet
Ausbeute: 2,00 g H-VaI-PEG - TFA
b) Peptidsynthese
2,0 g H-VaI-PEG · TFA (1,4 mM) werden in 20 ml CH2Cl2 gelöst (I). In einem separaten Gefäß wird zu einer Lösung von 5,6 mM Boc-GIy-OH in 10 ml CH2Cl2 langsam 2,8 mM DCC5 bei 0°C zugetropft Nach ca. 30 Minuten bei 0°C wird der entstandene DC-H«irnstoff abgesaugt und die klare Lösung (Boc-Aminosäuieanhydrid) zu ίο Lösung I zugegeben. Anschließend werden noch 1,5 mM N-Methylmorpholin langsam zugetropft und die Reaktionslösjuig 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt danach wird auf 10 ml eingeengt und das Polymerpeptid durch Zutropfen von Diäthyläther ausgefällt (-100C). Es wird noch 10 Minuten bei —100C gerührt dann der Niederschlag abgesaugt und i. V. getrocknet
Durch Behandlung des Boc-Gly-VaI-PEG mit TFA/CH2C12 (1 :1) wird die Schutzgruppe abgespalten.
Aufarbeitung analog a) Ausbeute: 1,98 g H-GIy-VaI-PEG · TFA.
In der gleichen Weise wird H-GIy-VaI-PEG · TFA mit 2,8 mM Boc-Ala-Anhydrid zur Reaktion gebracht
Nach Abspaltung der Schutzgruppe und Ausfällung mit Äther erhält man 1,96 g H-Ala-Gly-VaI-PEG · TFA.
Durch entsprechendes Umsetzen von H-Ala-Gly-VaI-PEG - TFA mit Boc-Leu-Anhydrid (1,8 mM) werden 1,95 g Boc-Leu-Ala-VaI-PEG erhalten. Die Aminosäureanalyse einer hydrolysierten Probe dieser Substanz zeigt folgendes Aminosäureverhältnis:
VaI : GIy : AIa : Leu = 1,00 :1,01 :0,99 :1,01
c) Abspaltung und Isolierung des Peptids
Eine Lösung von 1,0 g Boc-Leu-Ala-GIy-VaI-PEG in 10 ml H2O/Dioxan (1 :1) und 1,5 ml 1 N KOH wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Mit 1,5 ml IN HCI wird genau neutralisiert und zur Trockne eingedampft. Zur Entfernung der Salze wird der Rückstand 2mal mit je 20 ml CH2Ci2 digeriert und das unlösliche KCl abfiltriert. Das CH2Cl2 wird abgezogen, der Rückstand in 20 ml abs. Äthanol aufgenommen und 2 Stunden auf — 10° C abgekühlt. Der entstandene Niederschlag (PEG) wird bei 15 000 U/Min, abzentrifugiert, die überstehende Lösung abdekantiert und der Rückstand ernein in Äthanol aufgenommen, abgekühlt und nochmals abzentrifugiert. Die vereinigten Lösungen von Äthanol werden auf 10 ml eingeengt und bei — 100C über Nacht stehengelassen. Der Niederschlag (leichte Trübung) wird abgesaugt und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das so erhaltene Boc-Tetrapeptid (275 mg) wurde zur Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit 10 ml TFA/CH2C12 behandelt und das Lösungsmittel i. V. abgezogen. Der Rückstand wurde in H2O aufgenommen, die Lösung mit schwach basischem Ionenaustauscher bei pH 6 behandelt und nach Abfiltrieren des Austauschers gefriergetrocknet.
Ausbeute: 202 mg, korrekte Aminosäureanalyse.
B e i s ρ i e 1 2
Synthese des Tetrapeptids H-Leu-Ala-Gly-VaI-OH an Polypropylenglycol (PPG)
a) Veresterung von Boc-VaI-OH mit PPG MG 6000 und Abspaltung der Schutzgruppe
5,0 g PPG, MG 6000,4,34 g Boc-VaI-OH (= 20 mM) und 4,12 g DCCI werden in 50 ml CH2Cl2 gelöst und bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit während 7 Tagen gerührt. Danach wird die Lösung analog Beispiel la)aufgearbeitet.
Ausbeute: 5,0 g H-VaI-PPG · TFA.
Beladung: 0,3 mM/g (AS-Analyse).
b) Peptidsynthese
5,0 g H-VaI-PPG · TFA in der im Beispiel Ib) beschriebenen Weise mit je 3 mM Boc-Gly-Anhydrid, Boc-AIa-Anhydrid und Boc-Leu-Anhydrid umgesetzt. Nach der letzten Kupplung (Boc-Leu) erhält man 4,7 g Boc-Leu-Ala-Gly-Val-PPG.
Die Aminosäureanalyse ergibt:
VaI : GIy : AIa : Leu = 1,00 :0,00 : 0,99 :1,02
c) Abspaltung und Isolierung des Peptids
Zur Abspaltung des Peptids wird eine Lösung von 4,0 g Boc-Leu-Ala-Gly-VaI-PPC in 40 ml H2O/Dioxan (1:1) und 2 ml 1 N KOH zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Neutralisation mit 2 ml 1 N HCI wird zur Isolierung des Peptids analog zu Beispiel Ic) vorgegangen.
Die Ausbeute an rohem Tetrapeptid ist 410 mg. Der Peptidanteil im rohen Tetrapeptid beträgt 68% (AS-Analyse), d. h. bezogen auf VaI beträgt die Totalausbeute 65%.
Die Aminosäureanalyse ergibt:
VaI: GIy : Ala : Leu = 1,00 :1,01 :0,99 : 1,00
Im dünnschichtchromatographischen Vergleich mit dem Beispiel in 1 synthetisierten Tetrapeptid verhält sich das Produkt identisch.
Beispiel 3
Synthese von Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met (Substanz P) an PEG · MG 15000
a) Veresterung von Boc-Met-OH mit PEG MG 15 000
7,50 g PEG MG 15 000 (=1 mM funktionell Gruppen), 1OmM Boc-Met-OH und 1OmM DCCI werden in 50 ml CH2CI2 gelöst und 7 Tage bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit gerührt. Danach wird abfiltriert, die Lösung auf ca. 20 ml eingeengt, auf — 100C abgekühlt und das Boc-Met-PEG durch Zutropfen von kaltem Diäthyläther unter Rühren ausgefällt. Die Mischung wird noch weitere 10 Minuten bei — 100C gerührt, der Niederschlag mit einer Glasfritte abgesaugt und i. V. getrocknet. Das weiße Pulver wird erneut in 30 ml CH2Cl2 gelöst und wie oben beschrieben mit Äther ausgefällt. Nach Abfiltrieren und Trocknen des Niederschlags werden 7,50 g Boc-Met-PEG erhalten. Die Beladung nach Aminosäureanalyse beträgt 0,08 mM/g resp. 60% d. Th.
b) Peptidsynthese
7,00 g H-Met-PEG · TFA ( = 0,45 mM) werden in 70 ml CH2CI2 gelöst (Lösung I). In einem separaten Gefäß werden 2,3 mM Boc-Leu-OH in wenig CH2Cl2 gelöst, auf 0°C abgekühlt und 1,15 mM DCCI zugefügt. Nach 30-minütigem Rühren bei 00C wird das Gemisch unter Abfiltrieren des ausgefallenen DC-Harnstoffs zu Lösung I gegeben. Anschließend werden dem Reaktionsgemisch 0,60 mM N-Methylmoropholin langsam zugetropft und die klare Lösung 30 Minuten stehengelassen. Danach wird die Lösung i. V. auf ca. 30 ml eingeengt, auf — 100C abgekühlt und unter heftigem Rühren langsam Diäthyläther zugetropft (ca. 200 ml), bis das Polymerpeptid quantitativ ausgefallen ist. Die Mischung wird dann noch weitere 10 Minuten bei — 100C gerührt und anschließend über eine Glasfritte der Niederschlag abgesaugt. Zur vollständigen Entfernung der überschüssigen Boc-Aminosäure wird das Polymerpeptid erneut in wenig CH2Cl2 (ca. 30 ml) aufgenommen und wie oben beschrieben mit Äther ausgefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 6,98 g Boc-Leu-Met-PEG.
Das geschützte Polymerpeptid wird in einer Mischung aus TFA/CH2C12 (1 :1) gelöst (10%ige Lösung) und 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Anschließend wird die Lösung eingeengt (auf ca. 30 ml) und das Polymerpeptid unter Kühlung auf -10° C und heftigem Rühren mit Diäthyläther ausgefällt. Nach Absaugen und Trocknen des Rückstandes wird in ca. 30 ml CH2Cl2 aufgenommen und mit Äther gefällt Das weiße Pulver wird erneut abgesaugt und i. V. getrocknet bis zur Gewichtskonstanz.
Ausbeute: 6,95 gH-Leu-Met-PEG · TFA.
In der oben beschriebenen Weise werden nacheinander folgende Aminosäurederivate gekuppelt (gleiche Mengenverhältnisse:)
a) Boc-Gly-OH, Ausbeute an H-Gly-Leu-Met-PEG ■ TFA = 6,98 g
b) Boc-Phe-OH, Ausbeute an H-Phe-Gly-Leu-Met-PEG · TFA = 6,93 g
c) Boc-Phe-OH, Ausbeute an Phe-Phe-Gly-Leu-Met-PEG · TFA = 6,92 g
d) Boc-Gln-OH, der Synthesezyklus wird hierbei wie folgt abgewandelt:
Boc-GIn-OH wird in einer Mischung aus DMF/CH2C12 (1 :2) gelöst
Die Aktivierungszeit zur Darstellung von Boc-Gln-Anhydrid beträgt nur 5 Minuten. Nachträglich ausfallender DC-Harnstoff wird nach beendeter Kupplung abgesaugt Zur quantitativen Entfernung des überschüssigen Boc-Gln-OH wird das geschützte Polymerpeptid nach zweimaliger Fällung mit Diäthyläther in abs. Äthanol unter Erwärmen gelöst (10%ige Lösung) und abkühlen lassen. Nach ca. 2 Stunden bei —5°C wird der Niederschlag durch Zentrifugieren (30 Min. bei 10 000 U/Min.) und Abdekantieren des Oberstan des isoliert und getrocknet Das Dünnschichtchromatogramm zeigt, daß alle Überschüsse entfernt sind. Die Abspaltung der Boc-Gruppe erfolgt durch lOminütiges Behandeln mit TFAZCH2Q2 bei 00C Anschließend wird das Peptidpolymer direkt aus der Lösung mit Äther ausgefällt Ausbeute an H-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-PEG · TFA - 6,88 g
e) Boc-Gln-OH, gleiches Vorgehen wie unter d) beschrieben. Ausbeute an H-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-PEG · TFA = 6,70 g.
Zum Lösen des Polymerpeptids werden ab dieser Stufe 20% DMF zum OH2Cl2 zugesetzt
f) Boc-Pro-OH, Ausbeute an H-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-PEG · TFA - 6,60 g.
g) Boc-Lys(Z)-OH, Ausbeute an H-Lys(Z)-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-PEG · TFA - 637 g
h) Boc-Pro-OH, Ausbeute an H-Pro-Lys(Z)-Pro-Gln-GIn-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-PEG · TFA - 6,25 g
i) Z-Arg(Tos)-OH, die Entfernung der Überschüsse erfolgte analog wie unter d) beschrieben. Ausbeute an Z-Arg(Tos)-Pro-Lys(Z)-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-PEG = 6,05 g.
c) Abspaltung und Isolierung des Peptids
Zur Abspaltung des vollgeschützten Peptids vom Träger durch Ammonolyse werden 4,0 g Polymerpeptid in 40 ml Äthanol abs. und 20 ml CH2CI2 gelöst, die Lösung bei — 10"C ca. 30 Minuten mit Ammoniak gesättigt (Druckflasche) und 4 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wird das Lösungsmittel abdestilliert und der feste Rückstand mit 40 ml H2O (pH 5) digeriert. Das wasserunlösliche Peptid wird abzentrifugiert (30 Minuten bei 15 000 U/Min.), die überstehende Lösung abdekantiert und mit ca. 20 ml H2O behandelt.
Nach erneutem Abzentrifugieren, Abdekantieren und Lyophilisieren bleiben 250 mg rohes Peptid zurück.
Ausbeute: 520 mg Substanz P vollgeschüti'.t. Das IR-Spektrum des Peptids zeigt, daß das Polymer quantitativ entfernt ist.
Abspaltung der Schutzgruppen
220 mg vollgeschütztes Peptid werden 1 Stunde bei 00C mit HF behandelt (unter Zusatz von 2 ml Anisol) anschließend das HF entfernt (N2-Strom) und im Exsikkator getrocknet. Der Rückstand wird dann mit je 30 ml Essigester und 0,1 N Essigsäure extrahiert. Die Essigesterphase wird dreimal mit H2O extrahiert und die wäßrigen Phasen vereinigt. Nach 2maligem Lyophilisieren bleiben 180 mg rohes Peptid zurück.
Ausbeute: 180 mg Substanz P.
Die Beladung des Polymers betrug nach dem letzten Synthesezyklus 55% (bezogen auf Met).
Die Ausbeute bei der Abspaltung durch Ammonolyse beträgt 90% d. Th. (aus AS-Analyse).
d) Reinigung und Charakterisierung des Peptids
Das Synthese-Rohprodukt wies papierlektrophoretisch bei pH 1,9 vier ninhydrinpositive Banden auf. Die Reinigung und Entsalzung erfolgte durch kontinuierliche Hochspannungs-Elektrophorese im freien Pufferfilm
bei pH 1,9 (Elektrolyt: 14,5 ml konz. Ameisensäure und 11,9 ml Eisessig in 5000 ml Wasser). Die Feldstärke
betrug ca. 35 V cm-'. Ca. 100 mg Rohprodukt wurden in 5 ml Puffer gelöst und bei der Anode (über Gläschen 1)
zugeführt. Die Fraktioneneinteilung ergab sich aus Tüpfelproben mit Ninhydrin und Sakaguchi sowie direkten
Papierelektrophoresen mit konzentrierten aliquoten Pröbchen aus den einzelnen Gläschen. Die unten angegebenen Pools wurden zweimal mit Wasser lyophilisiert:
Fraktion 27-33: Ca. 25 mg weißes, stark hygroskopisches Pulver:
entspricht nach den bisherigen Prüfungen reiner Substanz P.
Fraktion 35-39: Reine Nebenkomponente mit der elektrophoretischen Beweglichkeit von 0,69 · Lys.
Die Totalausbeute an reiner Substanz P beträgt in bezug auf das C-terminale eingesetzte Met ca. 35% d. Th.
Beispiel 4
Synthese des Tripeptids PyTOgIu-HiS-PrO-NH2(TRH) an PEG1MG 6000
a) Veresterung von PEG
6 g PEG MG 6000 ( = 2 mM OH-Gruppen), 10 mM Boc-Pro-OH und 10 mM DCCI werden in 60 ml CH2Cl2 gelöst und bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit 7 Tage gerührt Anschließend wird vom ausgefallenen DC-Harnstoff abgesaugt und der Lösung 5 mM Boc-Pro-Anhydrid zugesetzt (separate Darstellung des Anhydrids mit DCCI analog den Beispielen 1 —3).
Die homogene Lösung wird 12 Stunden am Rückfluß erhitzt, auf ca. 20 ml eingeengt und das Boc-Pro-PEG durch Zutropfen von ca. 200 ml Äther ausgefällt Nach Absaugen des Niederschlags wird erneut in 20 ml CH2CI2 aufgenommen und wieder mit Äther gefällt. Zur Abspaltung der Boc-Gruppe wird der trockene Rückstand in 60 ml einer Mischung aus TFA/CH2CI2 (1 :1) gelöst und 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wird die Trifluoressigsäure am Vakuum abgezogen lind zur eingeengten Lösung Äther zugetropft bis alles H-Pro-PEG · TFA ausgefallen ist Nach Absaugen, Aufnehmen in CH2Cl2, erneutem Ausfällen mit Äther und Trocknen des Niederschlags werden 5,98 g H-Pro-PEG · TFA erhalten. Beladung 0,17 mM/g (Amiss nosäureanalyse) = 51%d.Th.
b) Fragmentkupplung
3 g H-Pro-PEG - TFA (=0,5 mM) werden in einer Mischung aus 10 ml CH2Cl2 und 10 ml DMF gelöst, auf —30° C gekühlt und mit 0,55 mM N-Methyl-morpholin neutralisiert
280 mg (1 mM) PyTOgIu-HiS-N2H3 werden in einer Mischung aus 5 ml DMSO, 5 ml DMF und 24 ml 2,4 N HCl/
Tetrahydrofuran bei 0° gelöst, auf —200C gekühlt, mit 0, 2 ml Isoamylnitrit versetzt, 30 Minuten bei —200C
gerührt und durch Zugabe von 035 ml Triäthylamin neutralisiert Diese Mischung wird zur ebenfalls auf -300C
gekühlte;; M-Pro-PEG-Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten unterhalb 0°C und 12 Stunden
bei 4°C gerührt, anschließend i.V. zur Trockne eingedampft und in 30ml abs. Methanol unter Erwärmen
aufgenommen. Die klare Lösung wird zur Kristallisation des PEG-Peptids zunächst bei 4° C (2 Stunden), dann
bei — 10°C stehengelassen (über Nacht) und anschließend vom ausgefallenen PEG-Peptid bei 104 U/Min.
* abzentrifugiert Die überstehende Lösung wird abdekantiert, der Rückstand erneut in Methanol aufgenommen.
das PEG-Peptid erneut bei tiefer Temperatur ausgefällt und aufgearbeitet.
Ausbeute: 2,85 g Pyrogla-His-Pro-PEG.
Das Produkt zeigt ein Aminosäureverhältnis von Pro : GIu = 1,00:0,71.
Zur erneuten Fragmentkondensation wird dieses Produkt in 20 ml CH2CI2 gelöst, mit N-Methyl-morpholin neutralisiert und wie oben beschrieben mit 280 mg (1 mM) Pyroglu-His-N2H3 umgesetzt. Nach Aufarbeitung des Reaktionsprodukts werden 2,70 Pyroglu-His-Pro-PEG zurückerhalten. Das Aminosäureverhältnis einer hydrolysierten Probe zeigt:
Pro: GIu = 1,00:1,00
10 c) Abspaltung durch Ammonolyse
2,5 g Pyroglu-His-Pro-PEG werden in einer Mischung aus 50 ml MeOH und 25 ml CH2Cl2 gelöst. Die Lösung wird bei — 100C mit NH3 gesättigt und während 4 Tagen bei Raumtemperatur aufbewahrt. Anschließend wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 50 ml MeOH gelöst und das PEG durch Abkühlen der Lösung auf 00C über Nacht ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, erneut mit MeOH behandelt und in analoger Weise wie oben das PEG auskristallisiert. Die vereinigten Methanollösungen werden zur Trockne eingedampft, das Rohpeptid in wenig Wasser aufgenommen und zur Entfernung der letzten Spuren von PEG das Produkt durch Sephadex^Chromatographie (G 15) über eine Säule (2,5 · 120 cm) aufgetrennt. Die vereinigten, tolidinpositiven Fraktionen ergeben nach Abdampfen des Wassers 115 mg Pyroglu-His-Pro-NH2, was einer Ausbeute von 71 % d. Th. entspricht, bezogen auf Pro vor der Abspaltung. Die Gesamtausbeute der Synthese, bezogen auf die erste Aminosäure (Pro), beträgt 64% d. Th.
Das Aminosäureverhältnis des so erhaltenen Produkts beträgt Pro : His :Glu = 1,00 :0,96 :0,99. Das dünnschichtchromatographische Verhalten dieses Materials entspricht demjenigen Pyroglu-His-Pro-NH?, das auf klassischem Weg durch die gleiche Kupplung hergestellt wird.
Beispiel 5
Synthese des Tetrapeptids H-Leu-Ala-Gly-Val-OH an PEG 20 000
20 g H-VaI-PEG MG 20 000 (Veresterung analog Beispiel 1, Beladung 85% d. Th. = 0,085 mMol/g) werden in 100 ml CH2Cl2 gelöst, mit 1,9 mMol Triethylamin und 5,0 mMol Z-GIy-ONP versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Lösung auf ca. 40 ml eingeengt und mit Diäthyläther zweimal gefällt. Der Rückstand wird nach Absaugen auf einer Glasfritte in 300 ml Methanol gelöst, mit 2.5 ml 4 N HCl/MeOH und Pd/C versetzt und bei RT und Normaldruck hydriert, bis keine Wasserstoffaufnahme mehr stattfindet.
Der Katalysator wird abfiltriert, das Filtrat eingeengt und mit Diäthyläther versetzt. Das auskristallisierte Polymerpeptid wird zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Ausbeute an H-Giy VaI-PEG : 19,3 g.
In analoger Weise wird H-GIy-VaI-PEG zuerst mit Z-AIa-ONP und anschließend mit Z-Leu-ONP umgesetzt. Nach Trocknung werden schließlich 18,5 g H-Leu-Ala-Gly-Val-PEG erhalten.
Die Aminosäureanalyse ergibt:
VaI: GIy : AIa : Leu = 1,00 :0,95 :0,99 :0,99
Beispiele
Synthese des Tetrapeptids H-Leu-Ala-Gly-Val-OH an PEG, MG 2000 nach Blockierung restlicher Hydroxylgruppen am PEG
Analog zu Beispiel 1 werden 2 g PEG, MG 2000,434 g BOC-VaI-OH und 4,12 g DCCI in 20 ml CH2Cl2 gelöst und bei Raumtemperatur sieben Tage gerührt
Anschließend wird vom ausgefallenen DC-Harnstoff abgesaugt und dem klaren Filtrat 20 mM Acetanhydrid zugesetzt Die Lösung wird 4 Stunden unter Rückfluß gekocht, dann auch ca. 10 ml eingeengt und wie in Beispiel 1 angegeben aufgearbeitet
Die Peptidsynthese wird dann analog zu Beispiel 1 durchgeführt Nach Abspaltung und Isolierung des Peptids wird die gleiche Ausbeute und Aminosäurezusammensetzung wie in Beispiel 1 erhalten.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch Kondensation von Aminosäuren oder Peptiden, die über eine Esterbindung an die freien OH-Gruppen eines gegebenenfaJls monoalkylierten, verätherteu oder veresterten Polyäthylen^iykols oder Polypropylenglykols vom durchschnittlichen MoleKulargewicht 2000 bis 20 000, gebunden sind, mit weiteren Aminosäuren oder Peptiden und anschließende Abspaltung des erhaltenen Peptides von dem Polyglykol, dadurch gekennzeichnet, daß man die an das Polyglykol gebundenen Peptide vor ihrer Abspaltung vom Polyglykol und/oder in vorangehenden Verfahrensstufen wenigstens einmal
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