DE2908957C2

DE2908957C2 -

Info

Publication number: DE2908957C2
Application number: DE19792908957
Authority: DE
Inventors: Jean-Claude Nicolas; Anne-Marie Boussioux; Bernard Descomps; Andre Prof. Montpellier Fr Crastes De Paulet
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1978-03-09
Filing date: 1979-03-07
Publication date: 1990-05-17
Also published as: FR2419519B1; GB2017906A; GB2017906B; DE2908957A1; FR2419519A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung der Östrogene E₁ und E₂ in biologischen Medien, insbesondere in Plasma und in Urin, wobei man eine gereinigte 17b-Östradiol-Dehydrogenase aus Plazenta in Gegenwart von NADP oder eines NADP- Analogen sowie einer spezifischen NADP-Dehydrogenase und eines NADPH-bildenden Substrates einsetzt.

Die genaue Kenntnis der Menge von Steroidhormonen, insbesondere der Menge Östron und Östradiol, die im Urin und im Plasma vorhanden sind, hat für den Kliniker, insbesondere für den Gynäkologen, eine wachsende Bedeutung bei der Feststellung einer sicheren Diagnose und bei der Erstellung einer wirksamen Therapie, insbesondere bei Ovarial-Insuffizienz, bei Störungen der Östrogen- Biosynthese, bei der Überwachung problematischer Schwangerschaften etc. Eine derartige Kenntnis macht es jedoch erforderlich, daß man über Techniken der Östrogen-Bestimmung verfügt, die spezifisch, genau und empfindlich, zuverlässig, reproduzierbar und relativ wenig kostspielig sind und durchgeführt werden können, ohne daß man von dem Techniker, der die Bestimmung durchführt, besondere Fähigkeiten und Geschicklichkeiten fordern muß.

Im Laufe der letzten Jahre wurden mehrere Methoden zur Mikrobestimmung von Östrogenen vorgeschlagen, die den Forderungen der Kliniker entsprechen sollen. Die bislang am häufigsten verwendeten Methoden der Mikrobestimmung sind:

die Mikrobestimmung durch Fluoreszenz,
die radioimmunologische Bestimmung.

Die erstere, d. h. die Bestimmung durch Fluoreszenz, bestimmt die gesamten Phenole des Harnes, Östradiol, Östron und Östriol und umfaßt vier Stufen: eine Stufe der Hydrolyse der konjugierten Verbindungen; eine Stufe der Extraktion, welche eine kostspielige und langwierige Phase der Bestimmung ist und die Handhabung großer Mengen sehr reiner Lösungsmittel erfordert; eine Stufe der Entwicklung des Chromophors; und eine Stufe der Ablesung. Auf alle Fälle ist der Wert dieser Bestimmung begrenzt, da sie keine große Spezifität hat und deshalb durch die Mediziner nur mit der äußersten Vorsicht angewendet werden kann.

Was den zweiten Typ der bislang vorgeschlagenen Bestimmung anbelangt, nämlich die radioimmunologische Bestimmung, obwohl sie viel genauer als die Bestimmung durch Fluoreszenz ist und die getrennte Bestimmung von Östradiol, Östron und Östriol im Plasma erlaubt, hat sie jedoch den Nachteil, daß sie teuer ist und die Verwendung von radioaktiven Isotopen erforderlich macht, wodurch ihre Verwendung auf Laboratorien beschränkt ist, welche eine geeignete, sehr kostspielige Einrichtung besitzen und aufgrund einer speziellen Vereinbarung mit dem Gesundheitsministerium dazu berechtigt sind.

Methoden zur enzymatischen Bestimmung von Östrogenen sind übrigens in der Literatur beschrieben (M. HÄRKONEN, H. ADLERKREUZ, E. V. GROMAN, Journal of Steroid Biochemistry 1974 Vol. 5, Seiten 717-725), aber infolge ihrer Schwierigkeit können sie nicht klinisch verwendet werden. Diese Methoden beschreiben die Bestimmung von Östradiol und Östron mit Hilfe von 17β-Östradiol- Dehydrogenase aus der Placenta, welche mit NADP⁺ (Phospho- Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid, Coenzym der Dehydrogenase) bzw. NADPH verbunden ist, wobei das Östradiol von den anderen reaktiven Steroiden, die im Plasma vorhanden sind, durch Chromatographie über einer Aluminiumoxid-Kolonne gereinigt wird. Die enzymatische Dismutation zwischen NADP⁺ und NADPH wird gemäß der in der oben genannten Publikation beschriebenen Methode durchgeführt, indem man Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) und Glutamat-Dehydrogenase verwendet, wobei man eine Verstärkung von 10 000 erreicht; der enzymatische Kreislauf ist erforderlich, um das während der Reaktion gebildete NADPH zu messen, weil im Plasma der nicht-schwangeren Frau nur eine sehr geringe Konzentration an Östradiol vorhanden ist (1 nMol/l). Das gebildete 6-Phosphogluconat wird durch Fluorometrie unter Verwendung von 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase und NADP⁺ bestimmt. Es ist in dieser Publikation angegeben, daß die beschriebene Methode eine Nachweisempfindlichkeit von 25 fMol Steroid und eine Bestimmungsgenauigkeit von 14% gestattet und daß ihre Spezifität vergleichbar ist mit der radioimmunologischen Bestimmung. Doch weisen die Autoren der Publikation auf die Schwierigkeit der Methode hin, insbesondere beim enzymatischen Kreislauf, wodurch die Anwendung ihrer Methode bei Routineanalysen im Laboratorium verhindert wird.

Es wurde nun gefunden, daß die Schwierigkeit dieser Methode nicht der einzige Grund ist, um ihre Verwendung für die enzymatische Routinebestimmung im Laboratorium zu verhindern.

Wie ebenfalls aus dem Stand der Technik hervorgeht, ist es bekannt, daß 17β-Östradiol-Dehydrogenase (das Enzym ist nach der internationalen Klassifikation als E.C.1.1.1.62 bezeichnet) nicht nur eine Dehydrogenase-Wirkung hat (NAD⁺ → NADH; NAD⁺ = Nikotinamid- Adenin-Dinucleotid), sondern auch eine Transhydrogenase- Wirkung hat: in Gegenwart von NADPH (in geringer Menge) findet eine Übertragung und Bildung von NADH statt (wobei das Östrogen in oxidierter oder reduzierter Form an dieser Transhydrierungsreaktion teilnimmt).

Der Zyklus der Bildung von NADP → NADPH in Gegenwart eines Enzyms wie Glucose-6-P-Dehydrogenase ist ebenfalls bekannt. Es genügt daher, wenn der folgende Zyklus gebildet wird (der im Schema 1 dargestellt ist), unter solchen Konzentrationsbedingungen der Cofaktoren, daß NADH in meßbaren Mengen entsteht, die proportional der Konzentration an Östradiol und Östron sind:

Schema 1

Diese Methode der enzymatischen Bestimmung der Gesamt-Östrogene Östron (E₁) + Östradiol (E₂) ist zwar viel einfacher als die tatsächlich verwendeten Bestimmungsmethoden und theoretisch sehr verlockend; leider ist sie in der Praxis jedoch nicht befriedigend, insbesondere hinsichtlich der Genauigkeit der erhaltenen Resultate: die Reaktionsgeschwindigkeit, die durch die Kinetik des Auftretens von NADH bestimmt wird, ist nämlich eine Funktion der Konzentration der Östrogene E₁ und E₂.

Nun ist die 17β-Östradiol-Dehydrogenase aus Placenta mit zwei Arten von Verunreinigungen behaftet, welche die Genauigkeit der Bestimmung beträchtlich beeinflussen:

sie enthält Steroide, insbesondere Östradiol, in nicht vernachlässigbaren Mengen, deren Anwensenheit die Resultate in umso größerem Ausmaß verfälscht als es nötig ist, die 17β- Östradiol-Dehydrogenase in relativ großen Mengen zu verwenden, wodurch in das Milieu eine umso größere Menge an Verunreinigungen eingebracht wird;
sie enthält als Verunreinigung auch andere nicht Östradiol-abhängige- Transhydrogenasen, deren Anwesenheit eine weitere Fehlerquelle darstellt.

Die Verfahren gemäß dem Stand der Technik weisen die Nachteile unzureichender Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, ungenügender Spezifität und komplizierter Durchführungsweise auf.

Demgegenüber liegt vorliegender Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung der Östrogene E₁ und E₂ in biologischen Medien zu liefern, das einfach durchführbar ist und mit großer Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Spezifität funktioniert, welches den Anforderungen der Praxis besser entspricht, als die bislang bekannten Verfahren und insbesondere spezifisch, sehr genau, zuverlässig, wenig kostspielig, relativ einfach durchführbar ist und im Vergleich zu dem in der Literatur beschriebenen Verfahren zur enzymatischen Bestimmung nicht nur die nicht Östradiol-abhängigen Transhydrogenasen beseitigt, welche die 17β-Östradiol- Dehydrogenase aus Placenta begleiten, welche zur Reduktion von NAD in NADH eingesetzt wird, und auch eine totale Eliminierung des mit der 17β-Östradiol-Dehydrogenase aus Placenta eingeschleppten Östradiols gewährleistet, so daß die enzymatische Bestimmung unter so genauen und zuverlässigen Bedingungen abläuft, wie sie im Stand der Technik nicht erreicht werden konnten.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem Verfahren der eingangs genannten Gattung dadurch gelöst, daß man eine 17β-Östradiol-Dehydrogenase aus Placenta verwendet, die von Steroiden und verunreinigenden nicht Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit ist, und daß man in Gegenwart von NAD oder eines NAD-Analogen, welches durch das Enzym anerkannt wird, arbeitet.

Besondere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind dadurch gekennzeichnet,
daß man das spezifische Enzym NADP-Dehydrogenase aus der folgenden Gruppe wählt: Tetrahydrofolat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-5-1-13, 1-5-1-15), Isocitrat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-42), Phosphogluconat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-1-144), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) (internationale Klassifikation 1-1-1-49), Lactaldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1- 1-55), Benzaldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-7), Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-9 (1-2-1-13)), L-Aspartat-semi-Aldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-11), Glyoxylat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-17),
daß das NADPH-bildende Substrat G6P (Glucose-6-Phosphat) ist, falls das spezifische NADP-Dehydrogenase-Enzym G6PDH ist,
daß die Bestimmungsreaktion in einem Medium stattfindet, das aus einem Puffer mit einem pH-Wert in der Nähe von 7,4 besteht, wobei die Ionenstärke gleich oder geringer ist als die eines 0,1-molaren Puffers,
daß der Puffer außerdem 0,5 Promille bis 1% Protein ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen enthält, daß das dem Milieu zugesetzte Protein Serum-Albumin, insbesondere Rinder-Serum-Albumin ist.

Weitere besondere Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet,
daß die Bestimmung in Gegenwart von NAD oder einem seiner Analogen durchgeführt wird, wie Acetyl-NAD oder Thio-NAD,
daß das NAD und NADPH-bildende Substrat im Überschuß vorhanden sind,
daß die Menge NAD im Reaktionsmilieu 10^-3- bis 10^-4-molar ist, diejenige des NADP 10^-6- bis 10^-7- molar und das Konzentrationsverhältnis NAD zu NADP etwa 10^-3 ist,
daß das Reaktionsgemisch, welches die Reaktionskomponenten und die zu bestimmenden Substanzen enthält, vor dem Ablesen der optischen Dichte 2 bis 12 Stunden, vorzugsweise 3 bis 9 Stunden, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C, vorzugsweise bei 25 bis 38°C inkubiert wird,
daß die Proben der biologischen Media, welche die zu bestimmenden Östrogene E₁ und E₂ enthalten, vor dem Bestimmungsverfahren einem Vorbereitungs- oder Extraktions- und/oder Reinigungsverfahren unterworfen werden,
daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Medium aus Plasma besteht, diese vorher einem an sich bekannten Extraktionsverfahren mit z. B. Äther unterworfen werden, worauf man mehrmals mit den geeigneten Lösungsmitteln wäscht, abdampft und den letzten Abdampfrückstand in einem Gemisch aus einem polaren Lösungsmittel und einem Puffer, dessen Ionenstärke praktisch gleich derjenigen eines 0,1 M-Puffers ist, löst, und der eine geringe Menge eines Proteins ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen sowie 15 bis 25% eines Polyols enthält,
daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Medium aus Urin besteht, dieses vorher einem Vorbereitungsverfahren mit Hilfe eines die konjugierten Verbindungen hydrolysierenden Enzyms, wie z. B. "β-Glucuronidase" Pasteur, unterworfen wird.

Beansprucht wird weiterhin eine anwendungsfertige Kombination zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist,
daß sie im wesentlichen folgende vorher bestimmte und lyophilisierte Bestandteile enthält:
das Enzym 17β-Östradiol-Dehydrogenase, welches von Steroiden und verunreinigenden nicht Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit sowie in einem geeigneten Polyol konserviert ist, insbesondere Glycerin,
einen inneren Standard (der einen bekannten Überschuß an Östrogenen enthält),
eine Kontrolle (blanc),
ein Enzym für die Hydrolyse der im Urin enthaltenen konjugierten Verbindungen (wie "β-Glucuronidase" Pasteur) das vorher in Funktion zur Menge der zu behandelnden Urinprobe bestimmt wurde,
NAD: 10^-2-10^-4 M,
Glucose-6-PDH: 0,1 IE/ml der zu bestimmenden Probe,
NADP: 10^-6-10^{- 8} M,
Glucose-6-P: 10^-2-10^-4 M,
BSA-Puffer (Rinder-Serum-Albumin): 0,5 Promille bis 1% Tris HCl Puffer 0,05 M, pH-Wert etwa 7,5.

Besondere Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet,
daß die Kontrolle (blanc) aus einem Gemisch von Tris HCl-Puffer, 15 bis 25% Polyol, + 0,5 Promille bis 1% BSA (Puffer A) und etwa 0,5 ml Puffer A + 2 ×10^-3 M NAD, 2×10^-6 M NADP, 2×10^-3 M Glucose- 6-Phosphat, 0,2 I.E. Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase/ml (Puffer B) besteht,
daß der innere Standard aus einem Gemisch des obigen Puffers B und des Puffers A, der 1600 Picogramm Östradiol/ml und 0,02 I.E. 17β-Östradiol-Dehydrogenase enthält, besteht.

Unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens - im Gegensatz zu den klassischen enzymatischen Bestimmungen - verschwindet die zu bestimmende Substanz, im vorliegenden Falle die Östrogene E₁ und E₂, nicht; sie ist nicht der limitierende Faktor der Reaktionsgeschwindigkeit und die Menge des gebildeten NADH ist direkt proportional der Östrogen-Konzentration.

Es wurde gefunden, daß die absoluten und relativen Mengenverhältnisse des in das Milieu eingeführten NAD bzw. NADP beträchtlich zur Genauigkeit der Bestimmung beitragen, indem die Menge des vorhandenen NADP nicht die oben angegebenen Mengenverhältnisse überschreiten darf, da sonst die Aktivität des Enzyms 17β-Östradiol- Dehydrogenase behindert und deshalb die Resultate verfälscht werden.

Die Antriebskraft zu der gesamten Dosierung besteht nämlich in den Umwandlungen von E₁ und E₂ und dann von E₂ in E₁ (wie weiter oben im Schema 1 angegeben). Diese Umwandlungen führen in jedem Cyclus zur Bildung einer stöchiometrischen Menge NADH. Diese Umwandlungen verlaufen während der Inkubationszeit. So entsteht am Ende von x Cyclen, welche einer bestimmten Inkubationsdauer entsprechen, eine Menge NADH, die dem x-fachen der stöchiometrischen Menge des Substrats (E₁ und/oder E₂), im Milieu entspricht, welche Menge NADH dann gut feststellbar ist.

Außer den oben genannten Ausführungsformen betrifft die Erfindung auch andere Ausführungsformen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen.

In den folgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert, ohne daß die Erfindung hierauf beschränkt werden soll.

Beispiele Beispiel 1 Extraktion und Reinigung der Östrogene des Plasmas

Man versetzt 3,5 ml Plasma mit 100 µl Natriumpyrophosphat- Puffer (0,1 M, pH 9). Der pH-Wert der Plasmaprobe beträgt dann 8,9.

Anschließend extrahiert man zwei Mal mit 3 ml Äther und der angereicherte Extrakt wird dann unter Stickstoff eingedampft und auf 2 ml konzentriert, dann zwei Mal mit 1 ml Natriumcarbonat (1 Promille) gewaschen. Dann wird der Äther zur Trockne abgedampft und der Trockenrückstand in 1 ml 2 M- Natronlauge aufgenommen. Die wäßrige Phase wird dann zwei Mal mit 2 ml Benzol/Heptan (2 : 1 V/V) gewaschen, dann mit 200 µl 10 M H₃PO₄ neutralisiert und zwei Mal mit 3 ml Äther extrahiert. Nach dem Abdampfen wird der Rückstand mit 100 µl Äthanol und 250 µl Tris-HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,4) aufgenommen, der 1 Promille Rinder-Serumalbumin und 20% Glycerin enthält.

Die Östrogenbestimmung wird mit 100 µl dieses Extrakts durchgeführt.

Bestimmung der Östrogene

Das Reaktionsmilieu besteht aus 1 ml Tris-HCl-Puffer (0,05 M, pH 7,4), der 5 Promille Serumalbumin, 5×10^-3 M Glucose-6-P, 5×10^-4 M NAD, 5×10^-7 M NADP, 0,1 IE Glucose-6-P-Dehydrogenase und 0,03 IE 17β-Östradiol-Dehydrogenase enthält. Die Östrogen- Konzentration des Extrakts beträgt 0,02 bis 2 pMol.

Die Inkubationsdauer beträgt 6 bis 16 Stunden bei 25°C.

Die Reaktionsgeschwindigkeit wird bei 340 nm mit Hilfe eines Spektralphotometers gemessen.

Die Adsorption (bei 340 nm) der verschiedenen Östrogen- Konzentrationen enthaltenden Lösungen wird am Ende der Inkubationsdauer gemessen.

Resultate

Die optische Dichte bei 340 nm wird nach 6 bis 16 Stunden Reaktionsdauer bestimmt. Die beigefügte Abbildung zeigt die Kurve I für den Standard, erhalten mit Östradiolmengen zwischen 0,020 und 2 Picomol, das heißt, 5 bis 500 pg nach 6 Stunden Reaktionsdauer; die Kurve II gibt die optische Dichte wieder, die man bei den gleichen Mengen Östradiol nach 16 Stunden Inkubation erhält.

Die Eichkurve verläuft in einem sehr großen Bereich linear. Sie deckt den Bereich der physiologisch auftretenden Konzentrationen, einschließlich derjenigen des nicht geschlechtsreifen Kindes und des Mannes, ab.

Normalerweise ist bei den Bestimmungen durch die fluorometrischen Methoden, die derzeit im Stand der Technik durchgeführt werden, die Empfindlichkeit begrenzt durch das Ausmaß der Hintergrund-Fluoreszenz, welche durch den biologischen Extrakt beigetragen wird. Nach der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode ist es wegen der großen Verstärkung nicht nötig, die Ablesungen durch Fluoreszenz oder in einem sehr hohen Empfindlichkeitsbereich durchzuführen. Aus diesem Grunde ist die durch den biologischen Extrakt beigetragene Absorption vernachlässigbar, gegenüber den Absorptionen der Produkte der enzymatischen Reaktion.

Beispiel 2 Bestimmung von Östradiol und Östron im Urin A - Vorbereitung der Urinproben

Die Entnahme wird mit vor dem Aufstehen entnommenem Urin durchgeführt. Man stellt 1 ml Urin auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7 ein, indem man 50 µl (0,1 M) Citratpuffer zusetzt. Diese Lösung wird mit einem Tropfen "β-Glucuronidase"-Pasteur 30 Minuten bei 37°C behandelt. Die Röhrchen werden dann abgekühlt und mit 1 ml Äthanol versetzt, die Mischung etwa 30 Minuten auf 24°C gehalten und dann bei 4000 g zentrifugiert. Der Überstand wird zur Hälfte mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), 1 Promille Rinder-Serumalbumin, 20% Glycerin verdünnt. Die Dosierung wird mit 100 µl dieses Extraks durchgeführt.

B - Bestimmung

Man verwendet die folgenden Puffer:
Puffer A:
Tris HCl 0,1 M, pH 7,4, 20% Glycerin, 1 Promille BSA
Puffer B:
Puffer A + 2×10^-3 M NAD, 2×10^-6 M NADP, 2×10^-3 M
Glucose-6-Phosphat, 0,2 Einheiten pro ml Glucose- 6-Phosphat-Dehydrogenase;
Puffer C:
Puffer A + 1600 pg Östradiol pro ml.

Für jede Probe verwendet man 3 Röhrchen, welche 100 µl der Urinverdünnung und die folgende Mengereaktionskomponenten enthalten:

Röhrchen 1:
Kontrolle = 0,5 ml Puffer A + 0,5 ml Puffer B
Röhrchen 2:
Bestimmung = 0,5 ml Puffer A + 0,5 ml Puffer B + 0,025 IE β-Östradiol-Dehydrogenase
Röhrchen 3:
Überschuß = 0,5 ml Puffer B + 0,5 ml Puffer C + 0,25 IE 17β-Östradiol-Dehydrogenase.

Die Röhrchen werden 4 bis 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Die optische Dichte wird bei 349 nm nach dieser Inkubationsdauer bestimmt.

C - Berechnung der Östrogen-Konzentrationen

Die Konzentration der in den Proben enthaltenen Östrogene wird im Vergleich zu dem Absorptionswert des Überschusses mit Hilfe der folgenden Formel berechnet

C: Östrogen-Konzentration im Urin oder Plasma (µg/Liter);
800: entspricht dem Östradiol-Überschuß in dem Röhrchen;
X: Volumen des entnommenen biologischen in Mikroliter. Im vorliegenden Beispiel ist es 1000 µl im Falle des Plasmas und 25 µl im Falle von Urin.

Beispiel 3 Spezifische Bestimmung von Östradiol

Die spezifische Bestimmung von Östradiol kann durchgeführt werden unter der Voraussetzung, daß man vorher das Östron des Mediums mit Hydrazin reagieren läßt.

Zu diesem Zweck läßt man 0,5 ml des biologischen Mediums (Plasma oder Urin mit Glucuronidase hydrolysiert) mit 100 µl einer wäßrigen Hydrazinlösung (5 M, mit HCl auf pH 7 bis 8 gebracht) 30 Minuten bei 37°C reagieren. Das Östradiol wid nach der vorher in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Methode bestimmt.

Aus der vorgehenden Beschreibung resultiert, daß unabhängig von den Ausführungsarten ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Östrogenen E₁ und E₂ erhalten wird, welches im Vergleich zu den bislang bekannten Bestimmungsmethoden wesentliche Vorteile besitzt, von denen einige schon vorher erwähnt wurden, insbesondere:

- das Verfahren ist sehr wenig kostspielig hinsichtlich der Reaktionskomponenten und Materialien, wobei man nur ein Photometer im nahen U.V. benötigt.
- Man braucht keine Radioisotope.
- Das Verfahren ist leicht automatisierbar und direkt bei im Handel erhältlichen automatischen Systemen verwendbar.
- Von Vorteil ist ferner die große Stabilität der Reaktionskomponenten und Enzyme, die eine unerläßliche Voraussetzung einer Kommerzialisierung in großem Umfange ist.
- Das Verfahren kann in einem sehr breiten biologischen Bereich angewandt werden.
- Es gibt keine Neben-Reaktion.
- Das Verfahren hat eine sehr hohe Spezifität.
- Es werden keine Enzyme zerstört.
- Das Verfahren ist einfach, zuverlässig, völlig reproduzierbar und sehr empfindlich.
- Man kann das Verfahren bei einer großen Anzahl biologischer Medien anwenden.
- Man kann das Verfahren bei biologischen Medien, wie zum Beispiel Urin, anwenden, ohne vorher die Östrogene extrahieren zu müssen oder indem man relativ einfache und schnelle Extraktions- oder Reinigungsmethoden anwendet.

Wie aus dem Obigen ersichtlich wird, ist die Erfindung nicht auf die ausführlich beschriebenen Ausführungsformen beschränkt; sie umfaßt vielmehr alle Varianten, die dem Fachmann aufgrund der Beschreibung einfallen, ohne vom Rahmen der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zur enzymatischen Bestimmung der Östrogene E₁ und E₂ in biologischen Medien, insbesondere in Plasma und in Urin, wobei man eine gereinigte 17β- Östradiol-Dehydrogenase aus Plazenta in Gegenwart von NADP oder eines NADP-Analogen sowie einer spezifischen NADP-Dehydrogenase und eines NADPH- bildenden Substrates einsetzt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 17b-Östradiol-Dehydrogenase aus Plazenta verwendet, die von Steroiden und verunreinigenden nicht Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit ist, und daß man in Gegenwart von NAD oder eines NAD-Anlogen, welches durch das Enzym anerkannt wird, arbeitet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das spezifische Enzym NADP-Dehydrogenase aus der folgenden Gruppe wählt: Tetrahydrofolat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-5-1-13, 1-5-1-15), Isocitrat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-1-42), Phosphogluconat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-1-44), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) (internationale Klassifikation 1-1-1-49), Lactaldehyd- Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1- 1-55), Benzaldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-7), Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-9 (1-2-1-13)), L-Aspartat-semi-Aldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-11), Glyoxylat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-17).

3. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das NADPH-bildende Substrat G6P (Glucose-6-Phosphat) ist, falls das spezifische NADP-Dehydrogenase-Enzym G6PDH ist.

4. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmungsreaktion in einem Medium stattfindet, das aus einem Puffer mit einem pH-Wert in der Nähe von 7,4 besteht, wobei die Ionenstärke gleich oder geringer ist als die eines 0,1-molaren Puffers.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer außerdem 0,5 Promille bis 1% Protein ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen enthält.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das dem Medium zugesetzte Protein Serum-Albumin, insbesondere Rinder-Serum-Albumin ist.

7. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in Gegenwart von Acetyl-NAD oder Thio-NAD durchgeführt wird.

8. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das NAD und NADPH-bildende Substrat im Überschuß vorhanden sind.

9. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge NAD im Reaktionsmilieu 10^-3- bis 10^-4-molar ist, diejenige des NADP 10^-6- bis 10^-7- molar und das Konzentrationsverhältnis NAD zu NADP etwa 10⁺³ ist.

10. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgemisch, welches die Reaktionskomponenten und die zu bestimmenden Substanzen enthält, vor dem Ablesen der optischen Dichte 2 bis 12 Stunden, vorzugsweise 3 bis 9 Stunden, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C, vorzugsweise bei 25 bis 38°C inkubiert wird.

11. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben der biologischen Medien, welche die zu bestimmenden Östrogene E₁ und E₂ enthalten, vor dem Bestimmungsverfahren einem Vorbereitungs- oder Extraktions- und/oder Reinigungsverfahren unterworfen werden.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Medium aus Plasma besteht, diese vorher einem an sich bekannten Extraktionsverfahren mit z. B. Äther unterworfen werden, worauf man mehrmals mit den geeigneten Lösungsmitteln wäscht, abdampft und den letzten Abdampfrückstand in einem Gemisch aus einem polaren Lösungsmittel und einem Puffer, dessen Ionenstärke praktisch gleich derjenigen eines 0,1 M-Puffers ist, löst, und der eine geringe Menge eines Proteins ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen sowie 15 bis 25% eines Polyols enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Medium aus Urin besteht, dieses vorher einem Vorbereitungsverfahren mit Hilfe eines die konjugierten Verbindungen hydrolysierenden Enzyms, wie z. B. "β-Glucuronidase" Pasteur, unterworfen wird.

14. Anwendungsfertige Kombination zur Durchführung des Verfahrens gemäß Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet,
daß sie im wesentlichen folgende vorher bestimmte und lyophilisierte Bestandteile enthält:
das Enzym 17β-Östradiol-Dehydrogenase, welches von Steroiden und verunreinigenden nicht Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit sowie in einem geeigneten Polyol konserviert ist, insbesondere Glycerin,
einen inneren Standard (der einen bekannten Überschuß an Östrogenen enthält),
eine Kontrolle (blanc),
ein Enzym für die Hydrolyse der im Urin enthaltenen konjugierten Verbindungen (wie "β-Glucuronidase" Pasteur), das vorher in Funktion zur Menge der zu behandelnden Urinprobe bestimmt wurde,
NAD: 10^-2-10^-4 M,
Glucose-6-PDH: 0,1 IE/ml der zu bestimmenden Probe,
NADP: 10^-6-10^-8 M,
Glucose-6-P: 10^-2-10^-4 M,
BSA-Puffer (Rinder-Serum-Albumin): 0,5 Promille bis 1%,
Tris HCl Puffer 0,05 M, pH-Wert etwa 7,5.

15. Kombination gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontrolle (blanc) aus einem Gemisch von Tris HCl-Puffer, 15 bis 25% Polyol, 0,5 Promille bis 1% BSA (Puffer A) und etwa 0,5 ml Puffer A mit 2 ×10^-3 M NAD, 2×10^-6 M NADP, 2×10^-3 M Glucose- 6-Phosphat, 0,2 I.E. Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase/ml (Puffer B) besteht.

16. Kombination gemäß Anspruch 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß der innere Standard aus einem Gemisch des obigen Puffers B und des Puffers A, der 1600 Picogramm Östradiol/ml und 0,02 I.E. 17β-Östradiol- Dehydrogenase enthält, besteht.