DE2546952A1

DE2546952A1 - Vorrichtung zur feststellung submikrometrisch bemessener partikel

Info

Publication number: DE2546952A1
Application number: DE19752546952
Authority: DE
Inventors: Tomas Hirschfeld
Original assignee: Block Engineering Inc
Current assignee: Block Engineering Inc
Priority date: 1974-10-24
Filing date: 1975-10-20
Publication date: 1976-04-29
Also published as: FR2289929A1; AU8581675A; FR2289929B1; JPS5165956A; USB517504I5; NL7512371A; US3999855A; GB1492203A

Description

Block Engineering, Inc., 19 Blackstone Street, Cambridge(Mass.)/USA

Vorrichtung zur Feststellung submikrometriseh bemessener Partikel

Die Erfindung bezieht sich auf optische Systeme, insbesondere zur Auffindung und Klassifikation submikr©metrisch bemessener Partikel, z.B. von Viren, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind.

Das Auffinden und die Klassifizierung von submikrometriseh bemessenen Partikeln, insbesondere von Viren, wird seit langer Zeit als wichtige Aufgabe anerkannt, jedoch ist die Lösung durch eine Vielzahl schwerwiegender Probleme erschwert. Ein vielversprechendes Verfahren zur Lösung der gestellten Aufgabe ist in der KT-OS 24 46 0J2 der Anmelderin beschrieben. Hierbei wird ein Phänomen benutzt, das Phänomen, welches unter der Bezeichnung "Vielfachabschwächungstotalreflexion" (ATR-Phänomen).

Dieses ATR-Phänomen tritt auf, wenn ein Lichtstrahl der ein erstes Medium mit einem gegebenen Brechungsindex durchläuft, auf eine Zwischenfläche zwischen dem ersten Medium und einem zweiten Medium auftrifft, das einen unterschiedlichen Brechungsindex besitzt, wobei der Einfallwinkel größer ist als der kritische Winkel. Ih derartigen Fällen tritt gemäß dem Gesetz von Snell eine Totalreflexion des Lichtstrahls ein. Außerdem erzeugt der einfallende Strahl auch in dem zweiten Medium eine Welle mit inhomogener optischer Oberfläche. Diese letztere Welle wird als "abklingende Welle" oder ^inhomogene Welle"·

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bezeichnet und sie breitet sich parallel zur Reflexionszwischenfläche aus und ihre Feldstärke schwächt sich exponentiell in einer Richtung normal zu dieser Zwischenfläche ab. Wenn das zweite Medium nicht absorbierend ist, kehrt die Energie der abklingenden Welle schließlich nach dem reflektierten Strahl in dem ersten Medium zurück, wodurch die Reflexion tatsächlich total wird. Wenn das zweite Medium dagegen absorbierend ist, dann wird ein Teil der abklingenden Wellenenergie absorbiert und die Reflexion ist nicht exakt total. Das gleiche Phänomen tritt auf, wenn das Licht einen Wellenleiter oder einen Lichtleiter, z.B. einen Film von lichtdurchlässigem Material durchläuft, dessen Dicke etwa in der Größenordnung der Lichtwellenlänge liegt. Für die Zwecke vorliegender Beschreibung soll jedes System, bei welchem dieses ATR-Phänomen auftritt, wenn Licht hindurchläuft, als "Zelle mit totaler innerer Reflexion" bezeichnet werden. Dieses ATR-Phänomen wird seither im großen Umfange bei analytischen Systemen benutzt, wie dies in dem Buch von N.J. Harrick "Internal Reflection Spectroscopy" New York, Interscience, I967 beschrieben ist. Das ATR-Phänomen in Lichtleitern und Systemen zur Kopplung solcher Lichtleiter an Lichtquellen ist beschrieben von P.K. Ten in "Light Waves in Thin Films and Integrated Optics", Applied Optics, November I97I, Seiten 2395-2413.

Gemäß der Erfindung wird ein Medium anfangs so präpariert, daß die Population auf die erwünschten Partikel begrenzt wird. So wird beispielsweise ein biologisches Strömungsmedium mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbt, der selektiv an alle Nukleinsäure enthaltende Partikel und Moleküle gekuppelt ist. Die auf diese Weise eingefärbten Partikel umfassen ganze Zellen, Mitochondrien, Chromosome, Ribosome, Messenger und Übergangsribonukleinsäure (RNA), sowie auch Viren. Die ersten drei, die sehr viel größer sind als selbst die größten Viren, können wirksam durch Filterung des Mediums durch ein milliporöses Filter zurückgehalten

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werden. Die letztgenannten beiden, die ein sehr viel kleineres Molekulargewicht haben als die kleinsten Viren, können vollständig durch schnelle Dialyse in einer Hohlfaser eliminiert werden. Auf diese Weise wird ein Objekt vorbereitet, bei dem die einzigen fluoreszierenden Partikel Viren, Ribosomen, die größten Messenger RNA und einige Fragmente größerer Partikel sind.

Dieses Objekt wird so angeordnet, daß eine Zwischenfläche mit einer total innen reflektierenden Zelle geschaffen wird, und eine Erregungsstrahlung auf ein Ende der Zelle gerichtet wird, wodurch eine erregte Zone oder ein Bereich in dem Objekt erzeugt wird. Dadie Braun¹sehe Bewegung die Partikel durch diesen Bereich oder das Sichtfeld (dies kann als ATR-Aperturblende bezeichnet werden) hindurchtreten läßt, findet eine im wesentlichen vollständige Modulation der Partikelemission über einigen wenigen hundert 8 der Bewegung statt. Die Schärfe der Grenze des Bereiches ist derart, daß die Modulationsfrequenzen, die durch Autokorrelation des äußeren Randstörpegels im Signal erhalten werden von 0 bis 1 kHz gehen, wenn die Virusgrößen 180 bis 5500 8 beträgt.

Wenn nun in einer geeigneten Instrumentenschaltung die log-log-Pourier Transformation der Autokorrelationskurve der Durchschnittswechselstromkomponente des fluoreszierenden Signals berechnet wird, kann man eine gerade Liniendarstellung erlangen, deren Anstieg proportional zu dem hydrodynamischen Radius der Partikel ist, und deren Abschnitt proportional zu dem Produkt von Partikelkonzentration mal Nukleinsäure-Partikelgehalt ist.

Wie in der genannten DT-OS beschrieben, ist die Intensitäts-Modulation, die von jedem Partikel bei der Bewegung in die ATR-Aperturblende hinein und aus dieser heraus erzeugt wird, eine Funktion, die wenigstens zum Teil abhängig ist von der Amplitude der Fluoreszenz-Emission des Partikels. Weil eine gegebene

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Spezies von Partikeln durch die Identifizierung der charakteristischen Punktion durch die Fourier-Analyse erkannt werden soll, ist es klar, daß es höchst erwünscht ist die Verteilung der Erregungsstrahlung so gleichförmig als möglich über das gesamte Sichtfeld bzw. die Aperturöffnung des Systems zu machen, in die die Partikel sich infolge der Braun¹sehen Bewegung hinein bzw. herausbewegen.

Im allgemeinen bewirkt sowohl eine Absorption im Übertragungsmedium als auch die Streuung durch kleine Teilchen eine Schwächung sowohl des eine total innen reflektierende Zelle durchlaufenden Strahles und der einem solchen Strahl zugeordneten abklingenden Welle. Eine solche Abschwächung führt zu einer ungleichförmigen Verteilung der Intensität der abklingenden Welle in der ATR-Aperturöffnung, was zu einer unerwünschten stellungsabhängigen Änderung der Amplitude der Fluoreszenz-Emission durch einander identische Teilchen führt. Eine solche Stellungsänderung in der Emissionsamplitude bewirkt eine Beeinträchtigung der Präzision einer Fourier-Analyse, insbesondere wenn das Objekt eine sehr niedrige Konzentration der gewünschten Partikelpopulation besitzt. Um einen solchen Effekt zu vermeiden, kann man natürlich die seitlichen Abmessungen der Blendenöffnung auf einen sehr kleinen Wert begrenzen, so daß die Intensitätsverteilung nicht mehr merklich schwankt, in Abhängigkeit von der Lage innerhalb der Aperturöffnung, aber eine solche Größenbegrenzung ist unerwünscht, weil hierdurch die Objektfrequenz vermindert wird.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die oben erwähnten Schwierigkeiten zu vermeiden und ein System zu schaffen, das eine relativ gleichförmigere Beleuchtung zwischen den Punkten gewährleistet, an denen die Erregungsstrahlung in eine Zelle eintritt und die Punkte an denen sie die Zelle verläßt.

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Weiter bezweckt die Erfindung die Schaffung eines verbesserten Systems, bei dem eine größere beleuchtete Fläche für Analysezwecke ausgenutzt werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein verbessertes System der beschriebenen Bauart zu schaffen, welches einen variablen Eindringwinkel der Erregungsstrahlung in die Zelle ermöglicht, in dem einfach eine oder mehrere der verschiedenen Elemente des Systems längs der optischen Achse des Systems verschoben wird.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine verbesserte Vorrichtung zu schaffen, um genau submikrometrisch bemessene Partikel durch eine Fourier-Analyse mit einer größeren beleuchteten Oberfläche festzustellen.

Die gestellte Aufgabe wird durch ein System gelöst, welches eine innen total reflektierende Zelle aufweist, wobei Mittel vorgesehen sind, die Strahlung wenigstens einer gewählten Wellenlänge liefert, die längs mehreren Pfaden gerichtet wird, und Mittel vorgesehen sind, um die Strahlung von wenigstens zwei der Pfade in einen ersten und zweiten gegenüberliegenden Abschnitt der Zelle einzuführen, so daß der Beleuchtungspegel der Zelle an allen Punkten zwischen den gegenüberliegenden Abschnitten etwa gleich ist. Außerdem sind Mittel vorgesehen, um den Eindringwinkel der Erregerstrahlung in die Zelle zu ändern.

Nachstehend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der Zeichnung beschrieben. In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 eine teilweise schematische Seitenansicht einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung;

Fig. 2 eine teilweise schematische Schnittansicht des Objekthalters der Ausführungsform nach Figur 1;

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Fig. 5 eine teilweise schematische Schnittansicht einer abgewandelten Ausführungsform des Objekthalters;

Fig. 4 eine teilweise schematische Seitenansicht einer abgewandäLten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;

Fig. 5 eine schematische Draufsicht der beleuchteten Fläche der Zellen des Ausführungsbeispiels nach Figur 1;

Fig. 6 eine schematische Draufsicht der beleuchteten Fläche der Zelle nach dem Ausführungsbeispiel gemäß Figur 4.

In der Zeichnung bezeichnen gleiche Bezugszeichen einander entsprechende Teile.

Figur 1 der Zeichnung zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, wo die Prinzipien der Erfindung verkörpert sind und hier ist ein Objekthalter 22 vorgesehen, der durch ein Beleuchtungssystem 20 beleuchtet und durch ein Beobachtungssystem 24 beobachtet werden soll.

Das Beleuchtungssystem 20 weist vorzugsweise eine Quelle 26 auf, die einen Strahl 28 erzeugt. Dieser Strahl weist im typischen Fall die Strahlung einer gewählten Wellenlänge oder eines schmalen Wellenlängenbandes auf. Da die Erfindung nicht von der Doppler-Verschiebung abhängt und demgemäß keine kohärente Beleuchtung erforderlich ist, kann es zweckmäßig sein, den Erregerstrahl 28 in einem vergleichsweise schmalen Wellenlängenband vorzusehen, welches sich beträchtlich von den Wellenlängen der erregten Fluoreszenz-Emission unterscheidet. Deshalb kann die Strahlquelle im typischen Fall eine monochromatisches Licht erzeugende Quelle

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sein und es wird ein Spektralfilter 30 vorgesehen, um die gewünschten Wellenlängen auszuwählen. Vorzugsweise ist die Quelle 26 ein Laser, um einen monochromatischen Strahl hoher Intensität zu erzeugen. Dies ist ein höchst zweckmäßiges Merkmal im Hinblick auf die winzigen Abmessungen der aufzusuchenden Partikel. Wie aus der folgenden Beschreibung hervorgeht, können die räumlichen und zeitlichen kohärenten Aspekte eines Laserstrahls benutzt werden, um ein Interferenzmuster zu erzeugen, das als räumliches Filter wirken kann und nützlich ist, im Hinblick auf eine Intensitätsmodulation der fluoreszierenden Partikel. Die Quelle 26 kann nicht dargestellte Mittel aufweisen, um den Ausgangsstrahl 28 zu bündeln, falls die Strahlquelle 26 kein Laser ist, und diese Bündelung ist zweckmäßig um die Totalreflexion aufrechtzuerhalten.

Ein "Axicon" 32, d.h. ein konisches Brechungselement liegt mit seiner Umlaufachse parallel zum Strahl 28 und der Scheitel ist auf die Quelle 26 hin gerichtet. Wenn ein gebündelter, im wesentlichen monochromatischer Lichtstrahl ("Licht" welches in diesem Zusammenhang benutzt wird, soll auch ultraviolette sichtbare und infrarote Anteile des elektromagnetischen Spektrums umfassen) auf den Scheitel des Axicon 32 auftrifft, dann wird das Licht von dem Axicon längs einer Vielzahl von Pfaden mit gleicher Intensität gebrochen, um einen divergierenden Strahl 34 zu erhalten, welcher einen konischen Ring bildet. In dem Strahl 34 liegt ein Kondensor 36 derart, daß er den konischen Strahl 34 vorzugsweise in einen konvergierenden Ringstrahl 38 bricht. Der Kondensor 36 ist in der Zeichnung als einfache Miniskuslinse dargestellt, es ist jedoch klar, daß der Kondensor auch von anderen Linsen oder einer Kombination von Linsen oder Reflexionselementen gebildet werden kann, die einen divergierenden Ringstrahl des Lichtes in einen konvergierenden Lichtringstrahl brechen oder reflektieren. Im Pfad des Strahles 38 befindet sich ein Körper vorzugsweise in Gestalt einer ringförmigen spiegelnden Reflexions-

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oberfläche, die eine innere keg^.stumpfförmige Oberfläche 41 besitzt. Die Oberfläche 41 ist so angeordnet, daß sie wenigstens Teile des Strahles 38 in die innen total reflektierenden Zelle 44 richten kann, die einen Teil des Objekthalters 22 bildet.

Der Objekthalter 22 ist im einzelnen in Figur 2 dargestellt, und er besteht aus einer Zelle 44, die vorzugsweise einen optisch dünnen Wellenleiterfilm aufweist, der von einer transparenten Platte 42 getragen wird. Natürlich kann die Zelle 44 auch andere Gestalt als plattenartige Gestalt usw. aufweisen. Zur Erlangung einer abklingenden Welle an der interessierenden Zwischenfläche ist es Bedingung, daß die Zelle 44 einen optischen Pfad durch das Material liefert, das einen größeren Brechungsindex besitzt als der Brechungsindex des Mediums, welches sich auf der anderen Seite der interessierenden Zwischenfläche befindet. Der Brechungsindex der Zelle 44 muß also größer sein als der Brechungsindex der Platte 42, damit eine innere Totalreflexion durch den Film erfolgen kann. Das Material der Zelle 44 muß außerdem über den Wellenbereich des Erregungsstrahles transparent sein, und sollte geeignete physikalische und chemische Stabilität gegenüber der Erregerstrahlung und dem Medium aufweisen, welches im typischen Fall von einem Strömungsmittel gebildet wird, das benutzt wird, um eine Zwischenfläche mit der Zelle zu bilden. Unter diesen typischen Materialien, die für die Zelle 44 benutzt werden können, befinden sich Ein-Kristall-Filme, Gläser z.B. Kronglas und Fritfcglas, zu Quarz geschmolzenes Silicium, synthetische organische Polymerisate, z.B. Polystyrol, Polymethacrylat oder Polyurethan und dergleichen.

Die Zelle 44 ist auf der oberen Oberfläche 46 der Platte 42 abgelagert oder befestigt, um eine erste Zwischenfläche dazwischen zu bilden. Die Platte 42 und die Zelle 44 können verschiedene Gestalt annehmen, sie sind jedoch vorzugsweise wie aus Figur 2 ersichtlich, kreisförmig in Gestalt flacher Blattmaterialien

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ausgebildet. Die größten gegenüberliegenden Seiten oder Oberflächen 48 und 50 der Zelle 44 liegen im wesentlichen parallel zueinander. Die Oberfläche 48 steht mit der Oberfläche 46 der Platte 42 in Berührung. Im optimalen Falle sind die Oberflächen 48 und 50 der Zelle optisch eben, so daß der Lichtleckstrom in Folge geringer Uhregelmäßigkeiten vermindert wird, der bewirken könnte, daß der Einfallwinkel eines reflektierenden Strahles an der Fehlstelle den kritischen Winkel überschreiten könnte. Im typischen Fall wird die Platte 42 von einer im Durchmesser 2,5cm großen Silicium-Mikroskopscheibe von 1 mm Dicke gebildet. Die Zelle 44 kann eine Schicht mit einem Durchmesser von 2,5 cm aufweisen, deren Dicke grob von dem Wellenlängenband des Strahles 38 abhängt.

Um einen Strahl 38 von dem Teil 40 auf die Zelle mit dem kritischen Winkel zu richten, der zur totalen inneren Reflexion erforderlich ist, weist der Halter 22 weiter ein Koppelglied 52 auf. Vorzugsweise besteht das Koppelglied 52 aus einem kreisförmigen Prisma mit dreieckigem Querschnitt, deren diagonale Oberfläche 54 der reflektierenden Oberfläche 41 des Teiles 40 gegenüberliegt. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform nach Figur 1 und 2 ist das Prisma 52 an der unteren Oberfläche 47 der Scheibe 42 befestigt. Bei dieser Anordnung wird der Strahl 38 von der Oberfläche 41 durch das Koppelglied 52 durch die Scheibe 42 in die Zelle 44 reflektiert. Da keine Vorkehrungen erforderlich sind, um die Strahlung aus der Zelle 44 zu entkoppeln, wird die Strahlung schließlich durch die gegenüberliegenden Ränder der Zelle gestreut. Demgemäß können nicht dargestellte Lichtfallen vorgesehen werden, um die Erregerstrahlung aufzufangen, wenn sie aus der Zelle austritt, so daß sie nicht in das Beobachtungssystem 24 reflektiert wird.

Gemäß einer abgewandelten Ausführungsform der Erfindung, die in Figur 3 dargestellt ist, wird das Koppelglied 52 direkt an der

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Oberfläche 50 der Zelle 44 befestigt. Bei dieser Anordnung wird der Strahl 38 von der Oberfläche 41 direkt auf das Koppelglied 52 und dann in die Zelle 44 reflektiert.

Das Koppelglied 52 kann an der Scheibe 42 oder der Zelle 44 je nach dem in irgendeiner optisch geeigneten Weise befestigt werden, und vorzugsweise erfolgt eine Verkittung mit einem geeigneten optischen Kitt mit geeignetem Brechungsindex.

Um die Strömungsmittelobjekte aufzunehmen und die gewünschte Zwischenfläche mit der Zelle 44 zu bilden, weist der Halter 22 bei beiden Ausführungsformen gemäß Figur 2 und 3 außerdem eine Abdeckplatte 58 auf, die durch einen Abstandshalter 56 im Abstand über der Zelle 44 gehalten wird, um ein Volumen 60 zu bilden. Der Abstandshalter 56 besteht vorzugsweise aus einem Kreisring aus einem Material mit einem Brechungsindex, der wesentlich kleiner ist als der Brechungsindex der Zelle. Der Abstandshalter 56 ist an der Zellenoberfläche durch irgendein bekanntes Verfahren beispielsweise durch Verklebung des Ringes mit einem optischen Kitt befestigt. Die Abdeckplatte 58 besteht aus einem Material, welches gegenüber der fluoreszierenden Strahlung transparent ist, welche von den Partikeln des Strömungsmittelobjekts innerhalb des Volumens βθ emittiert wird und sich in der abklingenden Welle bewegt, die durch den Strahl 38 erzeugt wird.

Das Maß der Eindringtiefe einer abklingenden oder seitlichen Welle im Strömungsmedium des Volumens 60 kann zwischen einem Minimalwert, z.B· 1/20 der Wellenlänge und einem Maximum mehrerer Wellenlängen dadurch geändert werden, daß der Einfallwinkel des innerhalb der Zelle 44 mehrfach reflektierten Strahles geändert wird, insbesondere in der Nähe des kritischen Winkels. Dies kann dadurch bewerkstelligt werden, daß eine Zahnstangenanordnung (nicht dargestellt) benutzt wird, um das Axicon 32 und/oder den

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Kondensor J>6 relativ zueinander längs der optischen Achse zu verschieben. Eine derartige Bewegung führt zu einer Änderung des Konvergenzwinkels des Strahles 38, wodurch der Winkel geändert wird, mit dem der Strahl 38 in die Oberfläche 48 oder 50 der Zelle 44 eintritt. Wie erwähnt, ist es zweckmäßig, daß der Strahl 38 sowohl monochromatisch als auch gebündelt ist. Wenn eine solche Strahlung benutzt wird, ist es klar, daß man die Zelle 44 im Hinblick auf die wirksame Tiefe der abklingenden Welle dadurch abstimmen kann, daß der Strahl 38 in das Koppelglied 52 mit veränderbaren Winkeln eingeführt wird, ohne die chromatische Aberration zu berücksichtigen.

Gemäß einer abgewandelten Ausführungsform, die schematisch in Figur 4 dargestellt ist, wird das konische Axicon 32 durch ein dreieckiges prismatisches Element 32a ersetzt und der Kondensor 36 ist durch eine Zylinderlinse 36a ersetzt, während anstelle des Ringes 40 zwei flache reflektierende Elemente 40a und 40b benutzt werden und das Koppelprisma 52 durch zwei dreieckige Prismen 52a und 52b ersetzt ist. In einem solchen Falle werden nur zwei Eintrittsränder für die Zelle 44 benötigt, die beide vorzugsweise eben ausgebildet sind. Demgemäß kann die Zelle 44 bei dem Ausführungsbeispiel nach Figur 4 rechteckig sein. Das Prisma 32a liegt so, daß der Strahl 28 auf den Scheitel auftrifft, wodurch er in zwei im wesentlichen ebene Strahlen 34a und 34b gleicher Intensität aufgespalten wird. Jeder dieser Strahlen wird durch die zylindrische Linse 36a nach zwei reflektierenden Teilen 40a und 40b hin gebrochen, wo sie in die Zelle 44 hinein durch dreieckige Koppelprismen 52a und 52b eingekoppelt werden.

Das System 24 zur Beobachtung der Fluoreszenz-Emission des Objektes in dem Raum 60 kann von irgendeinem System gebildet werden, welches geeignet ist, den erregten Bereich zu beobachten. Allgemein umfasst das System 24 eine Optik mit einem Objektiv, das

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eines oder mehrere optische Elemente, z.B. brechende und reflektierende Elemente aufweisen kann. Das System 24 kann außerdem nicht dargestellte Mittel aufweisen, um das Objektiv 62 auf den im Erregungsbereich sich bewegende Partikel zu fokusieren, oder das System kann auch ein Fixfokussystem sein. So ist die erste konjugierte Ebene (d.h. die Objektebene) des Systems 24 im wesentlichen in der gleichen Ebene angeordnet wie der erregte Bereich oder die ATR-Blendenöffnung im Raum 60 oder sie kann in dieser Ebene angeordnet werden, durchlaufen von einer abklingenden Welle die gemäß dem Durchtritt des Erregerstrahls 38 durch die Zelle 44 durch mehrfache Totalreflexion erzeugt wurde.

Gemäß einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist außerdem ein Spektralfilter 64 vorgesehen, das dazu dient, die wirksamen Spektralbänder zu begrenzen, die vom Detektor 68 erkannt werden, so daß das System 24 unter verschiedenen Fluoreszenzbändern unterscheiden kann, die von Partikeln herrühren, welche Affinitäten für unterschiedliche Farbstoffe besitzen. Es ist z.B. bekannt, daß Viren im wesentlichen entweder aus Deoxyribonukleinsaure oder aus Ribonukleinsäure bestehen und gewöhnlich von einer Proteinschale umgeben sind, und daß derartige Nukleinsäuren durch gewisse Farbstoffe eingefärbt werden können, die jeweils ein charakteristisches Fluoreszenz-Emissionsspektrum liefern, welches jeweils von einem anderen unterscheidbar ist.

Eine Beobachtung der Intensitätsmodulation der fluoreszierenden Partikel dient zur Unterscheidung virenartiger Partikel vom Hintergrund und es wird eine nützliche Virenklassifikationsbeschreibung geliefert. Ein nicht dargestelltes räumliches Filter kann demgemäß in der Ebene des Objektes abgebildet werden, das in dem Raum angeordnet ist. Das räumliche Filter kann vor dem Halter 22 angeordnet werden, und es kann z.B. im Strahl 38 liegen oder der Halter kann vor dem räulichen Filter im Lichtpfad

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liegen. Im letzteren Fall wird das Objekt in typischer Weise auf das Filter durch das Objektiv 62 abgebildet. Die räumlichen Filter sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Optik bekannt und sie können aus einer einzigen Aperturblende oder aus einem Filter mit einer "Vielzahl von Aperturblenden bestehen und sie können die Gestalt von Gittern, Ringen oder dgl. haben. Jeweils wird ein Rand oder es werden mehrere Ränder zwischen einem relativ lichtdurchlässigen Element und einem relativ nicht durchlässigen Element definiert. Es ist klar, daß bei Bewegung eines Partikels infolge Braun¹scher Kräfte oder wenn das Bild des Objekts den Rand des räumlichen Filters nach einer lichtdurchlässigen Fläche kreuzt, der Detektor 68 jenes Partikel als Lichtausbruch oder als Skintillation erkennt. Wenn der Partikel den Rand nach einer nicht durchlässigen Fläche kreuzt, wird der Lichtausbruch ausgelöscht. Demgemäß wird unter der Annahme, daß ein Partikel in gerader Linie über ein Gitter wandert, die beobachtete Intensität der Emission von dem Partikel zwischen einem Maximalwert und einem Minimalwert mit einer Frequenz geändert, die vom Gitterabstand und der Partikelgeschwindigkeit abhängt. Theoretisch sollte im Sinne einer optimalen Modulation und Sicherheit der Gitterabstand wenigstens in der Größenordnung der Partikelgröße angepaßt sein. Die ATR-Aperturblende, die durch die Erfindung vorgesehen wird, kann so angepaßt werden. Wie oben erwähnt, wird wenn die Quelle 26 ein Laser ist, der räumlich kohärente Strahl 28 durch das Axicon 32 und den Kondensor 38 längs mehrerer Pfade gebrochen, wo eine Kopplung in die Zelle 44 hinein erfolgt. Da die Strahlung in gegenüberliegende Punkte der Zelle eingekoppelt und aufeinander zu reflektiert wird, führt die räumliche und zeitliche Kohärenz des Strahles möglicherweise zu einem Interferenzmuster, das hellere und dunklere Zonen zur Folge gehabt hat. Derartige Zonen teilen ihrerseits die ATR-Apertürblende wie ein zweites orthogonales Raumgitter, wodurch eine andere Modulationsordnung geschaffen wird.

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Während des Betriebes trifft bei dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 bis 3 ein monochromatischer Strahl 28, der durch Licht von der Quelle 36 und das Filter 30 erzeugt wird, auf den Scheitel des Axicons 32, worauf der Strahl 28 in den Strahl 3^ gebrochen wird. Der Strahl 34 wird durch den Kondensor 36 auf den ringförmigen Reflexionskörper 4o gerichtet, der den Ringstrahl 38 nach dem ringförmigen Koppelprisma 52 spiegelt. Dann wird der Strahl 38 in die Zelle 44 unter einem Winkel eingeführt, der größer ist als der kritische Winkel, so daß eine Mehrfachtotalreflexion im Inneren erfolgt. Wie in Figur 5 dargestellt, zeigt sich, daß da der Strahl 38 gemäß der bevorzugten Ausführungsform ringförmig und an ein Ringprisma gekoppelt ist, der Strahl in die Zelle 44 über den gesamten Umfang eintritt, der durch das Prisma gegeben ist. Der Strahl wird innen durch die Zelle von jedem Punkt des Umfanges des Prismas über dessen Zentrum nach der diametral gegenüberliegenden Seite des Prisma reflektiert, wo er dann von der Zelle entkoppelt werden kann. Wenn ein Teil des Strahles 38 an einem Punkt A des Umfanges eintritt, wird er innen von dem Punkt A nach dem diametral gegenüberliegenden Punkt B reflektiert und er wird infolge Absorption, Streuung und dergleichen abgeschwächt. Wenn die Abschwächung der Beleuchtung die Umkehr der Abschwächung der Beleuchtung ist, wenn der Strahl von dem Punkt B nach dem Punkt A gelangt, dann ist die Summe der beiden Strahlen an allen Punkten zwischen A und B im wesentlichen eine Konstante.

Das gleiche tritt bei dem Ausführungsbeispiel nach Figur 4 ein, wie dies in Figur 6 veranschaulicht ist.

Da die durch den Strahl 38 erzeugte abklingende Welle parallel zur oberen Oberfläche 50 der Zelle 44 fortschreitet, wird sie exponentiell im Medium im Raum 60 von der Zwischenfläche zwischen dem Medium und der oberen Oberfläche abgeschwächt. Die Braun¹ sehe Bewegung kleiner Partikel bewegt diese Partikel in den Bereich

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im Medium dieser Schicht hinein und aus diesem heraus indem die abklingende Welle eine beträchtliche Feldstärke besitzt, was zu einer Strahlungsemission führt, und zwar entweder durch Streuung der abklingenden Welle durch die sich bewegenden Partikel, oder durch Fluoreszenz, die in den Partikeln durch die abklingende Welle erregt wird. Die Emission der Partikel wird moduliert, d.h. scheint zu skintillieren, wobei die Skintillationsdauer durch die Länge der Zeit erzeugt wird, während der die Partikel in dem Erregungsbereich innerhalb des Mediums verbleiben. Die Partikel außerhalb des Erregungsbereiches werden natürlich keine geeignete Strahlung emittieren und sie bleiben deshalb unsichtbar.

Die von den erregten Partikeln im Objekt emittierte Strahlung durchläuft das Filter 64 über eine Feldbegrenzung 66, worauf die Strahlung auf den Detektor 68 trifft. Die Begrenzung 66 ist bekannt und wird allgemein einfach dazu benutzt, das Ausmaß des Objektes oder Feldes zu bestimmen oder zu begrenzen, das durch den Detektor 68 erkannt wird. Der Detektor 68 kann von bekannter Bauart sein, und besitzt eine spektrale Empfindlichkeit, und er kann auch als Intensitätsdetektor ausgebildet sein, und vorzugsweise wird eine Photovervielfacherröhre bekannter Art benutzt. Die elektrischen Ausgangssignale vom Detektor 68 können verstärkt und einem bekannten, nicht dargestellten Frequenzanalysator zugeführt werden. Der Frequenzanalysatorausgang kann einem nicht dargestellten Datengerät zugeführt werden, welches ein Streifenkartenaufzeichner und/oder ein Computer sein kann.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. System mit einer innen total reflektierenden Zelle und einer Strahlquelle wenigstens einer gewählten Wellenlänge,

dadurch gekennzeichne t, daß Mittel (32) vorgesehen sind, um die Strahlung längs einer Mehrzahl von Pfaden (34) zu richten, und daß weitere Mittel vorgesehen sind, um die Strahlung in wenigstens zwei dieser Pfade an einem ersten und einem zweiten gegenüberliegenden Abschnitt der Zelle (44) einzuführen, wodurch der Pegel der Beleuchtung innerhalb der Zelle an allen Punkten zwischen den einander gegenüberliegenden Abschnitten etwa ausgeglichen wird.

2. System nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Richten der Strahlung ein Axicon (32) aufweisen, dessen Scheitel nach der Strahlquelle (26) hin gerichtet ist, so daß der Strahl zu einem konischen Ringstrahl (38) gebrochen wird.

3· System nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlrichtmittel ein Prisma (32) aufweisen, dessen Scheitel nach der Strahlquelle (26) derart gerichtet ist, daß der Strahl (38a, 38b) längs zweier Pfade aufgespalten wird.

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4. System nach Anspruch 2,

dadurch gekennzeichnet, daß Mittel vorgesehen sind, um den Konuswinkel des konischen Ringstrahles zu ändern.

5. System nach Anspruch 4,

dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Veränderung des Winkels einen Kondensor (36) aufweisen, der zwischen dem Axicon (32) und der Vorrichtung zum Einleiten angeordnet ist, und daß Kondensor (36) und/oder Axicon (32) relativ zueinander beweglich sind, so daß der Konuswinkel des konischen Ringstrahles geändert wird.

6. System nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Einführung des Strahles wenigstens ein Prisma (52) umfassen.

7. System nach Anspruch 6,

dadurch gekennzeichn et, daß das Prisma (52) als Torus ausgebildet ist und dreieckigen Querschnitt besitzt.

8. System nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Einführung des Strahls zwei langgestreckte prismatische Elemente (52a, 52b) aufweisen, die beide einen dreieckigen Querschnitt besitzen.

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9. System nach Anspruch 8,

dadurch gekennzeichnet, daß Mittel (40) vorgesehen sind, um die Strahlung zu reflektieren und daß diese Mittel im Abstand von den prismatischen Elementen so angeordnet sind, daß die Strahlung auf die prismatischen Elemente von der Strahlrichteinrichtung eingespiegelt werden.

10. System nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlung in den beiden Pfaden (38, 38a, 38b) räumlich und zeitlich kohärent ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 1,

zur Peststellung suhmikrometrisch bemessener Partikel in einem Strömungsmedium, dadurch gekennzeichnet, daß eine total innen reflektierende Zelle (44) vorgesehen ist, die wenigstens teilweise durch eine Zwischenfläche (60) mit dem Medium verbunden ist, und daß eine optische Bilderζeugungsvorrichtung vorgesehen ist, um die Partikel in einer ersten konjugierten Ebene zu beobachten, die im wesentlichen mit dem Bereich des Mediums zusammenfällt, der von einer abklingenden Welle durchlaufen ist, die nach innerer Reflexion der Strahlung der zwei Strahlungspfade innerhalb der Zelle erzeugt wird.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichn et, daß die Strahlrichteinrichtung Mittel aufweist, um einen ringförmigen Strahl (38) zu erzeugen.

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13. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel vorgesehen sind, um den Einfallwinkel zu ändern, mit der die Strahlung in wenigstens zwei Pfaden auf die Zelle gelangt, so daß das Eindringen der abklingenden Welle geändert werden kann.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Änderung des Winkels und des Eindringens einen Kondensor (36) aufweist, der optisch zwischen der Strahlrichteinrichtung und den Mitteln zur Einführung des Strahles angeordnet ist, und daß der Kondensor und die Strahlrichtmittel relativ zueinander beweglich sind, so daß die Richtung der wenigstens zwei Strahlpfade veränderbar ist.

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