DE2807403C2

DE2807403C2 -

Info

Publication number: DE2807403C2
Application number: DE2807403A
Authority: DE
Inventors: Dimitrios West Chester Pa. Us Sarantakis
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1977-02-22
Filing date: 1978-02-21
Publication date: 1990-11-29
Also published as: DK150618B; FR2382433B1; IE46462B1; SE447482B; DK76378A; SE7802015L; DK150618C; FR2382433A1; DE2807403A1; IE780348L

Description

Die Erfindung betrifft Analoga des Somatostatins, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel gemäß den voranstehenden Ansprüchen.

Es wurde gezeigt (Brazeau et al., Science 179, 77 (1973)), daß der als Somatostatin bekannte cyclische Somatotropin-frei setzungsinhibierende Faktor (SRIF) die folgende Struktur besitzt:

wobei sämtliche Aminosäuren der "natürlichen" oder L-Konfigura tion angehören.

In der Literatur wurden verschiedene Methoden zur Synthese von Somatostatin berichtet. Hierzu gehört die Festphasen methode von Rivier, J. Am. Chem. Soc., 96, 2986 (1974), sowie die Lösungsmethoden von Sarantakis et al., Biochemical Biophysical Research Communications 54, 234 (1973) und immer et al., Helv. Chim. Acta, 57, 730 (1974). Die Peptidforschung unternimmt große Anstrengungen mit dem Ziel, die pharmakologi sche Wirksamkeit von Somatostatin durch synthetische Modifi kation seiner Struktur zu erhöhen.

Die reduzierte Form (offenkettige Form) von Somatostatin (RS) ist das lineare Tetradecapeptid der Formel B

Die reduzierte Form (B) wurde durch Totalsynthese (vgl. Rivier et al., C. R. Acad. Sci. Ser. p. Sci. Natur (Paris) 276, 2737 (1973) und Sarantakis und Mc Kinley, Biochem. and Biophys. Res. Communications, 54, 234 (1973)) hergestellt; sie kann (B) durch Oxydation in das Somatostatin (A) überführt werden, wo bei zwischen den beiden Sulfhydrylgruppen der im Tetradeca peptid befindlichen Cysteinylaminosäurereste eine Brücken bindung gebildet wird.

Es wurden zahlreiche Polypeptide synthetisch hergestellt, die als Strukturmodifikationen des Somatostatins angesehen werden können. Diese sind in der chemischen Literatur beschrieben. Derartige Polypeptide haben mit dem Somatostatin gewisse Strukturparameter gemeinsam und unterscheiden sich vom Somato statin dadurch, daß spezifische Aminosäurereste oder funktio nelle Gruppen, die ursprünglich im Somatostatinmolekül ent halten sind, entweder fehlen oder durch andere Aminosäurereste oder funktionelle Gruppen ersetzt sind.

Falls nicht anders angegeben, besitzen sämtliche optisch aktiven Aminosäurereste und Aminosäuren die L-Konfiguration.

Bei den Symbolen, die in der vorliegenden Anmeldung die Amino säuren und Aminosäurereste in den Polypeptiden bezeichnen, handelt es sich um Symbole, die vom IUPAC-IVB Committee on Biochemical Nomenclature Recommendation (1971) zugelassen sind. Sie sind in den Archives of Biochemistry and Biophysics, 150, 1 bis 8 (1972) beschrieben.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen folgende physikali sche Eigenschaften auf: Sie sind weiße bis hellbraune Fest stoffe, die in Chloroform oder Benzol im wesent lichen unlöslich sind, jedoch in Wasser und wäßrigen sauren Lösungen, wie Chlorwasserstoffsäure und Essigsäure, Löslich keit besitzen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen keine klar unterscheidbaren Schmelzpunkte. Sie können bei spielsweise durch Chromatographie gereinigt werden. Die Hydrolyse der erfindungsgemäßen Verbindungen, beispiels weise in 4 n Methansulfonsäure, erlaubt die Bestimmung ihres Aminosäuregehalts, der sich mit den hier angegebenen Struktu ren als in Übereinstimmung befindlich erwiesen hat

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind pharmazeutisch wirk sam. Kennzeichnend ist, daß durch ihre Verwendung die Frei setzung von einem oder mehreren der Hormone Somatotropin, Gluca gon oder Insulin inhibiert wird. Dies läßt sich durch übliche pharmakologische Tests feststellen. Durch Regelung der Dosis erlaubt die selektive Wirkung der erfindungsgemäßen Verbin dungen die Inhibierung der Somatotropin- und Glucagonfrei setzung, ohne daß die endogenen Insulinsekretionsspiegel be einträchtigt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Mischung mit Insulin verwendet werden. Sie sind dann für die Behandlung von Diabetes mellitus bei Warmblütern geeignet.

Vorzugsweise stehen X₁ und X₂ jeweils für His, oder X₁ steht für Arg und X₂ steht für Glu.

Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind:

und

und deren reduzierte (offenkettige) Formen.

Die Erfindung betrifft auch geschützte Verbindungen der Formel I. Hierzu gehören die Verbindungen der Formel II:

worin:
R für eine Carboxylschutzgruppe (beispielsweise Alkyl, Aralkyl) oder einen über eine Methylengruppe gebundenen Polystyrolharzträger, d. h. einen Rest

steht;
R₁ eine α-Aminoschutzgruppe bedeutet;

worin R³ eine Schutzgruppe für die Seitenketten-Stickstoffatome des Arginins bedeutet und R² Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für das Imidazol stickstoffatom des Histidins darstellt;

worin R⁴ eine Schutzgruppe für die Seitenketten- Carboxylgruppen der Glutaminsäure dar stellt, steht;
R⁶ eine Schutzgruppe für die Seitenketten-Aminogruppe des Lysins bedeutet;
R⁷, R⁸ und R⁹ jeweils Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen des Threonins und Serins bedeuten;
X₃ für D-Trp steht;
X₄ für Cys oder D-Cys steht; und
α und β jeweils eine Sulfhydryl-Schutzgruppe oder Wasserstoff bedeuten, oder worin α und β eine direkte Bindung zwischen den Schwefelatomen symbolisieren.

Zu Beispielen für α-Aminoschutzgruppen der durch R¹ symbolisierten Art gehören:

(1) Schutzgruppen des Acyl-Typs; hier kann man nennen Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, p-Toluolsulfonyl (Tosyl) oder Nitro phenylsulfenyl;
(2) Schutzgruppen des aromatischen Urethan-Typs; hier kann man nennen: Benzyloxycarbonyl und substituiertes Benzyl oxycarbonyl, wie beispielsweise p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl;
(3) Schutzgruppen des aliphatischen Urethan-Typs; hier kann man nennen: tert.-Butyloxycarbonyl, Diisopropylmethoxy carbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 2,2,2- Trichloräthoxycarbonyl, Amyloxycarbonyl;
(4) Schutzgruppen des Cycloalkylurethan-Typs; hier kann man nennen: Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclo hexyloxycarbonyl;
(5) Schutzgruppen des Thiourethan-Typs; hier kann man nennen: Phenylthiocarbonyl;
(6) Schutzgruppe des Alkyl-Typs; hier kann man nennen: Triphenylmethyl (Trityl);
(7) Trialkylsilangruppen, beispielsweise Trimethylsilan.

Die bevorzugte α-Aminoschutzgruppe ist tert.-Butyloxycarbonyl.

Zu Beispielen für den Rest R³ gehören Nitro, Tosyl, Benzyl oxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl oder tert.-Butyloxycarbonyl; vorzugsweise steht R³ für Tosyl.

Der Schutz über die Nitro- oder Tosylgruppe erfolgt entweder an den N^ω oder N^ω ¹-Stickstoffatomen des Arginins, während die Schutzgruppen des Oxycarbonyl-Typs das N^δ-Stickstoffatom und eines der N^ω- oder N^ω ¹-Stickstoffatome schützen.

Zu Beispielen für R² gehören Tosyl, Benzyloxycarbonyl, Adaman tyloxycarbonyl und tert.-Butyloxycarbonyl. Vorzugsweise steht R² für die Tosylgruppe.

Die Seitenketten-Aminogruppe des Lysins ist durch den Rest R⁶ geschützt. Als Beispiele für diesen Rest kann man Tosyl, tert.-Amyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, Diisopropyl oxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Halogenbenzyloxycarbonyl oder Nitrobenzyloxycarbonyl nennen. Bevorzugt ist die 2-Chlorbenzyloxycarbonylgruppe.

Beispiele für die Schutzgruppen R⁷, R⁸ und R⁹ für die Hydroxyl gruppe des Threonins und Serins sind Acetyl, Benzoyl, tert.- Butyl und Benzyl. Für diesen Zweck ist die Benzylgruppe be vorzugt.

Beispiele für den Rest R⁴ sind Benzyl und tert.-Butyl.

Beispiele für die Schutzgruppen α und β für die Sulfhydryl gruppe des Cysteinylaminosäurerests sind Benzyl, substituiertes Benzyl, worin es sich beim Substituenten um mindestens einen der Reste Methyl, Methoxy, Nitro oder Halogen handelt (bei spielsweise 3,4-Dimethylbenzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl oder p-Nitrobenzyl), Trityl, Benzyloxycarbonyl, Benzhydryl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Benzylthiomethyl, Äthylcarbamoyl, Thioäthyl, Tetrahydropyranyl, Acetamidomethyl, Benzoyl oder s-Sulfonsäuresalz. Die p-Methoxy benzylgruppe ist bevorzugt.

Die Verbindungen der Formel I können hergestellt werden, indem man sämtliche Schutzgruppen und den gegebenenfalls vorhandenen Polystyrolharzträger aus einer wie oben definierten Verbindung der Formel II entfernt, das Produkt gewünschtenfalls oxydiert oder reduziert, um die cyclische oder offenkettige Form zu erhalten und ferner gewünschtenfalls das Produkt in Form der freien Base oder in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes isoliert.

Die Entfernung der Schutzgruppen kann durch Methoden erfolgen, die im Stand der Technik für entsprechende Schutzgruppen be kannt sind siehe z. B. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 14. Vorzugsweise entfernt man die Schutzgruppen in einer einzigen Stufe, beispielsweise durch Verwendung von Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol.

Man kann den Polystyrolharzträger gleichzeitig mit der Ent fernung der Schutzgruppen abspalten, indem man beispielsweise Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol verwendet. Man kann ihn auch durch Umesterung abspalten, wobei man ein Carboxyl geschütztes Zwischenprodukt der Formel II erhält, worin R für eine Esterfunktion steht. So ergibt beispielsweise eine Metha nolyse ein Methylester-Zwischenprodukt der Formel II, worin R für Methyl steht. Die Hydrolyse derartiger Ester liefert die erforderliche C-terminale Carboxylfunktion.

Durch geeignete Wahl der Schutzgruppen können die Schutz gruppen α und β aus den Verbindungen der Formel II selektiv entfernt werden, wobei man die freien Disulfhydrylderivate der Formel II erhält, worin α und β für Wasserstoff stehen. Wenn beispielsweise α und β die Bedeutungen Trityl oder Acetamido besitzen, können sie durch Einwirkung eines Queck silber-II- oder Silbersalzes entfernt werden, wobei man das entsprechende Disulfhydrylderivat in Form seines entsprechen den Quecksilber-II- oder Disilbersalzes erhält. Das letztere Salz kann mit Schwefelwasserstoff behandelt werden, wobei man das entsprechende freie Disulfhydrylderivat der Formel II erhält.

Die freien Disulfhydrylderivate der Formel I und II können jeweils cyclisiert werden, indem man sie oxydiert. Man ver wendet ein Oxydationsmittel, beispielsweise Jod, Sauerstoff (beispielsweise Luft), 1,2-Dÿodäthan oder Natrium- oder Kaliumhexacyanoferrat-III, um die entsprechenden Verbindungen der Formel I zu erhalten, worin die beiden Gruppen A eine direkte Bindung bilden, bzw. um die Verbindungen der Formel II zu erhalten, worin a und β eine direkte Bindung bilden.

Die Polypeptid-Endprodukte und ihre entsprechenden Zwischen produkte können nach der wohlbekannten Festphasenmethode her gestellt werden. Diese ist beispielsweise von Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963) beschrieben. Man kann die Ver bindungen auch durch klassische Synthese erhalten. Die Herstel lung einer Verbindung der Formel II, worin α und β Schutz gruppen darstellen und R für einen Polystyrolharzträger steht, erfolgt dadurch, daß man die entsprechenden, auf geeignete Weise geschützten und/oder aktivierten Amino säuren der Reihe nach unter Festphasensynthesebedingungen an einen chlormethylierten Harzträger oder einen Hydroxymethyl harzträger kuppelt. Alternativ können die Verbindungen der Formel II, worin α und β Schutzgruppen darstellen und R eine Carboxylschutzgruppe bedeutet, durch Kupplung der entsprechen den, in geeigneter Weise geschützten und/oder aktivierten Aminosäuren oder Gruppen von Aminosäuren durch Methoden herge stellt werden, die zur Bildung von Peptidbindungen bekannt sind, wobei man die gewünschte Aminosäuresequenz erhält. Dann kann man die α- und β-Schutzgruppen selektiv entfernen und das Produkt oxydieren, um das cyclische Disulfid der Formel II, worin α und β eine direkte Bindung darstellen, zu erhalten.

Methoden zur Aktivierung von Aminosäuren vor dem Kuppeln und die Kupplungsmethoden als solche sind bekannt; man vergleiche beispielsweise das nachstehend erwähnte Lehrbuch von Schröder und Lübke.

Bei der Auswahl einer bestimmten Seitenketten-Schutzgruppe, die bei der Synthese der erfindungsgemäßen Peptide gebraucht werden soll, sollte man sich an die nachfolgenden Regeln hal ten:

(a) die Seitenketten-Schutzgruppe muß gegenüber dem Reagens und unter den zur Entfernung der α-Aminoschutzgruppe ge wählten Bedingungen bei jeder Synthesestufe stabil sein;
(b) die Schutzgruppe muß ihre schützenden Eigenschaften beibe halten (d. h. sie darf unter den Kupplungsbedingungen nicht abgespalten werden); und
(c) die Seitenketten-Schutzgruppe muß beim Abschluß der Synthese, d. h. nachdem man die gewünschte Aminosäuresequenz er halten hat, unter Reaktionsbedingungen abspaltbar sein, die nicht zu einer Änderung der Peptidkette führen.

Bei der auf die erfindungsgemäßen Verbindungen angewendeten klassischen Methode wird das gewünschte Peptid aufgebaut, indem man nötigenfalls geschützte Aminosäuren oder Gruppen von Amino säuren kondensiert. Die Kondensationsreaktionen können durch geführt werden, indem man Methoden anwendet, von denen allge mein bekannt ist, daß sie auf dem Gebiet der Peptid- und Penicillinchemie zu Amidverbindungen führen. Zur Kondensation der Aminosäuren ist es bevorzugt, ein Kondensationsmittel einzusetzen. Zu Beispielen für Kon densationsmittel gehören Carbodiimide, beispielsweise N,N′-Di cyclohexylcarbodiimid, (DCC), und N,N′-Diisopropylcarbodiimid. Alternativ kann die Kondensation durchgeführt werden, indem man eine oder beide endständige Gruppen aktiviert. Beispiele für die aktivierte Form der endständigen Carboxylgruppen sind das Säurechlorid, Säureanhydrid, Azid und der aktivierte Ester. Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß die jeweils vor geschlagene Methode zur Durchführung der Kondensationsreaktionen mit den Schutzgruppen der Aminosäuren vereinbar ist.

Beim Aufbau des Moleküls nach der klassischen Methode ist es bevorzugt, ein geschütztes Peptid der Formel VIa

mit einem geschützten Peptid der Formel:

worin:
R₁ eine Carboxy-Schutzgruppe (vorzugsweise Benzyl) bedeutet und R¹, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, B₁, B₂, X₃ und X₄ die zuvor genannten De finitionen besitzen und α und β für Schutzgruppen, vorzugsweise für p-Methoxybenzyl, stehen, kondensiert, wobei man eine Ver bindung der Formel II erhält, die entschützt und cyclisiert ist.

Bei der auf die erfindungsgemäßen Verbindungen angewendeten Festphasenmethode wird zuerst Cystein, das an der α-Aminogruppe und an der Sulfhydrylgruppe geschützt ist, an ein chlormethy liertes Polystyrolharz gekuppelt; anschließend wird mit Hilfe von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure alleine oder HCl in Dioxan die α-Aminoschutzgruppe entfernt. Man führt das Entschützen bei einer Temperatur zwischen unge fähr 0°C und Raumtemperatur durch. Man kann auch andere Üb liche Spaltungsreagentien und Bedingungen zur Entfernung spezifischer α-Aminoschutzgruppen gebrauchen, so wie sie bei spielsweise in Schröder und Lübke. "The Peptides", 1, 72 bis 75 (Academic Press, 1965) beschrieben sind. Nach dem Entfernen der α-Aminoschutzgruppe werden die nächsten jeweils gewünsch ten, geschützten Aminosäuren einzeln und der Reihe nach an die vom Harz getragene Sequenz angekuppelt. Alternativ kann man auch kleine Peptidfragmente herstellen, beispielsweise mit Hilfe der Lösungsmethode und diese in der gewünschten Reihenfolge in den Festphasenreaktor einführen. Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in ungefähr 4fachem Überschuß in den Festphasenreaktor eingeführt. Man führt das Kuppeln in Dimethylformamid, Methylenchlorid oder einer Mi schung dieser beiden Lösungsmittel durch. Der erfolgreiche Verlauf jeder Kupplungsreaktion wird bei jeder Synthesen stufe mit Hilfe der Ninhydrinreaktion bestimmt. Diese Reaktion ist von E. Kaiser et al., Analyt. Biochem. 34, 595 (1970) be schrieben. Falls die Kupplung unvollständig war, wird die Reaktion wiederholt, bevor die α-Aminoschutzgruppe zur Ein führung der nächsten Aminosäure oder Aminosäurensequenz ent fernt wird.

Die bevorzugten Kupplungsreagentien sind 1-Hydroxybenzotriazol und Diisopropylcarbodiimid; andere derartige Reagentien sind dem Fachmann bekannt.

Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz synthetisiert wurde, entfernt man das Polypeptid vom Harzträger. Dies erfolgt bei spielsweise durch Behandlung mit Fluorwasserstoff und Anisol. Hierbei erhält man das vollständig entschützte lineare Poly peptid. Man kann das cyclische Disulfid durch Luftoxydation oder beispielsweise durch Oxydation mit K₃Fe(CN)₆ herstellen.

Nicht-toxische Additionssalze der linearen und cyclischen Polypeptide werden nach bekannten Methoden mit Chlorwasser stoffsäure, Brimwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphor säure, Polyphosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Zitronen säure, Benzoesäure, Bernsteinsäure, Malonsäure oder Ascorbin säure hergestellt. Das Essigsäuresalz ist bevorzugt.

Die im Verlauf der Festphasensynthese eingesetzten Schutz gruppen sind bekannt. Die α-Aminoschutzgruppen, die bei jeder in der jeweiligen Sequenz des schließlich gewünschten Polypeptids eingeführten Aminosäure gebracht werden, lassen sich in folgende Typen unterteilen:

(1) Schutzgruppen des Acyl-Typs; Zur Erläuterung seien genannt: Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, p-Toluolsulfonyl (Tosyl), oder Nitrophenylsulfenyl.
(2) Schutzgruppen des aromatischen Urethan-Typs; diese lassen sich durch folgende Vertreter erläutern: Benzyloxycarbonyl und substituiertes Benzyloxycarbonyl, beispielsweise p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl;
(3) Schutzgruppen des aliphatischen Urethan-Typs; diese lassen sich durch folgende Vertreter erläutern: tert.-Butyloxy carbonyl, Diisopropylmethoxy, Isopropyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl, Amyloxy carbonyl;
(4) Schutzgruppen des Cycloalkylurethan-Typs; diese lassen sich durch folgende Vertreter erläutern: Cyclopentyloxy carbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl;
(5) Schutzgruppen des Thiourethan-Typs; genannt sei hier das Phenylthiocarbonyl als Vertreter;
(6) Schutzgruppen des Alkyl-Typs; als Verteter sei hier ge nannt das Triphenylmethyl (Trityl);
(7) Trialkylsilangruppen, beispielsweise Trimethylsilan,

Die bevorzugte α-Aminoschutzgruppe ist das tert.-Butoxy carbonyl.

Das Imidazolstickstoffatom des Histidins, als N^im bezeichnet, wird durch eine Gruppe geschützt, bei der es sich um Tosyl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl oder tert.-Butyloxy carbonyl handeln kann. Bevorzugt ist die Tosylgruppe.

Die Seitenketten-Aminogruppe des Lysins kann durch Tosyl, tert.-Amyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, Diisopropyl oxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Halogenbenzyloxycarbonyl, Nitrobenzyloxycarbonyl, und dergleichen, geschützt sein. Be vorzugt ist die 2-Chlorbenzyloxycarbonylgruppe.

Die Seitenketten-Stickstoffatome des Arginins, die als N⁹ be zeichnet sind, sind durch Gruppen geschützt, bei denen es sich um Nitro, Tosyl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl oder tert.-Butyloxycarbonyl handeln kann. Bevorzugt ist die Tosyl gruppe. Der Schutz durch die Nitro- oder Tosylgruppe erfolgt entweder an den N^ω oder N^ω ¹-Stickstoffatomen, während die Schutzgruppen des Oxycarbonyl-Typs das N^δ-Stickstoffatom und entweder das N^ω- oder das N^ω ¹-Stickstoffatom schützen.

Der Schutz der Hydroxylgruppe des Threonins und Serins kann durch Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl oder Benzyl erfolgen. Für diesen Zweck ist die Benzylgruppe bevorzugt.

Bei der Schutzgruppe für die Sulfhydrylgruppe des Cysteinyl aminosäurerests handelt es sich um eine Gruppe, die ausge wählt ist unter Benzyl, substituiertem Benzyl, worin als Substituent mindestens eine Methyl-, Methoxy-, Nitro- oder Halogengruppe enthalten ist (beispielsweise 3,4-Dimethylbenzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl, und dergleichen), Trityl, Benzyloxycarbonyl, Benzhydryl, p-Methoxybenzyloxy carbonyl, Benzylthiomethyl, Äthylcarbamoyl, Thioäthyl, Tetra hydropyranyl, Acetamidomethyl, Benzoyl, s-Sulfonsäuresalz, und dergleichen. Bevorzugt ist die p-Methoxybenzylgruppe.

In gleicher Weise wie das Somatostatin können die erfindungs gemäßen Verbindungen entweder in der monomeren offenkettigen Form (der sogenannten "reduzierten" Form) oder der monomeren cyclischen Form (der sogenannten "oxydierten" Form) vorliegen. Jede dieser Formen kann mit Hilfe einer Arbeitsweise herge stellt werden, die im wesentlichen mit derjenigen identisch ist, die zur Herstellung der entsprechenden Form des Somatosta tins gebraucht wird. Diese Arbeitsweisen sind dem Fachmann bekannt. Die "reduzierte" Form wird hier als diejenige Struk tur dargestellt, in der "A" Wasserstoff bedeutet; dies be deutet, daß sich an den beiden Cys-Aminosäureresten freie Thiolsubstituenten befinden. Die "oxydierte" Form wird hier durch dieselbe Struktur dargestellt in dem Fall, in dem die beiden Gruppen "A" eine direkte Bindung darstellen. Das heißt es besteht eine Einzelbindung zwischen den Schwefelatomen, die von den beiden Cys-Aminosäureresten getragen werden. Es wird somit ein monomerer Ring gebildet.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer sogenannten "polymeren reduzierten" Form vorliegen (vgl. beispielsweise US-PS 39 26 937). Diese Form kann man durch eine Arbeitsweise erhalten, die im Stand der Technik in Verbindung mit der Herstellung des polymeren reduzier ten Somatostatins beschrieben ist.

Die pharmakologische Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide kennzeichnet diese Verbindungen als brauchbar zur Behandlung von Akromegalie und Diabetes, und zwar auf dieselbe Weise wie das Somatostatin selbst. Die Verabreichung der Peptide kann auf den üblichen Wegen erfolgen, die dem Somatostatin und verwandte Polypeptiden gemein sind. Sie erfolgt unter An leitung eines Arztes in einer Menge, die durch das vom Arzt bestimmte Ausmaß der Fehlfunktion bestimmt wird. Die Verbin dungen können alleine oder in Verbindung mit üblichen, pharma zeutisch verträglichen Trägern und Adjuvantien in Dosiseinheits form verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch brauchbar in Mi schung mit Insulin zur Behandlung eines an Diabetes mellitus leitenden Warmblüters. Man vergleiche beispielsweise US-Patent schrift 39 12 807. Dort ist die Verwendung einer wirksamen Menge eines Mittels, bestehend aus Somatostatin, das mit Insu lin gemischt ist, zur Behandlung eines an Diabetes mellitus leidenden Warmblüters beschrieben.

Bei der therapeutischen Verwendung der erfindungsgemäßen Ver bindungen zur Behandlung von Akromegalie, juveniler Diabetes und Diabetes mellitus, wird die Behandlung mit kleinen Dosen eingeleitet. Die Dosisgröße ist kleiner als die optimale Dosis der Verbindung. Danach wird die Dosierung in kleinen Anteilen erhöht, bis unter den jeweiligen Umständen die beste Wirkung erzielt wird. Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Ver bindungen in einer Dosishöhe verabreicht, die im allgemeinen zu wirksamen Ergebnissen führt, ohne daß irgendwelche nach teiligen oder schädlichen Nebenwirkungen auftreten. Jedoch können die Dosen, abhängig von den jeweiligen Erfordernissen des Patienten und der jeweils eingesetzten Verbindung, variiert werden. Es ist günstig, die tägliche Gesamtdosis aufzuteilen und gewünschtenfalls portionsweise im Verlauf des Tages zu verabreichen.

Die Erfindung schafft somit auch ein pharmazeutisches Mittel, das mindestens eine Verbindung der Formel I oder ein pharma zeutisch verträgliches Salz davon in einem pharmakologisch verträglichen Träger enthält. Vorzugsweise ist das Arzneimit tel in Dosiseinheitsform formuliert.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 a) tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-M^im-tosyl- L-histidyl-N^im-tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl- D-tryptophyl-N^ε-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L- threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl- S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-Hydroxymethylpolystyrol

Man verestert chlormethyliertes Polystyrolharz (Lab Systems Inc.), das zu 1% mit Divinylbenzol vernetzt ist, nach der Arbeitsweise von Gisin, Helv. Chim. Acta, 56, 1976 (1973) mit BOS-Cys-(SMBzl)OH. Der Polystyrolharztester wird nach der nach folgenden Arbeitsweise A behandelt, um die folgenden Substanzen einzuführen: BOC-Ser(Bzl)OH, BOC-Thr(Bzl)OH, BOC-Phe-OH, BOC-Thr(Bzl)OH, BOC-Lys(Clz)OH, BOC-D-Trp-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-His(Tos)OH, BOC-His(Tos)OH und BOC-Cys(SMBz1)OH. Hierbei erhält man das in der Überschrift näher bezeichnete Peptidharz.

Arbeitsweise A

1. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.
2. Man behandelt mit TFA-CH₂Cl₂-EDT (1 : 1 : 5% v/v) während eines Zeitraums von 5 Minuten.
3. Man behandelt 25 Minuten lang wie in Stufe 2 beschrieben.
4. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.
5. Man wäscht mit DBF.
6. Man behandelt zweimal 3 Minuten lang mit 12% TEA in DMF.
7. Man wäscht mit DMF.
8. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.
9. Man behandelt mit 4 Äquivalenten des entsprechenden Aminosäurederivats in CH₂Cl₂-DMF und rührt 5 Minuten lang.
10. Man gibt in zwei Anteilen 5 Äquivalente DIC, gelöst in CH₂Cl₂, im Verlauf von 30 Minuten zu. Die Reaktionszeit beträgt 6 Stunden.
11. Man wäscht dreimal mit DMF.
12. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.
13. Man führt die Ninhydrinreaktion nach Kaiser et al., Annal. Biochem. 34, 595 (1970) durch. Im Falle einer unvoll ständigen Reaktion werden die obigen Stufen 9 bis 13 wiederholt.

b) L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenyl alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L- threonyl-L-seryl-L-cysteincyclisches (1-12) Disulfid

Man vermischt das Peptidharz gemäß Stufe a) (9 g) mit Anisol (18 mg) und behandelt mit flüssigem HF (180 ml) in einem Eisbad während eines Zeitraums von 45 Minuten. Das überschüssige HF wird so schnell wie möglich (ungefähr 1 Stun de) im Vakuum entfernt. Man extrahiert den Rückstand mit ent gaster 2 m Essigsäure und filtriert dann. Das Filtrat wird mit Äther gewaschen, und die wässerige Schicht wird bei pH 7 mit K₃Fe(CN)₆ oxydiert. Der Überschuß an Oxydationsmittel wird mit Hilfe eines Ionenaustauscherharzes Bio Rad® AG-3 entfernt. Dann wird das Peptid an einem Ionenaustauscherharz Bio Rex® 70 absorbiert und mit einem Pyridinpuffer von pH 7 eluiert, wo bei man nach dem Lyophilisieren 1,5 g Material erhält. Dieses Material wird auf eine Säule mit Sephadex® G 15 (2,5 cm × 160 cm) aufgebracht und mit 15%iger wässeriger AcOH eluiert. Die Fraktionen (5,2 ml jeweils) in den Röhrchen 88 bis 90 werden vereinigt und lyophilisiert. Hierbei erhält man 174 mg Titel verbindung.

R _f (BWA, 4 : 1 : 1) 0,45
R _f (BWAP, 30 : 24 : 6 : 20) 0,64
Aminosäureanalyse: Thr(2)1,87, Ser(1)0,89, Cys(2)1,16, Phe(3)3, Lys(1)1,05, His(2)1,76, Trp ND.

Die pharmakologische Wirksamkeit des in Beispiel 1b) hergestell ten Dodecapeptids wurde in vivo nach den nachfolgenden Arbeits weisen bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend angegeben:

Unterdrückung des Wachstumshormons

Man verabreicht eine subkutane (sc) Injektion des in physiolo gischer Kochsalzlösung gelösten oder suspendierten Peptids an Charles River CD® männliche Ratten. Die Ratten hatten zuvor nicht gefastet. Als Kontrolltiere nimmt man Ratten, denen eine entsprechende Kochsalz-Kontrollösung subkutan injiziert wurde, so daß für jede Testratte eine Kontrollratte vorhanden ist. Man hält die Ratten in getrennten Käfigen und verabreicht ihnen 20 Minuten vor Ende des Testzeitraums eine intraperito neale (ip) Injektion von Nembutal® in einer Dosis von 50 mg/kg. Blutproben werden durch Herzpunktion erhalten. Man trennt das Plasma ab, um die Konzentration (ng/ml) an Wachstumshormon (GH) durch Radioimmunoassay zu bestimmen. Man wählt Zeiträume von 2 und 4 Stunden nach der Injektion, um die Wirkungsdauer der Peptide bei der Unterdrückung zirkulierender, peripherer GH-Spiegel zu untersuchen. Die Vergleiche zwischen den GH-Wer ten bei den Kontrolltieren und den Testtieren werden zu jedem Zeitraum nach dem Student "t"-Test ausgewertet. Die statistische Signifikanz (p) bei einem Spiegel von 0,05 oder geringer wird als Aktivitätsindex genommen.

Unterdrückung von Wachstumshormon, Glucagon und Insulin

Man teilt männliche Albino-Ratten in drei Gruppen zu je 9 Ratten pro Gruppe auf. Man injiziert Nembutal zu 50 mg/kg intraperitoneal. 15 Minuten nach der Nembutal-Injektion wird den Ratten je nach Gruppe (a) Testverbindung, typischerweise 10 bis 2000 µg/kg, (b) SRIF, 200 µg/kg oder (c) physiologische Kochslazlösung, injiziert. 10 Minuten später injiziert man 0,5 ml Arginin (300 mg/ml; pH=7,2) in das Herz. 5 Minuten nach der Verabreichung des Arginins werden die Ratten ent hauptet, und das Blut in Trasylol-EDTA gesammelt. Dann werden entsprechende aliquote Anteile auf Wachstumshormon, Glucagon und Insulin untersucht. Als aktive Verbindung wird eine Ver bindung klassifiziert, die den Plasmaspiegel irgendeiner die ser Hormone im Vergleich zu den Kochsalzlösung-Kontrollen signifikant verändert. Die Vergleiche zwischen den Test- und Kontrollwerten werden durch die Analyse der Variationsmethode statistisch ausgewertet. Die statistische Signifikanz (p) bei einem Wert von 0,05 oder niedriger wird als Aktivitätsindex gebracht.

Beispiel 2 a) tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N^gn-tosyl- L-arginyl-N^im-tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl- D-tryptophyl-N^ε-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L- threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl- S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-Hydroxymethylpolystyrolester

Man verestert chlormethyliertes Polystyrolharz (Lab Systems Inc.), das mit Divinylbenzol zu 1% vernetzt ist, nach der Methode von Gisin, Helv. Chim. Acta, 56, 1976 (1973) mit Boc-Cys-(SMBzl)-OH. Der Polystyrolharzester wird nach der Arbeitsweise A behandelt, um die Bestandteile: Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Lys(ClZ)-Oh, Boc-D-Trp-OH, Boc-PHe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-His(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH und Boc-Cys(SMBzl)-OH einzuführen. Man erhält das oben näher bezeichnete Peptidharz.

Arbeitsweise A

1. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.
2. Man behandelt 5 Minuten lang mit TEA-CH₂Cl₂-EDT (1 : 1 : 5%, v/v).
3. Man behandelt 25 Minuten lang wie in Stufe 2 beschrieben.
4. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.
5. Man wäscht mit DMF.
6. Man behandelt zweimal 3 Minuten lang mit 12% TEA in DMF.
7. Man wäscht mit DMF.
8. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.
9. Man behandelt mit 4 Äquivalenten des entsprechenden Amino säurederivats in CH₂Cl₂-DMF und rührt 5 Minuten lang.
10. Man gibt in zwei Portionen 5 Äquivalente DIC, gelöst in CH₂Cl₂, im Verlauf von 30 Minuten zu. Die Reaktionszeit beträgt 6 Stunden.
11. Man wäscht dreimal mit DMF.
12. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.
13. Man führt die Ninhydrinreaktion nach Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970) durch. Im Falle einer unvoll ständigen Reaktion werden die obigen Stufen 9 bis 13 wie derholt.

b) L-Cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl- D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L- seryl-L-cysteincyclisches (1-12) Disulfid

Man vermischt das Peptidharz der Stufe a) (8,5 g) mit Anisol (16 ml) und behandelt dann mit flüssiger HF (100 ml) 45 Minuten lang. Der Überschuß an HF wird so schnell wie möglich im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in 25%iger wässeriger AcOH aufgenommen. Man filtriert den polymeren Träger ab und wäscht das Filtrat mit Äther. Die wässerige Schicht wird in 3,5 l Wasser gegossen. Der pH wird mit NH₄OH auf 7 eingestellt, und anschließend oxydiert man die Sulfhydrylverbindung mit K₃Fe(CN)₆. Man stellt den pH mit Eisessig auf 5 ein und ent fernt das anorganische Oxydationsmittel mit Bio Rad® AG 3. Das Peptid-Material wird auf Bio Rex® 70 absorbiert und mit Pyridinpuffer von pH 7 eluiert. Hierbei erhält man 2 g rohe Verbindung. Dieses Material wird durch eine Säule mit Sephadex® G-15 (2,5 × 160 cm) durchgegeben und mit 15%iger wässeriger AcOH eluiert. Das Material in den Fraktionen 47 bis 93 (jede Fraktion beträgt 5,2 ml) mit einem Gewicht von 886 mg wird auf eine Säule mit CM-Sephadex® G-25 aufgegeben und unter Verwendung eines stufenweisen NH₄OAc-Gradienten (0,1 bis 0,3 molare NH₄OAc) eluiert. Hierbei erhält man die Titelverbindung. Dieses Material wird auf eine Säule mit Sephadex® LH 20 (2,5 × 92 cm) aufgegeben und mit 10%iger wässeriger AcOH eluiert. Die reine Titelverbindung wird in den Fraktionen 55 bis 63 (jeweils 4,1 ml) erhalten. Die Aus beute beträgt 159 mg.

R _f (BWA, 4 : 1 : 1) 0,46 R _f (BWAP, 30 : 24 : 6 : 20) 0,65
Aminosäureanalyse: Thr(2)1,94, Ser(1)0,91, Cys(2)1,79, Phe(3)3, His(1)1,02, Lys(1)0,85, Arg(1)0,95, Trp. ND

Die pharmakologische Wirksamkeit der in Beispiel 2b) hergerstell ten Titelverbindung wurde in vivo durch die folgende Arbeits weise bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind angegeben:

Unterdrückung von Wachstumshormon, Glucagon und Insulin

Man teilt männliche Albino-Ratten in drei Gruppen zu je 9 Ratten pro Gruppe auf. Man injiziert Nembutal zu 5C mg/kg intraperitoneal. 15 Minuten nach der Nembutal-Injektion wird den Ratten je nach Gruppe (a) Testverbindung oder (b) physiologische Kochsalzlösung, injiziert. 10 Minuten später injiziert man 0,5 ml Arginin (300 mg/ml; pH=7,2) in das Herz. 5 Minuten nach der Verabreichung des Arginins werden die Ratten ent hauptet, und das Blut in Trasylol-EDTA gesammelt. Dann werden entsprechende aliquote Anteile auf Wachstumshormon (GH) Glucagon (GLUN) und Insulin (INS) untersucht. Als aktive Verbindung wird eine Ver bindung klassifiziert, die den Plasmaspiegel irgendeiner die ser Hormone im Vergleich zu den Kochsalzlösung-Kontrollen signifikant verändert. Die Vergleiche zwischen den Test- und Kontrollwerten werden durch die Analyse der Variationsmethode statistisch ausgewertet. Die statistische Signifikanz (p) bei einem Wert von 0,05 oder niedriger wird als Aktivitätsindex gebraucht.

Ergebnisse

Beispiel 3 a) tert.-Butyloxy-carbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-im-tosyl- L-histidyl-im-tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl- D-tryptophyl-ε-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L- threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl- S-p-methoxybenzyl-D-cysteinyl-Hydroxymethylpolystyrolester

Man verestert chlormethyliertes Polystyrolharz (Lab Systems Inc.), das mit Divinylbenzol zu 1% vernetzt ist, mit Boc-D-Cys- (SMBzl)OH nach der Methode von Gisin, Helv. Chim. Acta, 56. 1976 (1973). Das Polystyrolharz wird nach der Arbeitsweise A behandelt, um die folgenden Bestandteile: Boc-Ser(Bzl)OH, Boc-Thr(Bzl)OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(Bzl)OH, Boc-Lys(ClZ)OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-His(Tos)OH, Boc-His(Tos)OH und Boc-Cys(SmBzl)OH einzuführen. Hierbei er hält man das oben näher bezeichnete Peptidharz.

b) L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-ohenyl alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L- threonyl-L-seryl-D-cystein-cyclisches (1-12) Disulfid; Diace tatsalz

Man vermischt das Peptidharz der Stufe a) (10 g) mit Anisol (20 ml) und behandelt mit flüssiger HF (150 ml) 45 Minuten lang in einem Eisbad, wobei man für Luftausschluß sorgt. Die überschüssige HF wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in 50%iger wässeriger AcOH aufgenommen. Man filtriert die Mischung und verdünnt das Filtrat mit Wasser auf 3,5 l. Der pH wird mit verdünntem NH₄OH auf 7 eingestellt. Das Disulfhydrylpeptid wird mit K₃Fe(CN)₆ zum cyclischen Di sulfid oxydiert. Man stellt den pH der Mischung mit Eisessig auf 5 ein und behandelt mit Bio Rad AG 3. Das Peptid-Material wird auf Bio Rex® 70 (H⁺-Form) absorbiert und mit Pyridinpuffer (Py-H₂O-AcOH, 30 : 66 : 4, v/v) eluiert. Die das Peptid-Material enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Hierbei erhält man 1,6 g Rohmaterial. Dieses Rohmaterial wird auf einer Säule mit Sephadex® LH-20 (2,5 × 90 cm) aufgebracht und mit 10%iger wässeriger AcOH eluiert (Fraktionen zu je weils 5,8 ml). Das Material, das in den Fraktionen 97 bis 101 auftritt, wird vereinigt und lyophilisiert, wobei man das oben näher bezeichnete Dodecapeptid erhält. Ausbeute 171 mg.

TLC (Dünnschichtchromatographie), mi Avicel vorbeschichtete Glasplatten, R _f (BWA, 4 : 1 : 1, v/v) 0,32, R _f (BWAP, 30 : 24 : 6 : 20, v/v) 0,56.

Aminosäureanalyse: Thr(2)1,85, Ser(1)0,84, Cys(2)1,29, Phe(3)3, Lys(1)1,05, His(2)1,41, Trp(1)0,75.

Die pharmakologische Aktivität des in Beispiel 3b hergestellten Dodecapeptids wurde in vivo nach den auf das Beispiel 1 fol genden Arbeitsweisen bestimmt. Die erhaltenen Daten sind wie folgt:

Unterdrückung des Wachstumshormons

Unterdrückung von Wachstumshormonen, Glucagon und Insulin

Aus den Daten ist ersichtlich, daß das Peptid gemäß Beispiel 3b) zu einer spezifischen Unterdrückung von Glucagon und Wachstums hormon führt, ohne daß die Insulinsekretion beeinträchtigt wird. Diese Wirkung wird bereits bei niedrigen Dosen hervorgerufen.

Beispiel 4 a) tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N^gn- tosyl-L-arginyl-γ-benzyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenyl alanyl-D-tryptophyl-N^ε-2-chlor-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-O- benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl- L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cystein-Hydroxymethylpolystyrol ester

Man verestert chlormethyliertes Polystyrolharz nach der Arbeitsweise von Gisin, Helv. Chim. Acta., 56, 1976 (1973) mit Boc-Cys(SMBzl)OH. Dann wird der Aminosäureharzester nach Arbeitsweise A (nachstehend aufgeführt) behandelt, wobei man in Stufe 9 der Arbeitsvorschrift Boc-Ser(Bzl)OH als geschützte Aminosäure einsetzt. Anschließend wiederholt man die Arbeits weise A, um nacheinander die folgenden Aminosäuren in das Peptidharz einzuführen:

Boc-Thr(Bzl)-OH
Boc-Phe-OH
Boc-Thr(Bzl)-OH
Boc-Lys(ClZ)-OH
Boc-D-Trp-OH
Boc-Phe-OH
Boc-Phe-OH
Boc-Glu(OBzl)-OH
Boc-Arg(Tos)-OH
Boc-Cys(SMBzl)-OH

Arbeitsweise (zur Behandlung des Harzesters)

1. Man wäscht dreimal mit Methylenchlorid (CH₂Cl₂).
2. Man behandelt 5 Minuten lang mit Trifluoressigsäure/Methy lenchlorid (1 : 1, v/v), enthaltend 5% 1,2-Äthandithiol.
3. Man wiederholt Stufe 2 und führt diese Behandlung 25 Minu ten lang durch.
4. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.
5. Man wäscht mit Dimethylformamid (DMF).
6. Man behandelt 3 Minuten lang mit 12%igem Triäthylamin in DMF.
7. Man wäscht mit DMF.
8. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.
9. Man behandelt mit 4 Äquivalenten der entsprechend ge schützten Aminosäure in CH₂Cl₂-DMF und rührt 5 Minuten lang.
10. Man gibt in zwei Anteilen im Verlauf von 30 Minuten 5 Äquivalente Diisopropylcarbodiimid, gelöst in CH₂Cl₂, zu. Man läßt die Reaktion 6 Stunden lang erfolgen.
11. Man wäscht dreimal mit DMF.
12. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.
13. Man führt die Ninhydrin-Reaktion nach der Arbeitsweise von Kaiser et al., Annal. Biochem. 34, 595 (1970) durch. Im Falle einer unvollständigen Reaktion werden die obigen Stufen 9 bis 13 wiederholt.

b) L-Cysteinyl-L-arginyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenyl alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L- threonyl-L-seryl-L-cystein-cyclisches (1-12) Disulfid

Man suspendiert das Peptidharz gemäß Stufe a) (8,5 g) in Anisol (16 ml) und behandelt mit wasserfreiem, flüssigem Fluorwaserstoff (HF) 45 Minuten lang in einem Eisbad. An schließend entfernt man die überschüssige HF unter Vakuum und extrahiert den Rückstand mit 10%iger wässeriger Essig säure. As Filtrat wird mit Äther gewaschen, und die wässerige Schicht wird in 5 l Wasser gegossen. Dann bringt man den pH mit verdünntem Ammoniumhydroxyd auf einen Wert von 7. Die Mischung wird an der Luft 48 Stunden gerührt und dann wird der pH mit Eisessig auf 5 eingestellt. Schließlich wird das Peptid auf Amberlite® CG-50 (H⁺-Form) absorbiert. Man eluiert das Peptid-Material mit 50%iger wässeriger Essigsäure und lyophilisiert, wobei man 850 mg festes Material erhält.

Das Rohprodukt wird auf eine Säule mit Sephadex® LH 20 (2,5 × 150 cm) aufgebracht und mit 10%iger Essigsäure eluiert. Die Fraktionen 94 bis 130 werden vereinigt und lyophilisiert, wobei man 483 mg Material erhält. Dieses Material wird auf eine Säule mit Sephadex® G 25 (1,5 × 115 cm) aufgebracht und mit 10%iger wässeriger Essigsäure eluiert. Die Fraktionen 43 bis 53 werden vereinigt und lyophilisiert. Hierbei erhält man das oben näher bezeichnete Peptid. Ausbeute 286 mg.

TLC (Dünnschichtchromatographie), mit Avicel vorbeschichtete Glasplatten, R _f (BWA, 4 : 1 : 1, v/v) 0,40, R _f (BWAP, 30 : 24 : 6 : 20, v/v) 0,65.
Aminosäureanalyse: Thr(2)1,92, Ser(1)0,89, Glu(1)1,03, Cys(2)1,49, Phe(3)3, Lys(1)1,05, Trp(1)0,81, Arg(1)1,02.

Beispiel 5 a) tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N^im-tosyl- L-histidyl-q-benzyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl- D-tryptophyl-N^ε-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L- threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl- S-p-methoxybenzyl-L-cycstein-Hydroxymethylpolystyrolester

Man verestert chlormethyliertes Polystyrolharz nach der Ar beitsweise von Gisin, Helv. Chim. Acta., 56, 1976 (1973) mit Boc-Cys(SMBzl)-OH. Dann wird das Aminosäureharz nach Arbeits weise A (vgl. Beispiel 9) behandelt, wobei man die in Stufe 9 als geschützte Aminosäure das Boc-Ser(Bzl)-OH einsetzt. Dann wird Arbeitsweise A wiederholt, um nacheinander die folgenden Aminosäuren in das Peptidharz einzuführen:

Boc-Thr(Bzl)-OH
Boc-Phe-OH
Boc-Thr(Bzl)-OH
Boc-Lys(ClZ)-OH
Boc-D-Trp-OH
Boc-Phe-OH
Boc-Phe-OH
Boc-Glu(OBzl)-OH
Boc-His(Tos)-OH
Boc-Cys(SMBzl)-OH

b) L-Cysteinyl-L-histidyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenyl alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L- threonyl-L-seryl-L-cystein-cyclisches (1-12) Disulfid

Man behandelt das Peptidharz gemäß Stufe a) (8 g) mit flüssigem, wasserfreiem HF, wie In Beispiel 10 beschrieben, und cyclisiert das lineare Disulfhydryldodecapeptid durch Oxy dation mit K₃Fe(CN)₆ bei pH 7,3 und bei hoher Verdünnung. Man bringt den pH mit Eisessig auf einen Wert von 5 und behandelt die Mischung mit Bio Rad® AG-3X4 (Cl-Form) Ionenaustauscher harz und absorbiert dann auf Amberlite® CG 50 (⁺-Form). Das Peptid-Material wird mit 30% wässeriger Essigsäure eluiert und lyophilisiert. Hierbei erhält man 500 mg Rohmate rial. Dieses Material wird durch eine Säule mit Sephadex® LH 20 chromatographiert, wobei man das oben näher bezeichnete Dodeca peptid erhält.

TLC (Dünnschichtchromatographie), mit Avicel vorbeschichtete Glasplatten, R _f (BW, 4 : 1 : 1, v/v) 0,43, R _f(tert.-AmOH-Py-W, 7 : 7 : 6, v/v) 0,74.
Aminosäureanalyse: Thr(2)1,92, Ser(1)0,93, Glu(1)0,94, Cys(2)1,59, Phe(3)3, Lys(1)1,02, His(1)0,91, Trp(1)0,81.

Die biologische Aktivität der Peptide gemäß Beispielen 4b) und 5b) wurde mit Hilfe der nachfolgenden Arbeitsweise bestimmt:

Man verabreicht eine Dosis von 50 mg pro kg Nembutal intra peritoneal an männliche Albino-Ratten. 15 Minuten später wird eine subkutane Injektion der Testverbindung in physiologischer Kochsalzlösung verabreicht. 10 Minuten später werden 0,5 ml Arginin (300 mg pro ml; pH 7,2) in das Herz injiziert. 5 Minu ten nach Verabreichung des Arginins werden die Ratten geköpft, und das Blut wird in Trasylol-EDTA gesammelt . Entsprechende, aliquote Anteile werden durch Radioimmunoassay auf Wachstums hormon (GH), Insulin und Flucagon untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchung sind wie folgt:

Die Daten zeigen, daß die für die erfindungsgemäßen Peptide repräsentativen Peptide der Beispiele 4b und 5b wirksame Mittel zur Unterdrückung des Wachstumshormons und des Glucagons darstellen, ohne daß bei einer Dosis von 40 mg/kg bzw. 50 mg/kg die Insulinspiegel wesentlich beeinträchtigt werden. Die Peptide der Beispiele 4b und 5b wurden bei mit Nembutal be handelten Ratten auch hinsichtlich der Dauer ihres Einflusses auf die GH-Sekretion untersucht. Das Peptid gemäß Beispiel 10 zeigte eine signifikante Inhibierung des GH während mindestens 4 Stunden bei einer Dosis von 1000 mg/kg (s. c.). Das Peptid gemäß Beispiel 12 zeigte nach 2 und 4 Stunden keine signifikante Inhibierung des GH.

Die hier beschriebenen Verbindungen können an warmblütige Säuger intravenös, subkutan, intramuskulär oder oral verab reicht werden, um bei der Behandlung von Diabetes die Menge an Serumglucose zu steuern. Die erforderliche Dosis variiert mit dem jeweiligen Zustand und der Behandlungsdauer.

Man kann den aktiven Bestandteil alleine oder in Verbindung mit pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Bindemitteln verabreichen. Geeignete pharmazeutische Mittel lassen sich auf der Grundlage des Fachwissens formulieren.

Beispiel 6 Klassische Synthese von L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenyl alanin-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl--L- threonyl-L-seryl-L-cystein cyclisches (1-12) Disulfid (a) N-Benzyloxycarbonyl-im-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L- phenylalanyl-Methylester (I)

Eine Suspension von 42,3 g (0,1 Mol) Z-His(Z)-OH und 21,8 g (0,1 Mol) Phe-OMe · HCl (98%) in 1000 ml) CH₂Cl₂ wird auf 0°C abgekühlt. Dann gibt man 22 g (0,12 Mol) DCC und 10,1 g (0,10 Mol) Triäthylamin zu. Man läßt die Mischung über Nacht Raumtemperatur erreichen.

Der abgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat wird konzentriert. Hierbei erhält man ein gummiartiges Material. Man löst das Material in Äthyl acetat und filtriert unlösliches Material ab. Das EtOAc wird mit 5%iger Zitronensäure, Wasser, eiskalter 5%iger Natriumbicarbonatlösung und wiederum mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet, auf ein Drittel ihres ursprünglichen Volumens konzentriert, und man gibt Äther (500 ml) zu, bis die Lösung trübe wird. Dann läßt man in einem kalten Raum über Nacht stehen. Der gebildete weiße Feststoff wird abgetrennt und getrocknet. Man erhält 32 g Produkt mit Schmelzpunkt 131 bis 133°C.

TLC: Silicagel F-254, CH₂Cl₂ : MeOH (9 : 1) R _f=0,8

(b) im-Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-Methylester- Dihydrobromidsalz (II)

30 g (0,5 Mol) Z-His(Z)-Phe-OMe (I) wird in 300 ml HBr-HOAc (32%) die Lösung wurde nach 2 Minuten trüb gelöst, und die Mischung wird 30 Minuten bei Raum temperatur stehengelassen. Dann gibt man Äther zu, um einen Niederschlag zu erhalten. Der weiche Feststoff wird ab filtriert und über Nacht getrocknet. Man erhält 32 g Fest stoff mit Schmelzpunkt 135 bis 137°C.

TLC: die Substanz wandert nicht.

(c) N-Benzyloxycarbonyl-im-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-im- benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-Methylester (III)

Eine Suspension von 30,5 g (0,05 Mol) His(Z)-Phe-OMe · 2HBr (II) und 21,7 g (0,05 Mol) Z-His(Z)-OH in 500 ml CH₂Cl₂ wird auf 0°C abgekühlt. Dann gibt man 11 g DCC und 10,1 g (0,10 Mol) Triäthylamin zu. Man läßt die Mischung über Nacht Raumtemperatur erreichen.

Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, und das Filtrat wird konzentriert. Hierbei erhält man ein glasartiges Material. Man löst den Rückstand in Äthyl acetat und wäscht das EtOAc mit 10%iger Zitronensäure H₂O, eiskaltem 5%igen Natriumbicarbonat und wiederum mit Wasser. Man trocknet die EtOAc-Phase über Natrium sulfat, konzentriert auf ungefähr ein Drittel ihres Anfangs volumens und gibt Äther zu. Hierbei erhält man eine Trübung in der Lösung. Man läßt in einem kalten Raum stehen. Dann trennt man den gebildeten weißen Feststoff ab. Ausbeute 29,5 g.

(d) L-Histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-Methylester-Tri hydrochloridsalz (IV)

Eine Mischung aus 29 g

10,8 ml konz. HCl, 180 ml MeOH und zwei Spatelspitzen 10%iges Pd-C wird unter Verwendung einer Parr-Hydriervorrichtung 5 Stunden lang hydriert.

Nach dem Abfiltrieren wird das Methanol entfernt, wobei man ein Öl erhält. Man gibt Äther zu, um einen Feststoff zu bilden. Für die nachfolgende Reaktion verwendet man 18 g des so erhaltenen Rohmaterials, ohne dieses weiter zu reinigen.

(e) tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-L- histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-Methylester (V)

Man rührt 30 Minuten lang eine Mischung aus 13 g Boc-Cys(MBzl)-OH (0,038 Mol), 5,4 g Hydroxybenzotriazol (0,040 Mol) und 8,3 g (0,040 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid in 1 l eiskaltem Methylenchlorid. Dann gibt man 19,5 g His-His-Phe-OMe · 3HCl (0,0345 Mol) und 10,5 ml N-Methyl morpholin (0,096 Mol) zu und rührt die Mischung über Nacht, wobei sie Raumtemperatur erreicht. Die Suspension wird filtriert, um den Dicyclohexylharnstoff abzutrennen. Dann wäscht man das Filtrat nacheinander mit Wasser, 10%igem NaHCO₃, wiederum mit Wasser und trocknet dann über Na₂SO₄. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Es bleiben 21,0 g Rohprodukt zurück.

Dieses Material wird 30 Minuten lang in 100 ml Acetonitril bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Der Nieder schlag wird zuerst mit Acetonitrilund anschließend mit Äther gewaschen und dann getrocknet. Man erhält 11 g Substanz.

TLC: R _f 0,12 Silicagel 60, CHCl₃ : CH₃OH : HAc 9 : 1 : 0,5 v/v.

Das Filtrat der Acetonitril-Extraktion enthält Produkt und Verunreinigungen und ist zur Extraktion weiterer Rohproduktfraktionen geeignet.

(f) tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-L- histidyl-L-histidyl-L-phenylalanin (VI)

Man löst 11,0 g Boc-Cys(MBzl)-His-His-Phe-OMe (0,0142 Mol) in 200 ml Methanol unf gibt 30 ml 1n Kaliumhydroxyd zu. Die Lösung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und das Methanol wird im Vakuum entfernt. Man verdünnt den Rückstand mit 200 ml Wasser und filtriert. Das Filtrat wird mit 10%iger Zitronensäure auf pH 5 eingestellt. Der erhaltene gummiartige Niederschlag wird während der Kristallisation stehen gelassen. Man filtriert das Pro dukt, wäscht mit Wasser und trocknet im Vakuum über P₂O₅. Die Ausbeute beträgt 7,3 g (67%).

TLC: R _f 0,52 Silicagel 60-n-Butanol : Äthylacetat : Essig säure : H₂O 1 : 1 : 1 : 1 v/v
R _f 0,43 Silicagel 60 tert.-Amylalkohol : Pyridin : H₂O 7 : 6 : 7 v/v.

(g) N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenyl alanin-Methylester (VII)

Eine Lösung von 61,8 g Boc-L-Thr(Bzl)-OH (0,2 Mol) und 22,4 ml N-Methylmorpholin (0,2 Mol) in THF wird auf -15°C abgekühlt. Man gibt portionsweise 26,2 ml (0,2 Mol) Iso butylchlorformiat zu, wobei man die Temperatur zwischen -15°C und -10°C hält. Nach 15minütigem Rühren bei -15°C gibt man eine kalte Mischung aus 43,1 g L-Phe-OMe · HCl (0,2 Mol) und 22,4 ml N-Methylmorpholin (0,2 Mol) in DMF portionsweise zu, wobei man die Temperatur zwischen -10°C und -5°C hält. Man rührt die Mischung 2 Stunden bei 0°C und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur. Die filtrier te Reaktionsmischung wird im Vakuum konzentriert, und der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen. Man wäscht die Äthylacetatlösung der Reihe nach mit 5%iger KHSO₄, 5%iger KHCO₃, mit Kochsalzlösung und trocknet dann über Na₂SO₄. Nach dem Konzentrieren im Vakuum erhält man ein Öl, das beim Stehenlassen kristallisiert. Der Feststoff wird aus Isopropyläther-Hexan umkristallisiert. Man erhält 74,9 g Produkt (80%) mit Schmelzpunkt 78 bis 81°C.

[α] + 10,75 (c 1,023, MeOH);
R _f (CHCl₃) 0,35.

Analyse für C₂₆H₃₄N₂O₆ (470,55)
ber.: C 66,36; H 7,28; N 5,95;
gef.: C 66,72; H 7,32; N 5,85.

(h) N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonin-L-phenyl alanin (VIII)

Man löst 23,5 g Boc-Thr(Bzl)-Phe-OMe (0,05 Mol) in einer Mischung aus MeOH-Dioxan (100 ml, 1 : 1) und behandelt 3 Stun den lang mit 55 ml 1n NaOH (bis durch TLC kein Ausgangs material mehr feststellbar ist). Man verdampft die Haupt menge des Lösungsmittels im Vakuum und verdünnt den Rück stand mit Wasser und säuert dann mit 5%iger Zitronen säure an. Das gummiartige Material, das sich abgeschieden hat, wird in EtOAc aufgenommen und mit Wasser (Kochsalz lösung) gewaschen und dann zur Trockne eingedampft. Man kristallisiert den Rückstand aus Et₂O-Hexan und erhält 19,8 g (87%) Produkt mit Schmelzpunkt 118 bis 119°C.

R _f (Chloroform-Methanol-Eisessig, 85 : 10 : 5) 0,80.

(i) N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L- serin-Methylester (IX)

Man löst 30,9 g N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L- threonin (0,1 Mol) in 200 ml trockenem Tetrahydrofuran, das auf -20°C abgekühlt war, und behandelt mit 11 ml N-Methylmorpholin, gefolgt von 13,4 ml Isobutylchlorformiat. Man rührt die kalte Reaktionsmischung 5 Minuten lang bei -20°C und behandelt dann mit einer Lösung von 25 g O-Benzyl- L-serin-Methylester-Hydrochlorid (ungefähr 0,1 Mol) in DME, das 11 ml N-Methylmorpholin enthält und läßt dann die Mischung über Nacht Raumtemperatur erreichen.

Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt, und der Rück stand wird zwischen Wasser-Äthylacetat verteilt. Man wäscht die organische Phase mit 5%iger Zitronensäure, Wasser, wässerigem KHCO₃ und wiederum mit Wasser und trocknet dann über MgSO₄. Anschließend dampft man zur Trockne ein, wobei man einen öligen Rückstand erhält, der aus Diäthyl äther-Hexan kristallisiert. Man erhält einen gelee-artigen Feststoff (29 g).

R _f (CHCl₃-MeOH, 25 : 1) 0,85, R _f (EtOAc-Hexan 1 : 1) 0,65.

(j) N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L- serin (X)

Man löst 28,2 g Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-OMe (0,0563 Mol) in ungefähr 50 ml Methanol auf und behandelt 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 75 ml 1n Natriumhydroxyd. Die alkalische Lösung wird mit 10%iger Zitronensäure zu pH 7 neutralisiert. Die Hauptmenge des Methanols wird im Vakuum entfernt. Den Rückstand verdünnt man mit etwas Wasser und säuert mit 5%igem wässerigem KHSO₄ an und extrahiert schließlich mit EtOAc. Die organische Phase wird mit Was ser gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und zur Trockne ein gedampft. Man erhält ein Öl. Die Ausbeute ist quantitativ.

R _f (EtOAc-Hexan, 1 : 1) 0,15 (langgezogener Spot).

(k) N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L- seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cystein-Benzylester (XI)

Man löst 24,3 g Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-OH (50 mMol) in 250 ml Acetonitril und Dichlormethan (2 : 3) und vermischt mit 25 g HCys(SMBzl)-Bzl-TosOH (50 mMol) und anschließend mit 6,8 ml Triäthylamin und 6,8 g N-Hydroxybenzotriazol. Dann wird die Mischung in einem Eisbad abgekühlt.

Man gibt eine Lösung von 11 g DCC (53 mMol) in 50 ml Acetonitril zu und rührt die Reaktionsmischung 2 Stunden in der Kälte und anschießend 2 Tage bei Raumtemperatur. Das abgeschiedene DCU (Dicyclohexylharnstoff) wird ab filtriert, und das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Man verteilt den öligen Rückstand zwischen Äthylacetat und Wasser und wäscht die organische Phase mit 10%iger Zitronensäure, Wasser, 5%iger KHCO₃, anschließend mit Kochsalzlösung und trocknet dann über NA₂SO₄. Das Lösungs mittel wird verdampft, und der ölige Rückstand wird aus Et₂O-Hexan kristallisiert, wobei man 24,5 g eines weißen Feststoffs mit Schmelzpunkt 87 bis 90°C erhält.

R _f (Chloroform-Methanol, 25 : 1) 0,54, Spuren bei 0,4 und 0,3 (Heptan-EtOAc, 1 : 1) 0,64, Spuren bei 0,25
J₂ positiv; [α] -14,7 (c 0,98, DMF)

Elementaranalyse für C₄₄H₅₂N₃SO₉ (798,9)
ber.: C 66,15; H 6,56; N 5,26;
gef.: C 66,22; H 6,95; H 5,29.

(l) O-Benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl- L-cystein-Benzylester-Trifluoracetat (XII)

Man vermischt 8 g Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)-OBzl (10 mMol) mit 100 mMol Anisol und behandelt 45 Minuten lang mit 100 ml TFA. Das Lösungsmittel wird im Vakuum ver dampft, und der Rückstand wird in trockenem Et₂O gelöst. Anschließend dampft man im Hochvakuum zur Trockne ein. Hierbei erhält man 7,2 g einer öligen Verbindung (90%).

R _f (n-Butanol-Wasser-Eisessig, 4 : 1 : 1) 0,9
R _f (Heptan-EtOAc) 0,0-0,1 langgezogener Spot
J₂ positiv und Ninhydrin-positiv.

(m) N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenyl alanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxy benzyl-L-cystein-Benzylester (XIII)

9,2 g Boc-Thr(Bzl)-Phe-Oh (20 mMol) (hergestellt nach der Methode des Beispiels III) werden in 100 ml DMF gelöst und mit 3,4 g N-Hydroxysuccinimid und einer Lösung von 20 mMol Thr(Bzl)Ser(Bzl)-Cys(SMBz)OBzl · TFA-Salz in 20 ml DMF, die mit Triäthylamin auf pH 7 neutralisiert ist, vermischt. Man kühlt die Mischung in einem Eisbad und behandelt 2 Stunden lang in der Kälte und anschließend 2 Tage lang bei Raumtemperatur mit 4,5 g DCC. Der DCU wird abfiltriert, und das Filtrat wird zur Trockne einge dampft. Man verreibt den Rückstand mit Wasser. Hierbei erhält man einen Niederschlag, der in EtOAc aufgenommen, mit 5%iger Zitronensäure, mit Wasser, mit 5%igem Na₂CO₃ und wiederum mit Wasser gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und zur Trockne eingedampft wird. Der Rückstand wird aus Et₂O-Hexan verfestigt. Er kann aus MeOH kristallisiert werden und ist in CHCl₃ sehr gut löslich. Man erhält 17,3 g (70%) Produkt mit Schmelzpunkt 105 bis 107°C.

R _f (CHCl₃-MeOH, 10 : 1) 0,90
[α] -3,6 (c 1, DMF)

Analyse für C₆₄H₇₅N₅SO₁₂H₂O (1156,2)
ber.: C 66,46; H 6,71; N 6,05;
gef.: C 66,68; H 6,59; N 6,20;

(n) tert.-Butyloxycarbonyl-D-tryptophyl-N^ε-benzyloxycarbonyl- L-lysyl-Methylester (XIV)

Man löst 30,4 g Boc-D-Trp-OH (0,1 Mol), 33 g Lys(Z)-OMe · HCl (0,1 Mol) und 13,6 ml Triäthylamin in 400 ml DMF und kühlt in einem Eisbad ab. Dann gibt man 22 g Dicyclohexylcarbo diimid zu und läßt die Mischung über Nacht Raumtemperatur erreichen. Der Dicyclohexylharnstoff, der sich abgeschie den hat, wird abfiltriert. Man konzentriert das Filtrat auf ein kleines Volumen und gibt dann überschüssiges Was ser zu, wobei man ein gummiartiges Material erhält. Dieses Material wird in Äthylacetat aufgenommen und mit 10%iger wässeriger Zitronensäure, H₂O, gesättigter NaHCO₃ und wiederum mit Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Dann dampft man zur Trockne ein. Der Rückstand wird zuerst mit Äther und dann mit Hexan verrieben. Hierbei erhält man 28 g eines kristallinen Feststoffs.

TLC: Silgel G, Hexan-EtOAc, 1 : 1, v/v, R _f 0,3.

(o) tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-N^ε- benzyloxycarbonyl-L-lysin (XV)

Ä) Man gibt 22 g Boc-D-Trp-Lys(Z)-OMe (44 mMol) zu einer vorgekühlten Mischung aus 220 ml TFA und 25 ml Anisol und rührt 30 Minuten lang in einem Eisbad. Das TFA wird so schnell wie möglich bei 27°C am Rotationsverdampfer verdampft, und das zurückgebliebene Öl wird mehrmals mit einem Gemisch Hexan-Äther 2 : 1 verrieben. Man dekantiert und behandelt unter einer Pumpe, wobei man 21,3 g (36 mMol) Produkt erhält.
B) 9,6 g Boc-Phe-OH (36 mMol), 5,3 g HOBT (39 mMol) und 8 g DCC (39 mMol) werden 20 Minuten lang in 500 ml kaltem Dichlormethan gerührt. Dann gibt man 21,3 g D-Trp-Lys(Z)-OMe · TFA-Salz (36 mMol) in 200 ml Dichlor methan zu, gefolgt von 4,25 ml N-Methylmorpholin (39 mMol). Man rührt das Reaktionsgemisch über Nacht, während man die Temperatur auf Raumtemperatur steigen läßt. Die Mischung wird filtriert, um das DCC zu ent fernen, und das Filtrat wird zweimal mit Wasser, zweimal mit 10%iger Zitronensäure, zweimal mit ge sättigter NaHCO₃-Lösung und schließlich zweimal mit Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Nach dem Filtrieren und Eindampfen erhält man 21,4 g (82%) Rückstand. Dieser wird ohne weitere Reinigung einge setzt. TLC: Silgel F-254/CHCl₃ 9 : CH₃OH 1 : HAc 0,5
R _f 0,76 plus Spuren von kleinen Verunreinigungen.
C) Man löst 22,9 g Boc-Phe-D-Trp-Lys(Z)-OMe (31,4 mMol) in 450 ml p-Dioxan und 100 ml Methanol, gibt 39 ml 1n wässerige KOH zu und rührt über Nacht bei Raumtempe ratur. Die Lösung wird am Rotationsverdampfer einge dampft. Man löst den Rückstand in 500 ml warmem Wasser, säuert mit 10%iger Zitronensäure auf pH 3 an, rührt 30 Minuten lang und filtriert. Nach dem Trocknen im Vakuum über Nacht erhält man 21,6 g (96%) Produkt mit Schmelzpunkt 85 bis 90°C. [α] +7,09 (c 0,987 MeOH)
R _f 0,63; CHCl₃ 9 : CH₃OH 1 : HAc, 0,5; Silgel F-254.

(p) tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-N^e- benzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenyl alanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxy benzyl-L-cysteinyl-Benzylester (XVI)

A) Man gibt 40,5 g Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys- (SMBzl)-OBzl (XIII) (35 mMol) zu einer kalten Mischung von 400 ml TFA und 40 ml Anisol und rührt 30 Minuten in der Kälte. Das TFA wird am Rotationsverdampfer ein gedampft. Der Rückstand wird mit 1 l 1 : 1 Äther-Hexan verrieben. Man erhält ein weißes Pulver. Nach dem Filtrieren, Waschen in Äther-Hexan und Trocknen im Vakuum über P₂O₂ und NaOH-Plätzchen erhält man 34,6 g Produkt (82%) mit Schmelzpunkt 136 bis 139°C (bei 120°C tritt Erweichung ein). [α] = -9,93 (c 1,04 MeOH)
N _f ^ε 0,63 Silgel CHCl₃ 9 : CH₃OH 1 : HAc 0,05 kleine polare Verunreinigung R _f 0,53
B) Man rührt 20,0 g Boc-Phe-D-Trp-Lys(Z)-OH (27,9 mMol), 4,15 g HOBT (30,8 mMol) und 6,3 g DCC (30,8 mMol) in 2,0 l kaltem Dichlormethan 30 Minuten lang in einem Eisbad. Man gibt 32,6 g H-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)- Cys(SMBzl)-OBzl · TFA-Salz (27,9 mMol( zu, gefolgt von 3,35 ml N-Methylmorpholin (30,8 mMol) und rührt über Nacht, während sich die Mischung auf Raumtemperatur erwärmt. Nach 2 Stunden erkennt man anhand von TLC, daß die Reaktion im wesentlichen beendet ist.
Man filtriert die Mischung und wäscht das Filtrat mit Wasser, 10%iger Zitronensäure, Wasser, gesättigter NaHCO₃-Lösung und wiederum mit Wasser und trocknet dann. Nach dem Filtrieren und Eindampfen zeigt Dünnschicht chromatographie (TLC) an, daß das Produkt und eine polare Verunreinigung vorliegt. Diese Verunreinigung wird durch Auflösen des Rohprodukts in 200 ml warmem DMF und Zugabe von 1 l 2%iger wässeriger NaHCO₃-Lösung entfernt. Man filtriert das Produkt, wäscht mit ver dünnter NaHCO₃-Lösung und Wasser und trocknet im Vakuum über P₂O₅. Die Ausbeute beträgt 36,5 g (75%) Produkt mit Schmelzpunkt 182 bis 184°C (bei 150°C schwindet das Produkt). [α] = 0 (c 0,988 CHCl₃)
R _f (einzelnes Spot) 0,76 Silgel CHCl₃ 9 : CH₃OH 1 : HAc 0,05.

(q) Herstellung von H-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)- Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)-OBzl-Trifluoracetatsalz (XVII)

32 g Boc-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)- Cys(SmBzl)-OBzl und 33 ml Anisol werden in 50 ml Dichlor methan gelöst, und man gibt 100 ml Trifluoressigsäure zu und rührt 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Lösung wird am Rotationsverdampfer bei 30°C eingedampft. Man verreibt den Rückstand mit wasserfreiem Äther, wobei man ein Pulver über P₂O₅ und Natriumhydroxid-Plätzchen getrocknet wird.

Dünnschichtchromatographie auf Silicagel 60 CHCl₃ : CH₃OH : HOAc 9 : 1 : 0,5 zeigt einen einzelnen Spot mit R _f 0,65. Das protonenmagnetische Resonanzspektrum (HNMR) zeigt keinen Peak für tert.-Butyl.

(r) tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-L- histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-trypto phyl-N^ε-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L- phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p- methoxybenzyl-L-cystein-Benzylester (XVIII)

Man rührt 5,5 g Boc-Cys(SMBzl)-His-His-PheOH (7,2 mMol), 1,07 g 1-Hydroxybenzotriazol-Monohydrat (7,9 mMol) und 1,65 g Dicyclohexylcarbodiimid (7,9 mMol) in 100 ml trocke nem Dimethylformamid 30 Minuten lang in einem Eisbad. Man gibt 12,5 g H-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)- Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)-OBzl-Trifluoracetatsalz (7,2 mMol) und 0,855 g N-Methylmorpholin (7,65 mMol) zu und läßt die Mi schung über Nacht unter Rühren Raumtemperatur erreichen. Die Suspension wird filtriert, um den Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, und das Filtrat wird auf 50 ml eingedampft und mit 500 ml gesättigter Natriumbicarbonat lösung verdünnt. Der erhaltene Feststoff wird filtriert, mit Wasser gewaschen und in 200 ml DMF wieder aufgelöst. Man verdünnt die Lösung mit 1 l 5%iger wässeriger Zitro nensäure und filtriert. Der Feststoff wird mit Wasser ge waschen, in 200 ml DMF gelöst und mit 1 l gesättigter Natriumbicarbonatlösung ausgefällt, filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur über P₂O₅ ge trocknet. Die Ausbeute beträgt 15 g.
Aminosäureanalyse: His 1,66(2,0); Lys 1,05(1,0); Phe(3,0); Ser 1,02(1,0); Thr 2,2(2,0).

(s) L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenyl alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L- threonyl-L-seryl-L-cystein cyclisches (1-12) Disulfid (XIX)

Man mischt 5 g Boc-Cys(SMBzl)-His-His-Phe-Phe-D-Trp-Lys(Z)- Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bezl)-Cys(SMBzl)-OBzl mit 10 ml Anisol und behandelt mit 100 ml flüssigem HF unter Luft ausschluß 60 Minuten lang in einem Eisbad. Man entfernt die überschüssige HF im Vakuum und nimmt den Rückstand in 200 ml 10%iger wässeriger AcOH auf und gießt in 7 l entgastes Wasser. Der pH wird mit verdünnter Na₄OH auf 7 eingestellt. Man rührt 24 Stunden an der Luft und bringt dann den pH mit Eisessig auf einen Wert von 5. Dann werden die Lösungen durch einen Säule mit Amberlite® CG 50 (H⁺-Form) gegeben. Das auf dem Ionenaustauscherharz absorbierte Peptid-Material wird mit 50%ige wässerige Essigsäure eluiert. Die das Peptid-Material enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Hierbei erhält man 2 g Rohmaterial. Das rohe Dodecapeptid wird durch Säulen chromatographie durch Sephadex® G 25, Eluieren mit 10%iger wässeriger AcOH und Verteilungschromatographie durch Sephadex® G 25 mit dem biplastischen System n-BuOH-Wasser- Eisessig 4 : 5 : 1, v/v, gereinigt.

TLC, Silicagel Merck AG, Chlor-Peptid-Spray, D. E. Nitecki et al. Biochem. 5, 665 (1966).
R _f (BWA, 4 : 1 : 1) 0,45, R _f (BWAP, 30 : 24 : 6 : 20) 0,64
Aminosäureanalyse: Thr(z)1,85, Ser(1)0,79, Pne(3)3, Lys(1)1,02, His(2)1,75, Cys, Trp ND. (N. D. = keine Daten)

Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß man in der in Bei spiel 6 beschriebenen klassischen Synthese andere Kupplungs mittel und Schutzgruppen einsetzen kann. Man kann auch unter schiedliche Aufbaustufen wählen, um die Aminosäurereste in der gewünschten Sequenz zu verbinden. Alle diese Methoden fal lenn in den Rahmen der Erfindung.

Claims

1. Analoga des Somatostatins der allgemeinen Formel I worin
A für ein Wasserstoffatom steht oder die beiden Gruppen A eine direkte Bindung zwischen den Schwefelatomen S darstellen;
X Wasserstoff,
X₁ His oder Arg,
X₂ His oder Glu,
X₃ D-Trp und
X₄ Cys oder D-Cys
bedeuten, deren pharmazeutisch verträgliche Salze und deren mit Carboxyl-, Amino-, Sulfhydryl- und/oder Hydroxyschutzgrup pen versehene Derivate.

2. L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L- phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lsyl-L-threonyl-L-phenyl alanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cystein-cyclisches (1 → 12) Disulfid.
L-Cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenyl alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L- threonyl-L-seryl-L-cystein-cyclisches (1 → 12) Disulfid.
L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenyl alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L- threonyl-L-seryl-D-cystein-cyclisches (1 → 12) Disulfid.
L-Cysteinyl-L-arginyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenyl alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl- L-threonyl-L-seryl-L-cystein-cyclisches (1 → 12) Disulfid und
L-Cysteinyl-L-histidyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenyl alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L- threonyl-L-seryl-L-cystein-cyclisches (1 → 12) Disulfid.
und deren pharmazeutisch verträgliche Salze.

3. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

a) die entsprechend geschätzten und/oder aktivierten Aminosäuren oder Gruppen von Aminosäuren kuppelt, oder
b) ein Peptid der allgemeinen Formel VIa mit einem Peptid der allgemeinen Formel: kondensiert, wobei
R eine Carboxyschutzgruppe oder einen über eine Methylen gruppe gebundenen Polystyrolharzträger darstellt;
R¹ eine α-Aminoschutzgruppe bedeutet; worin R³ eine Schutzgruppe für die Seitenketten-Stickstoffatome des Arginins bedeutet und R² Wasserstoff oder eine Schutz gruppe für den Imidazolstickstoff des Histidins dar stellt;
B₂ für das vorstehend definierte steht, worin R⁴ eine Schutzgruppe für die Seitenketten-Carboxygruppe der Glutaminsäure bedeutet;
R⁶ eine Schutzgruppe für die Seitenketten-Aminogruppe des Lysins bedeutet;
R⁷, R⁸ und R⁹ jeweils Schutzgruppen für die Hydroxylgrup pen des Threonins und Serins darstellen;
X₃ für D-Trp
X₄ für Cys oder D-Cys steht; und
α und β jeweils eine Sulfhydryl-Schutzgruppe, Wasserstoff oder eine direkte Bindung zwischen den Schwefelatomen S darstellen,

gegebenenfalls die Schutzgruppen abspaltet und die gebil dete Verbindung oxidiert oder reduziert und in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes isoliert.

4. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2 zusammen mit einem pharmazeutischen Träger enthält.