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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von Kennwerten von Suspensionen von Hefezellen, das sich günstig zur mikrobiologischen Kontrolle von Hefekulturen eignet, und bei dem das Verhältnis von toten und lebenden Zellen und die Menge der Lipideinschlüsse in ihnen sowie der Paraffine in Suspensionen von n-Paraffine oxidierenden Hefen bestimmt werden.
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Bei der Kultivierung von Futterhefen ist die mikrobiologische Kontrolle der Kennwerte einer Hefesuspension von besonderer Bedeutung.
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Eine systematische Durchführung der mikrobiologischen Kontrolle erlaubt die gezielte Steuerung kontinuierlich geführter Kultivierungsverfahren und ermöglicht eine Produktionssteigerung sowie die Herstellung von Futterhefen hoher Qualität.
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Es ist bekannt, das Qualität und Menge der kultivierten Hefen in wesentlichem Maße von der Genauigkeit und Schnelligkeit der Ermittlung des Prozentsatzes an toten und lebenden Zellen, der Lipideinschlüsse in ihnen und der Paraffinmenge in der Hefesuspension abhängig sind.
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Zur Ermittlung der Gesamtzahl der Zellen in Hefesuspensionen sind bereits verschiedene Verfahren bekannt. Hierzu gehören: Die direkte mikroskopische Auszählung der Partikel- bzw. Zellzahl in Zählkammern, auf fixierten gefärbten Ausstrichen, die Zellzahlermittlung nach Impfung in festen Medien etwa nach dem Koch'schen Plattengußverfahren sowie in flüssigen Nährmedien nach dem Maximalverdünnungsverfahren.
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Die direkte Zählung der Zellzahl unter einem Mikroskop kann auch in einer Gorjajew-Zählkammer, die der Zählkammer nach Thoma ähnelt, erfolgen.
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Die Gorjajew-Zählkammer besteht aus einem dicken, geschliffenen Glas, in dessen mittlerem Teil ein Gitter aus Quadraten vorgesehen ist, die durch Längs- und Querlinien gebildet werden, die sich rechtwinklig kreuzen.
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Damit die Zellzahl in der zu untersuchenden Probe ermittelt werden kann, muß so mit Wasser verdünnt werden, daß die Zellen im Gitter gezählt werden können (nicht mehr als 10 bis 16 Zellen/Gitterquadrat).
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Nach gutem Mischen der Probe wird mit einem Glasstäbchen ein Tropfen davon auf das Gitter aufgebracht.
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Das fertige Präparat wird auf den Objekttisch eines Mikroskops gelegt und bei geringer Vergrößerung im Gitterbereich ausgezählt. Die Zellzählung erfolgt mit einem Objektiv mit 40facher Vergrößerung und einem Okular mit 10facher Vergrößerung, wobei dann ein Gitterquadrat ganz im Gesichtsfeld liegt.
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Dieses Verfahren der direkten Zellzählung in Mikroorganismensuspensionen ist jedoch nicht sehr effektiv, da die Zählgeschwindigkeit außerordentlich klein ist.
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Dieses Verfahren erlaubt ferner auch keine Differenzierung zwischen toten und lebenden Zellen und keine Bestimmung von Anzahl und Menge der Lipideinschlüsse in den Zellen und der Paraffineinschlüsse in entsprechenden Hefesuspensionen.
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Zur direkten Zählung von Zellen auf fixierten gefärbten Ausstrichen ist das Winogradski-Schulgina- Breed-Verfahren bekannt. Dieses Verfahren besteht darin, daß die Zellzahl in einem bestimmten Volumen der zu untersuchenden Hefesuspensionen direkt ausgezählt wird.
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Die Verwendung fixierter Ausstriche eröffnet die Möglichkeit, die hergestellten Präparate der Hefesuspension lange aufzubewahren und die Zählung der Zellen zu einem beliebigen, günstigen Zeitpunkt durchzuführen.
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Die Zellzählung erfolgt unter einem Mikroskop mit Immersionsobjektiv durch ein quadratisch geteiltes Okulargitter hindurch. Es werden 50 bis 100 Gitterquadrate (mindestens 10 Gesichtsfelder) ausgezählt, wobei das Präparat der Hefesuspension schräg verschoben wird. Ohne Okulargitter können die Zellen auch in der gesamten Fläche des Gesichtsfelds des Mikroskops ausgezählt werden.
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Maximale Genauigkeit wird erreicht, wenn die Gesamtzahl der ausgezählten Zellen 600 bis 1000 beträgt. Die Fläche des Quadrats des Okulargitters bzw. Gesichtsfelds wird mit einem Objektmikrometer bekannten Maßstabs ermittelt.
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Dieses Verfahren zur direkten Zellzählung auf fixierten Ausstrichen ermöglicht wie das zuvor erläuterte Verfahren lediglich die Erfassung der Gesamtzellzahl, gibt aber keine Möglichkeit zu einer Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen sowie zur Ermittlung des Anteils von Paraffinen in der Hefesuspension und von Lipideinschlüssen in den Zellen.
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Die Zählgeschwindigkeit ist ferner relativ gering und die Auszählung selbst sehr anstrengend und zeitaufwendig, was sich wiederum ungünstig auf die Genauigkeit auswirkt.
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Ein sehr bekanntes und in weitem Umfang angewandtes Verfahren ist das Koch&min;sche Plattengußverfahren, bei dem ein aliquoter Teil einer in geeigneter Weise verdünnten homogenen Zellsuspension mit flüssigem Nährmedium vermengt und in Petrischalen ausgegossen und darin verfestigt oder auf der Oberfläche des festen Nährbodens in einer Petrischale "ausgespatelt" wird, worauf die Anzahl der Kolonien ausgezählt wird. Dabei wird angenommen, daß jede Kolonie aus einer vermehrungsfähigen Zelle hervorgegangen ist.
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Das Koch&min;sche Plattengußverfahren wird in breitem Maße zur Ermittlung der Lebendzellzahl in Hefesuspensionen verwendet, da es nicht nur die Erfassung der Anzahl der Kolonien, sondern auch eine Abschätzung der Vielfältigkeit der Morphologie der Kolonien erlaubt.
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Sehr bekannt ist ferner das Verfahren der Maximalverdünnung und Titration, bei dem in flüssige Nährmedien geimpft wird. Das Verfahren beruht im wesentlichen darauf, daß in Reagenzgläser bzw. Kolben mit flüssigem Nährmedium ein genau abgemessenes Volumen der Hefesuspension eingebracht wird, worauf nach einer Inkubationszeit das Vorhandensein bzw. Fehlen einer Zunahme der Zellzahl ermittelt wird (visuell aufgrund der Trübung des Nährmediums, nach Entstehung eines Films bzw. eines Niederschlags u. dgl.); die Ergebnisse werden statistisch anhand von Tabellen ausgewertet; als Ergebnis wird die Zellzahl berechnet, die in 1 g (1 ml) einer Ausgangsprobe der Hefesuspension vorhanden war.
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Dieses Verfahren der Beimpfung von Nährböden verlangt jedoch hohe Reinheit und große Genauigkeit bei der Durchführung aller Arbeitsgänge. Pipetten und Nährböden müssen ferner vor Infektionen mit fremden Mikroorganismen sorgfältig geschützt werden, da jede zufällig eingebrachte Zelle die Anzahl der Zellen in der zu untersuchenden Probe vergrößern und damit das Ermittlungsergebnis verfälschen kann. Das Verfahren der Beimpfung fester und flüssiger Nährmedien ist ferner gegenüber dem Verfahren der direkten Zellzählung unter einem Mikroskop noch mit dem Nachteil einer noch geringeren Geschwindigkeit der Zellzählung belastet. Durch diese Verfahrensweise kann ferner auch nur die Anzahl der lebenden Zellen ermittelt werden, da keine Möglichkeit besteht, die Anzahl der nicht lebensfähigen Zellen und den Anteil an Paraffinen sowie an Lipideinschlüssen in den lebenden Zellen zu ermitteln.
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Bei der Kultivierung von Futterhefen ist jedoch die Ermittlung der Anzahl der nicht lebensfähigen Zellen von großer Bedeutung. Bei einem normal verlaufenden Kultivierungsprozeß soll unter optimalen Verhältnissen die Anzahl der toten Zellen 3 bis 5% praktisch nicht übersteigen. Bei irgendwelchen Störungen des Verfahrens (Temperaturerhöhung, Absinken des pH-Werts des jeweiligen Nährmediums unter den zulässigen Wert, Entstehung von Stauzonen in einem Fermentationsgefäß bei schlechter Vermischung u. dgl.) steigt der Prozentsatz an toten Zellen auf 10 bis 24% an. Beim Vorliegen von 30 bis 40% toten Zellen in der Hefesuspension ist der Austausch der Kultur empfehlenswert.
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Zur Ermittlung der Anzahl toter Zellen ist ferner ein Verfahren bekannt, bei dem die Anzahl der toten Zellen durch direkte Auszählung in einem Präparat der Hefesuspension (5 bis 6 Gesichtsfelder), das mit Methylenblau gefärbt ist, ermittelt wird.
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Zu einem auf einen Objektträger aufgetragenen Tropfen der Hefesuspension wird ein Tropfen Methylenblaulösung zugegeben. Zur Erkennung der toten Zellen wird eine 0,02%ige Lösung von Methylenblau in einem Phosphatpuffer verwendet (18,2 g Kaliumdihydrogenphosphat und 28,1 g Natriumhydrogenphosphat pro Liter aqua dest.).
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Tote und sehr geschwächte Zellen werden hierdurch dunkelblau bis blau gefärbt. Die Auszählung der Zellen muß innerhalb von 5 bis 10 min erfolgen, da bei längerer Zeit Zellen absterben können, was zu einer Verfälschung des Ergebnisses führen kann.
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Die Differenzierung von toten und lebenden Hefezellen kann auch nach Färben des Präparats mit einer Primulinlösung (1 : 10 000) in einem Lumineszenzmikroskop erfolgen. Bei Lumineszenzerregung durch blaue Strahlung weisen lebende Zellen lediglich an den Zellwänden ein kaltes Leuchten auf, während das kalte Leuchten bei toten Zellen über die ganze Zelle auftritt. Durch Färbung mit Acridinorange können ferner lebende Zellen grün und tote Zellen rot gefärbt werden.
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Die Genauigkeit dieses Verfahrens hängt jedoch vom Zustand und der Aufbewahrungsdauer der Farbstofflösung sowie von der subjektiven Einschätzung des Färbungsgrads einer Zelle ab, nach dem eine Zelle als tot anzusehen ist, was zu ungenauen Messungen führt.
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Neben der geringen Genauigkeit ist auch dieses Verfahren sehr zeitaufwendig und erlaubt ebenfalls nicht die Ermittlung von lebenden Zellen und der Lipideinschlüsse in ihnen sowie der Paraffinmenge in der Hefesuspension.
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Ein einfacheres, jedoch auch langwierigeres und subjektives Verfahren zur Ermittlung der Anzahl von lebenden und toten Zellen besteht in der direkten Auszählung der Zellen in einem Vitalpräparat, das im Phasenkontrastmikroskop betrachtet wird. Die Ermittlung der lebenden und toten Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie beruht auf den unterschiedlichen optischen Eigenschaften der Zellen: Lebende Zellen erscheinen dunkler mit einer gut zu ermittelnden intrazellulären Struktur, während tote Zellen als stark lichtbrechende Körper erscheinen, die keine differenzierte intrazelluläre Struktur mehr aufweisen.
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Dieses Verfahren erlaubt jedoch wegen der zugrundeliegenden subjektiven Entscheidung ebenfalls keine schnelle und genaue Analyse.
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Zur Ermittlung des Paraffingehalts in Hefesuspensionen ist ferner ein mikroskopisches Verfahren bekannt, bei dem der Paraffingehalt in der Hefesuspension qualitativ nach "viel", "vorhanden", "wenig" und "praktisch fehlend" geschätzt wird.
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Bei Betrachtung eines Präparats einer Hefesuspension in einem Mikroskop mit einem Objektiv mit 40facher Vergrößerung bedeuten die Bewertungen "praktisch fehlend" 1 oder 2 kleine Paraffintröpfchen auf 5 bis 10 Gesichtsfelder, "wenig" 1 bis 2 kleine Tropfen auf 3 bis 5 Gesichtsfelder, "vorhanden" 1 bis 3 kleine Tropfen auf 1 bis 5 Gesichtsfelder und "viel" mehr als 1 bis 3 Tropfen verschiedener Größe je Gesichtsfeld.
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Dieses bekannte visuelle Verfahren ist entsprechend ungenau, subjektiv und sehr zeitaufwendig. Es erlaubt ferner auch nicht die Ermittlung der übrigen Parameter, d. h. der Anzahl toter und lebender Zellen sowie der Lipideinschlüsse in ihnen.
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Bei der Kultivierung von Futterhefen wird ferner der Kontrolle der Lipideinschlüsse in den Hefezellen große Aufmerksamkeit gewidmet.
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Das Auftreten von Lipideinschlüssen mittlerer und großer Abmessungen in den Zellen deutet auf eine Beeinträchtigung des Kohlenstoff-Stickstoff- Verhältnisses, einen überschüssigen Gehalt an Paraffin in der Hefesuspension sowie die Alterung der jeweiligen Zellen und das Absinken ihrer Oxidationsaktivität bei Verminderung ihres Eiweißgehalts hin. In derartigen Lipideinschlüssen können sich nicht genutzte Paraffine in großer Menge ansammeln, was zu einer Vermehrung rückständiger Kohlenwasserstoffe in der Hefesuspension führt. Die Kultivierung soll deshalb so durchgeführt werden, daß die Größe der Lipideinschlüsse in einer Zelle 0,5 bis 0,8 µm beträgt.
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In der Stufe der "Nachreifung" sollen die Lipideinschlüsse fehlen bzw. nur klein sein.
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Zur Ermittlung des Gehalts an Lipideinschlüssen in Zellen ist ein Verfahren bekannt, bei dem der Gehalt an Lipideinschlüssen visuell mikroskopisch nach Anzahl und Abmessungen dieser Einschlüsse ermittelt wird. Auch bei diesem Verfahren wird der Gehalt an Lipideinschlüssen qualitativ ermittelt und durch "viel", "wenig" bzw. "fehlend" bewertet.
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Auch dieses Verfahren ist daher subjektiv, ungenau und langsam.
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Aus der Zeitschrift Technisches Messen tm 1979, Heft 7/8, S. 267-270, ist ein mikroprozessor-gestützter Bildanalysator für die Körnungsanalyse von Schüttgut bekannt, bei dem ein mikroskopisches Präparatbild mit einer Fernsehkamera abgetastet wird, und die Abtastsignale in einem Rechner so verarbeitet werden, daß die Partikelfläche sowie die statistische Häufigkeitsverteilung der Partikelflächen ermittelt wird. Als Anwendungsgebiete sind Metallographie und Medizin angegeben.
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Aus dem Prospekt der Fa. Ernst Leitz GmbH, Wetzlar, Liste 521-275, VII/71/LX/SO: "Leitz-Classimat" sind ferner ein Gerät sowie ein Verfahren zur automatischen quantitativen Bildanalyse bekannt, mit denen Kennwerte von Feststoffdispersionen ermittelt werden können. Hierbei wird das mikroskopische Bild des zu vermessenden Objekts von einer Fernsehkamera aufgenommen und in einem nachgeschalteten Rechner nach quantitativen Gesichtspunkten ausgewertet, wobei die Meßfeldfläche, die Partikelfläche, die Sehnenzahl sowie die Partikelzahl als Grundgrößen direkt ermittelt werden. Durch Veränderung der Bildsignale sowie geeignete mathematische Weiterverarbeitung lassen sich neben den Grundgrößen weitere Kenngrößen des Objekts ermitteln.
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Eine Anwendbarkeit dieser Methodik auf das spezielle Problem der simultanen Ermittlung des Verhältnisses von toten und lebenden Zellen sowie der Menge an Lipideinschlüssen und von Paraffinen im Kulturmedium bei n-Paraffine oxidierenden Hefen ist in dieser Druckschrift nicht angesprochen.
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Wie oben erläutert, waren zur Ermittlung einzelner Kenngrößen von Zellsuspensionen und insbesondere Hefesuspensionen bereits verschiedene Verfahren bekannt, jedoch gab es noch kein Verfahren zur gleichzeitigen Ermittlung des Anteils toter und lebender Zellen, der Lipideinschlüsse in ihnen und von Paraffin in Hefesuspensionen.
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Der Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Ermittlung des Anteils von toten und lebenden Zellen, Lipideinschlüssen in ihnen und des Paraffingehalts in Suspensionen von n-Paraffine oxidierenden Hefen anzugeben, bei dem die oben erläuterten Schwierigkeiten nicht auftreten, und das sich einfach und schnell durchführen läßt und zu genauen Ergebnissen führt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses von toten und lebenden Zellen, der Lipideinschlüsse in ihnen sowie des Paraffingehalts in Suspensionen von Hefen, die n-Paraffine oxidieren, beruht auf der Herstellung eines Einschichtpräparats der Hefesuspension und der Auswertung eines mikroskopischen Präparatbilds und ist gekennzeichnet durch
- (A) Abtastung und Photometrierung des Präparats in einem Abtastmikroskop unter Erzeugung einer Digitalmatrix des Präparatbilds,
- (B) Erzeugung eines Gesamthistogramms der Helligkeitsamplituden des Präparatbilds,
- (C) Zerlegung des Gesamthistogramms in einzelne Histogramme der Helligkeitsamplituden der toten und lebenden Zellen, der Lipideinschlüsse in ihnen und der Paraffine in der Hefesuspension durch Vergleich der Helligkeitswerte des Gesamthistogramms mit vorgegebenen Helligkeitswerten der toten und lebenden Zellen, der Lipideinschlüsse in ihnen sowie der Paraffine und
- (D) Ermittlung des Verhältnisses der Flächen der einzelnen Histogramme zur Fläche des Gesamthistogramms als entsprechende Kennwerte der Hefesuspension.
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Im Schritt (C) kann wie folgt verfahren werden:
- (c1) Spiegeln der äußersten Flanke des linken oder rechten äußersten Teilhistogramms an dessen Mittellinie unter Erhalt des ersten Teilhistogramms,
- (c2) Subtraktion der Ordinatenwerte der gespiegelten Flanke des Teilhistogramms von denen des Gesamthistogramms unter Erhalt der entsprechenden Flanke des nächsten Teilhistogramms,
- (c3) Spiegeln dieser Flanke des nächsten Teilhistogramms an dessen Mittellinie unter Erhalt des nächsten Teilhistogramms,
- (c4) Subtraktion der Ordinatenwerte der gespiegelten Flanke dieses nächsten Teilhistogramms von denen des Gesamthistogramms unter Erhalt der entsprechenden Flanke des folgenden Teilhistogramms und
- (c5) Wiederholung der Schritte (c3) und (c4), bis das Gesamthistogramm in sämtliche Teilhistogramme zerlegt ist.
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Die Erzeugung einer Digitalmatrix und die anschließende Erzeugung eines Gesamthistogramms, seine Zerlegung in Teilhistogramme sowie die Ermittlung des Verhältnisses der Flächen der einzelnen Histogramme erfolgen maschinell mit einem elektronischen Rechner, was eine zeitaufwendige visuelle und subjektive Analyse dieser Probenparameter ausschließt. Zugleich wird die Genauigkeit und Geschwindigkeit der Ermittlung der Kennwerte erhöht.
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Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine schnelle, genaue und objektive gleichzeitige Ermittlung der Kennwerte gattungsgemäßer Systeme, was nach keinem der bisher bekannten Verfahren möglich ist.
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Das Verfahren wird im einzelnen wie folgt durchgeführt:
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Auf einen sauberen Objektträger wird mit einem Glasstäbchen ein Tropfen der Suspension aufgetragen. Der Tropfen der Hefesuspension auf dem Objektträger wird mit einem Deckgläschen bedeckt, wobei der Tropfen mit dem Deckgläschen unter einem Winkel von 45° berührt und das Deckgläschen dann, wenn der Tropfen längs des ganzen Randes des Deckgläschens zerfließt, so aufgelegt wird, daß keine Luftblasen eingeschlossen werden. Überschüssige Flüssigkeit, die über den Rand des Deckgläschens hinaus austritt, wird mit einem Stück Filterpapier abgesaugt.
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Das hergestellte Präparat soll nicht zu dick sein; die Hefezellen sollen in einigen Schichten einander überdeckend vorliegen.
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Das so hergestellte Präparat wird auf den Objekttisch des Abtastmikroskops gelegt und untersucht.
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In den folgenden Beispielen wird das Präparat der Hefesuspension, die aus einem Fermenter entnommen ist, in einem Abtast-Lichtmikroskop im Anoptralkontrast (Phasendunkelfeldkontrast) untersucht; es können jedoch auch andere Mikroskopierverfahren angewandt werden.
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Die Herstellung des Präparats kann ferner von der oben beispielhaft angegebenen Herstellungsweise abweichen; beispielsweise kann eine Durchflußküvette verwendet werden, wobei die Entnahme der Probe der Hefesuspensionen aus dem Fermenter und die Präparatherstellung automatisiert sein können.
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Im Anoptralkontrast sind die Hefezellen hell auf dunklem Untergrund, die Paraffintröpfchen etwas dunkler und die toten Zellen noch dunkler. Die Lipideinschlüsse in den Zellen sind als hellere Flecke auf dem Hintergrund des Cytoplasmas sichtbar.
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Durch Abtastung und Photometrierung erhält man eine Digitalmatrix des Präparatbilds.
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In Tabelle 1 ist ein typisches Beispiel einer experimentell erhaltenen Digitalmatrix der Helligkeitsamplituden der einzelnen Komponenten einer Hefesuspension, d. h. der Zellen, der Lipideinschlüsse in ihnen und des Paraffins, dargestellt, die bei Abtastung mit Schritten von 0,5 µm Tabelle 1 &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz36&udf54; &udf53;vu10&udf54;in Richtung der X- und Y-Achse und einem Durchmesser des Ablesungsflecks des photometrischen Abtasters von 0,5 µm erhalten wurde. Die Zahlenwerte der Digitalmatrix sind den Helligkeitsamplituden an den entsprechenden Stellen des Präparats proportional.
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Nach der Erzeugung der Digitalmatrix des Präparatbilds wird ein Gesamthistogramm der Helligkeitsamplituden des Präparatbilds erzeugt, wobei an der Abszisse die Werte der Helligkeitsamplituden (Helligkeit N) und an der Ordinate die Häufigkeit gleicher Helligkeitswerte (Anzahl des Auftretens der Helligkeiten, P N ) angetragen wird.
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In den Fig. 1 bis 4 sind typische experimentelle, nach Photometrierung erhaltene Histogramme der Helligkeitsamplituden von Präparatbildern von Hefesuspensionen dargestellt, wobei an der Ordinate die Häufigkeit P N und an der Abszisse die Helligkeit N angetragen sind.
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Das Gesamthistogramm der Helligkeitsamplituden entspricht folglich der Überlagerung der Histogramme der Helligkeitsamplituden der toten und lebenden Zellen, der Lipideinschlüsse in ihnen und des Paraffins in der Hefesuspension.
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Das Gesamthistogramm muß in einzelne Histogramme aufgetrennt werden, deren Fläche zu bestimmen ist.
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Anschließend wird allgemein der mathematische Erwartungswert (m) für die Helligkeitsamplituden der zu bestimmenden Parameter experimentell festgelegt.
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Für den Fall von Hefesuspensionen wurden zuvor vereinzelt vorliegende tote Zellen, Paraffintröpfchen, lebende Zellen sowie Lipideinschlüsse in ihnen untersucht, wobei im Mittel (500 Messungen) folgende mathematischen Erwartungswerte (m) für die Helligkeitsamplituden der verschiedenen Parameter der Hefesuspension gefunden wurden:
- tote Zellen: 20 bis 25
Paraffin: 23 bis 30
Lipideinschlüsse: 34 bis 45.
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Ferner wurde festgestellt, daß der Asymmetriewert sämtlicher Parameter nahe Null liegt.
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Aufgrund des Unterschieds der mittleren m-Werte und der Streuung der mittleren Werte für jeden der Parameter überdecken sich die Bereiche der Helligkeitsamplituden der zu photometrierenden Parameter.
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Das bekannte Verfahren der Phasenanalyse für beliebige Präparatbilder ermöglicht es jedoch, das Gesamthistogramm der Verteilung der Helligkeitsamplituden in einzelne Histogramme der Helligkeitsamplituden für tote und lebende Zellen, Lipideinschlüsse in ihnen und des Paraffins in der Hefesuspension zu zerlegen, indem die Helligkeitswerte des erzeugten Gesamthistogramms mit vorgegebenen Werten der Helligkeiten der einzelnen Parameter für die zu untersuchende Hefezellenkultur verglichen werden.
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Die Zerlegung des Gesamthistogramms kann sowohl von der linken als auch von der rechten Seite des Histogramms her begonnen werden, wobei das Ergebnis gewöhnlich genauer wird, wenn die Zerlegung von der Seite begonnen wird, an der ein einzelnes, gesondertes Histogramm deutlicher zu beobachten ist. Experimentell wurde festgestellt, daß es zur Phasenanalyse einer Hefesuspension vorzuziehen ist, die Zerlegung von der rechten Seite des jeweiligen Gesamthistogramms der Helligkeitsamplituden zu beginnen.
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Vom Extrempunkt des äußeren rechten Histogramms (Lipideinschlüsse) werden die Ordinatenwerte nach links gespiegelt, da Symmetrie zum rechten Zweig vorliegt, weil die Asymmetrie sämtlicher Histogramme praktisch gleich Null ist; auf diese Weise wird ein separates Histogramm der Lipideinschlüsse erhalten.
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Aus dem Gesamthistogramm werden dann die Ordinatenwerte des ausgesonderten Histogramms der Lipideinschlüsse subtrahiert, wodurch der rechte Zweig des Histogramms der lebenden Zellen erhalten wird. Dieser so resultierende rechte Zweig des Histogramms der lebenden Zellen wird dann symmetrisch zum Extremwert links abgebildet. Die Ordinatenwerte des auf diese Weise erhaltenen linken Zweigs des Histogramms der lebenden Zellen werden dann vom Gesamthistogramm abgezogen, wodurch der rechte Zweig des Histogramms des Paraffingehalts der Hefesuspension resultiert, dessen linker Zweig wiederum symmetrisch aufgebaut wird.
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Im folgenden werden die Ordinatenwerte des linken Zweigs des Histogramms des Paraffingehalts der Hefesuspension vom Gesamthistogramm abgezogen, wodurch die Ordinatenwerte des rechten Zweigs des Histogramms der toten Zellen erhalten werden, dessen linker Zweig symmetrisch aufgebaut wird.
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In den Fig. 1 bis 4 entsprechen die einzelnen Histogramme 1 den toten Zellen, die Histogramme 2 dem Paraffingehalt, die Histogramme 3 den lebenden Zellen und die Histogramme 4 den Lipideinschlüssen. Die ausgesonderten Einzelhistogramme sind gestrichelt dargestellt.
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Genauere Ergebnisse können erhalten werden, wenn die Histogramme in bezug auf den rechten Zweig asymmetrisch abgebildet und die Asymmetriewerte für jedes Histogramm einzeln berücksichtigt werden.
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Die toten und lebenden Zellen, die Lipideinschlüsse in ihnen sowie das Paraffin in der Hefesuspension stellen symmetrische Körper dar (Paraffintropfen, kugelförmige Lipideinschlüsse, rotationsellipsoidale Zellen).
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Für symmetrische Körper sind die Flächen ihrer Projektionen bzw. Abbildungen proportional zu ihrem Volumen. Der Wert der zu ermittelnden Parameter der Hefesuspensionen entspricht dem Volumverhältnis von toten zu lebenden Zellen, Lipideinschlüssen in ihnen und dem Paraffingehalt. Da für symmetrische Körper Proportionalität zwischen Projektionsfläche und Volumen besteht, entspricht das Verhältnis der Flächen der einzelnen Histogramme, die den zu ermittelnden Parametern zugeordnet sind, zur Fläche des Gesamthistogramms dem Anteil an toten und lebenden Zellen, Lipideinschlüssen in ihnen und dem Paraffinanteil in der Hefesuspension.
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Im folgenden wird die Ermittlung des Verhältnisses von toten und lebenden Zellen, der Menge der Lipideinschlüsse in ihnen und des Paraffins in einer Hefesuspension anhand von Ausführungsbeispielen erläutert.
Beispiele 1 bis 4
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Ein Dünnschichtpräparat einer Hefesuspension (Candida G, Stamm WSB 569), die aus einem Fermenter entnommen worden war, wurde auf den Objekttisch eines Abtastmikroskops gebracht und mit einer Schrittweite von h = 0,5 µm abgetastet, wobei der Durchmesser der Abtastblende, bezogen auf die Präparatebene, gleich 0,5 µm war, und die Anzahl der Zählungen pro Zeile sowie die Anzahl der Zeilen 256 betrugen.
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Durch Photometrierung wurde eine Digitalmatrix des Präparatbilds erhalten, aus der das Gesamthistogramm der Helligkeitsamplituden der Hefesuspension erzeugt wurde.
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Dieses Gesamthistogramm der Hefesuspension ist in Fig. 1 dargestellt, wobei der der Kulturflüssigkeit entsprechende Untergrund abgezogen ist.
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Das Gesamthistogramm wurde dann in einzelne Histogramme zerlegt. Die erhaltenen Teilhistogramme sind in Fig. 1 eingetragen.
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Zur Zerlegung des Gesamthistogramms wurden die Werte der Helligkeiten des Gesamthistogramms mit den vorgegebenen Werten der Helligkeiten der toten und lebenden Zellen, der Lipideinschlüsse in ihnen und des Paraffins für die zu untersuchende Kultur der Hefesuspension verglichen. Ferner wurde das Verhältnis jeder Fläche der einzelnen Teilhistogramme zur Fläche des Gesamthistogramms ermittelt.
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Die Anteile der Teilhistogramme am Gesamthistogramm von Fig. 1 sind:
- Lebende Zellen: 2%
Paraffin im Kulturmedium: 7%
Lipideinschlüsse: 4%
lebende Zellen (Rest): 87%.
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Ähnliche Beispiele sind in den Fig. 2, 3 und 4 dargestellt.
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Die Ergebnisse der Beispiele 1 bis 4 sind in Tabelle 2 zusammengestellt, wobei die angegebenen Zahlenwerte den Prozentzahlen der entsprechenden Teilhistogramme an der Fläche des Gesamthistogramms bzw. den zugehörigen Anteilen der jeweiligen Parameter entsprechen. Tabelle 2 &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz11&udf54; &udf53;vu10&udf54;
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Der mittlere quadratische Fehler beträgt für die Ermittlung des Anteils an toten Zellen in der Hefesuspension im vorliegenden Fall 10% und für die Ermittlung des Paraffingehalts im Kulturmedium und der Lipideinschlüsse in den Zellen 15%.
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Die Zeitdauer zur Bestimmung dieser drei Parameter beträgt sogar bei mechanischer Abtastung und Verwendung eines Amplitudenanalysators nur 5 bis 10 min.
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Die erfindungsgemäße Verfahrensweise vermeidet die Subjektivität herkömmlicher Meßverfahren. Die Genauigkeit kann bis auf 10 bis 15% erhöht und der Zeitaufwand für eine vollständige Analyse auf 5 bis 10 min verringert werden. Es ist daher erfindungsgemäß möglich, die erhaltenen Kennwerte von Hefesuspensionen zur Prozeßsteuerung und insbesondere zur Prozeßoptimierung zu verwenden, wodurch sich die Effektivität entsprechender Prozesse deutlich erhöhen und die Qualität der resultierenden Produkte, beispielsweise von Futterhefen, deutlich verbessern läßt.