DE3486247T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Vorbereitung bei niedrigen Temperaturen von biologischen Geweben für die Strukturanalyse. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Präparation biologischer Gewebeproben zur Ultrastrukturanalyse, wobei eine wesentliche Modifizierung der Ultrastruktur des Gewebes während der Präparation der Proben selbst vermieden wird. Es ist im Bereich der Medizin bekannt, daß zur Untersuchung von Gewebeproben und zur Bestimmung der zellulären Struktur und Funktion davon das Gewebe vor der Anwendung nahezu aller analytischer Methoden fixiert werden muß.
• Obwohl die Untersuchung von Gewebeproben unter Verwendung verschiedener Mikroskope oder verwandter Vergrößerungsvorrichtungen seit vielen Jahren durchgeführt wird, besteht ein inhärentes Problem bei der Präparation der Gewebeproben für die Verwendung bei modernen hochauflösenden analytischen Mikroskopen, wie STEM-Elektronenmikroskopen, die die Untersuchung von Probenbestandteilen mittels Röntgenstrahlanalyse bei Vergrößerungen von 500X bis 500 000X mit einer Punkt-zu- Punkt-Auflösung von 2 bis 3·10&supmin;¹&sup0; m (2 bis 3 A) ermöglichen.
• Insbesondere ist es schwierig, die Ergebnisse einer Gewebeanalyse zu interpretieren und gleichzeitig das Ausmaß verschiedener Artefakte, die während des Präparationsverfahrens des Gewebes erzeugt werden, zu bewerten. Es ist daher wesentlich, Artefakte zu vermeiden, wenn immer dies möglich ist. Ein weiteres Problem folgt aus der physikalischen Schrumpfung der Gewebeprobe selbst, wenn sie den extremen, aber nach gegenwärtiger Überzeugung für die erfolgreiche Präparation erforderlichen Verfahren zur Präparation unterworfen wird. Bei den meisten normalen Gewebepräparationsstufen liegt die Gewebeschrumpfung in der Größenordnung von 40 bis 50%. Diese Schrumpfung führt unweigerlich zu einer Veränderung der Ultrastruktur und zu einer massiven Umordnung der infrastrukturellen Auflösung. Das Ergebnis dieser ultrastrukturellen Translationsschädigung besteht in ungenauen Details bei der Beschreibung mittels dieses analytischen Verfahrens.
• Während des sogenannten "Goldenen Zeitalters der Morphologie" bestand das hauptsächliche Ziel bei der qualitativen und quantitativen Mikroskopie in ästhetisch ansprechenden Bildern. Dieses Ziel ist mit den derzeit verfügbaren Fixiermethoden und -vorrichtungen leicht zu erreichen. Es ist jedoch wichtig geworden, daß das ästhetisch ansprechende Bild, das durch das Präparationsverfahren hergestellt wird, auch eine Gewebeprobe ergibt, die genau den wahren Zustand des Gewebes im lebenden Organismus widerspiegelt, d. h. sich dem "lebenden Zustand" annähert. Dies ist ein Problem, mit dem sich das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung beschäftigen und das gelöst wird. Die Vergrößerungsvorrichtungen, die gegenwärtig für analytische Anwendungen zur Verfügung stehen, sind technisch ausgereifter als die gegenwärtigen Gewebepräparationstechniken, die bereits zuvor angewandt wurden. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zur Präparation von Gewebeproben, die leicht in bekannten Vergrößerungsvorrichtungen und analytischen Vorrichtungen verwendet werden können.
• Das gebräuchlichste Verfahren zur Präparation von Gewebeproben nach dem Stand der Technik wird mittels chemischer Fixierung und organischer Lösungsmitteldehydratisierung durchgeführt. Diesem Verfahren sind die gleichzeitige Erzeugung von Artefakten, die Schrumpfung der Probe und die daraus folgende Schädigung und Modifizierung der Gewebemerkmale inhärent. Diese Modifizierungen in Form von Artefakten oder dergl. erfordern die Interpretation durch den einzelnen oder die Analyse oder Bewertung der Probe mittels einer Vorrichtung. Dies führt in vielen Fällen zu einer unbefriedigenden Gefahr eines Fehlers. Die chemische Fixierung ist eine bekannte Technik und hat dem analytischen Biologen über viele Jahre gute Dienste geleistet und wird dies unzweifelhaft weiter für bestimmte beschränkte Anwendungen tun. Die Anwendung der Gewebeprobeanalyse wird jedoch komplexer, und die Anwendung einer derartigen Analyse findet eine weitere Verbreitung, so daß ein Bedarf an Alternativen zur chemischen Fixierung besteht. Dies gilt insbesondere, da Fortschritte hinsichtlich der Vergrößerung und der analytischen Vorrichtungen, die verfügbar sind, gemacht werden. Es ist erforderlich, das Gewebepräparationsverfahren und die Vorrichtungen, die erforderlich sind, um Gewebeproben zu präparieren, genau so ausgereift sind wie die analytischen Werkzeuge, d. h. die Elektronenmikroskope, die zur Analyse der Proben verwendet werden. Wenn die Technologie der Gewebeprobepräparation hinter der Technologie der Mikroskope zurückbleibt, dann ist es offensichtlich, daß ausgereifte Mikroskope den Morphologen oder anderen Gewebe untersuchenden Forschern keinen Dienst erweisen.
• Die gebräuchlichste Alternative zur chemischen Fixierung und organischen Lösungsmitteldehydratisierung besteht im Gefriertrocknen cryofixierter Proben. Das Gefriertrocknen nach der Cryofixierung ist eine gut beschriebene und bekannte Technik zur Gewebekonservierung. Sie weist mehrere Vorteile auf. Die Cryofixierung-Gefriertrocknung führt zu einer nahezu augenblicklichen Hemmung des Zellstoffwechsels. Es tritt auch eine Stabilisierung und Zurückhaltung von löslichen Zellbestandteilen durch Ausschluß eines Lösungsmittelkontakts mit der Probe auf. Dies sind wesentliche Vorteile der Cryofixierungs- Gefriertrocknung, die zu erheblichen Forschungsanstrengungen geführt haben, um zu versuchen, Techniken der Cryofixierung und Gefriertrocknung auf bekannte Gewebepräparationsverfahren anzuwenden.
• Allerdings hat die Anwendung der Gefriertrocknung zur Identifizierung einer Reihe von Nachteilen geführt. Der hauptsächliche Nachteil bei gegenwärtig verfügbaren Gefriertrocknungstechniken besteht in der Verhinderung der Bildung von Eiskristallen. Wie leicht einzusehen ist, zerstört die Bildung von Eiskristallen die ultrastrukturellen morphologischen Merkmale der untersuchten Gewebeprobe. Das Bild wird verzerrt, wenn das Cytoplasma vernetzt wird. Die Bildung von Eiskristallen in der Probe kann auch zu einer Änderung des pH-Wertes des Gewebes führen (Bildung eines Eutektikums), was möglicherweise zu einer anomalen Vernetzung von Makromolekülen führt. Es besteht auch die Möglichkeit, das Proteine denaturieren und ausfallen. Dies sind nur einige Nachteile, die dem Gefriertrocknungsverfahren inhärent sind.
• Dieses allgemeine Thema wird ausführlich zusammen mit weiteren Verfahren nach dem Stand der Technik in einem Artikel mit dem Titel "Freezing and Drying of Biological Tissues for Electron Microscopy" von Louis Terracio und Karl G. Schwabe erläutert, der in The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Bd. 29(9) (1981), S. 1021-1028 veröffentlicht wurde. Mit der Artefaktbildung verbundene Probleme werden in "Understanding the Artifact Problem in Freeze-Fracture Replication: A Review", The Royal Microscopial Society (1982), S. 103-123 beschrieben.
• Allgemeine Prinzipien, von denen festgestellt worden ist, daß sie auf Gefriertechniken anwendbar sind, die sich als zweckmäßig bei der Präparation von Gewebeproben erwiesen haben, bestehen darin, daß mit steigender Abkühlgeschwindigkeit Gewebeflüssigkeiten gefroren werden können, ohne daß eine Abgabe von Wasser in extrazelluläre Räume auftritt. Es ist jedoch festgestellt worden, daß unabhängig von der Abkühlgeschwindigkeit Eiskristalle wahrscheinlich immer noch gebildet werden, daß jedoch die Größe der intrazellulären Eiskristalle abnimmt, sowie die Abkühlgeschwindigkeit ansteigt. Die geringe Größe der Eiskristalle bei hohen Gefriergeschwindigkeiten ist natürlich ein wesentlicher Vorteil bei der morphologischen Untersuchung, da dies zu einer minimalen Artefaktbildung und zu einer minimalen ultrastrukturellen Schädigung während der Dehydratisierung führt.
• Historisch bestand das Kriterium, gemäß dem die Techniken zum raschen Einfrieren bewertet wurden, nicht in der Abkühlgeschwindigkeit des Systems, sondern einfach in der Temperatur der Umgebung, in der das Gewebe eingefroren wurde. So wurde der Ausdruck "rasches Gefrieren" auf jedes System angewandt, bei dem das Kühlmittel eine Temperatur von -150ºC oder weniger aufwies. Die Wirksamkeit eines Kühlsystems hängt von der Geschwindigkeit ab, mit der Wärme aus der Probe entfernt wird. Die Wärmeübertragung hängt nicht nur von der Temperatur des Gefriersystems ab, sondern auch von seinen physikalischen und thermischen Merkmalen sowie von der Größe und den thermischem Merkmalen der Probe.
• Die gebräuchlichste Technik zum raschen Einfrieren besteht im Eintauchen oder "Abschrecken" der Probe in einem fluiden Kühlbad. Die gebräuchlichsten Fluide zum Abschrecken sind flüssiger Stickstoff, Isopentan, Propan und Fluorkohlenstoffe, wie Freon 12 und Freon 22. Obwohl flüssiger Stickstoff im allgemeinen als ideale Abschreckflüssigkeit aufgrund seiner niedrigen Temperatur (-196ºC) angesehen wird, bestehen inhärente Nachteile in der Verwendung von flüssigem Stickstoff, da ein Filmsieden an der Gewebeoberfläche aufgrund der niedrigen Verdampfungswärme von flüssigem Stickstoff auftritt. Filmsieden ist ein Merkmal von flüssigem Stickstoff, das die Wärmeübertragungsgeschwindigkeit durch eine Isolierung der Probe verringert.
• Ein zum raschen Einfrieren alternatives Verfahren nach dem Stand der Technik ist das Einfrieren auf der Oberfläche eines gekühlten Metalls. Dies beinhaltet typischerweise das Aufbringen der Gewebeprobe auf eine polierte flache Metalloberfläche, indem die Gewebeprobe fest gegen diese Oberfläche des Metalls gepreßt wird. Silber und Kupfer werden typischerweise als polierte Metallblöcke verwendet. Dieses Verfahren wurde entwickelt, um den Vorteil der hohen Wärmeleitfähigkeiten und der hohen Wärmekapazitäten dieser Metalle zu nutzen, wenn sie auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff oder flüssigem Helium gekühlt sind. Die kritische Stufe bei der Abkühlung auf der Oberfläche eines Metalls besteht darin, einen engen Kontakt mit der trockenen gekühlten Metalloberfläche herzustellen, ohne eine Rotations-, Translations- oder Rückstoßbewegung auszuführen. Bestimmte im Handel erhältliche Vorrichtungen, die im Bereich der Medizin eingesetzt werden, ermöglichen ein "aufprallfreies" Gefrieren. Der Verdienst an der Entwicklung dieser Vorrichtung wird im allgemeinen Dr. Alan Boyne von der University of Maryland School of Medicine zugeschrieben.
• Kürzlich ist bestätigt worden, daß eine direkte Korrelation zwischen der Abkühlgeschwindigkeit und der ultrastrukturellen Konservierung in abschreckenden Fluiden besteht. So wie die Gefriergeschwindigkeit in einem Bereich von 100 bis 4100ºC/Sekunde (flüssiger Stickstoff - Propan) ansteigt, tritt eine entsprechende Abnahme hinsichtlich der Größe der vorhandenen Eiskristalle und so eine Verbesserung der morphologischen Konservierung ein.
• Die kritische Stufe beim nachfolgenden Gewebepräparationsverfahren besteht unverändert in der Sublimation-Dehydratisierung der unterkühlten Gewebefluide, die kürzlich als adiabatischer "molekularer Destillationsprozeß" beschrieben worden ist. So wie das geeignete Unterkühlungsverfahren ausgewählt und implementiert worden ist, ist es erforderlich, das Gewebe für die mikroskopische Bewertung weiterzuverarbeiten, da Elektronenmikroskope oder andere Vergrößerungsvorrichtungen, die eine Abbildung der gefrorenen hydratisierten Probe erlauben, nicht leicht verfügbar sind. Die Dehydratisierung ist also eine wesentliche Stufe bei der Herstellung biologischer Gewebeproben und eine Stufe, die oftmals zur Zerstörung durch Vernetzung von Infrastruktur und Ultrastruktur der Gewebemorphologie führt.
• Bei bestimmten Trocknungsverfahren nach dem Stand der Technik war die Gewebeprobe aufgrund der Bildung eines Eutektikums nicht vollständig verfestigt, da die in zellulären Fluiden gelösten Stoffe in Kompartimenten mit gebundenem Wasser angereichert sind. Diese Übertragung von gelösten Stoffen tritt auf, während die Materialien in einem fluiden Zustand sind, wenn ein langsames Abkühlen angewandt wird. Wenn rasche Gefriertechniken angewandt werden, dann sind besondere Überlegungen hinsichtlich der Dehydratisierungsstufe erforderlich. Diese Probleme haben ihre Ursache in der Tatsache, daß die Dehydratisierung (das Wasser muß entfernt werden) im festen Zustand, d. h. durch Sublimation, und nicht im flüssigen Zustand stattfinden muß.
• Nach dem Stand der Technik beinhaltet der Gefrier-Substitutions-Ansatz die Entfernung von Gewebewasser, indem es durch ein Lösungsmittel oder ein Lösungsmittel-Fixiermittel-Gemisch bei -75 bis -80ºC ersetzt wird. Dies führt zu weniger schwerwiegenden Lösungsmittelphasentrennungen und Artefakten durch chemische Veränderung an der Gewebeprobe als früher angewandte chemische Fixiermethoden. Vom praktischen Standpunkt aus wird das Gefriertrocknen durch die Anforderung verkompliziert, daß die Gewebeprobe erwärmt werden muß, um den Dampfdruck des unterkühlten Wassers zu erhöhen und es zu ermöglichen, daß die Sublimation in einer vernünftigen Zeitspanne abläuft. Die erhöhte Temperatur kann, außer zur Erhöhung des Dampfdrucks, zu einer Reihe physikalischer Ereignisse führen, die zur Ausdehnung der Eiskristalle und zur gleichzeitigen Schädigung der ultrastrukturellen Morphologie der Gewebeprobe führen. Viele der physikalischen Ereignisse, die während des Erwärmungsverfahrens auftreten, hängen mit Übergängen im physikalischen Zustand des vorhandenen Wassers zusammen. Änderungen, die typischerweise auftreten, sind Glasübergänge, Entglasung und Rekristallisierung mit einer darauffolgenden Reihe von Kristallgitterkonfigurationsübergängen.
• Es ist daher klar, daß Gefriertrocknen und andere Cryopräparationstechniken eine außerordentliche Möglichkeit zur Präparation von Gewebeproben für die morphologische Untersuchung bieten. Der Anwendung von Cryopräparationstechniken sind jedoch mit der Dehydratisierung und der Fixierung der Proben verbundene Probleme inhärent. Diese Probleme werden durch das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung angesprochen.
• Das erfindungsgemäße Cryopräparationsverfahren hat auch eine außerordentliche Anwendung bei der Transplantation von Hornhautgewebe gezeigt. Vor dieser Erfindung haben Versuche zur Transplantation von Hornhaut, die eine notwendige Stufe des Gefrierens oder Gefriertrocknens der Hornhaut nach der Entnahme aus dem Donor erfordert, stets zu einer getrübten Hornhaut nach der Transplantation geführt. Dieser physikalische Zustand der transplantierten Hornhaut wurde durch Kristallbildung in der Hornhaut selbst und der damit verbundenen Schädigung des Stroma verursacht. Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat Augenärzten die Cryopräparation der Hornhaut unmittelbar nach der Entnahme aus einem Donor und die anschließende Transplantation dieser Hornhaut in einen Rezipienten fast ohne irgendeine Trübung oder Kristallbildung ermöglicht. Die Fähigkeit, auf diese Weise eine Hornhaut zu transplantieren, stellt einen außerordentlichen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie einen medizinischen Durchbruch bei der Hornhaut-Transplantationschirurgie dar.
• Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Präparation biologischer Proben ohne offenkundige Unterbrechung oder Zerstörung der morphologischen Merkmale der Ultrastruktur der Gewebeprobe bereitzustellen.
• Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Präparation von Gewebeproben bereitzustellen, die in einer festen, glasartigen Phase durch rasches Gefrieren erhalten werden, wobei das Gefrierverfahren nicht zu unnötigen Artefakten führt, die die Interpretation durch herkömmliche analytische Vorrichtungen beschränkt.
• Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Präparation von Gewebeproben bereitzustellen, das die wirksame Dehydratisierung der Proben ohne entsprechende Schädigung der Gewebe-Ultrastruktur erlaubt und das zu Proben führt, die in modernen hochauflösenden Vergrößerungsvorrichtungen verwendet werden können.
• Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Probenhalter zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitzustellen.
• Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Cryopräparation einer biologischen Gewebeprobe zur Ultrastrukturanalyse bereitgestellt, das durch die Stufen von Anspruch 1 gekennzeichnet ist.
• Erfindungsgemäß wird ferner eine Vorrichtung zur Cryopräparation einer biologischen Gewebeprobe zur Ultrastrukturanalyse gemäß dem Verfahren von Anspruch 1 bereitgestellt, das durch die Merkmale von Anspruch 16 gekennzeichnet ist.
• Die abhängigen Ansprüche beziehen sich auf bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.
• Die Erfindung wird nun mit Hilfe von Beispielen mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung erläutert, in der:
• Fig. 1 ein schematisches Flußdiagramm des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt;
• Fig. 2 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist;
• Fig. 3 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Probenkammer ist;
• Fig. 4 eine Seitenansicht des erfindungsgemäßen Probenhalters darstellt;
• Fig. 5 eine Ansicht des erfindungsgemäßen Probenhalters von oben darstellt;
• Fig. 6 eine Ansicht des erfindungsgemäßen Probenhalters von unten darstellt;
• Fig. 7 eine perspektivische Ansicht der erfindungsgemäßen Probentrenneinrichtung darstellt;
• Fig. 8 einen Querschnitt entlang der Linie 8-8 von Fig. 4 darstellt;
• Fig. 9 eine perspektivische Ansicht des erfindungsgemäß bevorzugten Heizstrahlers von oben darstellt;
• Fig. 10 eine perspektivische Seitenansicht des erfindungsgemäß bevorzugten Heizstrahlers darstellt.
• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Cryopräparation biologischer Gewebeproben zur Ultrastrukturanalyse. Das Verfahren umfaßt die adiabatische Dehydratisierung einer biologischen Gewebeprobe unter den Bedingungen eines stark verringerten Drucks. Die einem stark verringerten Druck ausgesetzte, glasartig gemachte Gewebeprobe wird bei einer Temperatur von weniger als -140ºC in den Gleichgewichtszustand gebracht. Die Gewebeprobe wird anschließend dehydratisiert, während sie im Gleichgewichtszustand gehalten wird. Nach Entfernung des Gewebewassers wird die Gewebeprobe mit einem entgasten Harz durchtränkt, das anschließend polymerisiert wird, wobei eine eingebettete Gewebeprobe gebildet wird. Die Erfindung betrifft außerdem eine Probenhaltervorrichtung, die beim erfindungsgemäßen Verfahren einzigartige Gebrauchseigenschaften aufweist.
• Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht eine grundlegende Voraussetzung darin, daß die gewünschte biologische Probe erhalten wird. Biologische Proben werden nach einer Reihe von Verfahren erhalten, z. B. durch chirurgisches Ausschneiden, durch Entnahme von Blutproben und Bindegewebe sowie durch beliebige einer Reihe weiterer Technikendie bekannt und üblich sind. Das besondere Verfahren, mit dem die biologische Probe erhalten wird, ist nicht beschränkend im Hinblick auf das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung. Die Präparation der Gewebeprobe nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und in der erfindungsgemäßen Vorrichtung gewinnt jedoch an Wert, wenn die Gewebeprobe sobald wie möglich nach der Entnahme verarbeitet wird.
• Es ist nicht möglich, daß die Gewebeprobe in einem Fixiermittel, d. h. Formaldehyd, oder in einer anderen biologisch aktiven stabilisierenden Lösung gehalten wird, mit der Absicht, die Probe während des Versands, der Lagerung oder anderer erforderlicher Operationen zu erhalten. Es ist auch kritisch, daß die Probe vor der erfindungsgemäßen Präparation nicht routinemäßig gefroren oder in anderer Weise physikalisch modifiziert wird. Die Größe der Gewebeprobe ist für die Erfindung von besonderer Bedeutung. Die Präparation der Gewebeprobe erfolgt unmittelbar, nachdem sie erhalten wurde. Die Probe kann später physikalisch geschnitten oder für die Langzeitlagerung in der Vorrichtung oder zur Verwendung in verschiedenen gegenwärtig im Handel erhältlichen analytischen Vorrichtungen in anderer Weise physikalisch präpariert werden.
• Bei der bevorzugten optimalen biologischen Probe zur Präparation nach dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine frische Biopsieprobe von 1 mm³. Diese Probe muß sobald wie möglich glasartig gemacht werden. Mit "Glasartigmachen" soll auf ein Verfahren bezug genommen werden, das zu einer Cryofixierung der Probe führt und von Einfrieren verschieden ist. Beim Verfahren des Glasartigmachens überführt die verwendete Gefriervorrichtung die Probe in eine glasartige Phase, so daß lösliche und unlösliche Anteile, die in der Gewebeprobe enthalten sind, nicht gestört, translatiert, verändert oder (als Eutektika) konzentriert werden. Per Definition zerbricht eine glasartig gemachte Flüssigkeit,z. B. Fensterglas, in Stücke, wenn sie einer Scherspannung unterliegt. Die glasartige Phase umfaßt die Umwandlung von flüssigem Wasser in eine amorphe oder "Glas"-Phase. Dies wird durch rasches Unterkühlen der Gewebeprobe erreicht, indem sie "aufprallfrei" auf eine hochgradig polierte (spiegelähnliche), kondensatfreie Oberfläche eines bei -196ºC gehaltenen Metallstabs aufgebracht wird. Das rasche Abkühlen und die "aufprallfreien" Verfahrensschritte sind vorstehend im Abschnitt zum Stand der Technik in dieser Anmeldung erläutert worden.
• Von besonderem Nutzen beim erfindungsgemäßen Verfahren und bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Vorrichtung zum "aufprallfreien" Einfrieren, die in Zusammenarbeit mit Dr. Allen Boyne von der University of Maryland School of Medicine entwickelt worden ist. In dieser Gefriervorrichtung wird ein Kupferblock zum Glasartigmachen der Gewebeprobe verwendet. Dieses Glasartigmachen im Zusammenhang mit einem unterkühlten Fluid, wie flüssigem Stickstoff, Helium, Propan oder verschiedenen Freonarten, führt dazu, daß die Fluide in der Gewebeprobe zu einem amorphen Zustand vor und/oder ohne die Bildung von merklichen oder auflösbaren Zellwasser-Eiskristallen unterkühlt werden. Es ist unbedingt erforderlich, daß die nun glasartig gemachte Gewebeprobe bei einer Temperatur von weniger als etwa -140ºC während Lagerung und Transport vor der Entfernung des Gewebewassers gehalten wird.
• Abhängig von der voraussichtlichen Zeitspanne zwischen dem Einfrieren der Probe und der Dehydratisierung der Probe kann sie eingetaucht in flüssigen Stickstoffin einem Dewar-Gefäß gelagert werden. Sobald die Probe getrocknet und in geeigneter Weise eingebettet worden ist, kann sie praktisch unbegrenzt ohne cytoplasmatische Vernetzung oder andere Formen des zellulären Katabolismus gelagert werden, die Modifizierungen und Translationen verursachen, die zu unerwünschten Artefakten führen, die das Ergebnis als analytische Daten nicht interpretierbar machen.
• Nachdem die Probe glasartig gemacht wurde, wird sie,während sie bei einer Temperatur von weniger als -140ºC gehalten wird, über einen Probentransport transportiert und mit Hilfe eines Probenhalters in ein Vakuum eingebracht. Der Probenhalter (der üblicherweise auch als Objektträger bezeichnet wird) wird in einem Behälter mit einer eingestellten Temperatur gehalten. Der Behälter und der Probenhalter werden beide bei einer Temperatur unterhalb -140ºC gehalten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise Temperaturen des flüssigen Stickstoffs vom -196ºC aufrechterhalten. Der Grund, aus dem -140ºC kritisch ist, besteht darin, daß bei reinem Wasser, das in der glasartigen Phase vorliegt, wenn sich diese bei Temperaturen des flüssigen Stickstoffs befindet, bei -140ºC eine Kristallisation zu kubischem Eis beginnt. Wie in dem Abschnitt Stand der Technik in dieser Anmeldung dargelegt wurde, führt die Eiskristallisation zur ultrastrukturellen Schädigung, d. h. zur Vernetzung, der Morphologie der Gewebeproben.
• Sodann wird der Druck der die Gewebeprobe, den Probenbehälter und den Behälter umgebenden Atmosphäre verringert. Dies wird typischerweise durchgeführt, indem ein Vakuum an den Probenhalter angelegt wird. Das Vakuum wird bis zu 4·10&supmin;&sup7;Pa (3·10&supmin;&sup9; Torr) in etwa 300 Minuten angelegt. Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Vakuum von 4·10&supmin;&sup7; Pa bis 1,333·10&supmin;&sup8; Pa (1·10&supmin;¹&sup0; Torr) in weniger als 300 Minuten angelegt. Der Druck bleibt bei 6,665·10&supmin;&sup7; Pa (5·10&supmin;&sup9; Torr) während des beschriebenen restlichen Verfahrens, und zwar bis das gesamte Gewebewasser entfernt worden ist. Während der Äquilibrierung des Systems (24 bis 48 Stunden) wird die Probentemperatur mittels flüssigem Stickstoff aufrechterhalten, während das Vakuum angelegt und aufrechterhalten wird.
• Während dieser Zeit befindet sich die Gewebeprobe bei einem überaus geringen Druck und einer außerordentlich niedrigen Gleichgewichtscryotemperatur. Nachdem das Gleichgewicht erzielt wurde (mit einer Gleichgewichtstemperatur unterhalb von -140ºC), beginnt das glasartige Wasser, das in der Gewebeprobe gefunden wird, zu sublimieren, sowie eine Energie, die der Sublimationswärme entspricht, portionsweise allmählich der Sublimationsfront im Gewebe zugeführt wird. Dies ist ein langsamer Prozeß, aber einer, der für die Präparation der Probe kritisch ist. Es ist eine wichtige Anforderung, daß man der Probe genug Zeit läßt, um nach jeder Zufuhr von Energie das Gleichgewicht zu erreichen. Mit dem Erreichen des Gleichgewichts ist gemeint, daß die Temperatur der Gewebeprobe innerhalb einer Zeitspanne von 2 bis 4 Stunden sich nicht mehr ändert. In einem typischen Gewebepräparationsverfahren wird die Probe rasch bei -196ºC glasartig gemacht und, während Lagerung/Transport zum Probenhalter in der Sublimationsvorrichtung (Trocknungsvorrichtung) unterhalb -140ºC gehalten, wobei nach einer angemessenen Zeit zur Gleichgewichtseinstellung die Gleichgewichtstemperatur einen beliebigen Wert zwischen -140ºC und -196ºC annimmt. Während dieses gesamten Gleichgewichtsverfahrens wird ein kritischer, überaus geringer Druck von 4·10&supmin;&sup7; Pa oder darunter aufrechterhalten.
• Nach dem Äquilibrierungsverfahren, bei dem es sich um eine wesentliche Phase des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt, würde es eine außerordentlich lange Zeitspanne dauern, bis eine nennenswerte Menge an Wasser von der Probe verdampft, wenn keine Energie (Wärme) für die Sublimation dem System zugeführt wird. Schätzungen liegen im Bereich von Jahren, damit Wasser bei Temperaturen und Drucken, die beim erfindungsgemäßen Verfahren herrschen, verdampft. Daher wird gemäß der am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine sekundäre Energiequelle (Heizung) eingeführt, um die sublimierenden Wassermoleküle auszutreiben, ohne eine Schädigung der Ultrastruktur der trockenen Gewebeprobe zu verursachen. Man nimmt an, daß Strahlungsenergie mit einer speziellen Wellenlänge einen besonders geeigneten Ansatz darstellt, um dieses Ziel zu erreichen. Die Zufuhr von Sublimationsenergie über Mikrowellen, Lasersysteme und magnetische Energie ist ebenfalls geeignet. Die am meisten bevorzugte sekundäre Quelle ist ein kernmagnetischer Resonanzansatz in Kombination mit dem Vorstehenden. Im Gleichgewicht ändert sich die Temperatur des Gewebes nicht, sofern sich nicht die Umgebungsparameter für die unmittelbare Umgebung (Strahlungsenergie herrscht vor, d. h. Raumtemperatur ist 27ºC) änderen. Dies ist eine allgemeine Definition des Gleichgewichtspunktes eines Systems.
• Nachdem die Gewebeprobe das Gleichgewicht erreicht hat, ist es erforderlich, unterkühltes festes Wasser und/oder zu diesem Zeitpunkt unlösliche Eiskristalle (Durchmesser von 20 nm oder weniger), die sich im Gewebe während des Glasartigmachens gebildet haben, zu entfernen. Dieser Teil der Dehydratisierung ist unbedingt kritisch, und es handelt sich um die Stufe, in der die meisten möglichen Zerstörungen und Vernetzungen der Ultrastruktur des Gewebes auftreten. Dies wird bewirkt, indem allmählich die Sublimationsenergie in der Probe durch minimale Portionen adiabatischer Wärme (Wärme) pro Stunde ersetzt werden. Die optimale Bedingung besteht darin, daß kein Anstieg der Gewebetemperatur auftritt. In dem auf diese Weise die thermische Energie, die der latenten Sublimationswärme entspricht, erhöht wird, wird das gesamte feste Wasser, ob es sich um Mikroeiskristalle oder amorphes unterkühltes Wasser handelt, wirksam aus der Gewebeprobe durch das umgebende Cryosystem entfernt. Mit geeigneten Instrumenten ist es möglich, zu bestimmen, wann das gesamte Zellwasser entfernt worden ist. Zu diesem Zeitpunkt kann die Energiezufuhr beschleunigt werden, um eine endgültige Probentemperatur 3ºC oberhalb Raumtemperatur (28 bis 30ºC) zu erzielen. Auf diese Weise wird mit diesen Instrumenten ein wesentlicher Vorteil bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt.
• Die nun dehydratisierte Gewebeprobe konnte Raumtemperatur plus 3ºC erreichen. Obwohl Raumtemperatur erreicht wird, wird das Vakuum bei dem ursprünglichen außerordentlich geringen Wert gehalten, wie die die Probe umgebende Temperatur. In dieser Anmeldung bedeutet Raumtemperatur eine Temperatur von ungefähr 24 bis 27ºC. Es können natürlich Variationen bei diesem Temperaturniveau auftreten.
• In diesem Zusammenhang hat der Forscher die Möglichkeit, die Probe für ungefähr 1 Stunde Osmiumdämpfen auszusetzen, um eine Kontrastverstärkung über die Elektronendichte bereitzustellen. Diese Stufe kann ausgelassen werden, wenn sich herausstellt, daß sie für den interessierenden Teil schädlich ist oder das schließliche Ziel eine klinische Verwendung ist. Der Osmiumdampf wird durch Rekristallisation durch Cryopräzipitation entfernt. Gemäß anderen eingeführten Fixierverfahren werden Paraformaldehyd und/oder Glutaraldehyd in Pufferlösungen verwendet. Diese Materialien werden typischerweise als chemische Fixiermittel bezeichnet. Das am meisten bevorzugte Material, das typischerweise zugegeben wird, ist Osmiumtetraoxid. Dieses Material verstärkt die Auflösung und den Kontrast der verschiedenen Bestandteile des Gewebes für verschiedene analytische Vorrichtungen, die möglicherweise verwendet werden, um die Gewebeprobe zu interpretieren.
• Ein entgastes Harz wird anschließend zu dem Gewebe gegeben, während weiterhin die Vakuumbedingungen aufrechterhalten werden. Dies wird typischerweise als Harzdurchtränkung bezeichnet und führt zu einer eingebetteten Gewebeprobe. Harze, die sich bei Verfahren nach dem Stand der Technik als geeignet erwiesen haben, sind gleichfalls bei dem erfindungsgemäßen Verfahren anwendbar.
• Nach diesen Stufen werden die Gewebeprobe und das Harz auf atmosphärischen Druck gebracht, indem man langsam Luft durch den Harzeinlaß strömen läßt. Die eingebettete Gewebeprobe, die durch die Anwendung des Harzes erhalten wurde, wird entfernt, und das Harz wird bei seiner vorgegebenen Temperatur polymerisiert. Das spezielle Polymerisationsverfahren hängt stark von dem verwendeten Harz ab. Typischerweise wird die Harzprobe durch Anwendung von Wärme in einem Ofen für 12 Stunden polymerisiert. Eine normale Temperatur beträgt 60ºC, aber sie kann einen sehr geringen Wert von -80ºC annehmen, falls dies erforderlich ist. Es ist wesentlich, daß die Polymerisationsstufe ohne Schädigung der Gewebe-Ultrastruktur durchgeführt wird.
• Nach der Polymerisation kann die Gewebeprobe dann bei Raumtemperatur gelagert werden, dünne Schnitte können gefärbt oder weiter für andere Analysen präpariert werden. Nachdem die Gewebeprobe jedoch gemäß dem durch diese Erfindung offenharten Verfahren dehydratisiert worden ist, wird sie in einem cryofixierten Zustand gehalten, der durch herkömmliche Ultramikrotome und Elektronenmikroskope leicht interpretierbar ist, und sie stellt eine Basis für außerordentlich bedeutungsvolle Analysen von Gewebeproben mit einer wesentlichen Veränderung und Verringerung von Artefakten bereit, die gleichzeitig Beschränkungen der Vergangenheit verringern oder aufheben, so daß sie allgemein bei der Fixierung und/oder Gewebepräparation für die visuelle Analyse geeignet ist.
• Die tatsächliche Herstellung eines Zusammenhangs zwischen Struktur und Funktion bei diesen biologischen Geweben wird durch routinemäßige ultradünne Schnitte mit einer enormen Erweiterung anwendbarer Kontrastiermethoden durchgeführt, von denen man bisher annahm, daß sie über herkömmliche Elektronenmikroskopie (d. h. immunologische Analyse beliebiger löslicher Gruppen, Zucker, Lipide und löslicher Proteine), Enzymcytochemie innerhalb von Organellen, röntgendispersive STEM- Analyse, Gewebetransplantatpräparationen, Mikrobenanalyse, Autocobiographie (insbesondere lösliche Verbindungen) und pharmazeutische Präparate nicht erreicht werden könnten.
• Andere Vorrichtungen sind zur Durchführung dieser Hierarchie verfügbar, aber keine davon hat die erwarteten Resultate geliefert, da sie die erforderlichen, definierten, vorstehend erläuterten Parameter nicht in ihrer Gesamtheit einschließen. Die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Vorrichtung ist schematisch in den Fig. 2 und 3 gezeigt.
• Der in Fig. 3 gezeigte Probenhalter, der hier auch als Objektträger bezeichnet wird, ist einzigartig bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung. Dieser Probenhalter muß die Fähigkeit aufweisen, Gewebeproben bei Cryotemperaturen zu halten, ohne diese Gewebeproben zu beeinträchtigen. Vorzugsweise werden die Gewebeproben frei hängend unter isolierten (keine Wärmeleitung) Bedingungen gehalten. Wie aus dem schematischen Diagramm ersichtlich ist, enthält der Probenhalter rheostatisch steuerbare Heizelemente, die durch Konstantan- Kupfer-Thermoelemente als Temperaturfühler überwacht werden. Durch die koordinierte Verwendung dieser Materialien ist es möglich, die ungefähre Temperatur der Gewebeproben selbst zu steuern und zu überwachen.
• Der Probenhalter ist innerhalb eines Cryostaten oder einer Tieftemperaturvorrichtung enthalten, die wiederum mit einer Druckverringerungsvorrichtung verbunden ist. Die Druckverringerungsvorrichtung, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist, umfaßt beliebige einer Reihe herkömmlicher Vorrichtungen, um außerordentlich niedrige Drucke zu erzielen und aufrechtzuerhalten. Es ist darauf hinzuweisen, daß es sich nicht um herkömmliche Vakuumtyp-Drucke handelt, sondern in der Tat um Simulationstyp-Druckverringerungen. Die Vorrichtung ist ein Beispiel einer geeigneten Vorrichtung zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, um die geeigneten Bedingungen für die Wärmeübertragung zu erzeugen, wobei dies jedoch nicht als Beschränkung betrachtet werden sollte, sondern lediglich als beispielhafter Typ von Vorrichtung, die sich als zweckmäßig erwiesen hat. In vielen Druckverringerungsvorrichtungen ist es erforderlich, daß verschiedene Saugeinrichtungen, Motoren, Gebläse und Heizelemente vorhanden sind, um die korrekte Funktion der Druckverringerungsvorrichtung zu erleichtern.
• Das rasche Einfrieren, das durch die Vorrichtung vom Alan Boyne-Typ erzielt wird, ist wesentlich für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Herkömmlicherweise werden flüssiger Stickstoff oder andere Arten der Anwendung von Abschreckbädern zusammen mit abgekühlten Metallen in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, und zwar bis zu dem Ausmaß, bis zu dem sie eine glasartige Phase von Zellwasser bereitstellen. Wie schematisch in Fig. 2 gezeigt ist, wird ein Abschreckbad mit flüssigem Stickstoff verwendet, um die Temperatur der Gewebeprobe, die in dem Gewebehalter eingeschlossen ist, zu verringern und aufrechtzuerhalten. Es ist darauf hinzuweisen, daß, wenn die Gewebeprobe unter der Bedingung des flüssigen Stickstoffs gehalten wird, es erforderlich ist, daß Verbindungsleitungen den Zugang zu verschiedenen Kontrastiermaterialien und Fixiermitteln ermöglichen, die wahlweise in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt werden, sowie zu verschiedenen Harzen, die schließlich verwendet werden, um die Gewebeprobe der Erfindung vor der Polymerisation einzubetten. Jede dieser Funktionen wird wiederum schematisch in den beigefügten Figuren gezeigt. Es versteht sich jedoch, daß diese keine beschränkenden Merkmale der Erfindung sein sollen, sondern lediglich die verfügbare Technologie erläutern.
• Beim Entwurf der Vorrichtung oder bei der Auswahl der Vorrichtung für die Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es erforderlich, die Wirkungen der außerordentlich geringen Temperaturen und Drucke auf verschiedene Materialien zu verstehen. Aus diesem Grund sind Abschnitte der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die verwendet werden, um das Material zu behandeln, während es sich in dem glasartigen Zustand befindet, typischerweise aus rostfreiem Stahl gefertigt. Andere Materialien können gleich gut geeignet sein. In ähnlicher Weise sind Abschnitte der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus Teflon gefertigt oder damit überzogen, wobei es sich um ein von Dupont hergestelltes Material handelt, das hauptsächlich aus Tetrafluorethylen besteht.
• Fig. 2 zeigt schematisch eine Vorrichtung, die zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird. Eine mechanische Pumpe 11 ist mit einer Ultrahochvakuumpumpe 10 verbunden. Die Vakuumvorrichtung 10 ist mit der Probenkammer 20 verbunden. Bei der Ultrahochvakuumpumpe 10 kann es sich um eine beliebige einer Reihe im Handel erhältlicher Vakuumpumpvorrichtungen handeln. Die bevorzugte Ausführungsform ist eine Turbomolekularpumpe und insbesondere eine von der Firma Leybold-Heraeus (Modell TMP-360) hergestellte Turbomolekularpumpe. Es ist wesentlich, daß die Ultrahochvakuumpumpe, ob es sich um eine Turbomolekularpumpe handelt oder nicht, ein kohlenwasserstofffreies Vakuum erzeugt. Die mechanische Pumpe 11 wird verwendet, um Gase auszupumpen, die durch die Ultrahochvakuumpumpe 10 aus der Probenkammer 20 transportiert werden.
• Die Probenkammer 20 wird in Fig. 3 beschrieben und ausführlicher gezeigt. In Fig. 2 ist jedoch die Probenkammer 20 unmittelbar benachbart zu der Probenhalterträgeranordnung 30. Die Probenkammer 20 wird verwendet, um die tatsächlichen Gewebeproben aufzunehmen. Eine Abschirmung für Wärmestrahlung 40 umgibt die Probenkammer 20, um die Probenkammer 20 und die eingeschlossenen Gewebeproben von der Umgebung zu isolieren.
• Typischerweise handelt es sich bei der cryogenen Badumgebung 50 um flüssigen Stickstoff, der in einem Dewar-Gefäß enthalten ist. Das wesentliche Merkmal besteht darin, daß die Temperatur -140ºC nicht überschreiten darf. Die Wärmeleitfähigkeit der cryogenen Energie von der cryogenen Badumgebung 50 zur Probenkammer 20 ist der Struktur inhärent. Es ist nicht erforderlich, daß eine direkte Verbindung zwischen der Strahlungsabschirmung 40 und der Probenkammer 20 besteht, um die geeignete Temperatur der Gewebeproben aufrechtzuerhalten.
• Fig. 3 zeigt ausführlicher die Probenkammer 20 und die Probenhalterträgervorrichtung 30. Die tatsächlichen Probenhalter werden mit Bezugszeichen 60 bezeichnet. Einer oder mehrere Probenhalter 60 sind in der Probenkammer 20 enthalten. Die Probenhalter 60 werden von einem Träger 30 getragen. Die Probenhalter werden von der Umgebung durch einen Strahlungsschutzschirm 22 isoliert, der eine innere Oberfläche 22A aufweist, die diffus (absorbierend) ist, und der eine äußere Oberfläche 22B aufweist, die spektral (reflektierend) ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Oberfläche 22A vollkommen schwarz mit einer Emissionsfähigkeit von 0 (sie erscheint schwarz) und absorbiert vollständig beliebige thermische Strahlung. Die spektrale Oberfläche 22B ist hochgradig poliert, um beliebige Strahlungsenergie vollständig zu reflektieren. Das Überziehen der äußeren Oberfläche 22B mit Nickel oder anderen Materialien, die hochgradig poliert werden können, wird bevorzugt.
• Strahlungswärmeeinrichtungen 24 werden in Fig. 3 gezeigt und stellen eine Quelle für Strahlungswärme für die Gewebeproben bereit. Die Strahlungswärmeeinrichtungen 24 werden durch die Steuereinrichtungen 26 gesteuert. Die Steuereinrichtungen 26 erlauben eine stufenlose Veränderung der Strahlungswärmeeinrichtungen, und es handelt sich typischerweise um Rheostate oder Thermostate. Die Temperaturanzeigeeinrichtung 28 ist ebenfalls mit verschiedenen Punkten der Probenkammeranordnung verbunden, so daß die Temperatur der Umgebung und der Gewebeproben speziell gesteuert werden können.
• Die Figg. 9 und 10 zeigen bevorzugte erfindungsgemäße gerichtete Strahlungswärmeeinrichtungen. Bei der bevorzugten Strahlungswärmeeinrichtung 24 wird Wärme als Folge einer geeigneten Ausrichtung und Herstellung in praktisch linearer Weise übertragen, im Gegensatz zur zufälligen, kugelförmigen Strahlungswärmeübertragung, die weniger wirksam, aber typischer ist. In dieser Ausführungsform wird anstelle des Standardheizblockmaterials, das mit Bezugszeichen 24 in Fig. 3 gezeigt ist, ein speziell entwickelter Heizblock verwendet, wie er in den Fig. 9 und 10 gezeigt ist. Gemäß dieser Ausführungsform erstrecken sich hervortretende Abschnitte 91 von der obersten Oberfläche des bevorzugten Heizstrahlers 90. Die Oberfläche 92 der hervortretenden Abschnitte 91 ist hochgradig poliert, so daß Strahlungswärme mit einem möglichst geringen Energieverlust übertragen wird, und sie sind speziell angewinkelt, um eine Basis für eine praktisch lineare Übertragung von Strahlungswärme bereitzustellen. Mit Bezug insbesondere auf Fig. 10 ist der vertiefte Abschnitt, der die hervortretenden Abschnitte 91 trennt und hier mit 93 bezeichnet wird, mit einem schwarzen Material überzogen, um eine maximale Energieübertragung zu erreichen.
• Gemäß der am stärksten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Strahlungswärmeeinrichtungen 24, die Kontrolleinrichtungen 26 und die Temperaturanzeigeeinrichtungen 28 alle durch einen Computer innerhalb genau definierter Bereiche gesteuert.
• Obwohl Fig. 3 die Anwendung von Strahlungswärme verdeutlicht, sind andere Energieformen für die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren in gleicher Weise geeignet. Insbesondere können elektromagnetische Energiequellen, wie Mikrowellen, Radiowellen, akustische Schallwellen, sichtbare Lichtwellen und ultraviolette oder nahultraviolette Wellen verwendet werden. Ein magnetischer Fluß ist ebenfalls geeignet, insbesondere in Kombination mit einer der vorstehend aufgelisteten Energieformen. Kombinationen der vorstehenden Energieformen können abhängig von der Anwendung und der Probe, die in die Vorrichtung gegeben wird, verwendet werden. Infrarotstrahlung sollte vermieden werden. Probeneigenschaften sind von großer Bedeutung bei der Bestimmung der Energiequelle, die schließlich ausgewählt wird.
• In Fig. 4 wird die Probenhalteranordnung 60 gezeigt. Eine Probenkammer 61 wird gezeigt, die typischerweise ist rostfreiem Stahl konstruiert wird. Öffnungen 62 können wahlweise vorhanden sein, um eine Basis für die Zirkulation von Strahlungsenergie sowie für die Entfernung von Feuchtigkeit bereitzustellen. Ein Abstandshalter 63 wird vorzugsweise am Rand der Kammer 61 bereitgestellt. In seiner am stärksten bevorzugten Form handelt es sich bei dem Abstandshalter 63 um einen O-Ring aus Teflon. Ein rohrförmiges Trägerteil 64 erstreckt sich vom Boden der Probenkammer 61 und endet am Abstandshalter 65. Der Abstandshalter 65 ist vorzugsweise aus Teflon gefertigt und besteht aus einem Gehäuse 66 und ineinandergreifenden O-Ringen 67 und 68. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das rohrförmige Trägerteil 64 ein Trockenmittel, wie einen Zeolith.
• Fig. 5 ist eine Ansicht des erfindungsgemäßen Probenhalters von oben. Die Öffnungen 62, die sich an den Seiten der Probenkammer 61 finden, finden sich auch im Boden der Probenkammer, wie in Fig. 5 gezeigt ist. Diese Öffnungen erlauben den Strom von Feuchtigkeit und die Übertragung von Strahlungsenergie. Eine Mehrzahl von Probenabstandshaltern 70 sind in Öffnungen 64 eingesetzt, die sich im gesamten Boden der Probenkammer 61 befinden. Gemäß der am stärksten bevorzugten Ausführungsform (vgl. Fig. 7) weisen die Probenabstandshalter 70 ein sich nach unten erstreckendes Bein 71 auf, das in am Rand befindliche Energieübertragungsteile 80 eingesetzt wird, wie in Fig. 8 gezeigt ist, die in der Oberfläche des rohrförmigen Trägerteils 64 enthalten und damit verbunden sind. Vorzugsweise bestehen die Teile 80 aus einem Teflonrohr mit einem Wolframdraht, der innen entlang des Teils verläuft. Die Rohre sind so bemessen, daß sowohl der Wolframdraht als auch das Bein 71 des Probenabstandshalters 70 entfernbar in das Innere des Teils 80 eingesetzt werden können. In der Praxis werden die tatsächlichen Proben zwischen benachbarten Probenabstandshaltern 70 angeordnet. Eine unendliche Anzahl von Formen und Konfigurationen kann unter Verwendung der Probenabstandshalter 70 abgeleitet werden. Auf diese Weise kann der erfindungsgemäße Probenhalter an praktisch jeden Typ oder jede Größe von Gewebeprobe angepaßt werden.
• Fig. 7 zeigt den erfindungsgemäßen Probenabstandshalter. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Probenabstandshalter 70 planare Flansche 72, die Öffnungen 73 aufweisen und die mit Zapfen auf einem Haltestift 74 angeordnet sind. Der Haltestift 74 weist ein abwärts sich erstreckendes Bein 71 auf, das in das Rohr 80 eingesetzt werden kann. Durch Einsetzen einer Vielzahl von Probenabstandshaltern 70 in die Öffnungen 64 und in einigen Fällen in das rohrförmige Teil 80 kann eine Vielzahl von Konfigurationen und Anordnungen der Gewebeproben erreicht werden.
• Fig. 6 zeigt den Boden des Probenhalters 60 und insbesondere ein Gitter 69. Das Teflon-Gitter 69 wird bereitgestellt, um den Zeolith oder andere Trockenmittel in dem rohrförmigen Trägerteil 64 zu halten, während es gleichzeitig den freien Strom von Feuchtigkeit und dergl. durch den Boden des Probenhalters 60 erlaubt.
• Obwohl die bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Probenhalters vorstehend ausführlich beschrieben wurde, ist darauf hinzuweisen, daß eine Vielzahl von Ausführungsformen jemandem, der eine Vorrichtung für einen speziellen Zweck entwickelt, zur Verfügung stehen. Die Beschreibung erfindungsgemäß bevorzugter Probenhalter soll die Erfindung nicht beschränken, sondern lediglich die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erläutern. Andere Probenhalter, die gegenüber den hier beschriebenen Modifikationen oder Änderungen aufweisen, werden in gleicher Weise in diese Anmeldung eingeschlossen.

Claims (24)

1. Verfahren zur Kryopräparation einer biologischen Gewebeprobe für die ultrastrukturelle Analyse, gekennzeichnet durch:

Verglasen der biologischen Gewebeprobe durch rasche Verringerung der Temperatur der Probe auf -140ºC und darunter mit einer solchen Geschwindigkeit, daß die Verglasung des Wassers im Gewebe ohne Bildung von auflösbaren Eiskristallen erfolgt;

Verringern des Drucks der die Probe umgebenden Atmosphäre auf weniger als 4·10&supmin;&sup7; Pa (3·10&supmin;&sup9; Torr) durch Anlegen eines Vakuums in weniger als 300 Minuten, wobei ein solches Vakuum geschaffen wird, daß verglastes Wasser aus der biologischen Probe entfernt werden kann; Äquilibrieren der verglasten Gewebeprobe bei einer Temperatur von weniger als -140ºC;

Dehydratisieren der verglasten Gewebeprobe durch Sublimation, wobei man die Probe bei einer Temperatur von weniger als w140ºC in einem Gleichgewichtszustand hält;

Infiltrieren der dehydratisierten Gewebeprobe mit einem entgasten Harz;

Polymerisieren des Harzes in der infiltrierten Gewebeprobe unter Bildung einer eingebetteten Gewebeprobe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend das Verglasen der Probe durch Verwendung eines Bads von flüssigem Stickstoff.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Vakuum 4·10&supmin;&sup7; Pa bis 1,333·10&supmin;&sup8; Pa (3·10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;¹&sup0; Torr) beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die verglaste Probe bei einer Temperatur von -140ºC bis -196ºC äquilibriert wird.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend das 2- bis 4stündige Belassen des Gewebes im Gleichgewichtszustand.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Probe durch Sublimation dehydratisiert wird.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Dehydratisierung durch Zufuhr von Energie aus einer sekundären Quelle verstärkt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Energie inkrementell zugeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei es sich bei der Energie um Wärmeenergie oder Strahlungsenergie handelt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, umfassend das Erzeugen der Strahlungsenergie durch kernmagnetische Resonanz.

11. Verfahren nach Anspruch 10, umfassend das Erzeugen der Strahlungsenergie mittels eines Lasers.

12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend das Anheben der Temperatur der Probe nach der Dehydratisierung auf Raumtemperatur.

13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend das Zugeben eines kontrastverstärkenden Materials.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das kontrastverstärkende Material Osmium umfaßt.

15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei der biologischen Gewebeprobe um eine Hornhautgewebeprobe zum Einsatz in chirurgischen Verfahren handelt.

16. Vorrichtung zur Kryopräparation einer biologischen Gewebeprobe für die ultrastrukturelle Analyse gemäß dem Verfahren von Anspruch 1, gekennzeichnet durch:

Mittel zum Verglasen der biologischen Gewebeprobe durch rasche Verringerung der Temperatur der Probe auf -140ºC oder darunter mit einer solchen Geschwindigkeit, daß die Verglasung des Wassers im Gewebe ohne die Bildung von auf lösbaren Eiskristallen erfolgt;

Mittel (10, 11) zum Verringern des Drucks der die Probe umgebenden Atmosphäre auf weniger als 4·10&supmin;&sup7; Pa (3·10&supmin;&sup9; Torr) durch Anlegen eines Vakuums in weniger als 300 Minuten, wobei ein solches Vakuum geschaffen wird, daß verglastes Wasser aus der biologischen Probe entfernt werden kann;

Mittel zum Äquilibrieren der verglasten Probe bei einer Temperatur von weniger als -140ºC;

Mittel zum Dehydratisieren durch Sublimation der verglasten Gewebeprobe, wobei die Probe bei einer Temperatur von weniger als -140ºC in einem Gleichgewichtszustand gehalten wird;

Mittel zum Infiltrieren der dehydratisierten Gewebeprobe mit einem entgasten Harz;

Mittel zum Polymerisieren des Harzes in der infiltrierten Gewebeprobe unter Bildung einer eingebetteten Gewebeprobe.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei das Verglasungsmittel einen auf einer Temperatur von weniger als -140ºC gehaltenen Kupferblock umfaßt.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, umfassend eine Probenkammeranordnung, die zur Unterbringung eines Probenhalters (20, 60) zur Aufnahme der verglasten biologischen Gewebeprobe geeignet ist, wobei die Probenkammeranordnung entfernbar ist, um sie leichter in das kryogene Bad (50) einzusetzen und daraus entfernen zu können.

19. Vorrichtung nach Anspruch 16, 17 oder 18, wobei die Einrichtung zur Senkung des Drucks eine Ultrahochvakuumpumpe (10) und eine mechanische Pumpe (11) zur Verminderung des Drucks der Probenkammeranordnung (20) auf weniger als 4·10&supmin;&sup7; Pa (3·10&supmin;&sup9; Torr) und zur Bildung eines kohlenwasserstofffreien Vakuums umfaßt.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, umfassend ein kryogenes Bad (50) zur Aufrechterhaltung der Temperatur der Probenkammeranordnung auf -140ºC oder darunter.

21. Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei der Probenhalter eine Probenkammer (61), die zur Aufnahme von einer oder mehreren Gewebeproben geeignet ist, und eine Abstandseinrichtung (70), die zur gegenseitigen Isolierung der in der Probenkammer befindlichen Gewebeproben geeignet ist, umfaßt, wobei die Abstandseinrichtung entfernbar in die Probenkammer eingesetzt ist.

22. Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei die Probenkammer (61) eine Mehrzahl von Öffnungen (62) umfaßt, um den Zutritt von Feuchtigkeit und Energie zu den Gewebeproben zu ermöglichen.

23. Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Probenkammer (61) des Probenhalters von einem Tragegehäuse (65) mittels eines Röhrenelements (64) getragen wird, wobei das Röhrenelement (64) passend im Tragegehäuse aufgenommen ist.

24. Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei der Probenhalter mit einer Strahlungserwärmungseinrichtung (24) verbunden ist.