DE2748657C3 - Verfahren zur Bestimmung von Ferritin - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Ferritin

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DE2748657C3 DE2748657A DE2748657A DE2748657C3 DE 2748657 C3 DE2748657 C3 DE 2748657C3 DE 2748657 A DE2748657 A DE 2748657A DE 2748657 A DE2748657 A DE 2748657A DE 2748657 C3 DE2748657 C3 DE 2748657C3
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Description

a) Der zweite Antikörper ist gegen ein Isoferritin gerichtet, welches verschieden ist von dem zur Produktion des ersten Antikörpers verwendeten Isoferritin;
b) die Ferritinstandard-Lösungen enthalten ein Isoferritin, das identisch mit oder verschieden ist von dem zur Produktion des ersten Antikörpers verwendeten Isoferritin;
c) der erste Antikörper ist in an sich bekannter Weise !covalent an Polyamid 6.6 gebunden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper erzeugt werden gegen und die Standards bestehen aus Leber-, Milz- oder Plazentaferritin.
Die Ferritin-Konzentration im Serum von Säugetieren, insbesondere von Menschen, ist ein geeignetes MaB für die Eisenspeicherung des Organismus.
Nach J. W. Halliday et al, Clinica Chimica Acta 58, 207—214 (1975), ist bekannt, Ferritin in Serum zu bestimmen, indem man in Plastikröhrchen, welche inwendig mit Anti-Leber-Ferritin-Antikörper überzogen sind, einerseits Leberferritin-Standards und andererseits Serumproben inkubiert, die Lösung abgießt, den Oberzug wäscht und anschließend mit Anti-Leberferritin-125-Jod-Antikörper behandelt, den Oberstand abgießt und die in den Röhrchen an den Oberzug gebundene Radioaktivität im Gammazähler mißt.
Dieae*, Verfahren hat folgende Nachteile: Es ist außerordentlich schwierig, Reagenzröhrchen reproduzierbar mit Antikörper zu beschichten. Die Antikörperschicht kann außerdem sehr leicht durch Serum oder Puffer abgelöst werden. Sie ist zudem empfindlich, zum Beispiel gegen zu viel oder zu wenig Feuchtigkeit bei der Lagerung. Schließlich kann man nach diesem Verfahren spezifisch das Ferritin nur eines Organs quantitativ bestimmen, und die Ferritine anderer Organe nur angenähert durch Kreuzreakiionen erfassen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Ferritin in Serum oder Plasma, bei dem man einen ersten Antikörper, gerichtet gegen ein ofganspezifiiches Isoferrilin, welcher an eine feste Phase gebunden ist, einerseits mit Ferritinstandard'Ld*
sungen und andererseits unter gleichen Bedingungei mit Serumprobeu jnkubiert, dann die Inkubationslösun gen dekantiert oder absaugt, den an die feste Phasi gebundenen Antikörper-Ferritin-Komplex wäscht uni
anschließend mit einem Jod-125-markierten zweitei
Antikörper, gerichtet gegen ein organspezifische Isoferritin inkubiert, die Lösung dekantiert ode
absaugt, den gebildeten, an die feste Phase gebundene!
Antikörper-Ferritin-Antikörper-125-Jod-Komplex
ίο wäscht, seine Radioaktivität im Gammazähler mißt um die Standardproben mit den Serumproben vergleich! gekennzeichnet durch folgende Merkmale:
a) Der zweite Antikörper ist gegen ein Isoferritii gerichtet, welches verschieden ist von dem zu Produktion des ersten Antikörpers verwendete! Isoferritin;
b) die Ferritinstandard-Lösungen enthalten em Isofer ritin, das identisch mit oder verschieden ist von den zur Produktion des ersten Antikörpers verwende ten Isoferritin;
c) der erste Antikörper ist in an sich bekannter Weisi kovalent an Polyamid 6.6 gebunden.
Es wird bevorzugt, daß die Antikörper erzeug
werden gegen und die Standards bestehen aus Leber-Milz- oder Plazentaferritin.
Zur Durchführung des Verfahrens gemäß dei Erfindung wird zunächst Ferritin einerseits aus mensch licher Leber und andererseits aus menschlicher Mil; entsprechend den in der Literatur angegebene! Verfahren, z. B. nach R. Crichton, Structure Bonding 17 68—139 (1973), isoliert und gereinigt Das Organ wird ii dest Wasser homogenisiert und das Homogenisat Qbei Glaswolle filtriert Nach Erwärmen auf 700C wird da Filtrat zentrifugiert und der Oberstand bis zur 50%igei Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt Der Nieder schlag wird abzentrifugiert in Wasser gelöst und gegei Acetat-Puffer dialysiert Nach Zentrifugieren wird dei Niederschlag in Phosphatpuffer-Lösung gelöst Di«
Lösung wird über «Sephadex G200 und anschließem Über *Sepharose6B Chromatographien. Die Ferritii
enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und in eine
Ultrafiltrationszelle konzentriert Plazentaferritin wurde nach der Methode vor H. Bohn, Archiv Gynecology 215,263 (1973) isoliert
Die Ferritinpräparationen sind mindestens 95% reit (bestimmt mit 2-dirnenäionaler-Immuno-Elektrophore se und isoelektrischer Fokussierung). Antikörper für das Kuppeln an Polyamid 6.6 (Nylon werden zweckmäßig in Kaninchen oder vorzugsweise ii Schai°.n und Antikörper für die Radiomarkierunf werden zweckmäßig in Kaninchen erzeugt Dazi werden jeweils 50 μg bis 2 mg Ferritin verwendet Dii Primär-Immurtisierung erfolgt durch Injektion einei Isoferritin-Lösung eines der genannten Organe um unter Zusatz von Freuds Adjuvants. Die Folge-Immuni sierung, gegebenenfalls mehrfach, wird mit Isoferritinlö sung ausgeführt und, wenn erforderlich, wieder Freud: Adjuvants zugesetzt
«ο Nach einigen Wochen wird den Tieren Serun entnommen, aus dem die Antikörper entweder durcl Fallen mit Ammonsulfat oder durch Behandeln mi Ittimunoadsörbentien (z. B. Cyanbromid-aktivierte Se pharose 6B) Isoliert werden.
Der to isolierte Antikörper (tmmutio-gamma-ölobu Hn IgG) wird an Polyamid 6.6 in Form von Netzen Stäbchen oder vorzugsweise Kugeln von z. B, einiget Millimetern Durchmesser nach der Methode vot
H, Faulstich et el, Federation of the European Biochemical Society Letters? 48,226 (1974) kovalent gebunden.
Zur radioaktiven Markierung der Antikörper wird ein wie vorstehend beschrieben gewonnenes Serum, vor^ zugsweise Antiplazenta-Ferritin-Serum, durch Adsorption an ein Immunoadsorbens, z, B, an Cyanbromid-aktivierte Sepharose6B mit Plazentaferritjn, spezifisch gemacht, d, h, der Anteil des Plazentaferritin-spezifischen Antikörper wird von z.B. einer Säule des genannten Immunoadsorbens adsorbiert und anschließend mit verdünnter Salzsäure eluiert und somit isoliert Dieser spezifische Antikörper wird anschließend unter Benutzung der Methode von Greenwood, Hunter und Glover, Biochem. Journal 89, 114 (1963), radiojodmarkiert
Zur Herstellung der Isoferritin-Standards wird der Proteingehalt der einzelnen Isoferritine (Leber, Milz, Plazenta) nach der Methode von O. H. Lowry et al. Journal of Biological Chemistry 193, 265 (1951) bestimmt
Die Isoferritine werden dann mit einer Protein-Pufferlösung, vorzugsweise mit Pferdeserum, auf Konzentrationen zwischen null und 600 Nanogramm Ferritin pro Milliliter verdünnt Man erhält so die Standardlösungen.
Zur Durchführung der Bestimmung von Ferritin in Serum werden in je ein Reagenzröhrchen ein Nylonstück, vorzugsweise eine Nylonkugel, woran ein Anti-Isoferritin-Antikörper (Antikörper gerichtet gegen ein organspezifisches Isoferritin, z. B. aus Milz oder Leber) kovalent gebunden ist, mehrere Stunden lang, vorzugsweise 3-10 Stunden lang, zweckmäßig bei einer Temperatur zwischen 20 und 40°C, mit 20—200 Mikroliter Isoferritin-Standardlösung, in der das Isofer ritin identisch mit oder verschieden von dem für die Erzeugung des Antikörpers verwendeten Jsoferritins ist, und daneben 20—200 Mikroliter Patientensemm, in dem das Ferritin bestimmt werden soll, sowie jewdls mit 100—400 Mikroliter Boratpuffer, vorzugsweise um einen pH-Wert von 8,6 — der außerdem 0,2 bis 1,0 Gewichtsprozent Rinderserumalbumin enthält — inkubiert Danach dekantiert, man die Lösung und wäscht den gebildeten Nylon-Antikörper-Ferritin-Komplex mit destilliertem Wasser. Anschließend gibt man in jedes
is Reagenzröhrchen 200—400 μΐ einer Lösung des radiojodmarkierten Anti-Isoferritin-Antikörpers (Antikörper gerichtet gegen ein organspezifisches Isoferritin, z. B. aus Plazenta) und inkubiert mehrere Stunden, vorzugsweise 10—20 Stunden, lang, zweckmäßig bei einer Temperatur zwischen 20 und 400Q Danach dekantiert man die Lösung oder saugt sie ab, und wäscht den gebildeten Nylon-Antikörper-Ferritin-Antikörper-125-Jod-Komplex mit destilliertem Wasser. Die an den Nylonkugeln verbliebene Radioaktivität wird im Gam mazähler gemessen und die Ferritinkonzentration der Serumproben aus den Standardkurven interpoliert
Im Verfahren gemäß der Erfindung sind folgende Kombinationen vorteilhaft und bevorzugt die drei ersten einzusetzen:
Antikörper an Nylon kovalent gebunden
Isoferritin-Standard
Antikörper radiojodmarkiert
Anti-Leberferritin Anti-Leberferritin Anti-Leberferritin Anti-Leberferritin Anti-Milzferritin Anti-Milzferritin Anti-Milzferritin Anti-Milzferritin Anti-Plazentaferritin Anti-Plazentaferritin A nti-Plazentaferri ti η Anti-Plazentaferritin Milzferritin Leberferritin Leberferritin Plazentaferritin Lebeiferritin Plazentaferritin Milzferritin Plazentaferritin Leberferritin Leberferritin Plazentaferritin Milzferritin Anti-Plazentaferritin Anti-Milzferritin Anti-Plazentaferritin Anti-Plazentaferritin Anti-Plazentaferritin Anti-Plazentaferritin A nti-Plazentaferri ti η Anti-Leberferritin Anti-Leberferritin Anti-Milzferritin Anti-Milzferritin Anti-Milzferrilin
Diese Kombinationen unterscheiden nicht zwischen den organspezifischen Isoferritiiien im Serum. Sie eignen sich daher zur Bestimmung der Gesamtmenge der Isoferritine.
Mit einer solchen Kombination von Antikörpern und Standards ist die Bestimmung des gesamten Serumferritins, das sieh aus den Perritinen der einzelnen Organe zusammensetzt, mit einer Empfindlichkeit bis hinab zu 2 Nanogramm Ferritin/ml möglich. Die obere Grenze der Bestimmungsmethode liegt bei 400 Nanogramm Fern-(in/ml. Die Werte sind gut reproduzierbar. Es ist auch möglich, höhere Ferritinwerte in Serum zu bestimmen (bis 15 000 Nanogramm Ferriiin/ml), wenn das zu bestimmende Serum mit einem Humanferritin freiem
Serum, z. B. Pferdeserum, verdünnt wird.
Es ist zweckmäßig die Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens in einem Besteck (»kit«) zusammenzustellen.
Dieses enthält z. B. Gefäße mit lQQNylonkugeln, an die Anti-Leberferritin-Antikörper gebunden ist
1 Antiplazentaferritin'125-Jod 8 Leberferritinstandards 0, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 ng/ml
1 Testserum, dessen Ferritingehalt bekannt ist 1 Verdünnungsserum (Pferdeserum) 1 Puffer Alle Reagenzien sind lyophilisiert.
IO
15
Beispiel
Herstellung von Antiteberferrittn Antikörper
14 Immunisierung
Tierart; Schaf
Eine Lösung von 2 mg Leberferritin in 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 wird in 2 ml Freuds Adjuvans emulgiert und intramuskulär an 4 bis 5 Stellen injiziert Testblutentnahmen werden jeweils nach 7 bis 10 Tagen ausgeführt und der Titer des Antiserums bestimmt Wenn ein Titer von 1 :16 (Ouchterlony) erreicht ist, wird 1 Liter Blut dem Tier entnommen und daraus das Serum gewonnen.
\2 Präparation der IgG-Fraktion des Antiserums
Eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung (536 g/l bei 200C) wird hergestellt und der pH-Wert auf 7,4 eingestellt Zu 100 ml Antiserum wird die gleiche Menge gesättigter Ammoniumsulfatlösung zugesetzt und dabei kontinuierlich gerührt Nach 30 Minuten Rühren bei Zimmertemperatur wird das Material mit 10 000 g 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand abgegossen. Der Niederschlag wird in 50 ml dest. Wasser gelöst und in einen Dialysierschlauch eingefüllt Die Dialyse wird gegen dest Wasser bei 4° C so lange fortgesetzt bis die Dialysate keine Sulfationen mehr enthalten. Die Dialyse ist nach 16 bis 24 Stunden beendet und benötigt im allgemeinen einen 3- bis 4maligen Wechsel des dest Wassers (jeweils 31).
Die so erhaltene Immunoglobulinlösung wird lyophilisiert und bei 4° C im Vakuum über Silikagel aufbewahrt Die Ausbeute des Iyophilisierten Materials beträgt 3,5 g IgG/100 ml Antiserum.
2. Kovalente Bindung von Antileberferritin IgG
an Nylonkugeln
5000 Kugeln werden in 11 Tetrachlorkohlenstoff gewasrhen und dann getrocknet Die Kugeln werden dann in das ReaktionsgefäB gegeben und 514,52 N HCl, *·' welche auf Zimmertemperatur abgekühlt ist, dazugegeben. Die Kugeln werden 30 Minuten gerührt, dann auf einen Büchner-Trichter gegeben und mit destilliertem Wasser so lange gewaschen, bis keine Säure mehr nachzuweisen ist Man gibt schließlich die Kugeln in das ReaktionsgefäB zurück und 51 0,1 M Na2HPO4-Lösung dazu. Allmählich fügt man 100 g Bernsteinsäureanhydrid dazu; der pH-Wert 9,0 der Lösung muß durch gleichzeitige Eingilbe von 46%iger NaOH erhalten bleiben. Man rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur, gibt c!<e Kugeln wiederum auf den Büchner-Trichter und wäscht nacheinander folgend mit 5150% Essigsäure, 51 destilliertem Wasser und 11 trocknem Dimethylformamid
Die nachfolgenden Reaktionen müssen unter wasserfreien Bedingungen ausgeführt werden. Die Kugeln werden in das ReaktionsgefäB zurückgegeben und 51 trocknes Dimethylformamid (DMF) eingefüllt Das Gefäß wird in ein Kühlbad gesetzt und die Temperatur der Reaktionslösung auf einen Bereich von -156 bis eo -206C eingestellt Die Kugeln werden langsam gerührt und 87 ml Triäthylamin und 60 ml Äthylchloroformat dazugegeben. Man läßt 15 Minuten reagieren. Die Kugeln werden mit 21 trockenem DMF gewaschen und dann 75 g N-Hydroxysuccinimid, gelöst in 21 trocknem DMF, zugesetzt Mpn rührt 1 Stunde bei Zimmertemperatur und wäscht die Kugeln mit 51 kaltem destilliertem Wasser. Die Kugeln werden danach in eine Reaktionsflasche gegeben, die bereits 2,51 der Immunoglobuline Lösung enthält, und über Nacht bei 4° C langsam gedreht (~ 10 Upm), Die Immunoglobulin-Lösung wird dekantiert und durch 111 M Glycin-Lösung ersetzt Die Kugeln sollen dann 30 Minuten bei Zimmertempera mr mit der Glycin-Lösung rotieren. Schließlich wäscht man die Kugeln mit 51 Borat-Rinderserumalbumin-Puffer. Man läßt gut abtropfen und legt die Kugeln in einer Schicht auf ein Metallblech und trocknet sie durch Lyophilisieren über Nacht
3. Herstellung
von Antiplazentaferritin-Antikörper
3.1 Immunisierung
Tierart: Kaninchen
Eine Lösung von 100 μg Plazentaferritin in 1 ml isotonischer Phosphat-Puffer-Γ. isung pH 7,4 wird mit 1 ml Freuds-Adjuvans emulgiert und intradermai an mehreren Stellen injiziert
Blutproben werden in Abständen von 7 bis 10 Tagen entnommen und der Titer des Antiserums mit Hilfe der Immunodiffusion gegen Leberferritin bestimmt
Wenn man den Titer 1 :4 erreicht hat ist eine Blutentnahme von 50 ml vorzunehmen. Die Blutentnahmen werden in Htägigem Abstand wiederholt bis der Titer unter 1 :4 fällt
Das Blut läßt man jeweils gerinnen und nimmt das Serum ab.
32 Präparation des spezifischen IgG
Man löst 6,18 g H3BO3 und 29,22 g NaCl in 900 ml dest Wasser, titriert mit NaOH auf pH 8,6 und füllt dann mit dest. Wasser auf 1 Liter auf.
Man löst 36 g Na2HPO4 und 3,12 g NaH2PO4-2 H2O in 11 dest Wasser, prüft das pH 7,4, gleicht an, wenn notwendig.
Eine Lösung von 5 mg Plazentaferritin wird in einen Dialyseschlauch gegeben und 2mal gegen 250 ml Borat/NaCl-Puffer (pH 8,6) über Nacht dialysiert, bei 4°C. Die CNBr-aktivierte Sepharose® (Pharmacia) wird 20 Minuten mit 250 ml 0,001 N HCI unter leichtem Rühren in einer Glasfilternutsche gewaschen. Nachdem die Sepharose trocken ist, wird sie in eine 25-ml-Plastikflasche mit Schraubverschluß gegeben. Man entnimmt die Ferritinlösung dem Dialysierschlauch, verdünnt sie mit Borat/NaCl-Püffer auf 5 ml und gibt sie in die mit aktivierter Sepharose gefüllte Flasche. Der Flascheninhalt wird durch Oberkopfrotation bei Raumtemperatur während 2 Stunden vorsichtig gemischt Man zentrifugiert danach mit 7000UpM für 2 Minuten, um die Sepharose abzutrennen. Der Überstand wird abgegossen und dann das Sepharose/Ferritin-lmmunoadsorbens mit 2 χ 10 ml Borat/NaCl-Puffer, 2 χ 10 ml 0,005 N HCl und 2 χ 10 ml Borat/NaCI-Rinderserumalbumin-Puffer gewaschen.
Die folgenden Operationen werden alle bei Zimmer· temperatur ausgeführt Das Immunoadsorbens wird in eine Säule gepackt und die Höhe des Flüssigkeitsreservoirs so gewählt, daß eine DurchfluPrate von 1 ml pro 23 Minuten erhalten wird. Die Säule wird mit Borat/NaCl-Puffer gespült Die auf der Säule stehende Flüssigkeit wild abgenommen und 5ml Antiplazentaferritin Antiserum auf die Säule gegeben. 20 Reagenzgläser mit je 1 ml Phosphat-Puffer, 0,1 M pH 7,4, werden in dem Fraktionssammler vorgelegt, das Reservoir mit 0,005 N HCI gefüllt und dieses mit der
Säule verbunden. Die ausfließenden Fraktionen des spezifischen IgG werden zusammengegossen und bei 4° C aufbewahrt.
4. Jodierung Methode
Das spezifische Anti-Plazentaferritin IgG ist mit Chloramin-T nach Greenwood und Hunter (Biochem. J 89, 114 [1963]) jodmarkiert worden.
Produklspc/ifikaiion:
spezifische Aktivität 11 mCi/mg
lodierungsgrad I Atom J/Molckül
Reinigung:
G^OOScphndex Säule 0.05 M Phosphatpuffer
pH 7.4 und 0.2% Rinderserumalbumin
•5. Standards
Es wird eine Lösung von J20 ng Leberferritin/ml in Pferdescrum hergestellt. Diese Vorratslösung ist der höchste Standard, aus dem durch Serienverdünnung die folgenden Standards 160. 80. 40. 20. 10. 5 ng Ferritin/ml hergestellt werden. Der Null-Standard besteht aus reinem Pferdescrum.
6. Durchführung der Ί crritinbestimmung
Man kennzeichnet eine ausreichende Menge von Polystyrolröhrchen. um acht Standards, ein Testserum und eine bestimmte Anzahl von Patientenseren bestimmen zu können, jeweils zweifach. Zusätzlich sind zwei Reagenzröhrchen zur Messung der Gesamtaktivität zu numerieren.
In jedes Reagenzröhrchen wird eine Nylonkugel plaziert.
In jedes Reagenzröhrchen werden dann 200 μΙ Pufferlösung pipettiert.
Dann werden jeweils 100 μΙ der Standardlösung, 100 μΙ des Testserum und jeweils 100 μΙ der Patientenseriimproben in die dafür vorbereiteten Reagenzröhrchen pipettiert.
Man rührt kurz auf Whirlmix und inkubiert 5 Stunden bei 370C.
Die Lösungen werden anschließend abgesaugt und die Kugeln mit 2 ml destilliertem Wasser gewaschen.
300 μΐ der jodierten Anti-Plazentaferritin-Lösung
u/ppHpn auf Hip NJvlnnlfιισρΐη ninptliprt Iiiir7 auf Hern
Whirlmix gerührt und die Röhrchen über Nacht bei 37'C inkubiert.
Die Lösung wird abgesaugt, die Kugeln mit 2 ml destilliertem Wasser gewaschen und die Radioaktivität anschließend im Gammazähler gemessen.
Für die Auswertung werden die gemessenen Impulse der acht Standards als Prozent der Gesamtaktivität berechnet. Die Prozent-Aktivität wird als Ordinate gegen iie Ferritinkonzentration (ng/ml) (Abszisse) eingetragen und durch eine Kurve verbunden. Die Werte des Testserums und der Patientensera werden auf dieser Kurve interpoliert.

Claims (1)

  1. Patentansprüche;
    1, Verfahren zur Bestimmung von Ferritin in Serum oder Plasma, bei dem man einen ersten Antikörper, gerichtet gegen ein organspezifisches Isoferritin, welcher an eine feste Phase gebunden ist, einerseits mit Ferritinstandard-Lösungen und andererseits unter gleichen Bedingungen mit Serumproben inkubiert, dann die Inkubationslösungen dekantiert oder absaugt, den an die feste Phase gebundenen Antikörper-Ferritin-Komplex wäscht und anschließend mit einem Jod-125-markierten zweiten Antikörper, gerichtet gegen ein organspezifisches Isoferritin inkubiert, die Lösung dekantiert oder absaugt, den gebildeten, an die feste Phase gebundenen Antikörper-Ferritin-Antikörper-125-Jod-Komplex wäscht seine Radioaktivität im Gammazähler mißt und die Standardproben mit den Serumproben vergleicht, gekennzeichnet durch folgende Merkmale:
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