DE2922748C2 - Testmittel zur Bestimmung des Harnstoffgehaltes in Flüssigkeiten - Google Patents

Testmittel zur Bestimmung des Harnstoffgehaltes in Flüssigkeiten

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Description

HarnstofT ist eines der wesentlichen Endprodukte des Proteinstoffwechsels im menschlichen Körper. Demzu- -to folge gibt die HamstofTkonzentration im Blut einen Hinweis auf die Nierenfunktion. Eine Erhöhung der HamstofTkonzentration im Blut deutet auf eine unzureichende Nierenfunktion hin. Da toxische Substanzen im Blut in etwa der gleichen Proportion zum Harnstoffniveau zurückgehalten werden, bedeutet ein hoher Gehalt an Nicht-Protein-Stickstoff oder Blut-Harnstoff-StickstofT für den Arzt eine ernstzunehmende Angelegenheit.
Eine der häufigsten Ursachen für hohe Blutharnstoffwerte (Urämie) stellt eine Nierenerkrankung dar, die entweder akuter oder chronischer Art sein kann. Eine beliebige Entzündung, eine degenerative, kongenitale oder neoplastische Erkrankung der Niere kann zur Urämie führen. Das Ausmaß der Urämie gibt einen groben Index dafür, wie ernst der vorliegende Zustand ist.
In der Paxis wird die HamstofTkonzentration im Blut normalerweise in Form von Blut-Harnstoff-StickstofT (BUN) ausgedrückt. Dieser BUN-Wert stellt die als HarnstofT vorliegende StickstofTmenge dar und beträgt t>u ungefähr die Hälfte des GesamtharnstofTwertes. Wenn entweder der Harnstoff- oder Stickstoffweri bestimmt wurde, so kann der andere Wert aus demselben berechnet werden.
Der normale Bereich der BUN-Werte liegt bei den einzelnen Personen zwischen 5 und 20 mg "/0. Den niedrigeren Werten wird daher keine Bedeutung zugemessen. Eine Erhöhung der BUN-Werte indiziert im allgemeinen jedoch das Vorliegen eines abnormalen Zustandes. Die häufigste Ursache einer Erhöhung von Blut-HamstofT-StickstofF stellt eine unzureichende Ausscheidung dar, welche gewöhnlich auf eine Nierenerkrankung oder eine Hamverstopfung schließen läßt. Zum Beispiel liegen bei akuter Nephritis die BUN-Werte zwischen 25 mg % bis zu 160 mg %. Eine erhöhte HarnstofTretention tritt auch bei extensiver Parenchymzerstörung des Nierengewebes, wie bei Pyelonephritis, fortgeschrittener Nephrosclerose, Nierentuberkulose, Nierenrindennecrose, Nierenmalignität, Niereneiterung oder chronischer Gicht auf. Obwohl die BUN-Werte bis auf 400 mg% ansteigen können, überschreiten sie im allgemeinen nicht 200 mg %.
Es besteht heute auf dem medizinischen Gebiet ein Bedarf nach einer schnellen und genauen Methode zur Bestimmung des BUN-Wertes. In der Vergangenheit hat man langwierige und zeitraubende cherrvsche Naßverfahren durchgeführt, um diese Analyse vorzunehmen. Es wurden auch andere Verfahren angewandt, wie z. B. Leitfahigkeitsmessungen, spektrofotometrische Methoden und coiorimetrische Verfahren. Diese Methoden sind zwar im allgemeinen genau, doch sind die entsprechenden Verfahren sehr zeitraubend und erfordern eine sorfaltige Auswertung.
Bei der wohl am häufigsten angewandten Methode zur Harnstofibestimmung in biologischen Flüssigkeiten wird der Harnstoff mit Hilfe des Enzymes Urease in Gegenwart einer Pufferlösung zu Ammoniumcarbonat hydrolysiert. Die freigesetzte Ammoniakmenge wird colorimetrisch bestimmt. Diese erste Methode ist sehr spezifisch und empfindlich, hat jedoch den Nachteil der Ureaseinhibierung und -inaktivierung, das Problem der Reagenzstabilität, sowie den weiteren Nachteil, daß mittels dieser Methode auch endogener Ammoniak bestimmt wird. Nach einem anderen Verfahren wird ebenfalls mit Urease hydrolysiert, wobei jedoch eine spezielle Vorrichtung erforderlich ist, die in einem Routinelabor nicht immer zur Verfugung steht. Nach einem weiteren Verfahren bedient man sich der direkten colorimetrischen Reaktion des Harnstoffs in einem proteinfreien Filtrat mit einem organischen Reagenz,' wie Diacetylmonoxim. Die Diacetyl-Reaktion weist jedoch den Nachteil auf, daß die gebildete Farbe instabil ist, sowie die Tatsache, daß die Farben bei etwa 95° C entwickelt werden und daß das flüchtige Diacetyl einen Geruch besitzt, den zumindest manche Menschen als unangenehm empfinden.
In der US-PS 40 74 972 wird eine Fiüssig-Bestimmungsmethode für Harnstoff offenbrjt, die auf einer Reaktion zwischen einer Probe einer biologischen Flüssigkeit und einer sauren Reagenzlösung aus o-Phthalaldehyd und 8-{4-Amino-l-methyl-butyI-amino)-6-methoxychinolin beruht. In dieser Druckschrift wird weder die Lehre noch ein Hinweis daraufgegeben, die Reagenzlösung in ein Testmittel, wie z. B. eine Trägermatrix, zu inkorporieren bzw. einzubauen. Darüber hinaus offenbart, diese Patentschrift kein Verfahren, das Stabilitätsproblem zu lösen, das dann auftritt, wenn Reagentien mit der sauren Reagenzlösung vereinigt werden. Ein weiteres Problem der offenbarten Nachweismethode gemäß der Druckschrift besteht in der Tatsache, daß die Bestimmungen bei Wellenlängen im Bereich von 470 bis 540 nm durchgeführt werden müssen, welcher in der Nähe des Farbabsorptionsmaximums der Blindprobe liegt, wodurch die Wahrscheinlichkeit besteht, daß sich Fehler bei der spektroskopischen Reflektionsmessung ergeben.
Auf industriellem Gebiet stellt Harnstoff ein wichtiges Zusatzmittel für Verfahrensflüssigkeiten, wie für Plattierungs- oder GaIvanisierungsbäder dar. so daß ein schnelles Nachweismittel zur Bestimmung der darin enthaltenen Harnstoflkonzentration von Bedeutung ist. HarnstofFselbst wird als Düngemittel verwendet und es ist wichtig, ein schnelles Nachweismittel zur Untersuchung dieses Materials für Kontrollmaßnahmen bei dessen Produktion und Verwendung zur Hand zu haben.
Demzufolge besteht sowohl für den medizinischen wie auch für den industriellen Anwendungsbereich djr Bedarf für eine Bestimmungsmethode des Harnstoffgehaltes von Flüssigkeiten, weiche schnell und ohne hochspezialisierte Ausrüstung oder trainiertes Personal zur Bedienung derselben durchgeführt werden kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Testmittel zum Nachweis von Harnstoff zur Verfugung zu stellen, das einfach gehandhabt werden kann und eine stabile Farbänderung :rgibt.
Diese Aiifrt2be wir« 2us°ehend von einem Testnuitel zum Nachweis von Harnstoff, wobei das Testmittel o-Phthalaldehyd und ein chromogenes Chinolinderivat enthält, durch die im Kennzeichen des Patentanspruchs 1 angegebenen Merkmale gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen 2 bis 6 beschrieben.
M it H ilfe des erfindungsgemäßen Testmittels wird die Stabilität der verwendeten Reagenzien zur Herstellung desselben gewährleistet. Darüber hinaus werden Ein-Piüssc aufgrund derSerutiturbidität und derGegenwart von Bilirubin bei der Bestimmung des Harnstoffgehaltes im Blutserum suf ein Minimum ,eduziert.
Die erfindungsgemäßen Testmitiel weisen eine hohe Spezifität und Empfindlichkeit für die Harr_,toffbestimmung in Flüssigkeiten über einen breiten Konzentrationsbereich auf.
Das erfindungsgemäße Testmittel ermöglicht den Nachweis von Harnstoff auch dann, wenn die zu untersuchende Flüssigkeitsmenge begrenzt ist.
Die Reagenzien o-Phthalaldehyd und das andere Reagenz 3-Hydroxy-l,2,3,4-tetrahydrobenzo[h]chinolin, 3-Acetoxy-l,2,3,4-tetrahydrobenzo[h]chinolin oder deren Dihydrochloridsalze werden vorzugsweise voneinander mit Hilfe eines polymeren Materials getrennt.
Das Testmittel wird angewandt, indem es für einen Augenblick bzw. kurze Zeit in eine Testprobe eingetaucht wird oder indem auf andere Weise die Testprobe auf die Trägermatrix aufgebracht wird und das Auftreten einer möglichen Farbänderung beobachtet bzw. ausgewertet wird.
Im Rahmen dieser Beschreibung bedeutet die Bezeichnung »Flüssigkeiten« Körperflüssigkeiten, wie Blutserum, Blutplasma, Urin, Rückenmarksflüssigkeiten sowie außerdem wäßrige Lösungen, welche Harnstoff enthalten. Obwohl die am meisten bevorzugte Anwendung des Testmittels und der Methode gemäß der Erfindung sich auf Körperflüssigkeiten, wie Blutserum, beziehen, ist es selbstverständlich, daß das Testmittel und die Methode auch auf industrielle Flüssigkeiten angewandt werden können.
Das Testmittel liegt zweckmäßig als Reagenzstreifen vor, der in einer Trägermatrix die genannten Reagenzien in geeigneter Weise, z. B. durch eine polymere Trennschicht getrennt, enthält. Der Ausdruck »Trägermatrix« bezieht sich auf saugfähige und nicht-saugfahige Matrizes, welche in Wasser oder anderen physiologischen Flüssigkeiten unlöslich sind und ihre strukturelle Integrität in den genannten Flüssigkeiten beibehalten. Geeignete saugfähige Matrizes umfassen Papier, Zellulose, Holz, synthetische Harzvliese, gewebte und vliesartige Stoffe.
■> Nicht-saugfähige Matrizes umfassen Glasfasern und organoplastische Materialien, wie Polypropylen. Die Matrix kann in vorteilhafter Weise auf einem unlöslichen Trägerelement, wie einem organoplastischen Streifen, z. B. Polystyrol, durch geeignete Mittel, wie
ι» ζ. B. ein doppelseitiges Klebeband, zur leichteren Handhabung befestigt bzw. aufgebracht sein.
Die in der Trägermatrix enthaltenen Reagenzien reagieren unter sauren Bedingungen mit Harnstoff, wobei sie eir-Chromogen bilden, welches Licht oberhalb etwa
ι "> 550 nit und normalerweise zwischen etwa 550 und etwa 700 nm absorbiert. Die quantitative Auswertung erfolgt durch Bestimmung bzw. Aufzeichnung der Reflexionsänderung bei ca. 620 nm Anwendung oder Kontakt mit der Probe.
2» Geeignete starke Kationenaustauschharze sind z. B. Divinylbenzol-vemetzte Sulfonsäure-modifizierte Polystyrole. Die Trägermatrix wird mit ca. 25 bis ca. 50 Gew.-% Ionenaustauschharz, vorzugsweise mit ca. 35 bis ca. 50 Gew.-%, beladen.
2'j Während gemäß der Erfindung die Reagenzien auf die Trägermatrix getrennt aufgebracht werden müssen, ist die Reihenfolge dieser Aufbringung der Reagenzien nicht von Bedeutung. Jedes der Reagenzien kann als erstes aufgebracht werden. Das Kationenaustauschharz
jo kann entweder gleichzeitig mit dem ersten Reagenz auf die Trägermatrix aufgebracht werden oder es kann eine mit dem Kationenaustauschharz beladene Trägermatrix verwendet werden.
Vorzugsweise umfaßt die erste Stufe das Auftragen
)5 von mindestens einem Reagenz auf die Trägermatrix. Die zweite Stufe umfaßt in der Regel das Auftragen eines Polymeren auf die Trägermatrix, wobei das Polymere in einem Lösungsmittel vorliegt, welches weder das erste Reagenz noch das Sulfonsäurems'erial auflöst.
■»ο Geeignete Polymere sind z. B. Methylzellulose, Zelluloseacetat, Polyäthylenoxid, Stynol-Butauien-Copolymer, Styrol-Isopren-Copolymer, Polystyrol- und Styrol-Acrylonitril-Copolymer. Schließlich umfaßt die dritte oder letzte Stufe das Auftragen des anderen Reagenz auf
■ti die Trägermatrix, wobei das Reagenz in einem Lösungsmittel vorliegt, welches das in der zweiten Stufe aufgebrachte polymere Material nicht auflöst. In der Regel läßt man den Reagenzstreifen zwischen den einzelnen Stufen trocknen.
Geeignete Lösungsmittel zur Verwendung mit o-Phthalaldehyd umfassen Wasser, Methanol, Aceton und Hexan. Wasser, Methanol oder ein Gemisch derselben stellen das bevorzugte Lösungsmittel dar, wenn das Reagenz o-Phthalaldehyd in der ersten Stufe aufgebracht wird. Aceton oder Hexan stellen das bevorzugte Lösungsmittel dar, wenn das Reagenz o-Phthalaldehyd in der dritten Stufe aufgebracht wird. In bezug auf die Polymeren stellen geeignete Lösungsmittel dar: Chloroform, Aceton, Benzol, Toluol und dergleichen.
bo Geeignete Lösungsmittel für das andere Reagenz umfassen Wasser, Methanol und Methanol- und Aceton-Gemische. Wasser stellt wiederum das bevorzugte Lösungsmittel dar, wenn das Reagenz in der ersten Stufe aufgebracht wird; wird das Reagenz in der dritten
b5 Stufe aufgebracht, so stellt entweder Methanol oder ein Methanol-Aceton-Gemisch das bevorzugte Lösungsmittel dar.
Die Reagenzien können in verschiedenen Konzentra-
tionen verwendet werden. In der Regel liegt o-Phthalaldehyd in einer Menge von ca. 300 mg % bis 800 mg % und vorzugsweise in eine/Menge zwischen ca. 500 mg% und 600 mg % vor. Das andere Reagenz liegt normalerweise in einer Menge zwischen ca. 200 mg % und ca. 500 mg % vor, wenn ein Dihydrochloridsalz verwendet wird, und in einer Menge von ca. 600 mg % bis ca. 1200 mg %, wenn die freie Base verwendet wird. Die Konzentrationen des polymeren Materials sind nicht kritisch, vorausgesetzt, daß eine Menge zwischen 0,5 g % und ca. 5 g % verwendet wird. Vorzugsweise sollte das polymere Material in einer Menge zwischen ca. 1 g % und 3 g % vorliegen.
Während vorzugsweise die Herstellung des Testmittels durch eine dreistufige Imprägnierung, der sich jeweils eine Trocknmig anschließt, erfolgt, kanri das Testmittel auch nach anderen geeigneten Methoden hergestellt werden, wie z. B. durch Aufdrucken auf eine oder mehrere Seiten einer Matrix oder durch geeignetes Aufbringen der getrennten Reagenzien auf gegenüberliegenden Seiten eines Substrates oder einer Matrix.
Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert:
Beispiel I
Die Herstellung eines Testmittels in Form einerTestvorrichtung wird nachstehend beschrieben. Ein mit Salzsäure (10 bsi 20%) vorgewaschenes, mit einem Kationenaustauscher beladenes Filterpapier mit einer Austauschkapazität von etwa 4 Milliaquivalenten pro Gramm Trockenharz, wurde in drei Stufen mit den folgenden Lösungen imprägniert, nachdem es mit deionisiertem Wasser gewaschen und getrocknet wurde.
Erste Imprägnierungsstufe
Das Filterpapier wurde imprägniert, indem es in Lösungen eingetaucht wurde, welche die folgenden Materialien in den angegebenen Mengen enthielten.
10
15
20
30
35
Material
Menge
100 ml 45 S 0
100 mg mg 5
10
2,5 20
300 30
10 g 40
Wasser
Maieinsäureanhydrid-Methylvinyläther-
Copolymer (Stabilisator)
Borsäure (Farbstabilisator)
o-Phthalaldehyd
7-(2,3-Dihydroxypropyl)-theophyliin
(Stabilisator)
Nach dem Imprägnieren wurde das Papier 30 Minuten lang bei 600C getrocknet.
Zweite Imprägnierungsstufe
Das getrocknete, imprägnierte Papier der ersten Stufe wurde in eine Lösung eingetaucht, welche die folgenden Materialien in den angegebenen Mengen enthielt.
50
Material
Menge
60
Toluol 1ÖÖ ml
Pelystyrokügelchen 2 g
Dritte Imprägnierungsstufe
Das getrocknete, imprägnierte Papier aus der zweiten Stufe wurde dann durch Eintauchen in eine Lösung imprägniert, welche die folgenden Materialien in den angegebenen Mengen enthielt. Die Materialien (1) und (4) wurden zuerst aufgelöst, die Stoffe (2) und (3) wurden getrennt aufgelöst und dann zu den Materialien (1) und (4) unter Bildung einer Lösung zugegeben.
Material
Menge
(1) Methanol 30 ml
(2) Aceton 70 ml
(3) Hydroxypropylzellulose (Stabilisator) 0,5 g
(4) 3-Hydroxy-l,2,3,4-tetrahydrobenzo[h]- 300 mg
chinolin-hydrochlorid
Das Papier wurde 10 Minuten lang bei 60° C getrocknet und mittels eines doppelseitigen Klebebandes auf eine Polystyrolunterlage bzw. einen -träger aufgebracht. Der Polystyrolträger gewährleistet eine geeignete Handhabe bzw. einen Griff zum Eintauchen des erhaltenen Papierteststreifens bzw. der Testvorrichtung in eine Lösung, deren Harnstoffge-'.- alt zu bestimmen ist.
Die Farbintensität der Reagenzstr:ifen für verschiedene Harnstoffkonzentrationen wird in der folgenden Tabelle gezeigt.
Ein Teil einer Serumprobe, welche die angegebene Menge an Harnstoff-Stickstoff enthält, wird mit 2 Teilen Wasser verdünnt und es werden 0,030 ml auf die Oberfläche des in Beispiel 1 hergestellten Teststreifen aufgebracht. Nach Inkubieren bei 37° C während 1 Minute wird die Reflexionsstärke des Reagenzstreifens bei 620 nm im Verhältnis zu einer Bariumsulfat, weißen Reflexionsoberfläche bestimmt.
Tabelle 1
HarnstofT- % Rifle- Harnstoff- % Refle-
StickstofF- xions- StickstofT- xions-
Konzentration stärke Konzentration stärke
(mg %) (mg %)
30 27 25 21 18 15
Ein mit 40 Gew.-% Kationenaustauschharz (Polystyrolsulfonsäure, zu 8% mit Divinylbenzol vernetzt, Säuref.-IyJi) beladenes Filterpapier wurde wie folgt imprägniert:
En>te Imprägnierungsstufe
Das Filterpapier wurd durch Eintauchen in eine Lösung imprägniert, welche die folgenden Materialien in den angegebenen Mengen enthielt.
75 50
62 60
54 70
44 90
38 120
33 150
B e i s ρ i e 1 I]
Material Menge
Wasser Polyäthylenoxid
o-Phthalaldehyd
100 ml
59 mg
300 me
Fortsetzung
Material
Menge
7-{2,3-Dihydroxypropyl)-theophyIlin 10 g
(Stabilisator)
Borsäure 2,5 g
Nach der Imprägnierung wurde das Papier 30 Minuten lang bei 60° C getrocknet.
Zweite Imrprägnierungsstufc
Das getrocknete imprägnierte Papier aus der ersten Stufe wurde dann durch Eintauchen in eine Lösung imprägniert, welche die folgenden Materialien in den angegebenen Mengen enthielt.
Material
.Menge
Toluol
Styrol-Acrylonitril-Copolymer
100 ml
2g
Material
Menge
(1) Methanol 30 ml
(2) Aceton 70 ml
(3) Hydroxypropyizellulose 0,5 g
(4) 3-Acetoxy-l,2,3,4-tetrahydrobenzo[hl- 300 mg
chinol in-hyd rochlorid
in
Ii
Nach der Imprägnierung mit dem Styrol-Copolymer wurde das Papier 15 Minuten lang bei 60° C getrocknet.
Dritte Imprägnierungsstufe
Das getrocknete, imprägnierte Papier aus der zweiten Stufe wurde dann durch Eintauchen in eine Lösung imprägniert, welche die folgenden Materialien in den angegebenen Mengen enthielt. Die Materialien (1) und (4) wurden zuerst aufgelöst; die Materialien (2) und (3) wurden getrennt aufgelöst und dann zu den Materialien (1) und (4) unter Bildung einer Lösung zugegeben.
10
45
Das Papier wurde dann 10 Minuten lang bei 60° C getrocknet und auf einen Polystyrolträger mittels eines doppelseitigen Klebebandes aufgebracht. Der Polystyrolträger schafft eine geeignete Handhabe bzw. einen Griff, womit die erhaltene, mit Reagenz imprägnierte Testvorrichtung in eine Lösung eingetaucht wird, um den Harnstoffgehalt der Lösung zu bestimmen.
Weitere Testmitte] wurden nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel II beschrieben, hergestellt, wobei das Harz zu 2% bzw. 16% mit Divinylbenzol vernetzt war. Es wurde festgestellt, daß die durch Eintauchen in eine Hamstoffprobe gebildete Farbintensität durch Variieren des Vemetzungsanteiles kontrolliert werden konnte. Die Intensität stand im umgekehrten Verhältnis zum Vemetzungsgrad.
Die Geschwindigkeit der Farbbildung der Hamstoff-Stickstoff-Reagenzstreifen, welche mit Trägern hergestellt worden waren, die Ionenaustauschharze mit unterschiedlicher Divinylbenzol-(DVB)-Vemetzung aufwiesen, wird in der folgenden Tabelle gezeigt.
Es wurden Reagenzsireifen, wie in Beispiel II, unter Verwendung von mit Ionenaustauschharz beladenem Papier, welches Harze mit 2%, 8% bzw. 16% Divinylben-
zol-Vernetzung enthielten, hergestellt. Die Harnstoffproben wurden dann verdünnt, I Minute lang bei 37° C inkubiert und auf einem Reflektormeter, wie in Tabelle 1, ausgewertet.
Tabelle 2
Bestimmung der Reflexionsstärke bei verschiedenen I larnstoffkonzentrationen und verschiedener DVB-Vernetzung (die Werte der Reflexionsstärke und die Farbintensität stehen im umgekehrten Verhältnis zueinander)
HarnstofT-Stickstofr-Kon/entration (mg 0A)
% DVB*)-Vernetzung 2 8
20 37 44 66
40 27 33 56
60 21 27 50
") Divinylben/ol
Die Geschwindigkeit der Farbbildung der Harristoff-Stickstoff-Reagenzstreifen, welche aus Trägern hergestellt wurden, die mit variierenden Mengen an Ionenaustauschharz beladen sind, wird in der folgenden Tabelle aufgezeigt.
Es wurden wie in Beispiel I Reagenzstreifen aus einem mit ionenaustauschharz beladenen Papier, welches 25,35 bzw. 50 Gew.-% eines 8% mit Divinylbenzol vernetzten Ionenaustauschharzes enthielt, hergestellt. Die Hamstoffproben wurden verdünnt, 1 Minute lang bei 37° C inkubiert und auf einem Reflektor wie in Tabelle 1 vermessen.
Tabelle
Ablesungen der Reflexionsstärke bei variierenden
Harnstoffkonzentrationen und variierendem Harzgehalt
mg % HamstofT-
S tickstofT-Konzentration
% Harzgehalt 25
35
58
48
42
Beispiel III
51
40
33
Unter Verwendung eines Ionenaustauschpapiers, wie es in Beispiel II beschrieben wird, wurden Testvorric.itungen bzw. Teststreifen nach dem folgenden 3-Stufen-Verfahren hergestellt.
Erste Imprägnierungsstufe
Das Papier wurde imprägniert, indem es in eine Lösung eingetaucht wurde, die die folgenden Materialien in den angegebenen Mengen enthielt.
Material
Menge
Wasser 25 ml
Polyäthylenoxid 100 mg
7-{2,3-Dihydrosypropyl)-theophyl!!n 10 g
Äthylendinitrilotetraessigsäure, 1,5 g Dikaliumsalr
Fortsetzung
Material
Menge
Natriumlaurysulfat
Methanol
Glycin
Borsäure
o-Phthalaldehyd
100 mg 75 ml 0,2 ml 4,5 g
600 mg
Nach der Imprägnierung wurde das Papier bei 50° C 20 Minuten lang getrocknet.
Zweite Imprägnierungsstufe
Material
Menge
Polystyrolkügelchen
3g
Nach der Imprägnierung mit dem Styrolpolymer wurde das Papier 10 Minuten lang bei 50° C getrocknet.
Dritte Imprägnierungsstufe _>-,
Das getrocknete imprägnierte Papier aus der zweiten Stufe wurde dann durch Eintauchen in eine Lösung imprägniert, welche die folgenden Materialien in den angegebenen Mengen enthielt. Die Materialien (2), (3) und (4) wurden separat vereinigt und dann das Material '" (1) unter Bildung einer Lösung zugegeben.
Material
Menge
(1) Methanol
(2) A es ton
25
ml m!
(3) Hydroxypropylzellulose 0,75 g
(4) 3-Hydroxy-l,2,3,4-tetrahydrobenzo[h]- 900 mg w
chinolin
Das Papier wurde 5 Minuten lang bei 50° C getrocknet. Der erhaltene Teststreifen kann für Blutserum oder Plasma, welche nicht verdünnt wurden, wie dies im 4> Falle der Teststreifen der Beispiele I und II erforderlich ist. Tür Konzentrationen bis zu 70 mg% HarnstofT-Stickstoff verwendet werden.
Es ist selbstverständlich, daß die Verwendung der in den Ausfuhrungsbeispielen genannten Stabilisatoren für die vorliegende Erfindung nicht kritisch ist; beispielsweise können auch Theophyllin und CofTein verwendet werden, z. B. in Mengen über 5 g %.
Durch die Erfindung ergeben sich folgende Vorteile:
Erstens, bei den üblichen sauren Bedingungen der Bestimmungen fallen Serumproteine normalerweise aus und interferieren mit der Entwicklung des Chromo-
gens. Die vorliegende Erfindung elimiert die Niederschlagsbildung von Serumproteinen, indem sie unter Verwendung eines mit einem starken Kationanaustauscher beladenen Papieres eine geeignete saure Matrix schafft.
Zweitens, die verwendeten Reagenzien sind normalerweise instabil. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfugung, bei welchem die Reagenzien auf einer auf einer Papiermatrix in einem Format so inkorporiert werden, daß die Reagenzien stabilisiert werden.
Drittens, gcmäti der vorliegenden Erfindung wird der Fehler bei den reflektionsspektroskopischen Messungen zur Bestimmung des Harnstoffgehaltes im Blutserum aufein Minimum reduziert. Gemäß der Erfindung wird ein Kopplungsagens verwendet, welches ein Chromogen bildet, das bei Wellenlängen weit über 550 nm nachgewiesen werden kann. Dadurch werden die Probleme infolge ρ.ϊπκγ auf den Streifen iiuftretenden gelben Blindreaktion und die durch Bilirubin und/oder Turbidität im Serum verursachte Farbbeeinflussung, welche bei der Absorptions- oder Reflcktionsspektroskopie beoachtet werden, überwunden. Durch die Verwendung von 3-Hydroxy-l,2,3,4-tetrahydrobenzo[h]-chinolin oder dessen Dihydrochlorid-salz wird die auftretende Blindreaktion aufein Minimum reduziert. Im Gegensatz dazu entwickelt bei Verwendung von Primachin-diphosphat-{8-(4-amino-l-methylbutylamino)-6-methoxychinolin] oder N-Naphthyläthylendiamindihydrochlorid das gebildete Chromogen eine Farbe, welche bei Wellenlängen in der Nähe des Absorptionsmaximums der Blindreaktion gemessen werden muß. Somit erlaubt die Verwendung von 3-Hydroxy-l.2,3,4-tetrahydrobenzo(h]chinolin oder dessen Dihydrochlorid-salz die Messung bei Wellenlängen, bei welchen die Farbe aufgrund der Blindreaktion minimal ist.
Darüber hinaus werden gemäß der Erfindung alle Reagenzien in eine einzige Matrix inkorporiert, ohne Verwendung von ätzenden bzw. korrosiven flüssigen Reagentien.
Die Erfindung kann außer bei der Bestimmung dej Harnsoffgehaltes von Körperflüssigkeiten auch eine wichtige Anwendung in der genauen Harnstoffbestimmung in industriellen Abwässern finden, bei welchen die Harnstoffkonzentration innerhalb bestimmter Grenzen gehalten werden muß. Mittel zur Bestimmung von Harnstoff enthaltenden Flüssigkeiten, sei es für industielle oder Tür physiologische Zwecke, sind dann von großer Bedeutung, wenn mit Hilfe des Testmittels die Bestimmung möglichst schnell, zuverlässig und auf einfache Weise durchzuführen ist, so daß sie von dem Techniker leicht erlernt werden kann.
Darüber hinaus muß im Falle der medizinischen Diagnose das Testmittel so genau sein, um Veränderungen im Zustand eines Patienten wiederzuspiegeln. Sämtliche dieser Ziele können mit Hilfe der Erfindung erreicht werden.

Claims (6)

Patentansprüche:
1. Testmittei zum Nachweis von Harnstoff, wobei das Testmittei o-Phthalaldehyd und ein chromogenes Chinolinderivat enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es eine mit einem in der Säureform vorliegenden starken Kationenaustauschharz beladene Trägermatrix umfaßt, weiche getrennt voneinander mit den Reagenzien a) o-Phthalaldehyd und b) einer Verbindung aus der Gruppe 3-Hydroxyl,2,3,4-tetrahydrobenzo[h]chinolin, 3-Acetoxyl,2,3,4-tetrahydrobenzo[h]chinolin und deren Dihydrochloridsalze imprägniert ist.
2. Testmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz o-Phthalaldehyd in einer Menge von ca. 300 mg % bis etwa 800 mg % und das andere Reagenz in einer Menge von etwa 200 mg % bis etwa 500 mg % vorliegt, wenn das Dihydrochloridsalz verwendet wird, und in einer Menge von etwa 600 mg % bis etwa 1200 mg %, wenn die freie Base verwendet wird.
3. Testmittel gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien voneinander durch ein polymeres Material getrennt werden. >5
4. Testmittel gemäß Ansprächen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermatrix eine saug fähige Zellulosepapiermatrix darstellt.
5. Testmittel gemäß Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermatrix mit etwa 25 jo bis etwa 50 Gew.-% Ionenaustauschharz beladen ist.
6. Testmittel gemäß Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Ionenaustauschharz ein Harz mit 2 bis 16% Divinylbenzol-Vernetzung darstellt. J5
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