DE2649902A1

DE2649902A1 - Verfahren zur hochempfindlichen szintillationsautoradiografie

Info

Publication number: DE2649902A1
Application number: DE19762649902
Authority: DE
Inventors: Brian G M Durie; Sydney E Salmon
Original assignee: University Patents Inc
Current assignee: University Patents Inc
Priority date: 1975-10-30
Filing date: 1976-10-29
Publication date: 1977-05-18
Also published as: DE2649902C3; GB1519268A; FR2347687A1; US4035155A; DE2649902B2; FR2347687B3

Description

Verfahren zur hochempfindlichen Szintillationsautoradiografie

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hochempfindlichkeitsautoradiografie und insbesondere ein Autoradiografxeverfahren, bei welchem kritische, biologische Substanzen wie DNS, EHA oder Hormone radioaktiv mit Tritium (H-3) markiert sind.

Die Autoradiograf ie ist eine Arbeitsweise, um in lebenden Zellen ö-ie Bewegung oder den Ort eines mit einem radioaktiven Isotop markierten Bestandteiles oder Baublockes einer Verbindung, welcherfür das Leben und die Funktion der Zelle wesentlich ist, wie ESA, EHA oder eines Enzyms, zu verfolgen. Der mit dem radioaktiven Isotop markierte Bestandteil oder Baublock wird während der üblichen Funktion der Zelle in einen wesentlichen Zellbestandteil wie BNA, DNA oder ein Enzym eingebaut. Die Einbaugeschwindigkeit des markierten Baublockes oder Bestandteiles in die Zelle ist ein Maß der Aktivität dieser Zelle, welches eine wertvolle, physiologische, für die klinische Untersuchung und die Medizin wertvolle Information liefert.

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Zu den wichtigen Zellbestandteilen, die in dieser Weise verfolgt werden können, gehören DHA und HKA. Die Geschwindigkeit der Bildung von DFA oder ERA in einer lebenden Zelle ist ein Maß der physiologischen Aktivität dieser Zelle und liefert Daten, die anzeigen können, ob diese Zelle normal oder abnormal ist. Beispielsweise besitzen Zellen von aalignen Geweben abnormale Wachstumskinetik und können einen gestörten DHA- und/oder ΕΝΑ-Umsatz haben. Durch Messung der Bildung von DHA oder EHA über einen mit einem radioaktiven Isotop markierten Bestandteil von DUA oder EHA wie tritiiertes Thymidin oder tritiiertes Uridin ist es möglich, die Aktivität der Zelle zu bestimmen und auf diese Weise brauchbare Informationen zu erhalten, welche die Feststellung ermöglichen, ob die Zelle maligne oder normal ist und, falls es eine maligne Zelle ist, ob sie auf eine chemotherapeutische Behandlung anspricht.

Die Autoradiografie ermöglicht einem Physiologen beispielsweise die Feststellung, welche Zellen eines Gewebes DHA oder EHA mit normaler oder großer Geschwindigkeit synthetisieren, und wieviel von diesen Materialien pro Zelle produziert wird. Aus solchen Daten ist die Bestimmung möglich, ob das die Zellen enthaltende, untersuchte Gewebe auf eine Chemotherapie, welche das Zellenwachstum stört, anspricht.

Bei der praktischen Durchführung der Autoradiografie werden die untersuchten Gewebe bis zu einer Suspension von lebenden Zellen aufgebrochen bzw. zerkleinert. Die untersuchte Suspension der Zellen wird mit dem tritiierten Isotop wie tritiiertem Thymidin oder tritiiertem TJridin inkubiert. Die Synthese von DHA oder EHA durch solche Zellen kann in Werten der Geschwindigkeit und der Menge des eingebauten Isotops bestimmt werden. Die DHA oder EHA, welche das radioaktive Thymidin

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oder Uridin enthalten, werden auf diese Weise mit einem radioaktiven Isotop (Tritium) markiert und können über normale, physiologische Prozesse mittels Arbeitsweisen des radioaktiven Nachweises verfolgt oder nachgewiesen werden. Durch solche Arbeitsweisen ist es möglich, genaue Daten hinsichtlich der Produktion von DNA oder ENA durch die untersuchten Zellen zu erhalten. Dieselben Arbeitsweisen können bei der Untersuchung der Kinetik von anderen Zellbestandteilen angewandt werden.

Aufgabe der Erfindung ist ein hochempfindliches Autoradiograf ieverfahren, welches es dem Physiologen erlaubt, Daten über das Wachstum oder die Produktion von DHA oder anderen, lebenswichtigen, physiologischen Bestandteilen von lebenden Zellen wie ΕΝΑ und Hormonen oder Enzymen in einer sehr viel kürzeren Zeitspanne zu erhalten, als dies bislang möglich war.

Bei dem erfindungsgemäßen Autoradiografieverfahren werden tritiiertes Thymidin mit hoher spezifischer Aktivität (40 bis 60 Ci/mMol) und eine Kernspuremulsion, imprägniert mit einem flüssigen Szintillator, verwendet, um eine sehr rasche Methode zur Bestimmung des Markierungsindex und der Wachstumsfraktion von Zellsuspensionen zu erhalten. Die Exposition der Emulsion bei niedrigen Temperaturen (-20 ⁰C bis -85 ⁰C) für 20 - 60 Minuten ist für ein ausgezeichnetes Markieren ausreichend, so daß die Durchführung einer raschen, klinischen Entscheidung möglich wird. Expositionszeiten für Forschungsarbeiten, welche ein Markieren mit sehr niedriger Energie erfordern, können beträchtlich abgekürzt werden, z. B. von sechs Monaten auf zwei Wochen oder weniger. Diese Arbeitsweise besitzt daher eine große Anwendbarkeit in der Biologie und der Medizin.

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Durch diese rasche Technik ist es möglich, einen Patienten zu untersuchen, die Bate der Zellfunktion in einem spezifischen Gewebe zu bestimmen und eine chemotherapeutische Behandlung zu empfehlen, wobei dies alles am gleichen Tag geschehen kann. Dies ist besonders wichtig bei Patienten, die an malignen Tumoren leiden.

Die Entwicklung der Hochempfindlichkeitsautoradiografie gemäß der Erfindung umfaßt daher die Verwendung -von tritiierten (radioaktiven) Verbindungen wie Thymidin oder TTridin,

mit
wobei das Tritium/einerhohen spezifischenAktivität im Bereich von 40-60 oder mehr Curie pro Millimol vorliegt, kombiniert mit einem Plüssigkeitsszintillatormedium, wobei der Effekt hiervon bei niedrigen Temperaturen (-20 ⁰C bis -80 ⁰C) gefördert wird. Durch diese Technik ist es möglich, eine ausgezeichnete Markierung mit Tritiumverbindungen in einer Stunde oder weniger zu erhalten, so daß eine rasche klinische Bestimmung und Entscheidung über die Therapie möglich wird, so daß das erfindungsgemäße Verfahren eine breite Anwendbarkeit in der Biologie und Medizin besitzt.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnung näher erläutert. Die Fig. 1 und 2 sind Diagramme, welche die Aktivität von mittels Hochempfindlichkeitsautoradiografie (HSAEG) gemäß der Erfindung untersuchten Zellen im Vergleich zu der Aktivität von Zellen bei der konventionellen Autoradiografie (AEG) erläutern. Die Prozentsätze der markierten Zellen, welche die Ablagerung von Silberkörnern hervorrufen, sind gegen die Expositionszeiten in jedem Diagramm aufgetragen. Hieraus ist ersichtlich, daß bei der erfindungsgemäßen BBAEG brauchbare Daten sehr viel rascher als bei der AEG gemäß Stand der Technik erhalten werden.

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Im folgenden wird die Erfindung näher erläutert. Bei der konventionellen Autoradiografie zur Bestimmung des Markierungsindex und der Wachstums fraktion sind wenigstens sechs Tage bis zum ATbseliliiß erforderlich. Durch Verwendung von tritiiertem Thymidin von iioher spezifischer Aktivität (40 - 60 Ci/mMol), eines IFliissIgkeitsszintillators und einer Emulsionsexposition bei niedriger· !temperatur (-20 ⁰C bis -85 °C) wurde ein Verfahren zur Szlntlllationsautoradiografie höchster Empfindlichkeit entwickelt» Unter Anwendung dieser Techniken können Proben von frischem BIiIt₁ Knochenmark und Tumor ζ eilen verarbeitet werden, um die Ergebnisse einer Thymidinmarkierung innerhalb von fünf Stunden zu liefern.

Die Aktivierung von Silberkristallen in der fotografischen Emulsion,, welche bei der Autoradiografie verwendet wird, hängt von der Anzahl und der Energie der die Emulsion durchdringenden ß-Strahlen ab. Bei der üblichen AEG ist das Ausmaß der ß-Emission relativ niedrig. Mit einem Isotop von sehr hoher spezifischer Aktivität wie dem bei der Erfindung verwendeten, tritiierten Thymidin, gibt es jedoch sehr viel mehr ß-Emissionen pro Molekül des eingebauten Isotops. Wenn die Emulsion zusätzlich mit einem Szintillator imprägniert wird, werden Photonen freigesetzt, wenn die Elektronen (ß-Teilchen) durch den Szintillator durchtreten, und hierdurch werden noch mehr Silberkristalle in der Emulsion aktiviert. Eine erhöhte Empfindlichkeit ist von einer geringen Zunahme der Streuung der Emissionen begleitet. In der Praxis ist diese Streuung jedoch minimal und beeinträchtigt die Interpretation der Daten nicht negativ.

Mit Heparin versetzte Zellsuspensionen werden für eine Stunde mit tritiiertem Thymidin hoher spezifischer Aktivität inkubiert. Vorzugsweise werden 5₅O pCi/ccm zu Zellsuspensionen mit 0,5 1,0 χ 10 Zellen/ccm zugesetzt. Dann wurden Gytozentrifugenschmieppräparate auf mit Gelatine beschichteten Objektträgern

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hergestellt und mit Methanol fixiert. In der Dunkelkammer werden die Objektträger bzw. Präparate zuerst für zehn Sekunden in einer Kernspuremulsion (HTB 3₅ Eastman Kodak Co.) bei 42 ⁰G eingetaucht. Nach dem Trocknen für annähernd 1 Stunde werden die Objektträger als nächstes für zehn Sekunden in die Szintillatorlosung eingetaucht. Die bevorzugte Szintillatorlosung umfaßt eine Kombination von 2,5-Diphenyloxazol (PFO) und 1,4-Bis-(4-methyl-5-phenyloxyzol-2-yl)-benzol (Dimethyl-POPOP), aufgelöst in Dioxan. Die mit dem Szintillator imprägnierte Emulsion wird in der Dunkelheit für 20 bis 60 Minuten belichtet. Die Objektträger werden dann bei 17 °C in üblicher Weise entwickelt. Die Schmierfilme der zentrifugierten Zellen werden direkt durch die Emulsion mit gepufferten Giemsa-Farblösungen angefärbt.

Die verschiedenen Stufen bei der eventuell erfolgreichen Arbeitsweise wurden getrennt untersucht und analysiert. Lymphocyten, die in vitro mit Phytohaemagglutinin stimuliert waren, wurden als zuverlässige Quelle für hochmarkierte Zellen verwendet.

Unter Verwendung von tritiiertem Thymidin hoher spezifischer Aktivität wurden mehrfach Experimente unter Exposition der Objektträger für Λ bis 24 Stunden mit und ohne Überziehen mit der Szintillatorlosung durchgeführt. Die 3Tig. 1 zeigt den Einfluß des Szintillators. Beinahe eine maximale Markierung wurde in 5 Stunden erreicht, und in nur einer Stunde wurden nahezu 75 % der Endmarkierung erreicht. Doppelte und dreifache Proben zeigten übereinstimmend ein rascheres Markieren mit der Szintillatorlosung (P<0,05 für Zeitpunkte bei 1 und 5 Stunden). Bei zusätzlichen Untersuchungen wurden die Emulsionsexposition auf sechs Tage verlängert, und die Endmarkierung wurde mit der Markierung bei Anwendung von tritiiertem Thymidin geringerer spezifischer Aktivität (2 Ci/mMol) verglichen. Die

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Endmarkierung wurde gegebenenfalls bei der gleichen Anzahl von Zellen nachgewiesen, welche beträchtlich früher unter Verwendung der schnellen Arbeitsweise identifiziert wurden. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach der Inkubation mit dem Isotop untersucht, wobei gefunden wurde, daß sie wesentlich größer als 95 % war.

Die Anzahl der Körner/Zelle wurde durch die Verwendung des Szintillators stark erhöht. Bei der Hochempfindlichkeitsautoradiografie hatten 50 % der Zellen mehr als 15 Körner pro Keim in fünf Stunden. Die Untergrundmarkierung war bemerkenswert niedrig, selbst bei Expositionszeiten von sechs Tagen. Für Zeitpunkte bis zu 24 Stunden betrug die mittlere Anzahl der Untergrundkörner 38 Körner pro 100 Zellen mit einem Maximum von 65 Körnern pro Hundert Zellen. Aus dem Wahrscheinlichkeitsgesetz von Poisson ergibt sich nur eine 0,05 %ige Wahrscheinlichkeit, daß der Untergrund für mehr als 4 Körner pro Zelle verantwortlich sein könnte. Daher wurden fünf oder mehr Körner pro Zelle als definitive Markierung bei dieser Arbeitsweise angesehen.

Es ist bekannt, daß die Temperatur die Fluorografie bei der Dünnschichtchromatografie mit Tritiumverbindungen beträchtlich beeinflußt. Es wurde hierfür angenommen, daß die Möglichkeit der Schwingung von Molekülen bei niedrigen Temperaturen "eingefroren wird" und daher Energie in die Photonenemission geht, die sonst durch die statistische Bewegung verloren ginge. Es wurde der Einfluß der Temperatur auf die Hochempfindlichkeitsautora diograf ie untersucht. Temperaturen zwischen 17 ⁰C und -196 ⁰C wurden angewandt. Ein frühes Markieren wurde deutlich gefördert, wenn die Exposition der Emulsion bei niedrigen Temperaturen zwischen -20 ⁰C bis -85 ⁰C ermöglicht wurde. Ein weiteres Abkühlen ergab eine unter dem Optimalwert liegende

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Markierung und führte zusätzlich zu einer Neigung zur Rißbildung der Emulsion. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IA angegeben. Bei 0,5/uCi/ccm waren -85 ⁰C die optimale Temperatur für das Markieren.

Der Einfluß von Szintillator und Temperatur sind bei geringen Werten des Isotopeneinbaues und der ß-Emission am stärksten ausgeprägt. Durch Erhöhung der Dosis von mit der Zellsuspension in vitro inkubiertem, tritiiertem Thymidin auf 5-10/uCi/ccm konnte ein rasches, maximales Markieren in einfacher Weise erreicht werden. Die Ergebnisse der Dosisversuche sind in den Tabellen IB und II zusammengestellt. Mit 5-10/uCi/ccm konnte ein maximales Markieren in 20 bis 60 Minuten durchgeführt werden. Der Wert von gezählten Körnern/ Zelle stieg auch noch nach dieser Zeit an, jedoch ergab sich nur eine vernachlässigbare Zunahme der Anzahl von Zellen, welche signifikant markiert wurden (mehr als 5 Körner/Zelle), selbst wenn die Exposition der Emulsion auf sechs Tage ausgedehnt wurde. Die Untergrundmarkierung blieb niedrig.

Da einer der Hauptgründe zur Entwicklung dieser Technik darin lag, sie bei der klinischen Untersuchung von Patienten anzuwenden, wurden Proben einer Reihe von Patienten mit Leukämien, Myelomen und malignen Effusionen genommen. Die Hochempfindlichkeitsautoradiografie mit 0,5 - 10yuCi/ccm wurde mit der Autoradiografie (Goons et al., Cancer I_-^ (1966), S. 1200-1204) verglichen. Die Ergebnisse waren hinsichtlich des Prozentsatzes an markierten Zellen vollständig vergleichbar. Eür eine Analyse von Doppelproben für gede Methode ergab sich eine zweifache Differenz im Markierungsindex als statistisch signifikant (P<0,05). Von 52 Beobachtungen bei 4-0 Patienten hatten die Ergebnisse der Hochempfindlichkeitsautoradiografie

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unter Standardautoradiografie ein mittleres Verhältnis von 1,4 und waren daher statistisch nicht verschieden. Bei der Anwendung der Hochempfindlichkeitsautoradiografie lag der mittlere Markierungsindex für elf nicht behandelte Patienten mit Myelom bei 4 % und für acht Patienten mit Remission bei 16 %. Diese Daten waren vollständig mit früheren Daten vergleichbar, welche mittels Standardautoradiografie bei Patienten mit multiplem Myelom erhalten worden waren.

Die zur Durchführung der Standardautoradiografie erforderliche Zeit schränkte zahlreiche klinische Anwendungen und IForschungsanwendungen ein. Gemäß der Erfindung sind sehr kurze Expositionszeiten möglich, so daß die Anwendung der Autoradiografie erleichtert wird. Dies ist ein wesentlicher Fortschritt gegenüber neueren Modifikationen der Standardautoradiografie einschließlich der Verwendung von tritiiertem Thymidin (spezifische Aktivität von 6 Ci/mMol, die Ergebnisse in 24 bis 48 Stunden ergibt) und der Verwendung eines Szintillators zusammen mit tritiiertem Thymidin von niedriger, spezifischer Aktivität.

E¹Ur geringe Werte der ß-Emission von eingebautem, tritiiertem Thymidin verstärkt das Beschichten der fotografischen Emulsion mit einem Szintillator eine früher Markierung sehr stark. Dieser Effekt kann noch weiter verbessert werden , indem die Emulsion bei niedrigen Temperaturen belichtet wird, wobei -85 °C bei dem erfindungsgemäßen Verfahren optimal ist (Tabelle IA). Die Methode sollte sich am brauchbarsten in den Fällen erweisen, in denen geringe Werte der Isotopenaufnahme bislang verlängerte Expositionszeiten (z. B. 6 bis 8 Monate) erforderten. Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Verfahren bei solchen Untersuchungsmethoden Ergebnisse in zwei bis drei Wochen möglich macht. Weiterhin gibt es potentielle Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Elektronenmikroskopie, der Dünnschichtchromatografie und der Papierchromatografie.

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Eine sehr wichtige Abänderung der Erfindung liegt in der Erhöhung der spezifischen Aktivität von tritiiertem Thymidin auf etwa 40-60 Ci/mMol/ccm an inkubierten Zellen, so daß eine maximale Zellmarkierung sehr rasch erreicht werden kann.

Mit EmulsxGnsbelichtungszeiten von nur 20 - 60 Hinuten bei 5 - 10yuCi/ccm werden Markierungsprozentsätze nahe bei den Maximalwerten erreicht. Auf diese Weise ist es möglich, den Markierungsindex (LI %) oder die Wachstumsreaktion innerhalb von 4-5 Stunden nach Erhalt einer klinischen Probe zu berechnen. Die relative Markierungsintensität oder die Kornzahl als Funktion der Zeit kann ebenso signifikant wie die prozentuale Markierung sein. Weiterhin war es möglich, die Markierungsgeschwindigkeit gemäß der Erfindung rasch zu bestimmen. In den Fällen, in denen eine in-vitro-Inkubation mit hohen Dosen an tritiiertem Thymidin hoher spezifischer Aktivität kombiniert mit der Anwendung des Szintillators und der Belichtung bei niedriger Temperatur (-85 ⁰C) möglich ist, können daher Daten für das Fällen einer raschen klinischen Entscheidung verfügbar gemacht werden. Die Kenntnis des Markierungsindex ist von beträchtlichem, klinischem Interesse, z. B. im Hinblick auf die Wahrscheinlichkeit des Ansprechens gegenüber einer Chemotherapie bei der akuten Leukämie wie auch als Kennzeichen für das Ansprechen bei Patienten mit festen Tumoren. Ein Hauptvorteil dieser Autoradiografiemethode gegenüber anderen Mitteln zur raschen Zellzyklusanalyse ist die Fähigkeit, gemischte Zellpopulationen sorgfältig zu analysieren. Durch das Anfärben nach Giemsa und gegebenenfalls nach anderen speziellen Anfärbemethoden kann die Zellmarkierung mit der konventionellen Morphologie in Beziehung gesetzt werden, und Mehrfachzellpopulationen können in einer vorgegebenen Probe untersucht werden. Der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren beobachtete, extrem geringe Untergrund scheint mit der erforderlichen, extrem kurzen Belichtungszeit oder Expositionszeit in Beziehung zu stehen,

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da dies die Exposition gegenüber der äußeren Bestrahlung durch die Umwelt, welche für den Untergrund verantwortlich ist, wesentlich herabsetzt.

Die "beschriebenen Methoden stellen einen wesentlichen Portschritt hinsichtlich der Empfindlichkeit oder Geschwindigkeit, mit der die Ergebnisse bei der Autoradiografie verfügbar sind, dar. Sowohl für !Forschungsanwendungen, welche häufig durch die extrem niedrigen Aufnahmeraten des Isotops beschränkt sind, wie auch für die Gewinnung von in-vitro-Indices für die Fällung von klinischen Entscheidungen liefert das erfindungsgemäße Verfahren daher eine zuverlässige Arbeitsweise, welche in der Biologie und der Medizin breite Anwendung finden kann.

Tabelle I

Einfluß der Temperatur auf die Markierungsgeschwindigkeit bei zwei verschiedenen Konzentrationen von tritiiertem Thymidin. Die Versuche A wurden bei einer Dosis von 0,5 AiCi/ccm und einer spezifischen Aktivität von 40-60 Ci/mMol durchgeführt. Die Versuche B wurden bei einer Dosis von 10 nCi/ccm und der gleichen spezifischen Aktivität durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz an markierten Zellen (Markierungsindex) angegeben.

20 Minuten 1 Stunde 5 Stunden 24 Stunden

17	A	⁰C	B	-85	A	⁰C	B
3	29	10	22
4,2	31	11	37
11	30	19	35
25	35	27	37

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tabelle II

Einfluß der Dosis von tritiiertem Thymidin auf die Karkierungsgeschwindigkeit, spezifische Aktivität «40-60 Ci/ml-lol. Ergebnisse angegeben als Markierungsindex (%).

/uCi/ccm Zellen	0,5	2,0	5,0	10,0	50,0	100,0
20 Minuten	6	21	26	29	22	25
1 Stunde	21	28	30	31	20	23
5 Stunden	31	44	37	30	34	30
24 Stunden	35	39	36	30	36	29

6 Tage 35 — 36 35 34- 32

Im folgenden werden noch Einzelheiten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angegeben.

I. Materialien:

1. Fotografische Emulsion: Kernspuremulsion NTB3 (Kodak)

2. Szintillationsflüssigkeit: 5 g PFO + 100 mg Dimethy1-1OPOP, aufgelöst in 500 ml Bioxan.

3. Polyoxyathylensorbitanmonooleat (Tween 80, ΡΊ754-) wurde als Emulgator für die fotografische Emulsion verwendet.

4. Tritiiertes Thymidin mit hoher spezifischer Aktivität, 40-60 Ci/mMol (Few England Nuclear NET-027Z).

5· Fotografische Fixierlösung (Eastman Kodak, Catalog Nr.

1971746).
6. Entwickler (Eastman Kodak D19).

7- Giemsa—Blutfärbelösung mit Zitronensäurepuffer (Fisher Scientific Company, G-146, 734-319)«

8- Die übrige, erforderliche Ausrüstung umfaßt einen Ofen und ein Wasserbad, das auf 42 C eingestellt werden kann, eine Dunkelkammer, eine Zellenzentrifuge (Shandon), standardmäßige Objektträger, ein Wasserbad von 17 °C, Objektträgerbehälter und die üblichen Laborlösungen.

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II. Metlioden;

Es wurden 2 ecm Knochenmark in eine 0,2 ml 1/1000 HeparinlÖBung (ohne Konservierungsstoff) enthaltende Spritze aufgesaugt. Die Markprobe wurde mit dem Heparin gut vermischt. Die Markprobe wurde in ein KuI tür röhrchen überführt und es wurden etwa 3 ecm Hanks-Lösung + 2 ecm 3 %ige Dextranlösung zugesetzt. Mit einer 10-ml-Pipette wurde das Mark durchgearbeitet. Bei 37 °C wurde bei 1 g während 2 Stunden absetzen gelassen. Die roten Zellen und Granulocyten sedimentierten sich auf dem Boden. Die restlichen weißen Zellen und das überstehende Plasma wurden abgenommen.

2. Die abpipettierten Zellen und das Plasma oder zuvor hergestellte Zellsuspension wurden entnommen und bei 1200 Upia zentrifugiert. Das Zellkügelchen wurde erneut suspendiert und auf 10 ecm mit Hanks-Lösung aufgefülltο

3. Es wurde die Anzahl der Zellen in der Lösung mit einem standardmäßigen Coulter-Zähler ausgezählt. Es wurde bei einer Konzentration von 0,5-1,0 χ 10 Zellen/ccm resuspendiert.

4. Es wurden 2 ecm der Suspension in ein getrenntes Eöhrchen pipettiert. Es wurden 5»0 uCi/ccm an tritiiertem Thymidin zugesetzt. Die Inkubation wurde für 1 Stunde bei 37 ⁰C durchgeführt. Es wurde zweimal zentrifugiert und gewaschen und erneut zu 0,5-1 Million pro ecm resuspendiert.

5. Es wurden Cytozentrifugenpräparate hergestellt. S¹Ur jedes Präparat wurden 3 Tropfen der präparierten Zeilsuspension + 1 Tropfen der Hanks-Lösung zugesetzt. Es wurde die erforderliche Anzahl von Präparaten in der Cytozentrifuge hergestellt. Die Präparate bzw. Objektträger wurden getrocknet (an Luft).

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Autoradiografie

I. Herstellung der Reagenzien und der Ausrüstung (in der Dunkelkammer)

1. Der Ofen -und das Wasserbad wurden auf 42 ⁰C eingestellt.

2. Es wurde die Kernspuremulsion NTB3 mit dem gleichen Volumen an destilliertem Wasser vermischt. Es wurden 1,0 ml der Emulgatorlösung (Tween 80) hinzugegeben. Die Mischung wurde für wenigstens 1 Stunde in dem Ofen von 42 ⁰C inkubiert.

30 ml der Mischung wurden in einen Kunststoffbehälter gegossen. Der Behälter wurde in dem Wasserbad von 42 ⁰C verwendungsbereit gehalten.

3. Die Objektträger bzw. Präparate wurden auf dem Wasserbad erwärmt.

4. Szintillationsflüssigkeit: 5 g PPO + 100 mg Dimethyl-POPOP wurden in 5OO ml Dioxan vermischt. Sie wurden in einer dunklen Flasche gelagert.

Arbeitsweise

1. Die Lichter in der Dunkelkammer wurden ausgeschaltet.

2. Nachdem die Kernspuremulsionslösung (HTB3-Lösung) fertig war, wurde jeder Objektträger, jeweils einer zu einem Zeitpunkt, in diese Lösung für 10 Sekunden eingetaucht. Jeder Objektträger wurde zum Abtropfen aufgestellt und in eine Trockenkammer überführt.

3. Die Kernspuremulsionslösung (NTB3-Lösung) wurde zurück in die Lagerflasche gegossen und in der Kälte aufbewahrt.

4. Die Objektträger bzw. Präparate wurden für wenigstens 1 Stunde trocknen gelassen.

5. Dann wurden die Objektträger nacheinander in die Szintillationsflüssigkeit für 10 Sekunden eingetaucht. Die Objektträger wurden in einem Objektträgerbehälter aufbewahrt und trocknen gelassen. Die Objektträger wurden bei Zimmertemperatur in der Dunkelheit bei 20 - 60 Minuten oder länger, je nach Erfordernissen, aufbewahrt.

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6. Nach der Expositionszeit wurden die Objektträger bzw Präparate entwickelt und fixiert.

Entwicklung und Fixierung:

1. Es wurden 450 ml destilliertes Wasser in einem 500-ml-Becherglas auf eine Heizplatte auf 45 bis 50 ⁰C erwärmt. Das destillierte Wasser wurde in die dunkel gefärbte Flasche eingeschüttet und das YoIumen auf 500 ml mit kaltem destilliertem Wasser gebracht, bis die Temperatur 37 ⁰C betrug (soll nicht variieren). Dann wurden 78,5 g Entwickler (Kodak D19) hinzugegeben und gut gerührt. Diese Lösung wurde für 0,5 Stunden in einen Kühlschrank eingesetzt. Dann wurde sie in einem Wasserbad von 17 ⁰C in der Dunkelkammer angeordnet.

2. Es wurden 92 g Fixiersalz (Kodak) in 350 ml destilliertem Wasser aufgelöst und dann auf 494 ml aufgefüllt. Es wurde für etwa 0,5 Stunden gerührt und dann in der Dunkelkammer aufbewahrt. Für 0,5 Stunde wurde gekühlt, um die Temperatur auf 17 ⁰C zu erniedrigen, dann wurde die Lösung in einem Wasserbad in der Dunkelkammer angeordnet.

Nach der Abdunkelung wurden die erforderlichen Volumina an Entwicklerlösung und Fixierbad in getrennte Schalen gegossen. Jedes Präparat bzw. jeder Objektträger wurde in dem Entwickler für 3 Minuten eingesetzt, dann in destilliertem Wasser für 10 Sekunden abgewaschen. Es wurde in die Fixierbadschale für 3 Minuten überführt, dann wurde jeder Objektträger in das Wasserbad von 17 ⁰C überführt, wo sie für 15 Minuten aufbewahrt werden sollen. Die Objektträger wurden aus diesem Wasserbad entfernt und an der Luft trocknen gelassen. Während dieser Zeit kann bei Licht gearbeitet werden.

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Färben:

1. Herstellung der Färbelösung

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Es wurden 0,5 g G-iemsa-Blutfarbstoff in 4-2 ml Glyzerin bei 55 - 60 ⁰C aufgelöst, 4-2 ml Methanol wurden zugesetzt und 48 Stunden für ein vollständiges Auflösen stehengelassen. Es wurde filtriert und auf diese Weise die Ausgangslösung erhalten. Die Färbelösung wurde in folgender Weise hergestellt: 75 ml Zitronensäure (0,1M), Puffer pH = 5,75; 5,4- ml Methanol; 4-, 5 ml filtrierte Ausgangslösung.

Die Färbelösung wurde in der ersten Anfärbschale (Fassungsvermögen 100 ml) angeordnet.

2_:_Herstellung_der_Zitronensäure_£0_JL1M2-£uffer

a) Für die zweite Färbelösungsschale, pH = 5?75» 119 ₅ 2 ml 0,2M Ua₂HPO₄, 80,8 ml 0,111 Zitronensäure, der pH-Wert muß überprüft werden.

b) Für die dritte Färbebadschale, pE = 5,40; 111,5 ml 0,2H NapHPO.; 88,5 ml 0,1M Zitronensäure; der pH-Wert muß überprüft werden.

Jeder Objektträger bzw. jedes Präparat wurde in die Giemsa-Blutfärbelösung für 12 Minuten eingebracht, dann in Puffer Nr. 1, der auf pH = ^^7^> eingestellt ist, für 30 Sekunden überführt, dann in Puffer Wr. 2, der auf pH = 5^ eingestellt ist, für 30 Sekunden überführt und dann wird der Objektträger bzw. das Präparat an der Luft trocknen gelassen.

Die Präparate bzw. Objektträger sind dann fertig, um in einem Deckglas versehen und ausgezählt zu werden.

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Claims

-νι- Patentansprüche

1. Verfahren zur Messung der physiologischen Veränderungen im Gewebe, wobei ein wesentlicher Zellbestandteil mit einem radioaktiven Isotop durch Inkubieren der Zellen mit einem radiomarkierten Zellenbestandteil in Form von Nukleinsäuren, Enzymen, Proteinen oder Hormonen, welche ein Radioisotop als Strukturatom hiervon enthalten, markiert wird, diese markierten Zellen mit einem Flüssigszintillator auf der Oberfläche eines Objektträgers mit fotografischem Silberhalogenid vermischt werden, das Silberhalogenid den Emissionen aus dem Radioisotop unter Aktivierung von Silberionen auf dem Objektträger exponiert wird, der Objektträger zur Bildung von Silberkristallen hierauf entwickelt wird und die relative Anzahl von Silberkristallen als Maß der Radioaktivität der Zellen und der physiologischen Aktivität hiervon bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß der radioaktive Bestandteil in !form der Hukleinsäure, des Enzyms, des Proteins oder des Hormons eine spezifische Aktivität von wenigstens 40 Ci/mMol besitzt, und daß das Silberhalogenid der radioaktiven Nukleinsäure oder dem radioaktiven Enzym bei einer Temperatur von nicht größer als -20 ⁰C exponiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Radioisotop Tritium ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure Ribonukleinsäure (RKA) oder Deoxyribonukleinsäure (DNA) ist.

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4. Verfahren nach. Anspruch. 3> dadurch gekennzeichnet, daß der Szintillator eine Kombination von 2,5-Diphenyloxazol (PPO) und 1,4-Bis-(4-methyl-5-phenyloxazol-2-yl)-benzol (Mmethyl-POPOP) ist.

5· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die radioaktive Hukleinsäurekomponente tritiiertes Thymidin oder tritiiertes Uridin ist.

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