DD149532A5

DD149532A5 - Verfahren zur herstellung von organextrakten mit hohem heparingehalt

Info

Publication number: DD149532A5
Application number: DD80219786A
Authority: DD
Inventors: Istvan Takacs; Gyoergy Kerey; Janos Illes; Peter Rudolf; Pal Gere; Laszlo Czebe; Erzsebet Neszmelyi
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1979-03-21
Filing date: 1980-03-20
Publication date: 1981-07-15
Also published as: SE451297B; AU5663780A; NL8001695A; BR8001717A; ES8102580A1; IT8067438A0; ZA801480B; GB2045272A; DK166504B; GB2045271B; IT8067444A0; SU1375115A3; AR219226A1; NZ193188A; ES490538A0; DD149467A5; CA1152894A; PL222794A1; SE8002126L; GB2045272B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von wenigstens 120 IE/ml Heparin, daneben nur wenig Fette und sonstige Verunreinigungen enthaltenden waeszrigen Extrakten konstanter Zusammensetzung. Erfindungsgemaesz wird 90 bis 95% Trockensubstanz enthaltendes, heparinreiches, amorphes,koerniges,formbestaendiges Rohmaterial hoher spezifischer Oberflaeche in waeszrigen Medium bei fuer das jeweilige Aufarbeitungssystem u.den Rohst. optim. Temper.- und pH-Werten einer diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Gegenstromextraktion mit Salzwasser unterzogen. Auf diese Weise wird ein waeszriger Extrakt mit einer Heparinaktivitaet von wenigstens 120 IE/ml erhalten.

Description

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Verfahren zur Herstellung von Organextrakten mit hohem Heparingehalt

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Organextrakten mit hohem Heparingehalt durch im Gegenstrom mit einem wäßrigen Medium vorgenommene Extraktion fester heparinhaltiger Rohstoffe.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen;

Es ist bekannt, daß die Aufarbeitung heparinhaltiger tierischer Organe, die Gewinnung des Heparins ein teurer und komplizierter Prozeß ist, der mehrere Extraktionsschritte unterschiedlicher Zweckbestimmung umfaßt. Der Extraktionsprozeß ist eigentlich von der Art des Sammelns und Konservierens der heparinhaltigen Organe nicht zu trennen,

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da diese Arbeitsgänge die industrielle Durchführbarkeit und die Ausbeute des Extraktionsprozesses entscheidend beeinflussen. Die Extraktionsschritte bei der Gewinnung von Heparin erfordern viel Zeit, auch ist ihre Reproduzierbarkeit zweifelhaft; deswegen sind, wie sowohl Fachliteratur wie auch Patentliteratur zeigen, zahlreiche Versuche gemacht worden, den die Effizienz und die Wirtschaftlichkeit der ganzen Heparinherstellung bestimmenden Extraktionsprozeß zu verbessern. Ziel der Extraktion ist es offensichtlich, den nach dem Sammeln und Lagern der unterschiedlichen Organrohstoffe in diesen noch vorhandenen Heparingehalt so vollständig wie möglich herauszulösen, wobei das Verfahren den Wirkstoff nicht schädigen, keine Zersetzung verursachen soll. Eine weitere Zielstellung ist es, aus der im Extraktionsprozeß erhaltenen wäßrigen Heparinlösung mit guter Ausbeute, in wenigen Schritten Heparin der im Arzneimittelbuch festgelegten Qualität herzustellen« Dazu ist es erforderlich, daß die Heparinextraktionsbrühe so wenig wie möglich mit die Reinigung erschwerenden heparinoiden pyrogenen Färb- und PoLypeptidsubstanzen verunreinigt ist. Will man eine möglichst selektive Extraktion des Heparins erreichen, so muß man berücksichtigen, daß die in dem Organextrakt vorliegenden sonstigen Komponenten (Fette, Lipoide, Eiweiße, Peptide, anorganische Salze) die Isolierbarkeit des Heparins verschlechtern, die Ausbeute verringern, technologische Probleme verursachen und das Endprodukt nicht immer von sämtlichen Begleitstoffen völlig gereinigt werden kann. Die genannten Zielstellungen können mit den bekannten Rohstofftypen und Extraktionsverfahren nicht immer alle optimal realisiert werden·

Bei der Extraktion heparinhaltiger tierischer Organe werden in der Praxis drei verschiedene Methoden angewendet, die im folgenden kurz beschrieben werden«

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Der prinzipielle Aufbau der ersten Extraktionsmethode stimmt mit der von Charles und Scott (J. Biol. Cte m. 102, 425, 1933) vorgeschlagenen Methode überein· Charakteristisch für diese Methode' ist, daß zur Extraktion, zum Zellaufschluß der zerkleinerten, meistens tiefgekühlten heparinhaltigen Organe auch die eigenen hydrolysierenden Enzyme der überlebenden Gewebe genutzt werden· Das Material wird längere Zeit autolysiert, dann werden, um die Extraktion vollständig zu machen, schwach alkalische Salzlösungen zugesetzt und das Gemisch gekocht. Methoden auf der Basis der Autolyse sind zum Beispiel in den US-PS¹η 2 571 697 und 2 797 184 beschrieben. Kombinationen der Autolyse mit weiteren Extraktionsschritten bilden den Gegenstand der US-PS¹η 2 884 358 und 3 OI6 331·

Die Nachteile der auf der Autolyse basierenden Extraktionsmethoden sind in der ungarischen Patentschrift 148 776 und der US-PS 2 587 924 beschrieben. Die Nachteile sind, wie experimentelle Erfahrungen zeigen, auf mehrere Gründe zurückzuführen:

- auch wenn man annimmt, daß sich während der Extraktion zwischen der extrahierenden Lösung und den zu extrahierenden Organen ein Gleichgewichtszustand einstellt, muß man wegen des hohen Wassergehaltes der Organe mit einem beträchtlichen Heparinverlust rechnen. Mit dem Entfernen des extrahierten Organs aus dem System wird zwangsläufig auch Flüssigkeit (Heparinlösung) aus dem System entfernt. Da der Autolysegrad nicht an allen Stellen der gleiche ist, stellt sich der Gleichgewichtszustand zwischen extrahierender Flüssigkeit und Organ nicht überall ein, d.h. die tatsächlichen Verluste sind noch größer.

- Während der der Autolyse vorangehenden Lagerung und während der Autolyse vermehren sich die das Heparin schädi-

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genden Mikroorganismen, was zu einer Verminderung der Ausbeute führt und auch unter sonstigen Aspekten (Pyrogenität, Toxizität) nachteilig ist. - Einer der Hauptprobleme der Autolysemethoden ergibt sich aus dem Sammeln der Organe, und hierauf ist die unsichere Zusammensetzung des erhaltenen Extraktes zurückzuführen« Wegen der großen Volumina sind in dieser Phase der Aufarbeitung auch große Vorrichtungen erforderlich, Industriell durchführbar ist das Verfahren nur dann, wenn das Volumen bis auf ein 1 - 10 % Heparin enthaltendes Zwischenprodukt verringert werden kann. Wegen der Schwankungen in der Zusammensetzung schwankt auch die Qualität des erhaltenen Produktes, eine wirtschaftliche Aufarbeitung ist nur schwer möglich.

Die zweite Extraktionsmethode kann dadurch charakterisiert werden, daß der Wirkstoffgehalt der heparinhaltigen Organe nur mittels Chemikalien aufgeschlossen und als Heparin oder Heparin-Eiweiß-Komplex in Lösung gebracht wird. Derartige Verfahren sind zum Beispiel in den ungarischen Patentschriften 148 776 und 149 339, der britischen Patentschrift 992 201 und den US-Patentschriften 2 623 001, 3 058 884 und 3 262 854 beschrieben. Auch bei diesem Verfahren ist nachteilig, daß die einen hohen Wassergehalt aufweisenden Organsrückstände aus dem System entfernt werden müssen, wobei - abhängig von dem organischen Trockensubstanzgehalt des Extraktionsrückstandes - Heprainverluste von 20 - 40 % auftreten (s. Beispiel 1 der ungarischen Patentschrift 148 776 sowie britische Patentschrift 992 201). Auch bei dieser Methode verursachen die Züsammensetzungsschwankungen Unannehmlichkeiten, wie schwankende Extraktzusammensetzung, mangelnde Reproduzierbarkeit der folgenden Aufarbeitungsschritte. Wegen dieser Schwierigkeiten wird zum Beispiel gemäß der US-Patentschrift 2 623 001 nach dem Aufschluß mit einem großen Volumen

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eine langwierige Dialyse vorgenommen. In dem Verfahren gemäß der US-Patentschrift 2 262 854 ist man gezwungen, in den mit den größten Volumina vorgenommenen Phasen der Extraktion organische Lösungsmittel einzusetzen·

Nachteilig bei den beiden beschriebenen Methoden, der autolytischen und der nur mit chemischem Aufschluß arbeitenden Methode, ist demnach, daß bei der Extraktion die im allgemeinen wegen der Konsistenz der üblichen Rohstoffe nur eine ein- oder zweistufige Gegenstromextraktion sein kann - im Endergebnis an Heparin recht arme, im Durchschnitt pro ml 10 - 20 IE, d.h. etwa 0,01 % Heparin und neben diesem viele Begleit- und Störstoffe enthaltende Lösungen gebildet werden. Anschaulich ausgedrückt: um 1000 MIE (6,5 kg) Heparin in Lösung zu bringen, muß die Extraktion mit einem Volumen von 50 000 bis 100 000 Litern vorgenommen werden, und der Heparinverlust beträgt wenigstens 20 %,

Bei der dritten Gruppe des Extraktionsmethoden werden die heparinhaltigen Organe zwecks Verminderung der Heparinverluste und Vermeidung der bei der Vorautolyse auftretenden Unsicherheiten nicht nur mit Chemikalien behandelt, sondern auch noch einer bis zur völligen oder fast völligen Auflösung führenden, langwierigen und intensiven Proteolyse unterworfen, indem Enzyme, wie Trypsin, Pankreasextrakt, Papain, Elastase in das System eingebracht werden« Derartige Verfahren sind zum Beispiel in der ungarischen Patentschrift 147 323 und den US-Patentschriften 2 587 924, 2 989 438 und 3 817 924 beschrieben, während die US-Patentschriften 2 884 358 und 3 016 331 auf die Kombination von Autolyse und enzymatischer Proteolyse eingehen. Trotz der vorhandenen Vorteile wird doch die V/irtschaftlichkeit der Verfahren von den Kosten der für die spezifische Menge der Organe erforderlichen proteolytischen Enzyme empfindlich berührt. Auf 2 kg heparinhaltige Organe gerechnet muß

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zum Beispiel bei einem der genannten Verfahren eine Menge von 1,5 - 3 kg Pankreas beziehungsweise Pankreasrückstand zugesetzt werden·

Bei Verringerung der spezifischen Enzymmenge werden Proteolyse und Filtrierprozeß außerordentlich langwierig. Bei dem ^Verfahren gemäß der US-Patentschrift 3 817 831 dauert die mit Pepsin vorgenommene Autolyse 24 Stunden, die mit Pankreatin vorgenommene Autolyse 15 Stunden, anschließend wird einmal grob filtriert, nach 24 Stunden ultrafiltriert· Besonders nachteilig ist, daß infolge der Zeitaufwendigkeit der einzelnen Schritte die Infektionsgefahr durch Bakterien ansteigt, durch die Gegenwart der mit den Enzymen eingebrachten degradierenden und die Glucosidbindungen des Heparins zersetzenden Enzyme steigt der Heparinverlust.

Infolge der völligen oder fast völligen Proteolyse gelangen auch die Begleitstoffe des Heparins, zum Beispiel Mucopolysaccharide, Uucleinsäurederivate, Farbstoffe, Fette und Lipoide, in Lösung und stören die schnelle und wirksame Aufarbeitung beträchtlich. Gemäß dem Beispiel 3 der US-Patentschrift 3 817 831 kommt in der Lösung B, nach Beendigung der Proteolyse und der Grobfiltration, auf einen Heparingehalt von 0,027 % ein Gesamttrocknungssubstanzgehalt von 10,35 %₉ d.h. drei Größenordnungen höher. Aus diesem Grund bereitet auch die Kanalisierung der wirkstoffreien, aufgearbeiteten Lösung Umweltschutzprobleme. Das Produkt der mit Proteolyse arbeitenden Verfahren ist eine außerordentlich verdünnte Lösung (6-45 IE/ml; 0,004-0,03 % Heparin); in konze.ntrierteren Lösungen kann wegen der auftretenden Substratinhibition keine Protolyse vorgenommen werden.

Der längste und komplizierteste Abschnitt des gesamten Herstellungsprozesses ist das Herauslösten des Heparins

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aus den tierischen Organen und die gut reproduzierbare Verminderung des Volumens der erhaltenen Lösung, Die Extraktion erfordert wegen der Proteolyse und den in mehreren Schritten ausgeführten physikalisch-chemischen Maßnahmen viel Zeit und ist kostspielig, weil wegen der sehr geringen Wirkstoffkonzentrationen Vorrichtungen mit großen Volumina angelegt und betrieben werden müssen· Bei der Extraktion mit Chemikalien beziehungsweise proteolytischen Enzymen fallen die Kosten dieser Stoffe sehr ins Gewicht. Die Reproduktion ist unsicher, da infolge der verschiedenen Sammel- and I<agerungsbedingungen der Wirkstoffgehalt innerhalb weiter Grenzen schwankt. Nachteilig ist ferner, daß die Aufarbeitbarkeit von den in mehrere Größenordnungen größeren Mengen vorhandenen Verunreinigungen ungünstig beeinflußt wird.

Die bei der Heparinherstellung üblichen Organsamme!methoden ermöglichen es demnach nicht, den: nach der Lggerung noch verbliebenen Heparingehalt ohne nennenswerten Verlust in Form reinen Heparins zu gewinnen. Die Extraktionsmethoden mußten der Qualität des Ausgangsmaterials angepaßt werden; dessen schwankende Qualität erfordert es, Arbeitsgänge in den Extraktionsprozeß einzuschalten, die die Selektivität vermindern, die Kompliziertheit jedoch erhöhen.

Ziel der Erfindung:

Es ist demnach eine wichtige technische Aufgabe, die Extraktionsmethoden zu vereinfachen, die Durchlaufzeit dieses Fabrikationsabschnittes zu verkürzen, seine Wirtschaftlichkeit zu steigern, die Selektivität zu verbessern und dadurch einen Extrakt herzustellen, dessen Zusammensetzung konstant ist, der wenig störende Verunreinigungen enthält und dessen Wirkstoffkonzentration extrem hoch (wenigstens 120 ΙΕ/ml ist. Energie-, Chemikalien- und Ar-.

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beitskräfteaufwand sollen dabei geringer sein· Darlegung des Wesens der Erfindung:

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können diese Zielstellungen optimal erreicht werden'.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von wenigstens 120 ΙΕ/ml Heparin, daneben wenig Fette und sonstige Verunreinigungen enthaltenden, wäßrigen Extraktion konstanter Zusammensetzung· Pur das erfindungsgemäße Verfahren ist charakteristisch, daß man 90-95 % Trockensubstanz enthaltendes, heparinreiches, amorphes, körniges, formbeständiges Rohmaterial hoher spezifischer Oberfläche in wäßrigem Medium bei für das jeweilige Aufarbeitungsverfahren und den Rohstoff optimalen Temperatur- und pH-Werten einer diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Gegenstromextraktion mit Salzlösung unterzieht·

Die Gegenstromextraktion wird bei 20 - 80⁰C, einer Elektrolytkonzentration (Salzkonzentrat-ion) von 1,5 - 12,0 % in einem pH-Bereich von 8 - 12,S beziehungsweise in einer 0,5 - 1,On alkalischen Lösung vorgenommen· Elektrolytkonzentration, Temperatur und pH-Wert werden zweckmäßig während des gesamten Extraktionsprozesses auf einem konstanten Wert gehalten· Das Verhältnis zwischen extrahierender Salzlösung und Rohstoff wird so eingestellt, daß die entstehende Extraktbrühe 150 - 300 ΙΞ/ml Heparin enthält. Dazu ist es zweckmäßig, daß Verhältnis von Trockensubstanz zu Flüssigkeit bei etwa 1:5 zu halten. Zum Einstellen des pH-Wertes werden ein- oder mehrwertige Laugen verwendet, zweckmäßig Natriumhydroxyd oder sonstige, bei der Heparinextraktion übliche Laugen. Als Elektrolyt können beliebige, gegenüber Heparin inerte Salze, vorzugsweise Natriumchlorid,

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verwendet werden· Unter heparinreichera Rohmaterial wird hier ein Ausgangsmaterial verstanden, das auf Trockensubstanz bezogen wenigstens 5 - 35 % mehr Heparin enthält als jedes natürliche Ausgangsmaterial·

Die Gegenstromextraktion kann in einer Vorrichtung diskontinuierlich bis zur Erschöpfung oder aber kontinuierlich, zweckmäßig in einem pulsierenden ¹J-Extraktor, durchgeführt werden. Der U-Extraktor ist in der ungarischen Patentschrift 159 977 beschrieben· Er ist nicht nur zur Extraktion von Hielpflanzen, sondern auch zur Herstellung wäßriger Heparinextrakte mit hohem Wirkstoffgehalt gut geeignet. Die Extraktionsprozesse in der Vorrichtung sind folgende:

Sprühaufschluß im Gleichstrom, Sprühvoraufschluß, Voraufschluß durch Herabtropfen, dann Vibrationsextraktion im Gegenstrom, schließlich Nachextraktion durch Herabtropfen· Die Vorrichtung ist aus Zellen aufgebaut, zwischen den einzelnen Zellen ist die Neigung der wäßrigen Extrakte, zurückzufließen und sich zu vermischen, stark gehemmt· Durch die Vibration wird das zu dem jeweiligen Augenblick gehörende Extraktionsgleichgewicht wesetnlich schneller erreicht· Das hat den Vorteil, daß sowohl die auf das zu extrahierende Material berechnete Flüssigkeitsmenge wie auch die Dauer der Extraktion und die Extraktionsweglänge bedeutend vermindert werden können.

Als Ausgangsstoff wird das auf die in der ungarischen Patentanmeldung RI-705 beschriebene Weise hergestellte, heparinreiche Trockenkonzentrat verwendet, welches körnig und amorph ist und eine hohe spezifische Oberfläche aufweist

"Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens können wie folgt zusammengefaßt werden:

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1. Bei den üblichen ein- oder zweistufigen Gleichstromverfahren zur Extraktion von Heparin ist es erforderlich, Temperatur und pH-Wert einem Programm entsprechend zu ändern beziehungsweise Chemikalien zuzusetzen. Die erfindungsgemäße Gegenstromextraktion kann in einer einzigen Vorrichtung, in einem für das jeweilige System optimal gewählten wäßrig-alkalischen Medium als einfaches Herauslösen realisiert werden· Die Prozeßbedingungen brauchen nicht geändert, Chemikalien nicht zugesetzt zu werden.

2. Bei der Gegenstromextraktion wird in kurzer Prozeßzeit und guter Ausbeute ein praktisch fettfreier Extrakt konstanter Zusammensetzung erhalten, der wenigstens 5-10 mal so konzentriert ist wie die mit üblicher Extraktion erhaltenen Extrakte. Dies ist darauf zurückzuführen, daß das Verhältnis zwischen Heparin und Begleitstoffen wesetnlich günstiger ist.

3. Die Ausführung der Gegenstromextraktion ist nicht an bestimmte Chemikalien gebunden. Es können immer die jeweils am besten zugänglichen Chemikalien verwendet werden.

4· Der Volumenbedarf der Gegenstromextraktion beträgt ein Viertel bis ein Zehntel des Volumenbedarfes der bekannten Verfahren. Der Heprainextrakt fällt gleichmäßig, konzentriert und in geringem Volumen an. Die Volumenkapazität der Vorrichtungen kann verringert, ihr Ausnutzungsgrad erhöht werden.

5· Durch die Verringerung des Volumens wird eine beträchtliche Energie- und Arbeitseinsparung erzielt, auch werden weniger Chemikalien benötigt.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß erfindungsgemäß einen extrem hohen Heparingehalt aufweisende Extrakte

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konstanter Zusammensetzung durch Extraktion im Gegenstrom hergestellt werden können und dabei der Zeitaufwand gering ist, die Volumina klein und daher die Vorrichtungen einfach sind. .

Wird zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens der in der ungarischen Patentschrift 159 977 beschriebene U-Extraktor verwendet und bei 50⁰C mit 0,5-1,0 Extraktionslösung mit wenigstens 5 % Kochsalzgehalt bei 30 Minuten Verweili.rit im Extraktor extrahiert, so wird der Wirkstoff praktisch quantitativ extrahiert. Das Verhältnis zwischen getrocknetem Organkonzentrat und Extraktionsflüssigkeit wird auf etwa 1:5 eingestellt. Das Organkonzentrat quillt-durch die Wasseraufnahme etwas auf, bewahrt jedoch seinen formbeständigen körnigen Charakter und seine ausgezeichnete Piltrierbarkeit auch bei hohen Laugekonzeritrationen. Eine Erhöhung der Laugenkonzentrationen wirkt sich praktisch nicht auf die Menge des herausgelösten Feststoffes aus, auch die Menge der in Lösung gehenden Peptide und Eiweiße ist praktisch unverändert· Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß in den die Hauptmenge des Trock-enkonzentrates ausmachenden Eiweiße beim Trocknen irreversible Denaturationsprozesse ablaufen.

Ausführungsbeisp Me:

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Zum Beweis der Vorteile des Verfahrens werden auch einige Vergleichsbeispiele gegeben.

Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel)

Das gemäß der ungarischen Patentanmeldung RI-705 hergestellte heparinhaltige Rohmaterial wird in an sich be-

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kannter Weise autolysiert und in Gegenwart von Toluol mit Elektrolytlösungen extrahiert.

20 kg dieses Rohmaterials werden zusammen mit 100 kg 18 % Trockensubstanz enthaltendem, feingemahlenem Schweinedarm, 450 Liter Wasser und 150 1 10 %iger Ammoniumsulfatlösung in einem Duplikator intensiv gerührt. Nach dem Verrühren wird das Gemisch auf 38⁰C erwärmt. Dann wird unter Rühren der pH-Wert mit 40 %iger Natronlauge auf 8,8-9,2 eingestellt. Um schädlichen mikrobiologischen Prozessen vorzubeugen, werden dem Gemisch 3 Liter Toluol zugesetzt.

Nach Zusatz von Enzymen wird bei 38⁰C 36 Stunden lang autolysiert, wobei das Gemisch von Zeit zu Zeit aufgerührt wird. Der pH-Wert wird alle 6 Stunden kontrolliert und notwendigenfalls durch Zusatz 40 %iger Natronlauge korrigiert.

Nach 35 Stunden Autolyse wird der pH-Wert mit 18 %iger Salzsäure auf 7,3-7,7 eingestellt und das Gemisch aufgekocht. Nach lOminütigem Kochen werden die koagulierten Teile auf einem Filtersieb abgetrennt. Das Filtrat wird bei 60⁰C durch Separieren fettfrei gemacht.

638 Liter dunkelbraune Extraktbrühe werden erhalten, deren Heparinkonzentration 18,1 ΙΕ/ml beträgt; das entspricht insgesamt 11,54 MIE Heparin. Verglichen mit Beispiel 5 ist dies eine Ausbeute von nur 76 %,

Beispiel 2 (Vergleichsbeispiel)

Heparinhaltiges Trockenkonzentrat wird auf die in der US-Patentschrift 3 817 831 beschriebene Weise extrahiert, 40 kg Rohmaterial werden in einem Duplikator mit 400 Liter Wasser gründlich verrührt. Der pH-Wert wird mit Salzsäure auf 2,7 eingestellt und das Gemisch auf 38 C erhitzt. Eine

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Pepsinmenge, die 10 kg Schweinemagenschleimhaut entspricht, wird zugesetzt, danach der pH-Wert erneut auf 2,7 eingestellt· Unter ständigem Rühren, wird 20 Stunden lang proteolysiert, die Temperatur wird bei 37-39 C gehalten.

Nach 20 Stunden Proteolyse wird der pH-Wert mit 40 ^iger Natronlauge auf 8,0 eingestellt und dem Gemisch bei 37⁰C 20 Liter aktiviertes Pankreasgemisch zugesetzt· Die zweite Proteolyse dauert 10 Stunden. Der pH-Wert wird alle 2 Stunden kontrolliert und notwendigenfalls mit Natronlauge erneut auf 8 eingestellt. Die Temperatur wird bei 37⁰C gehalten. Wach der zweiten Proteolyse wird das Gemisch gekocht und dann durch ein Filtersieb filtriert. 417 liter eines braunen Filtrates werden erhalten, dessen Heparinkonzentration 32,0 ΙΕ/ml beträgt, d.h. der Gesamtheparingehalt liegt bei- 13,32 MIE, was, verglichen mit dem Beispiel 5» einer 62,7 %lgen Ausbeute entspricht.

Beispiel 3 (Ver^leichsbeispiel)

Das getrocknete heparinhaltige Ausgangsmaterial wird gemäß der ungarischen Patentschrift 148 776 aufgearbeitet. 11,2 kg Rohmaterial werden in einem Duplikator mit 195 Liter V/asser gründlich vermischt· Dann werden 6,5 kg Kochsalz zugesetzt, der pH-Wert wird mit 40 %iger Watronlauge auf 10 eingestellt. Unter gleichmäßigem Rühren wird das Gemisch mit Dampf auf 65⁰C erwärmt und bei dieser Temperatur mit Peroxyd behandelt. Dazu werden 250 ml 40 ^iges Wasserstoffperoxyd mit Wasser auf ein Volumen von 4 Liter verdünnt, ein Liter der verdünnten Lösung wird dem Gemisch zugesetzt. Die verbleibenden 3 Liter werden unter Aufrechterhaltung der Temperatur von 65⁰C innerhalb von 30 Minuten gleichmäßig zugegeben. Nach der Peroxydbehandlund wird das Gemisch bei der gleichen Temperatur noch eine Stunde lang gerührt und dann mit 6OO g Ammoniumchlo-

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rid versetzt, wodurch sich ein pH-Wert von 8,7 einstellt· Mit dem Heizmantel des Duplikators wird das Gemisch bis zum Sieden erhitzt, es wird 5 Minuten lang gekocht, der Rührer wird abgeschaltet. Man läßt das Gemisch 15 Minuten lang absetzen. Die über den abgesetzten, extrahierten Organrückständen stehende hellgelbe, völlig durchsichtige Flüssigkeit wird mit Hilfe eines an der Seite des Apparates befindlichen Stutzens dekantiert. Wach dem Dekantieren wird das in dem Apparat verbliebende Gemisch \ aus Organrückständen und Flüssigkeit aufgerührt und dann durch ein Filtersieb der Lochgröße 0,8 mm filtriert.

Die vereinigten Extrakte haben ein Volumen von 168 liter und eine Heparinkonzentration von 32,4 ΙΕ/ml, was einer Gesamtmenge von 5»44 MIE Heparin entspricht. Verglichen mit dem Beispiel 5 ist das eine 72,4 %ige Ausbeute.

Beispiel 4

5»0 kg des auch in den vorherigen Beispielen verwendeten Rohmaterials werden in 10 gleiche Teile geteilt. Diese Portionen von je 0,5 kg werden den/Vorschriften der diskontinuierlichen Extraktion im Gegenstrom entsprechend in 5 Extraktionsschritten aufgearbeitet. Die einzelnen Extraktionsschritte werden folgendermaßen ausgeführt:

Die erste Portion des getrockneten Organkonzentrates wird mit 4O⁰C warmer, 0,25 η Natronlauge, die 6 % Kochsalz enthält, zu 3,2 Liter Extraktionsgemisch angesetzt. Wach Minuten wird der Extrakt mittels Vakuum mit einem Blüchertrichter filtriert. Die Pilterflache ist ein Metallnetz mit 0,6 mm Lochweite. Die erste Extraktionsbrühe wird gesammelt, ihr Volumen bestimmt und ihre Heparinaktivität gemessen.

Der auf dem Drahtsieb verbleibende nasse Organrückstand wird erneut mit 4O⁰G warmer, 6 % Kochsalz enthaltender

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0,25 η Natronlauge vermischt, wobei wieder ein Extraktionsvolumen von 3,2 Liter eingestellt wird. Die zweite Extraktion der bereits einmal extrahierten Organmasse wird auf die beschriebene Weise vorgenommen. Das bei der zweiten Extraktion der ersten Portion Organkonzentrat anfallende FiItrat wird .mit .der zweiten Portion des getrockneten Konzentrates vermischt. Das Extraktionsvolumen wird wieder auf 3,2 Liter eingestellt.

Die folgenden Schritte sind sinngemäß die gleichen. Im Endergebnis wird eine diskontinuierliche Gegenstromextraktion in fünf Schritten durchgeführt, Das Extraktionsvolumen beträgt immer 3,2 Liter, die Temperatur 40⁰C.

Volumen und Heparinaktivität der gesammelten Extrakte sind in folgenderTabelle angegeben.

Kr.	Volumen des	Aktivität	Heparingehalt
	Filtrates ml	(IE/ml)	(MIE)
I	1770	83	0,147
II	1810	118	0,214
III	1790	133	0,238
IV	1750	140	0,245
V	1800	143	0,257
VI	1770	153	0,271
VII	1800	153	0,275
VIII	1780	152	0,271
IX .	1815	149	0,270
X/l	1790	153	0,274
X/2	1800	52,5	0,095
X/3	1850	16,4	0,030
X/4	1830	5,2	0,009
X/5	1780	1,8	0,003

Insgesamt . 2,599

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Wie die Daten der Tabelle zeigen, können aus 5»-O kg des 90»4 % Trockensubstanz enthaltenden Ausgangsstoffes durch diskontinuierliche Extraktion in fünf Stufen 2,599 MIE Heparin gewonnen werden. Wie die einzelnen Schritte bei der Extraktion der zehnten Portion zeigen, war die Extraction erschöpfend. Die Ausbeute is"fc praktisch gleich der des Beispiels 5 (98,3 %).

Beispiel 5

Der gleiche Ausgangsstoff wird in dem U-Extraktor gemäß der ungarischen Patentschrift 159 977 im Gegenstrom kontinuierlich extrahiert..

Das getrocknete Rohmaterial wird kontinuierlich mit dem Schneckendosierer der Vorrichtung dosiert. Aus dem über dem Dosierer angebrachten Sprühkopf wird das doppelte Volumen an 70⁰C warmer, 6 % Kochsalz enthaltender 0,55 η Natronlauge zugesetzt. Das Material hat in dem Schneckendosierer eine Verweilzeit von 10 Minuten.

Im Gegenstrom zu dem in den einzelnen Zellen des U-Extraktors befindlichen gequollenen Material wird 6 % Kochsalz enthaltende OmI η Natronlauge geführt. Während der kontinuierlichen Gegenstromextraktion wird eine Temperatur von 50 C aufrechterhalten. Zur Verbesserung des Stoffaustausches wird der am Boden des U-Extraktors befindliche Vibrator eingeschaltet.

Das Volumen des kontinuierlich anfallenden, hell strohgelben, fast völlig klaren Extraktes wird mit dem Rotameter gemessen. Die Heparinkonzentration wird durch halbstündliche Probenahme bestimmt.

Der Heparingehalt des Extraktes wird - ebenfalls kontinuierlich - ausgefällt, der entstehende Niederschlag wird

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mit einem Trommelfilter abgetrennt.

Die verwendete Vorrichtung hat eine Kapazität von 10 kg Trockenkonzentrat pro Stunde, die Verweilzeit beträgt 35 Minuten. In 10 stündigem Betrieb werden 210 Liter Extrakt gewonnen, das eine durchschnittliche Heparinaktivität von 252 ΙΕ/ml hat. Auf 100 g 90,4 % Trockensubstanz enthaltendes Ausgangsprodukt bezogen ist das eine Ausbeute von 52,9 MIE.

Der extrahierte nasse Rückstand wurde auf seine Heparinakti tat untersucht. Es wurde festgestellt, daß die Gegenstromextraktion mit Verlusten von weniger als 2 % ausgeführt werden kann.

Der Rückstand ist infolge seines hohen Eiweißgehaltes als Viehfutter geeignet.

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Claims

-is- 219786 Erfindungsanspruch

1· Verfahren zur Herstellung von wenigstens 120 ΙΕ/ml Heparin, daneben nur wenig Fette und sonstige Verunreinigungen enthaltenden wäßrigen Extraktion konstanter Zusammensetzung, gekennzeichnet dadurch, daß man 90-95 % Trockensubstanz enthaltendes, heparinreiches, amorphes, körniges, formbeständiges Rohmaterial hoher spezifischer Oberfläche in wäßrigem Medium bei für das jeweilige Aufarbeitungssystem und den Rohstoff optimalen Temperatur und pH-Werten einer diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Gegenstromextraktion mit Salzwasser unterzieht.

2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man die Gegenstromextraktion bei 20-8O⁰C vornimmt«

3· Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man die Extraktion bei einem Elektrolytgehalt (Salzgehalt) von 1,5-12,0 % vornimmt.

4· Verfahren nach Punkt 1 bis e* gekennzeichnet dadurch, daß man die Extraktion im pH-Bereich von 8 bis 12,8 beziehungsweise in 0,5 bis 1,0 η Alkalilauge vornimmt.

5· Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet...dadurch, daß man während der Extraktion das Verhältnis zwischen extrahierender Flüssigkeit und zu extrahierendem Material so einstellt, daß Extrakt mit einem Heparingehalt von wenigstens 150 ΙΕ/ml entsteht.

6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5» gekennzeichnet dadurch, daß man die Gegenstromextraktion diskontinuierlich bis zur Erschöpfung vornimmt.

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7» Verfahren nach Punkt 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß man die Gegenstromextraktion kontinuierlich, in
einem in Zellen unterteilten U-Extraktor, zweckmäßig unter Anwendung von Vibration vornimmt,

8« Verfahren m^Ii ^unkt 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß man die Extraktion in einer einzigen Vorrichtung vornimmt, .