DE2921829C2

DE2921829C2 -

Info

Publication number: DE2921829C2
Application number: DE2921829A
Authority: DE
Inventors: Yasuhisa Yokohama Kanagawa Jp Takeda; Takashi Omiya Saitama Jp Matsuno; Mihoko Tokio/Tokyo Jp Ohtaka; Hiroki Iruma Saitama Jp Mitsui; Tsutomu Saitama Jp Kawaguchi; Hisako Tokio/Tokyo Jp Masuda; Hiroshi Sayama Saitama Jp Okazaki; Mitsuaki Kamifukuoka Saitama Jp Handa; Yutaka Omiya Saitama Jp Sugawara; Haruki Chofu Tokio/Tokyo Jp Ogawa
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1978-05-29
Filing date: 1979-05-29
Publication date: 1987-08-13
Also published as: GB2024857A; GB2024857B; JPS6234726B2; JPS54157815A; DE2921829A1; US4349541A; CH649709A5; FR2427099A1; FR2427099B1; CA1135184A

Description

Es ist klinisch bewiesen, daß eine Infektion mit Zellen von haemolytischen Streptococcen mit ß-haemolysierender Wirkung eine bestimmte Wirkung gegen maligne Neoplasien ausübt. Es ist ferner bekannt, daß diese Erreger unter anderem Erysipel erzeugen, und daß ihre Antitumorwirkung sehr instabil ist, d. h. durch Erhitzen oder andere Behandlung die Wirkung leicht verloren geht. Aus diesen Gründen war es nicht möglich, lebende vermehrungsfähige Zellen zur Behandlung maligner Neoplasien einzusetzen. Es wurden verschiedene Methoden zur Herstellung von Präparaten zur Behandlung maligner Neoplasien entwickelt, bei denen lebende Zellen von Bakterien der Art Streptococcus haemolyticus in Bernheimer′s Basalmedium (nachstehend wird dieses Medium als "BBM" bezeichnet) suspen diert, die Suspension mit einem Penicillin in sehr hoher Kon zentration versetzt und das Gemisch erhitzt wird; vgl. JP-AS 6 690/70. Andere Methoden sind in den JP-ASen 8 871/70, 2 674/71 und 37 003/72 beschrieben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Präparat zur Behandlung maligner Neoplasien zu schaffen, das eine wesent lich stärkere Wirkung hat als die Präparate, die übliche Stämme von Streptococcus haemolyticus enthalten. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somit den in Patentanspruch 1 gekenn zeichneten Gegenstand. Die Ansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß Stämme von Streptococcus equisimilis, insbesondere von Streptococcus equisimilis ATCC 21597, sich durch eine wesentlich stärkere Wirkung gegenüber malignen Neoplasien auszeichnen, als die üblichen Stämme von Streptococcus haemolyticus. So zeigt bei spielsweise ein Präparat von Streptococcus equisimilis ATCC 21597 eine sehr hohe Wirkung gegen den Tumor MH 134, der bei Behandlung mit einem Präparat mit Streptococcus haemolyticus nicht anspricht. Das Präparat der Erfindung zeigt sogar bei intraperitonealer Gabe Wirkung gegen solide Tumoren, bei denen die bekannten Streptococcus haemolyticus- Präparate nur eine geringe oder keine Wirkung bei intra peritonealer Gabe zeigen. Ferner ist die Antitumorwirkung der Stämme von Streptococcus equisimilis verhältnismäßig beständig gegen Wärme.

Die erfindungsgemäß verwendbaren Stämme sind die Stämme von Streptococcus equisimilis, vorzugsweise Stamm ATCC 21597.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes sind nach stehend aufgeführt. Sie entsprechen denen von Streptococcus equisimilis in Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974.

1) Morphologische Eigenschaften

Die Zellen haben kugelige oder eiähnliche Gestalt mit einem Durchmesser bis zu 2 µm und bilden in Todd-Hewitt-Medium typische Ketten.

2) Physiologische Eigenschaften

(1) Art der Haemolyse: ß-Haemolyse
(2) Serologische Klassifikation nach Lancefield: Gruppe C
(3) Katalaseaktivität: negativ
(4) Wachstum bei 10° C und 45° C: negativ
(5) Wachstum bei pH 9,6: negativ
(6) Wachstum in 10% Galle enthaltendem Medium: positiv
(7) Wachstum in 40% Galle enthaltendem Medium: negativ
(8) Wachstum in einem 6,5% NaCl enthaltenden Medium: negativ
(9) Hydrolyse von Hippursäure: negativ
(10) Vergärung von Zuckern (Bildung von Säure aus Kohlen hydraten)

Tabelle 1

(11) Arginin-Decarboxylase-Aktivität: positiv
(12) Ornithin-Decarboxylase-Aktivität: negativ
(13) Lysin-Decarboxylase-Aktivität: negativ
(14) Assimilierung von Salzen der Citronensäure: negativ
(15) Bildung von Schwefelwasserstoff: negativ
(16) Bildung von Indol: negativ
(17) Urease-Aktivität: negativ
(18) ONPG-Test (O-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid-Test): negativ
(19) Voges-Proskauer-Test: negativ
(20) Celluloseabbau: schwach positiv.

Die Züchtung der Bakterien des Stammes Streptococcus equisimilis wird beispielsweise in Fleischbrühe oder 3 bis 5prozentigem Hefeextraktmedium bei etwa 37° C durchgeführt. Die Züchtungsdauer beträgt gewöhnlich 18 bis 20 Stunden, doch hängt sie etwas vom Nährmedium und der Einsaatdichte und anderen Faktoren ab. Nach beendeter Züchtung werden die Zellen aus der Kulturflüssigkeit in üblicher Weise abgetrennt, beispielsweise abgeschleudert, und mit einer geeigneten Flüs sigkeit, wie physiologischer Kochsalzlösung, gewaschen.

Die Zellen werden in einer Salzlösung, wie Bernheimer′s Basalmedium, suspendiert, das 1,35 g Maltose, 12 ml 20prozentige wäßrige Kaliumhydrogenphosphatlösung, eingestellt mit Natriumhydroxid auf pH 6,8 bis 7,0, 24 ml 2prozentige wäßrige Magnesiumsulfat · 7H₂O-Lösung und 132 ml destilliertes Wasser enthält. Der erhaltenen Suspension wird ein Penicillin in einer Menge von mindestens 25 000, insbeson dere 26 000 bis 60 000 Einheiten/ml zugesetzt. Das Gemisch wird 10 bis 30 Minuten bei 30 bis 38° C stehengelassen und sodann 20 bis 40 Minuten auf 40 bis 50° C erhitzt. Die bevorzugte Salzlösung ist BBM, doch kann auch eine phosphat-gepufferte physiologische Koch salzlösung oder physiologische Kochsalzlösung allein als Salz lösung verwendet werden.

Da die Antitumorwirkung von Streptococcus equisimilis verhältnis mäßig beständig gegen Wärme ist, werden die Zellen in einer Salzlösung, wie BBM, phosphat-gepufferter physioligischer Kochsalzlösung oder physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspension wird 5 bis 30 Minuten auf 65 bis 100° C erhitzt. Auf diese Weise erhält man ebenfalls ein Präparat zur Behandlung maligner Neoplasien.

Das erhaltene Präparat kann klinisch als solches unmittelbar verwendet oder nach dem Gefriertrocknen längere Zeit gelagert werden. Zur Gefriertrocknung wird das Präparat mit einer Aminosäure, vorzugsweise Methionin, Arginin, Ornithin, Cystein, Asparaginsäure oder Glutaminsäure, oder einem Zucker, wie Saccharose, Maltose, Raffinose oder Lactose, oder Dextran oder löslicher Stärke als Stabilisator versetzt.

Die Beispiele und Versuche erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Streptococcus equisimilis ATCC 21597 wird in 100 ml Fleisch brühe überimpft und 20 Stunden bei 37° C gezüchtet. Die erhaltene Kulturflüssigkeit wird sodann in 2 Liter eines 5prozentigen Hefeextraktmediums überimpft und weitere 20 Stunden bei 37° C gezüchtet. Hierauf wird die Kultur zentrifugiert. Die abge schleuderten Zellen werden in 40 ml physiologischer Kochsalz lösung suspendiert, sodann nit 4 ml einer 10prozentigen wäßrigen Wasserstoffperoxidlösung versetzt und gründlich gemischt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 0°C stehengelassen. Danach wird das Gemisch zentrifugiert. Die abgeschleuderten Zellen werden in 30 ml physiologischer Kochsalzlösung ver setzt. Die Zellen werden abgeschleudert und noch weitere zwei mal mit jeweils 30 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.

Sodann werden die erhaltenen Zellen in 90 ml BBM suspendiert. Eine 1 : 20 verdünnte Lösung der Kokkensuspension in physio logischer Kochsalzlösung hat bei 660 nm eine Absorption von 0,460, gemessen mit einem Hitachi-Spektrophotometer Modell 101. Die Kokkensuspension in BBM (85 ml) wird mit 17 ml einer Lösung des Natriumsalzes von Benzylpenicillin (1,6 × 10⁵ Ein heiten/ml) versetzt, 20 Minuten bei 37° C stehengelassen und sodann 30 Minuten auf 45° C erhitzt.

Es werden 102 ml einer Kokkensuspension erhalten, die mit 102 ml einer Lösung eines Penicillins und DL-Methionin ver setzt wird. Es werden 1,08 × 10⁵ Einheiten/ml des Kaliumsalzes von Benyzlpenicillin und eine 1,0prozentige wäßrige Lö sung von D1-Methionin verwendet. Die erhaltene Suspension wird in einer Menge von jeweils 2 ml in 90 Ampullen abgefüllt, die gefriergetrocknet und sodann in trockener Luft bei Atmosphärendruck abgeschmolzen werden. Es werden 90 Ampullen erhalten, die jeweils 5 mg getrocknete Zellen enthalten.

Beispiel 2

Streptococcus equisimilis ATCC 21597 wird gemäß Beispiel 1 ge züchtet. 2,1 Liter der Kulturflüssigkeit werden zentrifugiert. Die erhaltenen abgeschleuderten Zellen werden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und jeweils zentrifu giert.

Sodann werden die Zellen in 108 ml BBM suspendiert. Die ver dünnte Kokkensuspension (1:20) in BBM mit physiologischer Koch salzlösung hat eine Absorption von 0,400 bei 660 nm. Die er haltene Kokkensuspension in BBM wird 10 Minuten auf 90° C in einem Wasserbad erhitzt und sodann im Eisbad abgekühlt.

Die erhaltene Kokkensuspension (102 ml) wird mit 102 ml einer 10prozentigen wäßrigen Lösung von DL-Methionin versetzt und gründlich vermischt. Hierauf wird die Suspension in einer Menge von jeweils 2 ml in 90 Ampullen abgefüllt. Die Suspension in den Ampullen wird gefriergetrocknet. Sodann werden die Ampullen in trockener Luft und bei Atmosphärendruck abgeschmolzen. Es werden 90 Ampullen erhalten, die jeweils 5 mg getrocknete Zellen enthalten.

Beispiel 3

Gemäß Beispiel 2 wird eine Kokkensuspension in BBM aus Streptococcus equisimilis erhalten. Die Kokkensuspension wird 10 Minuten auf 65° C in einem Wasserbad erhitzt und sodann gemäß Beispiel 2 gefriergetrocknet.

Versuch 1

MH 134 Tumorzellen werden subcutan in den Rücken von 3 Wochen alten männlichen Mäusen des Stammes C3H/HeN in einer Menge von 10⁶ Zellen/Maus injiziert. 3 Tage nach der Injektion erhält jede Maus intravenös 5 mal jeden zweiten Tag eine Suspension des gemäß Beispiel 1 erhaltenen gefriergetrockneten Pulvers in physiologischer Kochsalzlösung in einer Menge von 0,1 mg (aus gedrückt durch das Trockenzellgewicht). 20 Tage nach der Beimpfung wird das Tumorgewicht bestimmt.

Zur Kontrolle werden Zellen von Streptococcus pyogenes Stamm Su (ATCC-Nr. 21068), die gemäß Beispiel 1 behandelt und in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert wurden, in gleicher Weise verwendet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt. Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß das Präparat mit den Zellen von Streptococcus equisimilis ATCC 21597 eine signifikante Wirkung gegenüber MH 134 Tumorzellen zeigt, während das Präparat von Streptococcus pyogenes Stamm Su nur eine sehr geringe Wirkung entfaltet.

Tabelle II

Versuch 2

BAMC 1 Tumorzellen werden subcutan in den Rücken von 6 Wochen alten weiblichen Mäusen des Stammes BALB/cAnN in einer Menge von 10⁶ Zellen/Maus injiziert. 3 Tage nach der Injektion wird jeder Maus intravenös oder intraperitoneal 5mal jeden zweiten Tag eine Suspension des in Beispiel 1 erhaltenen gefrierge trockneten Pulvers in physiologischer Kochsalzlösung in einer Dosis von 0,1 mg (ausgedrückt durch das Trockenzellgewicht) gegeben. 21 Tage nach der Injektion wird das Tumorgewicht jeder Maus bestimmt. Zum Vergleich wird ein gemäß Beispiel 1 hergestelltes Präparat aus Streptococcus pyogenes Stamm Su suspendiert in physiologischer Kochsalzlösung verwendet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt. Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß das Präparat der Erfindung eine we sentlich höhere Wirkung gegenüber dem BAMC 1 Tumor hat als das Präparat aus Streptococcus pyogenes Stamm Su.

Tabelle III

Versuch 3

Ehrlich-Tumorzellen werden subcutan in den Rücken von 5 Wochen alten nackten Mäusen in einer Menge von 10⁶ Zellen/Maus injiziert. Die Hälfte der Mäuse ist männlichen Geschlechts. 3 Tage nach der Injektion wird jeder Maus intravenös oder intraperitoneal 5mal jeden zweiten Tag eine Suspension des von in Beispiel 1 erhaltenen gefriergetrockneten Pulvers in physio logischer Kochsalzlösung in einer Dosis von 0,1 mg (Trocken zellgewicht) gegeben. 21 Tage nach der Injektion wird das Tu morgewicht jeder Maus bestimmt. Zum Vergleich wird ein gemäß Beispiel 1 hergestelltes Präparat aus Streptococcus pyogenes Stamm Su suspendierten physiologischer Kochsalzlösung verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt. Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß das Präparat der Erfindung eine wesentlich höhere Wirkung gegenüber Ehrlich-Tumor auf weist als Streptococcus pyogenes Stamm Su.

Tabelle IV

Versuch 4

Meth A Tumorzellen werden subcutan in den Rücken von 6 Wochen alten männlichen Mäusen des Stammes BALB/cAnN in einer Menge von 10⁶ Zellen/Maus injiziert. 3 Tage nach der Injektion wird jede Maus intravenös oder intraperitoneal 5 mal jeden zweiten Tag eine Suspension des gemäß Beispiel 1 herge stellten gefriergetrockneten Pulvers in physiologischer Kochsalzlösung in einer Dosis von 0,1 mg (Trockenzellgewicht) gegeben. 21 Tage nach der Impfung wird das Tumorgewicht jeder Maus bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die Antitumorwirkung des Präparats der Erfindung ausgezeichnet ist.

Tabelle V

Versuch 5

Ähnlich Versuch 1 wird 6 Wochen alten männlichen Mäusen des Stammes C3H/HeN das in Beispiel 1 oder Beispiel 2 erhaltene Präparat von Streptococcus equisimilis ATCC 21597 gegeben, und die Antitumorwirkung der Präparate gegen MH 134 Tumor wird bestimmt. 19 Tage nach der Verimpfung des Tumors wird das Tumorgewicht bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt. Beide Präparate zeigen eine ausgezeichnete Antitumorwirkung gegen MH 134 Tumor.

Tabelle VI

Versuch 6

Ähnlich Versuch 1 wird 5 Wochen alten männlichen Mäusen des Stammes BALB/cAnN Crj das Präparat gemäß Beispiel 1, 2 oder 3 von Streptococcus equisimilis ATCC 21597 gegeben. Sodann wird die Antitumorwirkung gegen Meth A Tumor bestimmt. 19 Tage nach der Verimpfung wird das Gewicht des Tumors bestimmt. Die Er gebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt. Sämtliche Präparate zeigen eine ausgezeichnete Antitumorwirkung.

Tabelle VII

Versuch 7

Die in den Beispielen 1 bis 3 erhaltenen Präparate werden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Nach dem Inakti vieren des Penicillins in der Suspension des Präparats von Beispiel 1 durch Behandlung mit Penicillinase wird jede Zellen suspension in üblicher Weise mit defibriniertem Pferdeblut agar vermischt. Das Gemisch wird in Petrischalen gegossen und 48 Stunden bei 37° C inkubiert. Nach der Züchtung werden die lebenden Zellen gezählt. Durch diesen Test wird be stätigt, daß keines der Präparate vermehrungsfähige Zellen enthält.

Claims

1. Präparat zur Behandlung maligner Neoplasien, erhältlich entweder

a) durch 10 bis 30minütiges Erwärmen der Zellen von Strepto coccus equisimilis in einer ein Penicillin in einer Menge von mindestens 25 000 Einheiten/ml enthaltenden Salzlösung auf 30 bis 38° C und anschließendes 20 bis 40minütiges Er hitzen auf 40 bis 50° C oder
b) durch 5 bis 30minütiges Erhitzen der Zellen von Strepto coccus equisimilis in einer Salzlösung auf 65 bis 100° C.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Salzlösung Bernheimer′s Basalmedium oder phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung eingesetzt worden ist.

3. Präparat nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen von Streptococcus equisimilis ATCC 21597 eingesetzt worden sind.