DE3485948T2

DE3485948T2 - Hepatitis-a-untereinheit-antigen.

Info

Publication number: DE3485948T2
Application number: DE8484402025T
Authority: DE
Inventors: Joseph V Hughes; Edward M Scolnick; Joanne E Tomassini
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1983-10-14
Filing date: 1984-10-09
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2004-10-10
Also published as: US4614793A; DE3485948D1; EP0138704A3; EP0138704B1; EP0138704A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Hepatitis A ist eine Leberkrankheit, die, obwohl sie im allgemeinen nicht tödlich endet, lange Perioden einer entkräftenden Krankheit hervorrufen kann. Diese Krankheit wird im allgemeinen durch direkten Kontakt mit einer infizierten Person oder durch mit Hepatitis A Virus (HAV) kontaminierten Trinkwasser und/oder Lebensmitteln übertragen.
Im Stand der Technik werden das Protein oder die Proteine des HAV (Hepatitis A Virus) nicht identifiziert, die neutralisierende Antikörper gegen dieses Virus induzieren. Einer der größten Nachteile bei der Untersuchung der protektiven Antigenizität der HAV-Proteine war der Mangel an genügenden Mengen von HAV und seiner Polypeptidkomponenten. Das Virus wird in sehr kleinen Mengen in Zellkulturen gebildet, hat eine begrenzte Zahl von Wirtstieren und ist aus infizierten Zellkulturen und aus tierischem Gewebe schwierig zu reinigen.
Um eine Untereinheitvakzine gegen HAV herzustellen, ist es erforderlich, entweder sämtliche Proteine oder Polyeptide des Virus zu identifizieren, die schützende oder das Virus neutralisierende Antikörper induzieren und/oder daran binden können.
Die Existenz von vier verschiedenen Polypeptiden im HAV wurde aufgrund von Studien berichtet, welche die Elektrophorese von aufgeschlossenem, mit radioaktiven Jod jodiertem HAV verwendeten; Tratschin et al., J. Virol. 38: 151-156 (1981); Coulepis et al., Intervirology 18: 107-127 (1982).

ZIELE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG

Es ist folglich ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Strukturprotein des HAV, auf das im Folgenden als VP-1 Bezug genommen wird, zu identifizieren, das als wichtigstes virales Antigen wirkt, welches an die neutralisierenden Antikörper gegen HAV bindet. Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, eine Methode zur Isolierung dieses Strukturproteins zur Verfügung zu stellen. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine Methode für die Verwendung dieses Strukturproteins zur Immunisierung eines beeinflußbaren Wirts gegen HAV zur Verfügung zu stellen. Noch ein weiteres Ziel ist es, eine Hybridoma-Zelle zur Verfügung zu stellen, die monoklonale Antikörper produziert, welche die Infektivität des HAV neutralisieren. Noch eine weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein diagnostisches Reagens zur Verfügung zu stellen, das diese monoklonalen Antikörper enthält. Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Strukturprotein (VP-1) des HAV wurde isoliert. Dieses Protein weist ein Molekulargewicht von 33 000 Dalton auf und ist an der äußeren Oberfläche des Virus lokalisiert. VP-1 reagiert hoch empfindlich mit HAV-Immunseren von mehreren infizierten Wirten, einschließlich solcher vom Menschen. Die Stellen für die Bindung der monoklonalen neutralisierenden Antikörper an das HAV befinden sich am VP-1. Eine Aminosäurenanalyse von VP-1 wurde durchgeführt und eine Aminosäurenteilsequenz durch Peptidspaltung von VP-1 mittels Bromcyan wurde erhalten. Das VP-1 des HAV ist in serologischen Untersuchungen auf HAV-Antikörper und für die Herstellung einer Polypeptid-Untereinheitvakzine gegen HAV verwendbar.
Die Hybridoma-Zellen werden aus einer Fusion einer Myelomzellinie mit Milzzellen, mit HAV oder VP-1 immunisiert, selektiert. Diese Hybridoma-Zellen wurden bis zur Homogenität geklont und die erhaltenen monoklonalen Antikörper neutralisieren die Infektivität des Virus und binden es, sie sind an VP-1 orientiert (siehe oben). Einige der monoklonalen Antikörper konkurrieren auch mit polyklonalen Antikörpern gegen HAV, die aus Seren von mit HAV infizierten Menschen stammen. Diese monoklonalen Antikörper können für einen diagnostischen Schnelltest verwendet werden, um die Gegenwart von Antikörpern gegen HAV zu messen und sie können auch die Gegenwart von neutralisierenden Antikörpern messen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

HAV wird in vitro in einem beeinflußbaren Gewebekultursystem, beispielsweise in Affennieren- oder Affenleberzellen, gezüchtet. Die Zellen werden aufgeschlossen, die Zelltrümmer werden entfernt, beispielsweise mittels niedertouriger Zentrifugation, und das Virus wird aus der überstehenden Flüssigkeit isoliert. Die virushaltigen Fraktionen werden gesammelt und gereinigt.
Die mit dem Virus infizierten Zellen können durch Lysis und Beschallung in Gegenwart eines nichtionischen Surfactants und eines hypotonischen Puffers aufgeschlossen werden. Geeignete nichtionische Surfactants sind Polyoxyethylenalkylphenole mit etwa 4 bis etwa 30 Oxyethyleneinheiten und einer Alkylgruppe von etwa 6 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen, von denen ein spezielles Beispiel Polyoxyethylen(9)octylphenol ist; Polyoxyethylen-sorbitan-fettsäureester mit etwa 4 bis etwa 30 Oxyethyleneinheiten und einer Fettsäure von etwa 12 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen, von denen einige spezielle Beispiele Polyoxyethylen(4)-sorbitan-monolaurat, Polyoxyethylen(4)-sorbitan-monostearat, Polyoxyethylen(5)sorbitan-monooleat, Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monostearat, Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monopalmitat, Polyoxyethylen- (20)-sorbitan-monooleat, Polyoxyethylen(20)-sorbitantrioleat und Polyoxyethylen(20)-sorbitan-tristearat sind; Polyoxyethylen-sorbitester von Fettsäuren mit etwa 12 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen, von Fettsäuregemischen und Harzsäuren, von Lanolin, von Bienenwachs und von Talgfettsäuren, von denen einige spezielle Beispiele Polyoxyethylensorbit-oleat, Polyoxyethylen-sorbit-tallöl, Polyoxyethylensorbit-laurat, Polyoxyethylen-sorbit-hexaoleat und ein Lanolinderivat von Polyoxyethylen-sorbit sind; Polyoxyethylen-säuren mit etwa 8 bis etwa 50 Oxyethyleneinheiten und einer Fettsäure mit etwa 12 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen, von denen einige spezielle Beispiele Polyoxyethylen(8)-laurat, Polyoxyethylen(8)-stearat, Polyoxyethylen(20)-palmitat, Polyoxyethylen(40)-stearat und Polyoxyethylen(50)-stearat sind; und Polyoxyethylen-alkohole mit etwa 2 bis etwa 25 Oxyethyleneinheiten und einem Alkohol von etwa 12 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen,von denen einige spezielle Beispiele Polyoxyethylen(2)-cetylether, Polyoxyethylen(2)-oleylether, Polyoxyethylen(2)-stearylether, Polyoxyethylen(4)-laurylether, Polyoxyethylen(6)tridecylether, Polyoxyethylen(10)-cetylether, Polyoxyethylen(10)-oleylether, Polyoxyethylen(10)-stearylether, Polyoxyethylen(12)-tridecylether, eine Harnstoffkomplex von Polyoxyethylen(12)-tridecylether, Polyoxyethylen(15)-tridecylether, Polyoxyethylen(20)-cetylether, Polyoxyethylen- (20)-oleylether, Polyoxyethylen(20)-stearylether und Polyoxyethylen(23)-laurylether sind; oder Desoxycholin. Polyoxyethylen(9)-octylphenol ist ein bevorzugter Surfactant.
Die Zelltrümmer, die von den beschallten Zellen stammen, können beispielsweise durch niedertourige Zentrifugation entfernt werden. Das Virus kann aus der überstehenden Flüssigkeit mittels verschiedener Methoden isoliert und gereinigt werden, beispielsweise mittels Zentrifugation, Säulenchromatographie oder Immunaffinitätschromatographie.
Das gereinigte Virus wird weiter behandelt, um die wichtigsten Proteine zu isolieren und aufzutrennen. Die Isolierung kann mittels Elektroelution aus Gelen, Säulenchromatographie oder Immunaffinitätschromatographie erfolgen.
Drei Hauptproteine des HAV können leicht durch Gelelektrophorese aufgetrennt werden, wonach sie mit einem nichtionischen Surfactant solubilisiert werden, vorzugsweise in Gegenwart eines Reduktionsmittels. Der nichtionische Surfactant kann ein Alkalimetallsalz eines Alkylsulfats mit etwa 10 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen sein, beispielsweise das Natriumsalz von Decylsulfat, Dodecylsulfat oder von Octadecylsulfat. Das Reduktionsmittel kann 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol sein. Eines der Hauptproteine, ein Protein mit 33 000 Dalton, VP-1, wird viel stärker mit J¹²&sup5; markiert als die beiden anderen, was anzeigt, daß es ein Protein der äußeren Oberfläche ist. Eine Bromcyanspaltung von VP-1 ergibt zwei große Polypeptidfragmente von etwa 20 000 und etwa 14 000 Dalton. Eine wiederholte Spaltung mit Bromcyan ergibt mindestens vier zusätzliche kleinere Fragmente.
VP-1 wurde isoliert und nach saurer Hydrolyse auf seine Aminosäurenkonzentration analysiert. Es enthielt folgende Aminosäuren in der ungefähren Reihenfolge der abnehmenden Gewichtsprozentanteile: Glycin, Serin, Glutaminsäure und/oder Glutamin, Asparaginsäure und/oder Asparagin, Alanin, Threonin, Leucin, Valin, Lysin, Prolin, Phenylalanin, Arginin, Isoleucin, Tyrosin, Histidin und Methionin.
Die vorerwähnten Aminosäuren liegen etwa in den folgenden Gewichtsprozentanteilen vor:
Glycin von etwa 21% bis etwa 30%,
Serin von etwa 9% bis etwa 11%,
Glutaminsäure und/oder Glutamin von etwa 8% bis etwa 10,5%,
Asparaginsäure und/oder Asparagin von etwa 7,2% bis etwa 10%,
Alanin von etwa 6% bis etwa 7,3%,
Threonin von etwa 4,9% bis etwa 8,2%,
Leucin von etwa 4,9% bis etwa 7,2%,
Valin von etwa 4% bis etwa 5,4%,
Lysin von etwa 3,7% bis etwa 4,3%,
Prolin von etwa 3,2% bis etwa 5,3%,
Phenylalanin von etwa 3% bis etwa 4,5%,
Arginin von etwa 2% bis etwa 4,1%,
Isoleucin von etwa 2% bis etwa 3,6%,
Tyrosin von etwa 2,0% bis etwa 3,0%,
Histidin von etwa 1,3% bis etwa 1,9%, und
Methionin von etwa 0,3% bis etwa 0,9%.
Aufgrund der Methode, die für die Isolierung der Proteine die Gelelektrophorese verwendet, und aufgrund der Bedingungen der Hydrolyse während der Analyse ist, wie erwähnt werden muß, die oben genannte Zahl für Glycin zu hoch, die für Methionin zu niedrig, und es wurden keine Werte für Cystein und Tryptophan wahrgenommen, die beide im Polypeptid enthalten sind.
Die Bromcyanspaltung von VP-1 ergibt, wie bereits vorher erwähnt, mindestens sechs Fragmente. Mittels einer HPLC- Analyse wurde gefunden, daß diese Fragmente die folgenden Aminosäurensequenzen in der Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus des Peptids enthielten, wobei die in Klammern gesetzten Aminosäurereste aus der Nucleotidsequenz abgeleitet werden:

Sequenz

I Val-Gly-Asp-Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-(Ser)-Thr-Thr
II (Met)-Lys-Asp-Leu-Lys-Gly-Lys-Ala-Asn-Arg-Gly-Lys
III (Met)-(Asp)-Val-Ser-Gly-Val-Gln-Ala-Pro-Val-Gly-Ala- Ile-Thr-Thr-Ile-Glu-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Lys- Lys-Val-Pro-Glu-Thr-Phe
IV (Met)-Gly-Arg-Ser-(His)-Phe-Leu-(Cys)-(Thr)-Phe-Thr- Phe-Asn-(Ser)-Asn-(Asn)-(Lys)-(Glu)-Tyr
V (Met)-Ala-(Trp)-Phe-Thr-Pro-Val-Gly-Leu-Ala-Val-Asp- Thr-Pro
Man glaubt, daß diese Sequenzen in der obigen Reihenfolge im VP-1-Protein enthalten sind,
VP-1 kann als Vakzine verwendet werden, wenn es in einen physiologisch annehmbaren Träger, beispielsweise in eine physiologische Kochsalzlösung, eingebracht wird, um neutralisierende Antikörper zu induzieren, wenn es an eine beeinflußbare Säugetierspezies, beispielsweise an Ratten, in einer Menge von etwa 5 bis etwa 150 ug je Dosis, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 50 ug je Dosis, verabreicht wird. Eine oder mehrere Dosen können verabreicht werden, um einen effektiven Schutz gegen HAV-Erkrankungen zu erreichen. Die Vakzine kann per Injektion, vorzugsweise intramuskulär, verabreicht werden.
Um monoklonale Antikörper gegen HAV zur Verfügung zu stellen, werden auf die übliche Weise erhaltene und mit gereinigtem HAV oder VP-1 in vivo oder in vitro immunisierte Milzzellen von Säugetieren, beispielsweise von Mäusen oder Ratten, mit einer Säugetier-Myelomzellinie fusioniert, üblicherweise von der selben Spezies, die für die Gewinnung der Milzzellen verwendet wurde, was aber nicht unbedingt erforderlich ist. Die gebildeten Hybridome-Zellen werden nach ihrer Fähigkeit selektiert, Antikörper zu bilden, die HAV binden und die HAV-Infektivität neutralisieren, was mit einem in-vitro-Assay bestimmt wird. Die selektierten Hybridoma-Zellen werden subkloniert, um monoklonale Zellinien zur Verfügung zu stellen, welche neutralisierende Antikörper gegen HAV produzieren. Fab-Fragmente werden aus den gereinigten monoklonalen Antikörpern mittels Standardverfahren (Papain-Verdauung) hergestellt und werden mit dem gesamten HAV chemisch quervernetzt. Die neutralisierenden monoklonalen Antikörper werden hoch spezifisch an das VP-1 des HAV gebunden, wie man mit Gelanalyse anschließend an die Quervernetzung feststellen konnte. Diese monoklonalen Antikörper können in einem diagnostischen Schnelltest verwendet werden, um die Gegenwart von Antikörpern gegen HAV zu messen, und sie können auch die Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern messen. Ein Immunserum von infizierten Tieren oder Menschen reagiert mit denaturiertem VP-1, wenn es mit einer Standard-Western-Blot- oder Immuno- Blot-Analyse untersucht wird (nämlich anschließend an die Geltrennung der HAV-Proteine und an den Transfer auf Nitrocellulosepapier).
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch zu begrenzen.

BEISPIEL 1

Züchtung und Reinigung des Hepatitis A Virus

Der Hepatitis A Virus wurde in einer kontinuierlichen Affennierenzellinie unter Verwendung der nachstehenden Methode, die auf der im U.S. Patent 41 64 566 beschriebenen basiert, gezüchtet.
HAV wurde nach 21- bis 28-tägigem Wachstum aus in Rollerflaschen infizierten Kulturen einer kontinuierlichen Affennierenzellinie, LLC-MK2, durch Abschaben der Zellen von der Oberfläche der Flasche, in der sie kultiviert wurden, und durch Abtrennung der Zellen mittels Zentrifugation (800·g, 10 Minuten, 4ºC) isoliert. Das Pellet der Zellen wurde dann in einem Lysispuffer (10mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM NaCl; 1,5 mM MgCl&sub2;; 1% Polyoxyethylen(9)-octylphenol) resuspendiert, wobei 5 ml des Puffers pro Pellet von zwei Rollerflaschen von 850 ccm verwendet wurden. Die Zellysate wurden dann 20 Sekunden lang in einem Ultraschallgerät mit einer hohen Einstellung beschallt und anschließend auf Eis 10 Minuten lang inkubiert. Die Beschallung wurde dann für 20 Sekunden mit der gleichen Einstellung wiederholt. Die Zellen wurden dann weitere 20 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation mit 10 000·g über 20 Minuten bei 10ºC pelletiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde sorgfältig entfernt und Sarkosinnatrium (SLS) wurde aus einer 20%igen Vorratslösung bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,5% zugegeben.
Die überstehende Flüssigkeit, die das Virus enthielt, wurde dann 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, wonach 10 Sekunden lang wie oben beschrieben beschallt wurde. Die das Virus enthaltende überstehende Flüssigkeit wurde dann mit einer Pipette vorsichtig über eine Saccharoseschicht in ein aus Polycarbonat bestehendes Zentrifugierröhrchen überschichtet. Die Saccharoseschichte enthielt 20% Saccharose (frei von Ribonuclease) gelöst in 0,1% SLS und 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl und 1,0 mM EDTA (TNE). Als typisches Beispiel werden 40 ml der das Virus enthaltenden überstehenden Flüssigkeit über 30 ml einer Saccharoseschichte überschichtet und dann in einem Polycarbonatröhrchen von 70 ml eines Beckmann-T-45-Rotors 20 Stunden lang mit 23 000 Umdrehungen/Minute bei 4ºC zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und das virushaltige Pellet in 0,5% SLS in TNE resuspendiert und dann wie oben beschrieben 10 Sekunden lang beschallt.
Das Virus wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und dann weitere 10 Sekunden wie oben angegeben beschallt. Das Virus wurde dann über einen 25%igen bis 45%igen vorgefertigten Cäsiumchloridgradienten überschichtet und 60 Stunden mit 40 000 Umdrehungen/Minute und bei 8ºC zentrifugiert (100 ml des Gradienten für die Virusmenge aus 10 Rollerflaschen in einem Beckmann T-45 Rotor; die Cäsiumchloridlösung war in TNE und 0,1% SLS hergestellt worden).
Fraktionen von 2,5 ml wurden vom Boden des Gradienten entnommen und auf Hepatitis-A-virales Antigen mittels eines RIA-Assays untersucht und der Refraktionsindex bestimmt, um den infektiösen HAV-Peak bei 1,34 g/ml zu lokalisieren. Der Peak wurde gepoolt (von 1,33 bis 1,35 g/ml), auf das 20fache mit 0,1% SLS in TNE verdünnt und durch 10stündige Zentrifugation mit 40 000 Umdrehungen/Minute bei 4ºC in einem Beckmann T-45 Rotor ein Pellet erhalten. Dieses endgültige virushaltige Pellet wurde in TNE mit 0,1% SLS gelöst und die Konzentration wurde mittels RIA für virales Antigen bestimmt.

BEISPIEL 2

Radioaktive Markierung des Hepatitis A Virus

Gereinigtes HAV wurde in mehreren verschiedenen Versuchen jodiert, wobei entweder ein Chloramin T- oder ein Lactperoxydase-System verwendet wurden. Mit jeder dieser Methoden wurde VP-1 des HAV stärker markiert als VP-2 oder VP-3.
Wie es für die Reaktion mit Chloramin T typisch ist, wurden 5 bis 20 Mikrogramm HAV, isoliert aus CsCl-Gradienten, wie im Beispiel 1 beschrieben, in einer 60 Sekunden dauernden Reaktion mit Chloramin T (25 Mikrogramm) unter Verwendung eines Phosphatpuffers (0,5 M) und von 1,0 mCi J¹²&sup5; in einem Gesamtreaktionsvolumen von 0,1 ml markiert. Natriumbisulfit (40 Mikrogramm/0,1 ml) wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das mit J¹²&sup5; markierte HAV wurde dann von dem nicht umgesetzten J¹²&sup5; chromatographisch an einer Säule (14 ml; 1,3·15 cm: Weite·Höhe) mit quervernetztem Dextran ((Sephadex G-100) abgetrennt. Die Fraktionen des Leervolumens, welche die markierten Virions enthielten, wurden mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert, wobei das von Laemmli et al. beschriebene (Nature, London, 277: 680-685, 1970) diskontinuierliche Gelsystem mit den folgenden Modifikationen verwendet wurde: Ein Trenngel mit 15% Acrylamid-3,5 M Harnstoff und ein Konzentrationsgel mit 5% Acrylamid-3,5 M Harnstoff wurden verwendet, um die Hauptstrukturproteine des HAV zu trennen. Die Hauptbanden, die nach Anfärbung mit Coomassie-Blau oder Silbernitrat aufgetrennt wurden, lagen bei 33 000 Dalton (VP-1), 29 000 Dalton (VP-2) und 27 000 Dalton (VP-3) und waren etwa in den gleichen Mengen vorhanden. Man fand, daß manchmal andere Nebenbanden in den Bereich von 28 bis 30 kD und von 24 bis 26 kD und in höhere Bereiche des Molekulargewichts (60 kd) wandern. Obwohl die Haupstrukturproteine des HAV in ungefähr den gleichen Mengen, basierend auf der Proteinkonzentration, vorlagen, war es ohne weiteres augenscheinlich, daß VP-1 viel stärker mit J¹²&sup5; markiert war als VP-2 oder VP-3. (VP-3 war stärker markiert als VP-2).
Die zweite Markierungsmethode benutzte das Enzym Lactoperoxydase, um intaktes HAV mit J¹²&sup5; radioaktiv zu markieren. Da dieses Enzym nicht in die intakten Teile des Virions eindringen kann, sollten nur die Proteine an der Oberfläche einer Markierung zugänglich sein. Für diese Reaktion wurden 10 ug des gereinigten HAV lyophilisiert und dann in 0,2 M Natriumacetatpuffer (pH 5,6) bis zu einer Konzentration von 10 ug/75 ul gelöst. 100 ug Lactoperoxidase, die 6-8 Einheiten der Enzymaktivität enthalten, wurden in einem Natriumacetatpuffer (pH 5,6) gelöst und zum HAV zusammen mit 1 mCi von J¹²&sup5; zugegeben. Um die Reaktion zu starten, wurden 10 ul von 1:3.600 verdünnten 50%igen H&sub2;O&sub2; (H&sub2;O als Verdünnungsmittel) zugegeben und die Mischung wurde 5 Minuten inkubiert. H&sub2;O&sub2; (10 ul) wurde noch dreimal zugegeben und nach jeder Zugabe wurde 5 Minuten inkubiert. Um die Reaktion zu beenden, wurden 300 ul NaJ (10 mg/ml) zugegeben und das markierte Material wurde über eine Säule mit quervernetzter Agarose (Sepharose CL6B) chromatographiert, um das J¹²&sup5;-HAV von der radioaktiv markierten Lactoperoxidase und vom freien Jod zu trennen. Wenn das markierte HAV an SDS-PAGE analysiert wurde, war wieder zu sehen, daß das 33kD-Protein (VP-1) viel extensiver markiert wurde als die 29 oder 27 kD-Proteine.
Diese zwei verschiedenen Markierungsverfahren zeigen beide, daß VP-1 das am besten zugängliche Protein für die radioaktive Markierung von der Oberfläche des Virus ist.

BEISPIEL 3

Isolierung und Charakterisierung der Virusproteine

Das 33kd-Protein, VP-1, wurde aus HAV isoliert, indem zuerst das Virus in einem Probenpuffer (wie von Laemmli beschrieben, die Referenz ist im Beispiel 2 angegeben) solubilisiert und die einzelnen Virusproteine auf einem Polyacrylamidgel wie im Beispiel 2 beschrieben aufgetrennt wurden. Nach der Elektrophorese wurde VP-1 von dem Gel nach folgendem Verfahren, das auf dem von Hunkapiller et al., 227-236, Methods in Enzymology, Vol. 91, Academic Press, New York, New York, 1983, beschriebenen basiert.
VP-1 wurde in nicht fixierten Gelen nach der Elektrophorese durch gleichzeitige Elektrophorese von mit J¹²&sup5; markiertem HAV und mit unmarkierten HAV lokalisiert und durch Exposition der Gele auf einen Röntgenfilm die Anordnung jedes Proteins bestimmt. Die Banden des Gels, die VP-1 enthielten, wurden mit einer losen Rasierklinge von dem Gel abgeschabt und in 10 mM Ammoniumbicarbonat (AB), 2,0% SDS, 1,5 mM Dithiothreitol 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4ºC inkubiert. VP-1 wurde dann von den Gelscheiben und dem Inkubationspuffer elektroeluiert, indem beide in einen Probenbecher des ISCO-Konzentrators, Modell 1750, gegeben und einer 4 bis 5stündigen Elektrophorese bei 3 Watt/Probe unterworfen wurden. 50 mM AB, 0,1% SDS wurden in der Elektrode und in den inneren Kammern verwendet. Laden, Elektrophorese und Entladen der Proben war in der Betriebsvorschrift für dieses Instrument beschrieben. Anschließend an die Elektroelution wurde VP-1 gegen dest. H&sub2;O dialysiert, wobei dest. H&sub2;O viermal innerhalb von 24 Stunden gewechselt wurde (ungefähr 1 ml der VP-1 Lösung auf 500 ml dH&sub2;O). VP-1 wurde dann getrocknet und entweder seine Reinheit (auf SDS-Gelen, wie im Beispiel 2 beschrieben) oder seine Aminosäurenkonzentration analysiert oder es wurde einer Sequenzanalyse unterworfen.
Die Aminosäurenkonzentrationen wurden nach 20stündiger Hydrolyse von VP-1 mit 6 molarer HCl bestimmt und wurde auf einem Beckmann Analysator, Modell 121, durchgeführt, wie von Poe at al. (J. Biol. Chem. 258: 2209-2216, 1983) und Spiess et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 2974-2978, 1979) beschrieben. Die Aminosäurenkonzentrationen werden in Tabelle 1 gezeigt. =TABELLE 1 Aminosäurenkonzentrationen nach der sauren Hydrolyse von VP-1 des HAV Aminosäure Versuch No. 1 (%) Glycin Serin Glutaminsäure und/oder Glutamin Asparaginsäure und/oder Asparagin Alanin Threonin Leucin Valin Lysin Prolin Phenylalanin Arginin Isoleucin Tyrosin Histidin Methionin
Für die Sequenzanalyse wurde VP-1 mit Bromcyan gespalten, da Vorversuche anzeigten, daß dieses Virusprotein scheinbar einen blockierten Aminoterminus aufweist. VP-1, 10 bis 40 ug, wurde in 70%iger Ameisensäure gelöst, ungefähr in 1 ml, und Bromcyan wurde in einem 40-fachen Gewichtsüberschuß zugegeben und mit dem Virus 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das aufgespaltene Protein wurde dann einer Sequenzanalyse in einem Gas-Flüssigkeit- Festphasen Sequenziergerät unterworfen, wie es von Hewick et al. (J. Biol. Chem. 256; 7990-7997, 1981) beschrieben wurde. Die nachstehenden Aminosäurensequenzen wurden erhalten, mit Ausnahme der Aminosäurereste in Klammern, die von der Nucleotidsequenz abgeleitet wurden:

Sequenz

I Val-Gly-Asp-Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-(Ser)-Thr-Thr
II (Met) -Lys-Asp-Leu-Lys-Gly-Lys-Ala-Asn-Arg-Gly-Lys
III (Met)-(Asp)-Val-Ser-Gly-Val-Gln-Ala-Pro-Val-Gly-Ala- Ile-Thr-Thr-Ile-Glu-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys- Val-Pro-Glu-Thr-Phe
IV (Met)-Gly-Arg-Ser-(His)-Phe-Leu-(Cys)-(Thr)-Phe-Thr- Phe-Asn-(Ser)-Asn-(Asn)-(Lys)-(Glu)-Tyr
V (Met)-Ala-(Trp)-Phe-Thr-Pro-Val-Gly-Leu-Ala-Val-Asp- Thr-Pro
Man nimmt an, daß diese Sequenzen in der obigen Reihenfolge im VP-1-Protein enthalten sind, wobei das Protein mit Val der Sequenz I startet.
Die Angaben über die Sequenzen wurden erhalten, indem die rohen Daten des Sequenziergeräts mit den Nukleotidsequenzen, die durch Sequenzierung der DNA von cDNA-Kopien des HAV-Genoms erhalten wurden, verglichen wurden. Die letztgenannte Arbeit wird in der gleichzeitig anhängigen U.S.A.-Patentanmeldung, Ser. Nr........., die gleichzeitig mit der vorliegenden CIP-Anmeldung, Patentanwaltsakte 17011, Erfinder Linemeyer, Menke, Mitra und Reuben, beschrieben und beansprucht; sie wurde auf den gleichen Rechtsnachfolger übertragen und ihre Beschreibung wird hiermit als Referenz inkorporiert. Es folgt nun die partielle Nukleotidsequenz des HAV, einschließlich der Nucleotidsequenz des VP-1-Genoms, und ihre entsprechende Aminosäurensequenz:
worin das Triplett MAA entweder CAA oder GAA bedeutet.
Da HAV ein RNA-Virus ist, muß man verstehen, daß die obigen Nukleotide, die mit dem Buchstaben "T" bezeichnet sind, was Desoxythymidinphosphat bedeutet, in Wirklichkeit Uridinphosphat ist, das üblicherweise mit dem Buchstaben "U" bezeichnet wird. Die unterstrichenen und numerierten Sequenzen bezeichnen die Nukleotidsequenzen, die den in ähnlicher Weise numerierten Seqenzen auf Seite 16 entsprechen.

BEISPIEL 4

Immunisierung von Mäusen mit gereinigtem Hepatitis A Virus

Erwachsenen Balb/c Mäusen wurde intraperitoneal gereinigtes Gesamt-HAV, wie es gemäß Beispiel 1 erhalten wurde, injiziert. Jede Maus erhielt 5 ug gereinigtes HAV, in 5 ml von kompletten Freundschen Adjuvans gelöst. Das Serum von einem Auge jeder Maus wurde 18 Tage nach der Injektion des Virus entnommen und nach Antikörpern gegen HAV mittels eines kompetitiven Standard-RIA-Assays (HAVAB, Abbott) und mittels eines Neutralisations-Assays (wie unten beschrieben), getestet; das Serum, das vor der Injektion des Virus entnommen worden war, diente für diese Analysen als Kontrolle.
Die Mäuse, die sowohl im RIA (wie im Beispiel 7 beschrieben) als auch in Neutralisations-Assays (wie im Beispiel 8 beschrieben) positiv für Anti-HAV-Antikörper waren, wurden 3 Tage vor der Zellfusion durch Injektion von 3,5 ug gereinigtem HAV in die Schwanzvene (in wäßriger Lösung, 0,2 ml/Maus) geprimed. Das nach dem Tod der beiden Tiere entnommene Serum, das für die Zellfusion verwendet wurde, wurde auf Antikörper gegen HAV (HAVAB, Abbott) und auf neutralisierende Aktivitäten untersucht und es wurde als positiv befunden.

BEISPIEL 5

Herstellung von Hybridomen durch Fusion von Milzzellen immuner Mäuse mit Myelomzellen von Mäusen

Myelomzellen von Mäusen (SP 2/0) aus gefrorenem Stammvorrat wurden in HT-Medium gezüchtet. Je 100 ml des HT-Mediums enthielten 66 ml von Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium; 20 ml fötales Kälberserum (FCS); 10 ml von NCTC 109 mit Eagle's Medium; 2 ml von 200 mM L-Glutamin; 1 ml einer Lösung von 408 mg Hypoxanthin und 114 mg Thymidin in 300 ml destilliertem Wasser; 1 ml einer OPI-Vorratslösung (1,5 g cis-Oxalessigsäure, 0,5 g Brenztraubensäure, 2000 Einheiten Rinderinsulin in 100 ml Wasser) und 0,2 ml einer Mischung von Penicillin (10 000 Einheiten/ml) und Streptomycin (10 000 ug/ml). Milze von Mäusen, die mit HAV immunisiert waren (Beispiel 4), wurden nach Genickschlag entnommen und bei Raumtemperatur in serumfreies HT-Medium gegeben. Die Milze wurde in Petrischalen aus Kunststoff gelegt und die Zellen wurden mit einem Kunststoffschaber von den Milzen abgefasert. Die Schalen wurden mit 5 ml serumfreien HT- Medium gewaschen und die Zellen wurden in ein konisches Kunststoffröhrchen von 15 ml gesammelt; große Teilchen ließ man eine Minute absetzen. Der Überstand wurde dann in ein Kunststoffröhrchen von 15 ml mit rundem Boden überführt und die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 350·g über 10 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in serumfreiem HT Medium (10 ml/2 Milze) resuspendiert und die Gesamtheit der lebensfähigen Zellen wurde durch Trypanblau-Ausschluß bestimmt.
Die Zahl der lebensfähigen SP 2/0 Myelomzellen wurde ebenfalls bestimmt und die Zellen wurden vereint, wobei eine Zehnerpotenz mehr Milzzellen als Myelomzellen verwendet wurde (das heißt in ein Kunststoffröhrchen von 50 ccm mit einem Schraubdeckel wurden 2·10&sup8; Milzzellen und 2·10&sup7; SP 2/0 Zellen eingebracht). Die Zellen wurden 10 Minuten bei 350·g zentrifugiert und dann wurden die Zellpellets in 10 ml serumfreien HT Medium resuspendiert. Dieser Arbeitsgang des Pelletierens und Waschens durch Resuspendieren wurde noch zweimal wiederholt und nach der letzten Resuspendierung in 10 ml serumfreien HT-Medium wurden die Zellen in ein Röhrchen von 15 ml mit rundem Boden überführt.
Die Zellen wurden bei 350·g 10 Minuten lang pelletiert.
Polyethylenglycol (PEG; durchschnittliches Molekulargewicht von 1000 D) wurde bei 45ºC verflüssigt und mit dem serumfreien HT Medium bis zu einer Konzentration von 35% PEG (Vol./Vol.) vereinigt. Die Mischung des PEG/HT Mediums wurde durch Filtrieren über ein Membranfilter von 0,22 Mikron, das am Ende einer 3 ml Injektionsspritze angebracht war, sterilisiert; das PEG wurde dann bei 37ºC gehalten. Dimethylsulfoxid (DM50) wurde dann zu der Mischung PEG/ Medium bis zu einer Endkonzentration von 5% hinzugefügt. Die Mischung von PEG/DMSO/HT-Medium wurde tropfenweise zu dem Milz-Myelomzellpellet unter Verwendung von 0,8 ml für 2·10&sup8; Zellen zugegeben, wobei die Zellen vorsichtig durch Antippen an die Wand des Kulturröhrchens und Aufwirbeln der Zellen resuspendiert wurden. Die Zellpellets wurden dann bei 250·g und bei Raumtemperatur zentrifugiert, so daß die gesamte Kontaktzeit der Zellen mit PEG 6 Minuten betrug. Der PEG-Überstand wurde dann abgesaugt und die Zellen in 10 ml HT-Medium resuspendiert. Die Zellen wurden pelletiert (10 Minuten bei 350·g) und vorsichtig in HT Medium bis zu einer Endkonzentration von 3,5·10&sup5; Myelomzellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden dann auf eine 96 Loch- Mikrotiterplatte gebracht, wobei mit einer Pipette 0,1 ml/Loch aufgegeben wurde, und bei 37ºC in einem mit einem Wasserbad stabilisierten CO&sub2; Inkubator mit 5% CO&sub2; und 96% Feuchtigkeit inkubiert.
Nach 24 Stunden wurden 0,1 ml eines HAT-Mediums (HT-Medium plus 0,352 mg/Liter Aminopterin) in jedes Loch zugegeben. Die Löcher wurden alle 4 bis 5 Tage wieder mit 0,1 ml frischem HAT-Medium beschickt.
Einige Zellen aus den mit der Kultur beschickten Löchern, die eine Konfluenz von 15% oder größer aufwiesen (gewöhnlich 40 bis 80%) wurden auf die Produktion von Antikörpern gegen HAV mit dem monoklonalen RIA und mit Neutralisations-Assays, wie weiter unten in den Beispielen 7 und 8 beschrieben, getestet.
Diejenigen Zellen, die in den obigen Assays eine hohe Aktivität aufwiesen, wurden durch zwei Cyklen von begrenzenden Verdünnungen subgeklont. Vier Subklone wurden selektiert, die hohe HAV-bindende und neutralisierende Aktivitäten aufwiesen. Die gereinigten monoklonalen Antikörper aus diesen Subklones wurden mit Standardmethoden hinsichtlich ihrer Zugehörigkeit zu Immunoglobulin- Unterklassen und ihres Molekulargewichts charakterisiert. Die folgenden Resultate wurden erhalten: Monoklonale Antikörper Unterklasse Molekulargewicht (Dalton) Schwere Kette Leichte Kette

BEISPIEL 6

Reinigung monoklonaler Antikörper aus Gewebekulturmedium

Die monoklonalen Antikörper, die bei Quervernetzungsexperimenten, bei Immunfällungen von markiertem HAV und bei anderen Experimenten verwendet wurden, um die neutralisierenden Bereiche auf dem Virus zu identifizieren, wurden aus der Gewebekulturflüssigkeit, die den wachsenden Kulturen der Hybridoma-Zellen, welche die einzelnen Antikörper produzieren, entnommen wurden, gereinigt. Die folgende Methode wurde angewendet, sie ist im Wesentlichen diejenige, die von Emini et al. (J. Virol. 43: 997-1005, 1982) beschrieben wurde. 2 Liter Gewebekulturflüssigkeit von einer speziellen Hybridoma-Zellinie wurden durch Whatman 4M Filtrierpapier, durch eine Glaswolle enthaltende Säule und schließlich durch eine Agarose (Sepharose 6B) enthaltende Säule filtriert. Die Gewebekulturflüssigkeit wurde dann durch Zugabe von 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, auf einen pH von 8,0 eingestellt und dann über eine Protein-A-Sepharosesäule (4 bis 6 ml Säulenvolumen für 2 Liter Flüssigkeit) laufen gelassen. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumen von 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) gewaschen. Glycin (100 ml), pH 3,0, wurde dann zugegeben, um die gebundenen Immunoglobuline von der Säule zu entfernen; die Fraktionen wurden mit 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) auf dem Boden von jedem Röhrchen gesammelt, so daß der pH-Wert von dem sauren pH des Glycins auf einen höheren pH-Wert gebracht wurde, um den Antikörper zu stabilisieren. Die Fraktionen der Proteinpeaks von der Säule wurden gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und entweder als gesamter Antikörper verwendet oder weiterbehandelt, um Fab-Fragmente zu erhalten.
Um Fab-Fragmente der einzelnen monoklonale Antikörper zu erhalten, wurden 10 bis 15 mg des Antikörpers, der unter Verwendung von Protein-A-Säulen wie oben beschrieben gereinigt worden war, lyophilisiert und dann in 100 mM Natriumphosphat und 10 mM Cystein, pH 7,2 (2 ml/20 mg Antikörper) gelöst. 10-15 Einheiten/mg Papain wurden im Gewichtsverhältnis 1:100, Enzym: Antikörper, zugegeben. Diese Reaktion wurde über Nacht 16 Stunden bei 37ºC inkubiert und durch Zugabe von Jodacetamid bis zu einer Endkonzentration von 30 mM beendet. Der verdaute Antikörper wurde dann über eine Säule (2,5·20 cm, Weite·Höhe) mit quervernetztem Dextran (Sephadex G-75) bei 4ºC chromatographiert und die Fraktionen wurden auf eine Absorption von 280 nm als ein Maß für enthaltenes Protein überwacht. Der zweite Peak der Kolonne, der den Großteil der Fab-Fragmente enthielt, wurde gesammelt und dann über eine Protein-A-Sepharosesäule laufen gelassen, um etwa vorhandene kontaminierende Fc-Fragmente oder nicht verdauten Antikörper zu entfernen, die an der Protein-A-Säule binden. Die Peakfraktionen der Fab-Fragmente von der Protein-A-Säule wurden gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann in aliquoten Teilen von je 22 ug lyophilisiert und bei -80ºC aufbewahrt.

BEISPIEL 7

Radioimmunoassay zum Nachweis von Antikörpern gegen das Hepatitis A Virus

Für diesen Assay wurden Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser von 0,6 mm mit Antiserum beschichtet, um entweder Mäuse- oder Rattenantikörper gegen HAV unter Verwendung von Ziegen-Antimausimmunoglobulinen (IgG) oder von Ziegen- Antiratten-IgG nachzuweisen. Die Beschichtung wurde durchgeführt, indem das beschichtende Antiserum auf mindestens 1:400 (bis 1:1000) in physiologischer Kochsalzlösung verdünnt wurde und die Kügelchen über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die Kügelchen wurden dann viermal mit destilliertem H&sub2;O gewaschen, luftgetrocknet und bei -20ºC aufbewahrt.
Für diesen Assay wurden 10 bis 20 ul jedes Serums (von mit HAV immunisierten Mäusen des Beispiels 4) oder von monoklonaler Gewebekulturflüssigkeit (des Beispiels 5) auf 0,2 ml mit PBS (phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung), die 1% BSA (Rinderserumalbumin) und 0,02% Natriumazid enthielt, verdünnt und in ein Loch eines Kunststoffreaktionsgefäßes gegeben. Ein Kügelchen, das mit Ziegen-Antimaus-IgG beschichtet war, um Mäuseantikörper nachzuweisen (oder mit dem entsprechenden Antirattenserum für Rattenantikörper) wurde in jedes Loch gegeben und mit dem Testserum 2 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Die Kügelchen wurden dreimal mit 3-5 ml Wasser gewaschen und 0,2 ml HAV (hergestellt wie im Beispiel 1) beschrieben und mit 50 Nanogramm/ml 1%iger BSA und 0,02% Natriumazid verdünnt) wurden pro Loch zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kügelchen wurden wieder dreimal mit je 5 ml Wasser gewaschen. J¹²&sup5; Antikörper gegen HAV (HAVAB, Abbott) wurden zugegeben (0,2 ml) und 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Kügelchen wurden wie oben angegeben gewaschen und in einem Gammazählrohr eine Minute/Probe ausgezählt.
Positive Kontrollen umfaßten Ratten- oder Mäuseseren von HAV-immunisierten Tieren, von welchen mit dem Neutralisations-Assay und dem HAVAB-Assay gezeigt worden war, daß sie positiv für Antikörper gegen HAV sind. Negative Kontrollen waren entweder PBS allein oder Seren vor der Immunisierung von Tieren, die für die positiven Seren verwendet wurden. Jedes Testserum oder monoklonaler Antikörper wurde als positiv bezeichnet, wenn die Counts pro Minute 5 Standardabweichungen übertrafen, die größer waren als die negativen Kontrollen.
Gewünschtenfalls können die Kügelchen vor der Zugabe von HAV direkt mit einem monoklonalen Antikörper gegen HAV beschichtet werden, wobei die Ziegen-Antimaus- oder die Ziegen-Antirattenschicht eliminiert wird.

BEISPIEL 8

Neutralisationsassay für das Hepatitis A Virus

Nierenzellen von neugeborenen Cymolgusaffen (NBCmk) wurden aus vorrätigen gefrorenen Kulturen auf eine 96-Lochplatte in einer Konzentration von 1·10&sup4; Zellen/Loch unter Verwendung von 0,2 ml/Loch EMEM (Eagle Minimum Essential Medium) plus 10% FCS aufgegeben und in einem mit einem Wasserbad stabilisierten CO&sub2; Inkubator bei 35ºC in einer befeuchteten Atmosphäre 5 bis 7 Tage inkubiert, bis eine Konfluenz von 80 bis 90% erreicht war. LLC-MK-2, eine kontinuierliche Affennierenzellinie, wurde in diesem Assay ebenfalls für die Züchtung und Neutralisierung von HAV verwendet, obwohl die Inkubationszeit für den Nachweis des Virenwachstums länger war (10 bis 14 Tage im Gegensatz zu 6 bis 8 Tagen mit NBCmk Zellen).
Das Virusmaterial, das in diesen Assays verwendet wurde, war vorher in dem gleichen Zelltyp gezüchtet worden, der auch für den Assay verwendet wurde (also NBCmk Virenmaterial nur für NBCmk Zellen). Obwohl auch unbehandeltes HAV-Material, hergestellt nach früher beschriebenen Verfahren (U.S.Patent 41 64 566) in diesen Assays verwendet werden könnte, kann ein empfindlicherer Titer einer neutralisierenden Antikörperaktivität festgestellt werden, wenn HAV mit dem Detergent SLS behandelt wird. Für diese Behandlung wurde SLS aus einer 20%igen Vorratslösung zu dem HAV-Material bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zugegeben. Das Virus wurde damit sorgfältig gemischt und 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Virus wurde dann über einen Zeitraum von 36 Stunden dialysiert, wobei die phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung dreimal gewechselt wurde, und zwar 4 Liter/ Wechsel für 3 bis 4 ml HAV. Die Lösung des Virus wurde dann aus dem Dialysierbehälter entfernt, steril filtriert und in kleinen aliquoten Mengen (0,3 bis 0,5 ml) bei -20ºC aufbewahrt.
An dem Tag, an dem das Neutralisationsassay durchgeführt wurde, wurde das aufbewahrte Virus auf mehrere 5 bis 10fache Verdünnungen (EMEM-Medium wurde für diese Verdünnungen verwendet) verdünnt. Serum oder die flüssige Zellkultur, die monoklonale Antikörper enthielt, wurde zu den Verdünnungen des HAV entweder in kleinen Kunststoffröhrchen oder auf Mikrotiterplatten zugegeben; normalerweise wird 0,1 ml von jeder verdünnten Lösung des Virus zugegeben und das Serum wird, in der oben angegebenen Weise von 1:4 bis 1:200 verdünnt (oder sogar höhere Verdünnungen für einige hyperimmune Tierseren) zugegeben. Die Mischung des Virus und des Antiserums wurde dann 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Das Kulturmedium wurde von den Testzellen abgesaugt und die vorinkubierte Virus-Antikörper-Mischung zugegeben, wobei für jede Verdünnung gesonderte Mikropipettenspitzen verwendet wurden, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Mikrotiterplatten der Zellen wurden auf einer Schüttelmaschine 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und dann ohne Schütteln bei 37ºC inkubiert. Das Medium wurde dann abgesaugt und frisches EMEM mit 0,5% FCS, 2 mM Glutamin, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 ug/ Streptomycin wurde zugegeben. (0,25 ml/Loch einer 96 Loch-Mikrotiterplatte).
Die Zellen wurden dann bei 35ºC in einem mit einem Wasserbad stabilisierten CO&sub2; Inkubator inkubiert. Den Zellen wurde am fünften Tag nach der Infektion durch HAV frische Nährlösung zugeführt, wobei zuerst das Medium durch Absaugen entfernt und dann frisches EMEM mit fötalen Kälberserum, Glutamin, Penicillin und Streptomycin, wie oben beschrieben, zugegeben wurde.
Die Zellen wurden nach der Infektion fixiert, die NBCmk-Zellen am siebenten Tag und die LCC-MK-2-Zellen am zehnten bis vierzehnten Tag nach der Infektion. Für diesen Schritt wurde das Medium abgesaugt und die Zellen vorsichtig dreimal mit je 0,2 ml PBS/Loch gewaschen. Aceton wurde zugegeben, um die Zellen mit 200 ul/Loch zu fixieren, und dann sehr schnell abgesaugt, so daß die gesamte Kontaktzeit des Acetons mit den Zellen weniger als 60 Sekunden betrug. Die Platten wurden an der Luft getrocknet, um das Aceton vollständig zu entfernen.
Mit J¹²&sup5; markierte Antikörper gegen HAV (HAVAB, Abbott) wurden zu jedem Loch zugegeben, und zwar 0,040 ml/Loch (ungefähr 0,15 Mikrocurie/Loch). Die Platte wurde 60 Minuten auf einer Schüttelmaschine bei Raumtemperatur und dann 3 Stunden ohne Schütteln bei 35ºC inkubiert. Das J¹²&sup5;-Antiserum wurde dann abgesaugt und die Löcher dreimal mit je 0,3 ml PBS/Loch gewaschen. Die Platten wurden dann zehnmal unter langsam fließenden Wasser gewaschen. Nach Trocknen der Platten, entweder an der Luft oder schnell in einem Trockenschrank, wurde sie einem Röntgenfilm mit einer verstärkenden Folie exponiert. Diese Exposition erfolgte bei -70ºC und dauerte von 10 Stunden bis zu 3 Tagen.
Die Kontrollen umfaßten 1.) nicht infizierte Zellen für die Leerwert-Markierung mit dem J¹²&sup5; Antikörper-Präparat, 2.) verdünnte Lösungen des Virus, zu denen kein Antiserum oder eine monoklonale Gewebekulturflüssigkeit zugegeben wurde, um den Titer des Virus zu bestimmen, und 3.) Seren vor und nach der Impfung von Mäusen, Ratten, Krallenaffen oder Schimpansen, von denen vorher gezeigt worden war, daß sie entweder negativ oder positiv für die Verwendung als HAV neutralisierende Antiseren sind.
Um den neutralisierenden Titer der Seren oder monoklonalen Antikörper zu bestimmen, wurde zuerst der Titer des unbehandelten Virus bestimmt, wobei die radioaktive Markierung (Schwärzung des Röntgenfilms) der verdünnten Viruslösungen mit der Markierung der nicht infizierten Zellen verglichen wurde. Dann wurde die höchste Antikörperverdünnung, die eine Wachstumshemmung des Hepatitis A Virus (oder weniger Antigenbildung pro Loch) ergab, bestimmt, indem die Löcher, die den Hepatitis A Virus mit den Testseren enthielten, mit dem Virenwachstum des Virus allein verglichen wurden. Dies wurde entweder visuell gemacht oder mit einem Densitometer, um den radioaktiven Film auszuwerten und so die Prozentangaben für die Wachstumshemmung genauer zu bestimmen.
Mit dem vorhergehenden Assay wurde gezeigt, daß sowohl die monoklonalen Antikörper als auch die Seren von mit HAV immunisierten Wirten eine das Virus neutralisierende Wirkung aufweisen.

BEISPIEL 9

Quervernetzung monoklonaler Antikörper an HAV

Gegen HAV gerichtete neutralisierende monoklonale Antikörper werden an den Virus unter Verwendung des heterobifunktionellen Vernetzungsmittels Toluol-2,4-diisocyanat (TDI) quervernetzt, mit den folgenden geringfügigen Anpassungen an die von Emini et al. (J. Virol. 43: 997-1005, 1982) beschriebene Methode. Ein Natriumphosphatpuffer (10mM, pH 7,2) wurde zu getrockneten Fab-Fragmenten eines monoklonalen Antikörpers gegeben, gewöhnlich bis zu einer Endkonzentration von 0,5 ug/ul. TDI wurde dann zugegeben, 1,1 ul/200 ul des Antikörpers. Das Antikörper-Fab-Fragment wurde dann entweder bei 4ºC oder bei Raumtemperatur mit TDI inkubiert. Die Reaktion wurde beendet, indem zu verschiedenen Zeitpunkten, gewöhnlich in geringeren Abständen als 10 Minuten, aliquote Teile entnommen wurden, die dann bei 0ºC 10 Minuten inkubiert wurden, um TDI fest werden zu lassen. Das verfestigte TDI wurde durch Pelletieren bei 2000·g und 0ºC entfernt, dann wurden die Schritte der Inkubation bei 0ºC und des Pelletierens wiederholt. Der endgültige Überstand wurde dann verwendet und HAV wurde zum Antikörper hinzugefügt. HAV wurde entweder als nichtmarkiertes Virus mit 3 bis 5 ug/Reaktion, als J¹²&sup5; markiertes HAV mit 50 000 bis 70 000 cpm per Reaktion oder als S³&sup5; markiertes HAV mit 3000 bis 7000 cpm zugegeben. Das Virus wurde mit dem Antikörper 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Gesättigter dreibasischer Phosphatpuffer wurde zugegeben, um den pH für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf 9,6 zu erhöhen. Gesättigtes monobasisches Phosphat wurde dann zugegeben, um den pH-Wert auf 7,0 zu erniedrigen. Die Proben wurden dann über Nacht gegen dest.H&sub2;O mit drei Wechseln des Wassers dialysiert. Jede Probe wurde zur Trockene lyophilisiert und über ein Polyacrylamidgel, wie im Beispiel 2 beschrieben, laufen gelassen. Anschließend an die Elektrophorese wurden die Gele mit Coomassie Blau (R-250, 0,2% in einer 50%igen Lösung von Methanol) 30 Minuten lang angefärbt und dann mit 15% Methanol und 5% Essigsäure abgefärbt. Das Gel wurde getrocknet und dann über verschiedene Zeitspannen einem Röntgenfilm exponiert. Um den Grad der Quervernetzung an die einzelnen Proteine zu bestimmen, wurde eine densitometrische Auswertung des Röntgenfilms durchgeführt, die auch ein quantitatives Maß der verschiedenen viralen Peaks erbrachte.
Im Falle des nicht radioaktiven HAV wurden die Gele selbst ausgewertet und dann getrocknet. Der monoklonale Antikörper wurde an mit J¹²&sup5; markiertes HAV entweder bei 4ºC oder bei Raumtemperatur quervernetzt. Bei beiden Temperaturen wurde der Antikörper an das 33 kD Protein, VP-1, in einem größeren Maß als an VP-2, ein 28-29 kD Protein, oder an VP-3, das 27 kD Protein, quervernetzt.

BEISPIEL 10

Immun-Blot-Assay von Antikörpern gegen Hepatitis-A-virale Proteine

Ein Immun-Blot-Assay der Antikörper gegen HAV wurde entsprechend der Bedienungsanleitung durchgeführt, die in dem Immun-Blottest-Kit der Bio-Rad Laboratories enthalten ist, wobei entweder Ziegen-Antikaninchen-Meerrettichperoxidase (GAR-HRP) oder Ziegen Antimaus-Meerrettichperoxidase (GAM-HRP) für den Nachweis von Kaninchenseren oder Mäuseseren verwendet wurde. Im wesentlichen wurde HAV einer Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen unterworfen, wie im Beispiel 2 beschrieben, und dann auf eine Nitrocellulosemembrane (in einem Kit) transferiert, wobei ein TE-42-Transphor von Hoefer Scientific Instruments und ein Transferpuffer, bestehend aus 100 mM Tris, 16 mM Glycin und 20% Methanol, für einen vierstündigen Transfer bei einer durchschnittlichen Spannung von 60 Volt verwendet wurde. Die Nitrocellulosemembran wurde dann mit 3% Gelatine in einer mit Tris gepufferten Kochsalzlösung (TBS) (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 500 mM NaCl) blockiert, wie es in der Bedienungsanleitung von Bio-Rad beschrieben ist. Streifen der Nitrocellulosemembran wurden dann über Nacht mit Verdünnungen im Bereich von 1:5 bis 1:25 für monoklonale Gewebezellkulturen und im Bereich von 1:100 bis 1:400 für Seren vor und nach der HAV-Infektion von Menschen, Schimpansen, Krallenaffen, Mäusen, Kaninchen, Ratten und Meerschweinchen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Membranen zuerst kurz mit dest.H&sub2;O und dann zweimal je 10 Minuten mit TTBS (TBS mit 0,05% Polyoxyethylen(20)-sorbitanmonolaurat) gewaschen. Die Serenproben von Schimpansen, Krallenaffen und Menschen wurden dann 1 Stunde mit Kaninchen-Antihumanserum, 1:2000 bis 1:3000 verdünnt, inkubiert. Nach kurzem Waschen, wie oben beschrieben, wurden alle Proben dann mit dem endgültigen Indikatorantikörper inkubiert: GAR-HRP für alle Kaninchenseren und für solche, die in einen zweiten, ein Kaninchenserum enthaltenden Antikörper gespült wurden, oder GAM-HRP für solche, die ein Mäuseserum enthielten. Nach einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Streifen der Nitrocellulose gewaschen und die Farbreagentien wurden zugegeben, wie es in der Bedienungsanleitung von Bio-Rad beschrieben ist, um die Reaktion der Antikörper mit den speziellen HAV-Proteinen zu entwickeln.
Die Schimpansenantiseren nach der Infektion reagierten hauptsächlich mit VP-1, mit einer geringeren Reaktion auf VP-2 und VP-3. Eine unspezifische Reaktion der Schimpansenseren vor der Infektion wurde nur beobachtet, wenn die niedrigeren Verdünnungen des zweiten Antikörpers (Kaninchen-Antihuman) verwendet wurden, und war bei allen Proteinen im gleichen Maße vorhanden, sie wurde aber nicht bei höheren Verdünnungen (1:3000) gefunden. Die Seren von Krallenaffen nach der Infektion reagierten stark mit VP-1 und VP-2 und in geringerem Maße mit VP-3, während die Seren vor der Infektion mit keinem der Proteine reagierten. Humanseren vor und nach der Infektion reagierten in einer ähnlichen Weise wie die Seren der Krallenaffen. Seren von Mäusen oder Kaninchen, denen HAV injiziert worden war, reagierten mit VP-1, in geringerem Maße mit VP-2 und VP-3.

BEISPIEL 11

Modifizierter kompetitiver Assay für Antikörper gegen das Hepatitis A Virus

Für diese Methode wurden einige der Reagentien und die allgemeine Methode mit den unten beschriebenen Abänderungen anwendet, die in einem im Handel erhältlichen Kit zur Messung von Antikörpern gegen HAV (HAVAB Abbott) verwendet wurden. Kurz, das Zellkulturmedium (von Hybridoma-Zellen) oder das zu testende Serum wurde auf die Löcher einer 20-Loch- Mikrotiterplatte, normalerweise 100 Mikroliter, aufgegeben. Wenn weniger als 100 Mikroliter verwendet wurden, wurde PBS, das 1 mg/ml BSA enthielt, zugegeben, um das Volumen auf 100 Mikroliter aufzufüllen. Auf jedes Loch wurden dann 100 Mikroliter entweder von J¹²&sup5;-Humanantikörper gegen HAV (HAVAB Abbott) oder ein J¹²&sup5;-Antikörper, hergestellt wie im Beispiel 13 beschrieben, aufgegeben. Ein Polystyrolkügelchen, an das HAV gebunden ist, wurde in jedes Loch gegeben. Die Mikrotiterplatte wurde auf einer Schüttelmaschine 30 Minuten und dann über Nacht bei Raumtemperatur ohne Schütteln inkubiert. Die Testseren oder Medien und die konkurrierenden markierten Antikörper wurden dann abgesaugt und die Kügelchen wurden dann dreimal mit 2 ml destilliertem Wasser gewaschen und in einem Gammazählrohr ausgezählt (1 Minute pro Probe). Die Kontrollen umfaßten positive und negative Humanseren (HAVAB Abbott) und die Grenze für die Festlegung, ob ein Testserum oder ein monoklonaler Antikörper positiv war, wurde bestimmt, indem die cpm-Werte für die negativen und positiven Seren addiert und durch 2 geteilt wurden.
Wenn der modifizierte kompetitive Assay getestet wurde, indem Seren vor und nach der Infektion von Tieren (Mäusen, Krallenaffen, Schimpansen) verwendet wurden, konnte der Test leicht Seren vor der Infektion als negativ und Seren nach der Infektion als positiv unterscheiden. Wenn monoklonale Gewebekulturflüssigkeiten in diesem Assay verwendet wurden, so konkurrierten einige, aber nicht alle, mit dem mit J¹²&sup5; markierten Humanantikörper gegen HAV. Alle die positiven monoklonalen Antikörper, einschließlich A, C und D des Beispiels 5, konkurrieren mit dem J¹²&sup5; Antikörper gegen HAV. Wenn diese monoklonalen Antikörper zu einer Kombination von zweien zusammengemischt wurden (wobei immer noch ein Gesamttestvolumen von 100 Mikrolitern verwendet wurde), schienen einige der Kombinationen der monoklonalen Antikörper sich gegenseitig zu ergänzen, wodurch eine größere Konkurrenz resultierte, während andere Kombinationen nur denselben Grad der Konkurrenz ergaben. Offensichtlich sind diejenigen monoklonalen Antikörper, die durch Kombination von zweien verstärkt werden, gegen zwei verschiedene aktive Bereiche des HAV gerichtet, während diejenigen, die nicht verstärkt werden, gegen die gleichen oder ähnliche aktive Bereiche gerichtet sind.
Wenn einer der monoklonalen Antikörper mit J¹²&sup5; markiert und als konkurrierender Antikörper in einem kompetitiven Assay verwendet wurde, kann ein solches Assaysystem leicht unterschiedliche Bindungsstärken für gegen HAV positive und negative Seren feststellen. Für diese Analysen wurden verschiedene Konzentrationen von Humanseren, positiv und negativ gegen HAV (HAVAB, Abbott) und Seren vor und nach der Injektion von Mäusen, Schimpansen und Krallenaffen zu den Mikrotiterplatten gegeben, wie es oben beschrieben wurde, und 100 Mikroliter von mit J¹²&sup5; markierten monoklonalen Antikörpern wurden zugegeben, um für die Bindung an die mit HAV beschichteten Polystyrolkügelchen zu konkurrieren. Dieser Assay war im Stande, bestimmte Unterschiede bei der Bindung von positiven und negativen Seren nachzuweisen und die Tatsache, daß der mit J¹²&sup5; markierte Antikörper ein neutralisierender Antikörper war, zeigt an, daß die konkurrierenden Antikörper in den Testseren gegen den gleichen neutralisierenden Bereich oder Epitop gerichtet sind wie der monoklonale Antikörper. So stellt ein kompetitiver Assay, der mit J¹²&sup5; markierte neutralisierende monoklonale Antikörper verwendet und monoklonale Antikörper zu mindestens einen neutralisierenden Bereich am HAV umfaßt, ein Schnellassaysystem zur Bestimmung der Anwesenheit von protektiven oder neutralisierenden Antikörpern in Testseren zur Verfügung. Im Gegensatz hierzu gibt es keinen Beweis, daß im Handel erhältliche Anti-HAV-Antikörper nachweisende Systeme, die polyklonale Anti-HAV-Antikörper verwenden, ausschließlich mit den neutralisierenden Bereichen am HAV reagieren.

BEISPIEL 12

Ascites-Flüssigkeiten von Tieren, denen Hybridoma-Zellen injiziert wurden, die monoklonale Antikörper gegen das Hepatitis A Virus produzieren

Junge erwachsene Balb/c Mäuse wurden 2 bis 5 Wochen vor der Injektion der Hybridoma-Zellen mit einer Injektion von 0,5 ml Pristin intraperitoneal geprimed. Hybridoma-Zellen wurden in EMEM verdünnt und intraperitoneal in einer Konzentration von 10&sup6; bis 10&sup7; Zellen/Maus in einem Volumen von etwa 1 ml injiziert. Obwohl das Wachstum der Hybridoma-Zellen beträchtlich für das Wachstum als Ascites variieren kann, wurde in einem typischen Versuch die Ascites-Flüssigkeit nach 10 bis 14 Tagen mit einer Nadel, die in den peritonealen Hohlraum eingesetzt worden war, aufgesammelt. Die Ascites-Flüssigkeit wurde bis zum Gebrauch bei 4ºC aufbewahrt.

BEISPIEL 13

Radioaktive Markierung des monoklonalen Antikörpers

Der monoklonale Antikörper wurde aus der Ascites- Flüssigkeit, hergestellt gemäß Beispiel 12, durch Fällung mittels Ammoniumsulfat bei 4ºC bis zu einer Konzentration von 202 mg/ml, gereinigt. Das Material wurde 15 Minuten bei 10 000·g pelletiert, das Pellet wurde in PBS gelöst und über eine A-25 Säule laufen gelassen, um etwa vorhandenes kontaminierendes IgM und IgA zu entfernen. Das Leervolumen enthielt 1 bis 2 Proteinfraktionspeaks, die bei 4ºC auf einen Proteingehalt von 1 bis 2 mg/ml unter Verwendung eines Amicon-Konzentrationssystems mit einem PM-10 Filter konzentriert wurden. Alternativ wurde der monoklonale Antikörper aus einer Gewebekulturflüssigkeit, wie im Beispiel 6 beschrieben, gereinigt.
Um das gereinigte Antikörperpräparat zu jodieren, wurden 10 bis 15 ug Protein in 0,5 M eines Natriumphosphatpuffers (pH 7,25) gelöst und in ein Glasröhrchen gegeben. 1 Millicurie J¹²&sup5; wurde in 10 ul zugegeben. Chloramin T wurde zu 25 ug aus einer Vorratslösung von 2,5 mg/ml eines 0,5 molaren Phosphatpuffers (pH 7,25) zugegeben, um die Jodierung zu starten. Nach 20 Sekunden wurden 40 Mikrogramm Natriumbisulfit zugegeben, um die Reaktion zu beenden. 300 Mikroliter NaJ-Lösung, 10 mg/ml, wurden in das Reaktionsröhrchen gegeben. Das gesamte Reaktionsvolumen wurde auf eine 14 ml Sephadex-G100-Säule (1,3·15 cm; Höhe·Weite) aufgegeben. Das Material wurde über die Sephadexsäule unter Verwendung von PBS mit 0,02% Natriumazid chromatographiert und die Fraktionen, die mit J¹²&sup5; markierte Proteine enthielten, wurden gesammelt und mit PBS, das 1 mg/ml BSA und 0,02% Natriumazid enthielt, auf 50 000 cpm/10 gl verdünnt.

BEISPIEL 14

Immunisierung von Tieren mit einer Untereinheitvakzine von VP-1

Erwachsenen Lewis-Ratten wurden 3 Dosen des isolierten VP-1, das wie im Beispiel 3 beschrieben erhalten worden war, injiziert. Dem ersten Tier wurde es an den Tagen 0, 73 und 89, dem zweiten Tier an den Tagen 0, 16 und 70 injiziert. Die erste Dosis (Tag 0) wurde subcutan mit etwa 10 bis 15 ug VP-1 in einem Volumen von 1,0 ml, das das isolierte Protein mit 0,5 ml H&sub2;O und 0,5 ml kompletten Freunschen Adjuvans enthielt, verabreicht. Die zweite Dosis (Tag 73 oder 16) und die dritte Dosis (Tag 89 oder 70) wurden intraperitoneal verabreicht und enthielten etwa 15 ug VP-1/Dosis/Tier in einem Volumen von 0,5 ml H&sub2;O und 0,5 ml inkompletten Freundschen Adjuvans.
Serum wurde (am Tag 10 bis 14, 21 und 28 und über mehrere Wochen) nach der letzten Injektion von VP-1 entnommen und wurde auf die Neutralisation von HAV-Infektivität, wie im Beispiel 8 beschrieben, untersucht. Diese Seren waren positiv hinsichtlich der Gegenwart von HAV neutralisierenden Antikörpern.

Claims

1. Ein isoliertes Oberflächenprotein des Hepatitis A-Virus mit einem Molekulargewicht von etwa 33 000 Dalton, welches im Stande ist, neutralisierende Antikörper gegen den Hepatitis A-Virus zu induzieren und welches nach saurer Hydrolyse und Gelelektrophorese die folgenden Aminosäuren in der ungefähren Reihenfolge der abnehmenden Gewichtsprozentanteile enthält: Glycin, Serin, Glutaminsäure und/oder Glutamin, Asparaginsäure und/oder Asparagin, Alanin, Threonin, Leucin, Valin, Lysin, Prolin, Phenylalanin, Arginin, Isoleucin, Tyrosin, Histidin und Methionin.

2. Ein Oberflächenprotein des Hepatitis A-Virus gemäß Anspruch 1, in welchem nach saurer Hydrolyse und Gelelektrophorese die Aminosäuren in etwa den folgenden Gewichtsprozentanteilen enthalten sind:

Glycin von etwa 21% bis etwa 30%,

Serin von etwa 9% bis etwa 11%,

Glutaminsäure und/oder Glutamin von etwa 8% bis etwa 10,5%,

Asparaginsäure und/oder Asparagin von etwa 7,2% bis etwa 10%,

Alanin von etwa 6% bis etwa 7,3%,

Threonin von etwa 4,9% bis etwa 8,2%,

Leucin von etwa 4,9% bis etwa 7,2%,

Valin von etwa 4% bis etwa 5,4%,

Lysin von etwa 3,7% bis etwa 4,3%,

Prolin von etwa 3,2% bis etwa 5,3%,

Phenylalanin von etwa 3% bis etwa 4,5%,

Arginin von etwa 2% bis etwa 4,1%,

Isoleucin von etwa 2% bis etwa 3,6%,

Tyrosin von etwa 2,0% bis etwa 3,0%,

Histidin von etwa 1,3% bis etwa 1,9% und

Methionin von etwa 0,3% bis etwa 0,9%.

3. Ein Oberflächenprotein des Hepatitis A-Virus gemäß Anspruch 1, welches eine oder mehrere der nachstehenden inneren Aminosäuresequenzen in der Richtung vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen Ende des Peptids enthält:

Sequenz

I Val-Gly-Asp-Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Thr-Thr

II Met-Lys-Asp-Leu-Lys-Gly-Lys-Ala-Asn-Arg-Gly-Lys

III Met-Asp-Val-Ser-Gly-Val-Gln-Ala-Pro-Val-Gly-Ala- Ile-Thr-Thr-Ile-Glu-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Lys- Lys-Val-Pro-Glu-Thr-Phe

IV Met-Gly-Arg-Ser-His-Phe-Leu-Cys-Thr-Phe-Thr-Phe- Asn-Ser-Asn-Asn-Lys-Glu-Tyr

V Met-Ala-Trp-Phe-Thr-Pro-Val-Gly-Leu-Ala-Val-Asp- Thr-Pro

4. Verfahren zur Isolierung des Oberflächenproteins gemäß Anspruch 1, das

a) die Solubilisierung des intakten Hepatitis A-Virus in einer einen anionischen Surfactant und ein reduzierendes Mittel enthaltenden Lösung,

b) die Abtrennung des Virusproteins und

c) die Auswahl des Virusproteins mit einem Molekulargewicht von etwa 33 000 Dalton umfaßt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, in welchem der anionische Surfactant Natriumdodecylsulfonat ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4, in welchem das reduzierende Mittel 2-Mercaptoethanol ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 4, in welchem die Abtrennung des Virusproteins mittels Gelelektrophorese erfolgt.

8. Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 3 zur Herstellung einer Zusammensetzung, die geeignet ist, neutralisierende Antikörper gegen den Hepatitis A-Virus oder Proteinuntereinheiten von diesem zu induzieren und Erkrankungen an Hepatitis A zu verhindern.

9. Eine therapeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutischen Träger umfaßt, der eine wirksame Menge des Proteins gemäß Anspruch 3 enthält.

10. Ein antigenes Oberflächenprotein des Hepatitis A-Virus mit folgender Sequenz

in der X unbekannt ist und A entweder Gln oder Glu bedeutet.