DE2930794C2 - Herstellung von Mikroorganismen zur Spaltung oder Synthese von β-Lactamantibiotika - Google Patents
Herstellung von Mikroorganismen zur Spaltung oder Synthese von β-LactamantibiotikaInfo
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Description
Es ist bekannt, daß zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (6-APS) und von 7-Aminocephalosporansäure (7-ACS) aus /7-Lactamantibiotika Acylasen, welche
die Säureamid-Bindung spalten, verwendet werden kennen.
6-APS und 7-ACS werden zur Synthese von verbesserten, semisynthetischen /?-Lactamen tibiotika
eingesetzt.
Acylasen wurden in Basidiomyceten, Schicomyceten und Actinomyceten gefunden, die vorzugsweise Penicillin V zu 6-APS spalten und in Bakterien, welche
vorzugsweise Penicillin G zu 6-APS und Cephalosporine zu 7-ACS spalten.
Siehe dazu B. Sjöberg, L. Nathorst-Westfell, B. Örtengren.ActaChem.Scand. 1967,21,547-551.
Außerdem können derartige Acylasen in Umkehrung der Reaktion zur Synthese von 0-Lactamantibiotika
verwendet werden. Siehe dazu M. CoIe, Biochem. J., 1969,115,747-756.
Per Stand der Technik zur Verbesserung der Leistungsfähigkeit von Mikroorganismen mittels »genetic
engineering« ergibt sich aus den nachstehend aufgeführten Druckschriften.
Nach Collins J. und Hohn B. (1978) Proa NatL Acad.
Sei. USA, 75, 4242—4246 und Collins Jt und Bruning J.
(1978) Gene 4,85—107 und Collins J.und Hohn B.(1979)
Hoppe Seyler's Z. f. PhysioL Chem. 360, 244 und
deutsche Patentanmeldung P 28 14 039.8 ist der Begriff
ίο des Cosmids ρ JC 720 (DSM 1448) und dessen Derivate
und des Cosmidhybrids und der in vitro Verpackung bekannt Plasmide mit hoher Kopienzahl, CoL E1
(ATCC 27 138), ρ MB 9 und dessen Derivat ρ BR 322 sind aus Timmis K. N, Cohen S. N, Cabello F. C (1978)
t5 Progr. Molec SubcelL BioL 6, 1 -58 und aus Collins J.
MicrobioL Immunol. (1977)78, 121 — 170 bekannt Die Gewinnung von Plasmiden ist in Clewell urvd Helinsky
(1970) Biochem. 9.4428-4440 beschrieben.
dem Fachmann bekannt nach Roberts CRS Crit Rev. Biochem. (1976)4, 123—164 und Gene (1978)4,
183—193. Die Kopplung von gespaltenen DNA-Fragmenten ist aus Collins J. (La) bekannt
Es ist die Aufgabe der Erfindung, Mikroorganismen
zur Spaltung oder Synthese von 0-Lactamantibiotika
unter Verwendung der Gesamt-DNA eines Acylaseproduzierenden Mikroorganismus herzustellen. Zur
Lösung dieser Aufgabe sind die kennzeichnenden Maßnahmen des Anspruches 1 vorgesehen. Die Ansprü
ehe 2 bis 7 nennen Ausgestaltungen des erfindungsge
mäßen Verfahrens. Im Anspruch 8 wird die Verwendung des erfindungsgemäß herstellbaren Prokaryonten
angegeben.
nachstehende Beispiel erläutert:
Aus der von Escherichia coli ATCC 11 105 isolierten
Gesamt-DNA wird das DNA-Fragment für die Acylase
herausgeschnitten und nach J. Collins und B. Hohn in
Proa Natl. Acad. Sei. USA (1978)75, 4242-4246 eine Genbank mit dem Cosmid ρ JC 720 (DSM 1448) in
Escherichia coli K 12-HB 101 (DSM 1452) angelegt Nach RepHca-Plattierung auf Vollmedien-Agarplatten
werden nach Überschichtung mit 5 ml Weich-Agar, der
04 ml einer Übernachtkultur von Serratia marcescens
(ATCC 27 117) in 100 ml Überschichtungsmedium und
3 g/l Penicillin G enthält, nach Bebrüten bei 37° C über Nacht durch Entstehen von Wachst'."nsinhibition von
so Serratia marcescens (ATCC 27 117) durch Bildung von
6-APS die Acylase-positiven Klone selektioniert.
Die isolierte DNA von einem Acylase-positiven Klon wird mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Pst 1
bzw. Hind Hl gespalten, das Plasmid ρ BR 322 ebenfalls
und die DNA-Fragmente in vitro mit Ligase gekoppelt
und in den /7-Laktamase-freien Escherichia coli-Stamm
5 K (DSM 1454) durch Transformation eingeführt und
mit dem vorher beschriebenen Wachstumsinhibitionstest in Gegenwart von 20μβ/τη\ Tetracyclin wird ein
bestrahlt und erneut in Escherichia coli 5K mit der
rnutagenisierten Plasmid-DNA transformiert und wie
zuvor in gleicher Weise selektioniert. Der so erhaltene
Stamm mit stabiler, hoher, konstitutiver Acylase-Aktivität erhielt die Bezeichnung Escherichia coli 5 K
(p HM 12) und die Hinterlegungsnummer DSM 1610.
Die spezifische Aeylase-Aktivität beträgt bei 45°C
240 U im nicht induzierten, d, h, konstitwtiven Zustand.
Die relative Substratspezifität für Escheriehja coH5K
(p HM 12) DSM J 610 ist folgende;
Substratspezifität bei Substratkonzentration 5Gew,-%, 45qC, pH 7,8, ReL Spaltung 240U für
Penicillin G = tOO; 1 U = 1 uMol 6 APS/min * g Bakterienfeuchtmasse.
| Stand der Technik |
Bovista
plumbea NRRL 3824 nicht induziert |
Verfahren der Erfin
dung |
|
|
E. coli
ATCC 11105 induziert |
Spuren |
E. coli 5K
(pHM12) DSM 1610 nicht induziert (konstitutiv) |
|
| Penicillin G | 13 | - | 100 |
| Ampicillin | 5,1 | 3 | 40 |
| Penicillin V | 1,6 | - | 10 |
| Cephalosporin G | - | 87 | |
| - = nicht bestimmt | |||
Die Stabilität von Escherichia coli 5K (p HM 12) DSM 1610 wird wie folgt überprüft:
Von einer 50 ml Übernachtkultur von Escherichia coli 5K (p HM 12), DSM 1610, im Vollmedium bei 30°C
gezüchtet, werden auf 20 μg/mI Tetracyclin-PIatten in
einer Verdünnung von 10~5 bis 10-'° ausplattiert und
mit dem vorher beschriebenen Wachstumsinhibitionstest auf Aeylase-Aktivität überprüft. Von 1000 Kolonien
konnte keine acylas?nsgative Kolonie nachgewiesen werden.
Bei 4° C gelagerte Bakterien-Ftcichtmasse von
E.COÜ 5K(p HM 12) DSM 1610 ztir-sich nach 15Tagen
noch die Ausgangsaktivität
Der nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Mikroorganismus Escherichia coli 5K (p HM 12)
DSM 1610 bietet gegenüber den Mikroorganismen nach dem Stand der Technik folgende Vorteile:
Die Synthese der Acylase ist konstitutiv und benötigt keinen Induktor und unterliegt in Gegenwart von
Lactose und Fruktose keiner Katabolitrepression, was die Wirtschaftlichkeit der Gewinnung des Biokatalysators
erheblich verbessert
Die spezifische Aktivität der Acylase zur Spaltung von /J-Lactamantibiotika ist mindestens 15fach gegenüber
einem nicht induzierten Mikroorganismus nach dem Stand der Technik. Außerdem ist das Gen für die
Acylase etwa 50O0fach angereichert und kann somit in vivo und in vitro durch spezifische und unspezifische
Mutagenese verändert werden, daß einerseits eine höhere spezifische Aktivität und andererseits eine
veränderte Substratspezifität resultiert
Nach dem Stand der Technik ist bekannt, daß die
Acylase auch die Umkehrung der Reaktion, d. h. die Synthese von /J-Lactamantibiotika aus 6-APA und einer
Säure durchführen kann (M. CoIe, Biochem.J. (1969), 115.747-756).
Da der Stamm Escherichia coli5K (pHM12)
DSM 1610 eine deutlich erhöhte spezifische Acylase enthält, kann dieser Stamm oder das daraus gewonnene
Enzym mit erhöhter Effizienz für die Synthese von ß-Lactamantibiotika eingesetzt werden.
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen zur Spaltung oder Synthese von /f-Lactam-antibioiika unter Verwendung der Gesamt-DNA eines
Acylase-produzierenden Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Gesamt-DNA das DNA-Fragment für die Acylase
herausgeschnitten und auf PJasmide mit hoher Kopienzahl in vitro gekoppelt wird und in einem
/ϊ-Lactamase-freien prokaryotischen Wirtsstamm
eingeführt, selektiv isoliert und damit ein Prokaryont
mit stabiler, hoher konsumtiver Acylase-Aktivität
hergestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die selektiv isolierte Plasmid-DNA in vivo oder in vitro mutagenisiert
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung eines Acylase-Gen-enthaltenden DNA-Fragmentes von einer
Genbank, die durch Cosmide aus der Gesamt-DNA
eines Prokaryonten hergestellt ist, ausgegangen
wird.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Cosmide solche mit der
Bezeichnung ρ JC 720 verwendet werden.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Plasmide mit hoher
Kopienzahl solche mit der Bezeichnung CoI E 1 oder ρ MB 9 verwendet werden.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als 0-Lactamase-freier prokaryotischer Wirtsstamm ein Organismus aus der
Gattung Enterobacteriaceae verwendet wird.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Einführung des in vitro an
ein Plasmid gekoppelten DNA-Fragmentes für die Acylase mittels Transformation in den Wirtsstamm
erfolgt
8. Verwendung des nach einem der Ansprüche 1 bis 7 erhaltenen Prokaryonten mit stabiler, hoher
konstitutiver Acylase-Aktivität als Biokatalysator zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure oder
von 7-Aminocephalosporansäure aus Cephalosporinen.
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Families Citing this family (3)
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-
1979
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Non-Patent Citations (1)
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