DE3248588A1

DE3248588A1 - Verfahren zur gewinnung von pankreatin von hohem schuettgewicht

Info

Publication number: DE3248588A1
Application number: DE19823248588
Authority: DE
Inventors: Hans Dr. 2082 Moorrege Schultze
Original assignee: Nordmark Werke GmbH
Current assignee: Nordmark Werke GmbH
Priority date: 1982-12-30
Filing date: 1982-12-30
Publication date: 1984-07-12

Description

Verfahren zur Gewinnung von Pankreatin von hohem Schutt
gewicht Als Pankreatin bezeichnet man das extrahierte Gemisch der Enzyme der Pankreasdrüse, bestehend iowo aus Lipasen, Amylase und Proteasen. Pankreatin wird als Wirkstoff zur Behandlung von Verdauungsstörungen, die auf Pankreasinsuffizienz beruhen angewendet. Als Ausgangsmaterial dient hauptsächlich Schweinepankreas in frischem oder gefrorenem Zustand, dem ursprünglich für die Herstellung von Pankreatin lediglich das Wasser und das Fett entzogen wurde. Wegen der Empfindlichkeit der Enzyme muß das aber sehr vorsichtig geschehen.
Nach den üblichen Verfahren wird die Trocknung und Entfettung mit Lösungsmitteln durchgeführt die Wasser und Fett zugleich lösen, z.B. Aceton oder höheren Alkoholen Nach anderen bekannten Verfahren werden die beiden Vorgänge nacheinander durchgeführt, meist erst die Trocknung (Gefriertrocknungsverfahren), danach die Entfettung mit einem leicht flüchtigen Fettlösungsmittel; oder auch umgekehrt: Entfettung in flüssiger Phase mit (Halogen-) Kohlenwasserstoffen und daran anschließend die Trocknung der wäßrigen Phase.
Zubereitungen von Pankreatin, die nach einem dieser Vero fahren hergestellt wurden, haben den Nachteil, daß die Proteasen, z.B. Trypsin und Chymotrypsin in ihnen nicht frei vorliegen, sondern in ihrer inaktiven Enzymogenform.
Sie können deshalb bei Patienten, die keine körpereigene Enterokinase produzieren, nicht aktiv werden, sind also völlig unwirksam. Ein weiterer Nachteil ist der Fasergehalt diesr Pankreatine, der aus dem Bindegewebe der Drüsen stammt und medizinisch wertlos ist Dieser Faseranteil stört bei der galenischen Zubereitung nicht nur den Preß- vorgang, sondern behindert auch den gewünschten Zerfall des Preßlings am Wirkungsort, so daß die Enzyme zu einem großen Teil ungenutzt bleiben.
Bei einigen neueren Verfahren werden daher die Fasern entfernt und zur Erzeugung aktivierter Enzyme wird eine Autolyse durchgeführt.
Die Durchführung der Autolyse wird sehr unterschiedlich gehandhabt. Bei dem Verfahren der US-PS 3 223 594 wird z.B.
2 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart von viel Wasser autolysiert, bei den Verfahren der DE-OSen 26 20 289 und 27 16 719 während 15 Stunden bei 150C bzw. 4 Stunden bei 15 0C in Gegenwart von mit Wasser nicht mischbaren Fettlösungsmitteln. In der Beschreibung der GB-PS 1 328 202 wird die Autolyse in 1/2 bis 2 Stunden bei 20 bis 300C unter Zusatz von Natronlauge oder Ammoniak durchgeführt. In der DE-AS 21 06 706 wird eine Autolyse beschrieben, die sich bei 40C in Gegenwart von Schweineduodenum zur.Verbesserung der Enterokinaseaktivität über 7 Tage erstreckt.
Bei den bekanntgewordenen Verfahren, die von einem Autolysat ausgehen, fällt das Pankreatin allerdings nie in einer Form an, die sich problemlos weiterverarbeiten läßt. Auch Verfahren, nach denen aus Pankreas unmittelbar Pankreatin, und zwar von hohem Schüttgewicht gewonnen wird, existieren in strengem Sinne nicht; man könnte allenfalls die Herstellung eines lipasereichen Enzympräparats" nach den vorstehenden DE-OSen hierzu rechnen, die allerdings mit erheblichem technischem Aufwand und 3 verschiedenen Lösungsmitteln arbeitet, so daß gemessen hieran schon eine gesonderte galenische Zubereitung zur Granulatbildung im Anschluß an ein einfacheres Gewinnungsverfahren vorteilhafter erscheint. Auch aus der DE-AS 29 23 279 geht lediglich hervor, daß die Galenik J von Pankreatin relativ problematisch ist.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein möglichst einfaches und ungefährliches Verfahren anzugeben mit dem man ohne großen technischen Aufwand direkt aus den autolysierten oder auf sonstige Weise gewonnenen Gewebe-Extrakten Pankreatin von hohem Schüttgewicht erhält, das darüber hinaus keimarm und rieselfähig ist und das sich praktisch ohne Verluste an Enzymen verarbeiten und lagern läßt, wobei gegebenonfalls das Autolysieren eines wäßrigen Pankreasgewebebreies bzw. einer wäßrigen Gewebesuspension, Entfernen der Faseranteile, Entfetten und Ausfällen vorausgegangen sind.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, indem man das ausgefällte Pankreatin sedimentieren läßt und nach Abheben oder Abfiltrieren des Überstandes durch gegebenen--falls mehrfaches Aufrühren mit Isopropylalkohol oder Aceton und Sedimentieren fett- und tryptonfrei wäscht, bis ein Niederschlag mit einer Konzentration zwischen 70 bis 85 % - vorzugsweise etwa 75 bis 76 % - an Isopropylalkohol bzw. Aceton in einer Konzentration von 80 bis 95 % -vorzugsweise etwa 88 bis 90 % - entstanden ist, den man absaugt oder abschleudert und unter Behandlung mit trockener Luft (z.B. Gehalt von unter 20 % relativer Feuchte bei 200C) oder mit Stickstoff bei unter 250C, vorzugsweise unter vermindertem Druck, trocknet. Die Konzentrationsangabe bezieht sich auf das rechnerisch im Niederschlag enthaltene Lösungsmittel (wasserhaltiges Isopropanol bzw. Aceton).
Das vorstehend beschriebene Verfahren ist auf alle Zubereitungen anwendbar, die durch Autolyse von Pankreas oder andere bekannte Verfahren erhalten werden können; man kann sogar ohne weiteres von Präparaten ausgehen, die der Gefriertrocknung unterworfen worden waren. Solche efriergetrockneten (lyophilisierten) Präparate besitzen nämlich ein sehr niedriges (0,2 g/ml) Schüttgewicht. Man braucht sie lediglich mit Isopropanol oder Aceton der erfindungsgemäßen Konzentration zu befeuchten und dann zu trocknen.
Erfindungsgemäß tritt während der Trocknung des Kuchens, welcher anhaftende Mutterlauge der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthält, eine starke Volumenkontraktion ein. Dieser Schrumpfungsprozeß führt zu einem Pankreatin von hohem Schüttgewicht (0,5 bis 0,7 g/ml), das nach Grobvermahlung gut rieselfähige Rörnchen bildet. Enthält dagegen das zu trocknende Pankreatin Isopropylalkohol von deutlich über 85 bis 86 % bzw. Aceton von über 95 % Gehalt, so erfolgt keine Kontraktion und es entsteht ein Produkt mit so niedrigem Schüttgewicht (0,2 g/ml), daß es sich leicht elektrostatisch auflädt und somit schlecht zu handhaben ist. Enthält andererseits das zu trocknende Pankreatin z.B. Isopropylalkohol von unter 70%, so erfolgt zwar die gewünschte Volumenkontraktion, aber die Lipase erleidet eine gewisse Schädigung, selbst wenn die Trocknung bei OOC und vermindertem Druck durchgeführt wird. Eine Enzymschädigung kann auch eintreten, wenn bei über 25 0C getrocknet wird, oder wenn - mit oder ohne Anwendung von vermindertem Druck - die Trocknung m t Luft, die bei 200C mehr als 20 % relative Feuchte enthält, vorgenommen wird.
Das erfindungsgemäß hergestellte Pankreatin ist keimarm, denn die Einwirkung von Isopropylalkohol in der benötigten Konzentration ist bekanntlich eine Maßnahme zur Abtötung von Keimen.
Mit besonderem Vorteil werden zur Erzielung von Pankreatin von hohem Schüttgewicht Zubereitungen verwendet, die durch Autolysieren einer Gewebesuspension und Ausfällen in folgender Weise erhalten wurden (alle Angaben über Prozentgehalte beziehen sich auf das Gewicht): Man führt die Autolyse unter Zusatz von bis zu 20 * Isopropylalkohol, bezogen auf die Suspension, bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise in Gegenwart eines pH 6,5 bis 7,5 einstellenden Puffers, z.B. bis 3 % und insbesondere 1 bis 1,5 % Alkalihydrogencarbonat, bezogen auf eingesetztes Gewebe, bei nicht über 250C durch und unterbricht sie, sobald eine Probe der Autolysensuspen--sion in 55 bis 65 %igem wäßrigem Isopropylalkohol eine Sedimentationsgeschwindigkeit von etwa 3 bis 10 mm/l bis 3 min erreicht. Diese Angabe bezieht sich auf die freie Sedimentation im Erdschwerefeld, also ohne Zentrifugieren.
Die Beendigung der Autolyse tritt ein durch Zugabe von Isopropylalkohol zur Hauptmenge an Autolysat bis zu einer Konzentration von 30 bis 35 % - bezogen auf die Summe von Wasser und Isopropylalkohol; das hierdurch gleichzeitig dünnflüssig gewordene Autolysat kann von den Bindegewebsfasern abgesiebt und bei 15 bis 25 0C in vorgelegten Isopropylalkohol eingetragen werden, so daß eine 55 bis 65 %ige Lösung - wiederum bezogen auf die Summe Wasser und Isopropylalkohol - entsteht. Die dabei entstehende Fällung hat eine grobe, körnige Form und eignet sich besonders für das erfindungsgemäße Trocknungsverfahren.
Praktisch verfährt man bei der Durchführung des Verfahrens wie folgt: Das gewolfte oder gecutterte Pankreas wird zur besseren Rührfähigkeit mit 20 bis 80 % Wasser versetzt. Der Autolysevorgang wird durch etwa 1 bis 1,5 % Natriumbicarbonat schonend, d.h. ohne daß eine Schädigung der Enzyme stattfindet, in erwünschter Weise gelenkt und beschleunigt, wobei man, wenn tiefge- 'frorenes Material verwendet wurde, dieses allmählich auf Raumtemperatur kommen läßt. Mit der Freisetzung der Proteasen aus ihren Proenzymen beschleunigt sich durch die ständig anwachsende Menge freier Proteasen zunächst die Verdauung der begleitenden Pankreas-Eiweißstoffe.
Die Verdauung würde nun aber schließlich auf die empfindlichen Enzyme übergreifen, so daß besonders die Amylase und auch die Proteasen selbst geschädigt würden. Speziell zur Schonung der Proteasen werden bis zu 20 % Isopropylalkohol zum Gemisch zugefügt, vorzugsweise etwa 10 %. Dieser Zusatz alleine reicht jedoch nicht aus, um die Enzymaktivität voll zu erhalten. Es ist daher wichtig, den Zeitpunkt kurz vor der beginnenden Enzymschädigung herauszufinden, zu dem man die Autolyse am günstigsten unterbricht. Die Autolysedauer bis zu diesem Zeitpunkt schwankt nämlich auch unter sonst völlig gleichen Bedingungen um bis zu 600 % je nach Herkunft, Alter und Lagerung der Pankreasdrüsen, so daß eine allgemeine Zeitangabe nicht möglich ist.
Dabei läßt sich der günstigste Zeitpunkt dadurch feststellen, daß man mit einem einfachen Schnelltest an einer Probe des Autolysats die optimale Sedimentationsgeschwindigkeit (Absitzgeschwindigkeit) i 55 bis 65 %igem Isopropylalkohol ermittelt. Dieser Absitztest ist praktisch die an kleinen Proben vorvollzogene weitere Verarbeitung des Autolysats bis zur Pankreatinfällung und Beobachtung über deren sich ständig veränderndes Sedimentationsverhalten. Hierzu kann man z.B. in Abständen von 1/2 Stunde - gegen Schluß auch z.B. alle 10 oder 15 Minuten - jeweils 10 g der Autolysatsuspension entnehmen, mit 5 ml 84 %igem Isopropylalkohol verrühren und die entstandene Lösung unter Rühren in 20 ml 84 %igen Isopropylalkohol eingießen. Man bestimmt die Sedimentationsgeschwindigkeit des ausgefällten Niederschlages. Wenn nach 3 Minuten Absitz- zeit im 50-ml-Becherglas z.B. mehr als 3 bis 5 mm klare Oberschicht erkennbar wird, ist in der Regel die optimale Sedimentationsgeschwindigkeit erreicht und damit auch der gesuchte Zeitpunkt vor der Enzymschädigung. Die beginnende Enzymschadigung kann daran erkannt werden, daß der Überstand (die Oberschicht) nicht mehr klar ist (bzw. das Sediment vom Überstand durch eine getrübte Zone getrennt ist.) Die Autolyse kann bei Temperaturen zwischen 20 bis +3000, vorzugsweise unter 250e, durchgeführt werden, wobei die Einhaltung einer konstanten Temperatur nicht erforderlich ist. Hierdurch ergibt sich eine Fülle von Nutzungsmöglichkeiten, wie Energie-Einsparung, Nacht- und Wochenend-Autolyse, Arbeitszeiteinsparung. Der günstigste Endpunkt wird immer an dem Absetztest erkannt.
Der gesamte Ansatz wird nun mit weiterem Isopropylalkohol versetzt, um die Autolyse zu unterbrechen. Dabei wird durch kurzes Rühren der Mischung bei einem Gehalt von 30 bis 35 % an Isopropylalkohol (bezogen auf Wasser und Alkohol) neben ungelösten Fasern eine fast klare und so dünnflüssige Lösung erhalten, daß die Abtrennung der Fasern, auch bei großen Ansätzen völlig problemlos durch einen Siebkorb von 4 bis 5 mm Maschenweite gelingt; der Siebkorb wird am besten ebenfalls mit einem Rührer versehen, um zuletzt nur noch trockenen Faserrückstand übrig zu behalten. Die abgesiebte Lösung läßt man zur Ausfällung von Pankreatin in soviel Isopropylalkohol von 80 bis 100 % Gehalt einlaufen, daß sie ausreicht, um nach Vermischen mit der 30 bis 35 %igen Lösung eine Fällungskonzentration von 55 bis 65 * Isopropylalkohol zu erzielen. Rückgewonnener Isopropylalkohol, der angenähert dem Azeotrop von 88 GewO-% etwa 84 % Alkoholgehalt hat, läßt sich mit Vorteil verwenden.
Bei Konzentrationen von unter 55 % ist die Fällung unvollständig, würde also einen Ausbeuteverlust mit sich bringen. Bei über 65 % werden vermutlich unerwünschte Enzyminhibitoren mit ausgefällt, wodurch die Aktivität der Proteasen niedriger erscheint.
Die nach diesem Verfahren erhaltene Pankreatinfällung ist so grobkörnig, daß sie sich innerhalb einer Stunde auf 10 bis 20 % des ursprünglichen Volumens abgesetzt hat, und man die klare, überstehende Lösung einfach abhebern oder abpumpen kann. Der abgesetzte Niederschlag kann durch Aufrühren mit zurückgewonnenem 84 %igem, oder mit frischem Isopropylalkohol und jeweils erneutem Sedimentieren auf einfache Weise gewaschen und auf die erfindungsgemäß zur Trocknung erforderliche Konzentration gebracht werden.
Beispiel 100 kg tiefgefrorene Schweinepankreas werden gewolft oder gecuttert und im 250 l-kessel mit einer Lösung von 100 g Calciumgluconat in 20 1 Wasser zusammen mit 200 g Silicone-Entschäumer verrührt. Je nach dem Gehalt der Drüse an freiem Trypsin werden bis zu 1 kg fertiges Pankreatin, gelöst in 5 1 Wasser, als Starthilfe für die Autclyse zugegeben. Diese Pankreatinmenge wird durch die später beschriebene w'37 0-Hydrolysenprobe" ermittelt. Zu diesem Zweck werden an dieser Stelle 120 g aus dem Ansatz entnommen.
Nach Zugabe von 15 1 84 %igem Isopropylalkohol wird weiterhin eine Lösung von 1,5 kg Natriumhydrogencarbonat in 20 1 Wasser eingerührt. Man läßt über Nacht stehen, wobei die Temperatur etwa von 20 auf 120 ansteigt, erwärmt am nächsten Morgen auf 200und rührt bei dieser Temperaturweiter.
9 'Den Endpunkt der Autolyse erkennt man an dem Absitztest.
Hierzu werden während dieses letzten Abschnitts der Autolyse zunächst alle halbe, später alle Viertelstunde 10 g der Suspension entnommen, mit 5,4 ml 84 %igem Isopropyl alkohol mittels eines Glasstabes eine Minute verrührt, die entstehende Lösung von den am Glasstab klebenden Fasern abgetrennt und in 20 ml einer-im 50 ml-Becherglas mit Magnetrührer vorgelegten Lösung von 84 %igem wäßrigem Isopropylalkohol eingerührt. Nach einer Minute stellt man den Rührer ab und läßt eine bzw. drei Minuten lang absitzen.
Die Probe wird positiv bewertet und daher die Autolyse beendet, sobald in einer Minute 3 mm bzw. in drei Minuten 10 mm (mehr oder weniger klare) Oberschicht erkennbar sind.
Als Beispiel wird eine typische Absitztestreihe wiedergege ben, die einsetzt, sobald das Autolysat 200C aufweist.
Absitztest 200C Autolysen- entspricht entspricht dauer mm/0,5 Min. mm/l Min. mm/3 Min.
1,00 Std. O 0 0 2,00 Std. O 0 0 2,50 Std. O 0 1 2t75 Std. 0 1 4 3,00 Std. 1 3 10 3,25 Std. 3 6 18 3,50 Std. 5 10 > 20 3,75 Std. 9 18 > 20 4,00 Std. 14 > 20 > 20 tIn diesem Beispiel wird also der günstigste Zeitpunkt zur Beendigung der Autolyse nach 3 Stunden erreicht. -Damit dieses auch -wenigstens ungefähr - bei Verwendung anderer (z.B länger oder kürzer gelagerter) Schweinepankreas der Fall ist, wird die "37°-Hydrolysenprobe" durchgeführt: Aus dem mit Ca-gluconat versetzten Drusenbrei werden 120 g entnommen, mit 1a5 g Natriumhydrogencarbonat in 25 ml Wasser versetzt und 30 Minuten bei 37 0C gerührt. Mit einer Probe dieses Schnellautolysatz wird der Absitztest durchgeführt. Bei unter 2 mm/3 Min. werden 2 Mio E freies Trypsin bei bis zu 12 mm/1 Min , wird 1 Mio E und bei noch höherer Absatzgeschwindigkeit kein freies Trypsin zu dem Hauptansatz (in Form von Pankreatin) zugesetzt. (1 Mio E freies Trypsin sind zBO in 250 g Pankreatin mit 4000 E/g enthalten.) Nachdem nun der günstigste Zeitpunkt ermittelt ist, wird die Autolyse des Ansatzes durch Einpumpen von 72,5 1 84 igem (rückgewonnenem) Isopropylalkohol beendet. Man rührt noch eine halbe Stunde, wobei eine klare Lösung neben ungelösten Pasers entsteht, von denen dann abgesiebt wird Hierzu wird der Kesselinhalt in einen offenen 50 1 Kessel mit eingelegtem Sieb von ca. 5 mm Maschenweite abgelassen, der mit einen Ankerrührer versehen ist. Der Bodenauslauf des Siebkessels ist über eine Pumpe mit einem 500 1-Polypropylenbehälter verbunden. Er ist mit 318 1 rückgewonnenem 84 %igern Isopropylalkohol beschickt und wird nun unter langsamem Rühren mit der abgelassenen, gesiebten Lösung weitergefüllt. Die im Siebkessel zurückbleibenden Fasern werden noch 10 Min lang trocken gerührt. Das Gewicht der Fasern beträgt 7 bis 8 kg. Sie werden verworf er in heißer, verdünnter Natronlauge gelöst und nach Abstumpfen mit Salzsäure ins Abwasser abgelassen.
In dem 500-1-Behälter setzt sich das ausgefällte Pankreatin als grober Niederschlag in einer Stunde auf ein Volumen von 80 1 ab (bei 20°C; bei 24°C in einer halben Stunden). Der Überstand wird abgehebert und der Rückdestillation zugeführt. Den Bodensatz verrührt man mit 63 1 rückgewonnenem 84 %igem Isopropylalkohol und läßt über Nach nochmals absitzen. Am nächsten Tag wird dieser Vorgang wiederholt und der so entstandene Bodensatz mit etwa 45 1 84 %igem Isopropylalkohol versetzt, d.h. soviel wie nötig, um eine Pankreatinsuspension in 76 %igem Isopropylalkohol herzustellen. Diese Suspension wird über eine Nutsche von 40 cm Durchmesser gefiltert und gut trocken gesaugt Der Filterkuchen wird im Cutter kurz zerkleinert und auf Bleche ausgebreitet. Die Trocknung erfolgt über Nacht bei Heiztemperaturen bis 55°C unter einem Vakuum von etwa 5 mbar.
Pankreatin-Ausbeute: 11,6 kg Amylase-Aktivität: 93,6 FIP-E/mg Lipase-Aktivität: 90,3 FIP-E/mg Protease-Aktivität mit Enterokinase aktiviert: 5,6 FIP-EVmg ohne Aktivierung: 5,6 FIP-E/mg Trypsin-Aktivität mit Enterokinase aktiviert: 4,2 FIP-E/mg ohne Aktivierung: 4,1 FIP-E/mg Chymotrypsin-Aktivität mit Enterokinase aktiviert: 28,3 FIP-E/mg ohne Aktivierung: 28,3 FIP-E/mg Trockengehalt: 98,7 % Fettgehalt: 0,4 * Schüttdichte: 0,65 g/ml Stampfdichte: 0,76 g/ml Keimzahl: 200 Keime/g keine nach USP XVII unerwünschten Keime

Claims

Patentansprüche (1.) Verfahren zur Gewinnung von Pankreatin von hohem Schüttgewicht durch vorzugsweise Autolysieren einer wäßrigen Pankreasgewebesuspension, Entfernen der Faseranteile, Entwässern, Entfetten, Ausfällen und Trocknung der Fällung, dadurch gekennzeichnet, khE t, daß man das ausgefällte Pankreatin sedimentieren läßt und nach Abhebern oder Absaugen des Überstandes durch gegebenenfalls mehrfaches Auf rühren mit Isopropylalkohol oder Aceton fett- und tryptonfrei wäscht, bis ein Niederschlag mit einer Konzentration zwischen 70 und 85 % an Isopropylalkohol bzw. 80 bis 95 % an Aceton entstanden ist, den man absaugt oder abschleudert und unter Behandlung mit trockener Luft oder Stickstoff bei unter 25 0C vorzugsweise unter vermindertem Druck trocknet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ausgeht von Pankreatin wie es erhalten wird, wenn man eine wäßrige, vorzugsweise Calciumionen enthaltende Pankreasgewebesuspension unter Zusatz von bis zu 20 Gew.-% Isopropylalkohol, bezogen auf die Suspension, bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 und nicht über 25°C autolysiert, die Autolyse durch Zugabe von Isopropylalkohol bis zu einer Konzentration von 30 bis 35 % - bezogen auf die Summe von Wasser und Isopropylalkohol - unterbricht, sobald eine Probe in 55 bis 65 %igem wäßrigem Isopropylalkohol eine im Erdschwerefeld gemessene Sedimentationsgeschwindigkeit von etwa 3 bis lO mm/l bis 3 min erreicht, die dünnflüssig gewordene Zubereitung von den Bindegewebsfasern absiebt, die Lösung bei 15 bis 250C in soviel Iso propylalkohol einträgt, daß eine an Isopropylalkohol 55 bis 65 gew.%ige wäßrige Lösung entsteht, das ausgefallene Pankreatin sedimentieren läßt, und nach Abhebern des Uberstandes durch gegebenenfalls mehrfaches Aufrühren mit Isopropylalkohol und Sedimentieren fett-und tryptonfrei wäscht.