DE3511270A1 - Insulin aus pankreasextrakten - Google Patents
Insulin aus pankreasextraktenInfo
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Description
- Insulin aus Pankreasextrakten
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Insulin aus Lösungsmittel enthaltenden Lösungen durch Einsatz von Eluat ionenaustauschern hydrophober Matrix.
- Die Erfindung findet Anwendung bei der Isolierung von kristallinem Insulin aus Lösungsinittel enthaltenden Pankreasextrakten.
- In der DT-OS 2 701 092 von 1976 wird ein Verfahren zur Herstellung von reinem Insulin aus alkoholischen ankreasextrakten vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Insulin während des gesamten Aufarbeitungaprosesses bis zur endgültigen Gewinnung in gelöstem Zustand verbleibt.
- Nachteilig herbei ist jedoch die Anwendung technologisch und kostenmäßig sehr aufwendiger Methoden wie der Fettausfrierung und der inversen Osmose.
- Die nachfolgende Ionenaustauschchromatografie wird an mechanisch sehr instabilen Systemen auf Xohlehydratbasis mit einer geringen EapazitCt sowie bei für die Stabilität des Insulins sehr kritischen Bedingungen (Sulfokationenaustauscher oder Anionenaustausch bei pH-Werten 7,0) durchgeführt. Es ist bekannt, daß durch die hohe Acidität der Sulfonsäuregruppen im Mikrobereich der Ionenaustauscher hydrolytische Abbaureaktionen des adsorbierten Insulins auftreten, während bei pH-Werten 7,0 erhaltene enzymatis¢he Verunreinigungen oder die Spaltung der Disulfidbrücken zur teilweisen Zerstörung des Insulins führen kennen.
- Zudem müssen zur Gewinnung des Eristallinsulins nach Elution vom lonenaustauscher weitere zusätzliche Aufarbeitungsschritte nachgeschaltet werden.
- In der DU-OS 2 757 377 von t977 wird ein Verfahren zum Stabilisieren, Konzentrieren und Reinigen von Insulin aus alkoholisohen Pankreasextrakten beschrieben, das auf dem Einsatz von nacheinandergeschalteten Eationen- und Anionenaustauschersystemen basiert.
- Nachteilig ist der verfahrensbedingte hohe Arbeits- und Kostenaufwand der Methode. Der Einsatz sulfonierter Eationenaustauscher sowie die Anwendung von pH-Werten 7,0 während des Kationen- und Anionenaustausches ist für die Stabilität des Insulins kritisch. Auch hier können die bereits beschriebenen Abbaureaktionen zur teilweisen Zerstörung des am lonenaustauschen adsorbierten Insulins führen.
- Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung von Insulin aus alkoholischen Pankreasextrakten durch Einsatz von lonenaustausohern ZU entwickeln, das sich gegenüber den bisher bekannten Verfahren dadurch Einhaltung von für die Stabilität des Insulins unkritischen Verfahrensbedingungen, den Einsat mechanisch stabiler und kostenunaufwendiger Ionenaustauscher sowie einen minimalen Aufwand bei maximaler Insulinausbeute auszeichnet.
- Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren, das mit mechanisoh und chemisch weitgehend stabilen Ionenaustauschern bei einer hohen Kapazität eine mit geringem technisohen und technologischen Aufwand durchzuführende Gewinnung des Insulins bei hohen Ausbeuten ermöglicht, aufzuzeigen.
- Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß das aus Lösungsmittel enthaltenden Pankreasextrakten, vorzugsweise ethanolischen Pankreasextrakten, an carboxylierten Kat ionenaustausohern hydrophober Matrix adsorbierte Insulin bei unterschiedlichen Lösungsmittelkonzentrationen im sauren pH-Bereich eluiert wird.
- Überraschend dabei ist, daß die Selektitität des i:lutioSsprozesses so hoch ist, daß das Verhältnis von Insulin zu den gleichzeitig eluierten Begleitsubstanzen etwa 2:1 beträgt, die im Eluat erhaltene Insulinkonzentration von 3-5 mg/ml eine direkte Kristallisation des Eluats ermöglicht.
- Bekannte Verfahren (DT-OS 2 701 092, DOOS 2 757 377) bevorsaugen für die Gewinnung und Reinigung des Insulins aus alkoholisohen Pankreasextrakten den Einsatz nacheinandergeschalteter Kationen- und Anionenaustauschsysteme. Nachteilig dabei ist im Vergleich zu dem hier vorgeschlagenen Verfahren die Verwendung sulfoniester Kationenaustauscher hoher Acidität sowie Verfahrenabedingungen oberhalb pH 7,0 während des Anionenaustauschprozesses. Auf Grund der bekannten Tatsachen, daß bei Anwendung stark saurer Kationenaustauscher auf Grund der hohen Acidität ihr er SO3H-Gruppen hydrolytische Abbaureaktionen am Insulin auftreten können, ebenso wie enzymatische Verunreinigungen in den insulinhaltigen Lösungen beim Arbeiten bei pH-Werten oberhalb 7,0 neben der naturgemäßen Instabilität der Disulfidbrücken im alkalischen Bereich zu teilweisen Zerstörungen des Insulins führen können, ist es swingend, diese Bedingungen zu vermeiden.
- In bereits bekannten Verfahren wird die Notwendigkeit der Abtrennung von im Pankreasextrakt enthaltenen Fetten und Farbstoffen vor Auftrag auf den Ionenaustauscher als grundsätzliche Voraussetzung beschrieben.
- Der Grund für diese aufwendigen Arbeiten besteht in der izzeversiblen Verschmutzung des eingesetzten Ionenaustauschers bei nicht erfolgter Abtrennung der genannten Ballaststcffe, die eine Verwendbarkeit derselben Ionenaustauscherpaokung drastich vermindert. Zur Durchführung dieser Reinigungsprozesse werden kostenaufwendige Prozesse wie die Ausfrierung des Fettes bei -35 bis -40 °C vorgeschlagen.
- Das erfindungsgemäße Ionenaustauscher-Verfahren zur Gewinnung von Insulin aus alkoholischen Pankreasextrakten zeichnet sich im Vergleich zu diesem Verfahren dadurch aus, daß der native -alkoholische Pankreasextrakt ohne vorherige Anwendung kostenaufwendiger Reinigungs- und Entfettungsprozesse auf die Austauschersäule gegeben, der Ionenaustauscher nach bekannten Methoden problemlos regeneriert werden kann und die Verwendbarkeit einer lonenaustauscherpackung bei ca. 50 Trennzyklen liegt.
- Die Aufarbeitung des insulinhaltigen Eluates im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt ohne Verdünnen der Lösung durch Fällung des Insulins mit Hilfe von zugesetzten Zinkionen und anschließender Kristallisation oder durch direkte Eristallisation des Insulins aus dem Eluat. Diese Verfahrensweise vermeidet die in früher beschriebenen Methoden angewendeten au9-wendigen Prozesse des Verdünnen des Eluats vor der Fällung mit Zink oder des Ausfällens des Insulins aus dem lösungsmittelhaltigen Eluat bei Temperaturen von -35 bis -40 °C.
- Das erfindungsgemäße Verfahren wird im allgemeinen so durchgeführe, daß das aus alkoholischen Pankreasextrakten tierischer oder menschlicher Herkunft an einem carboxylierten makropordsen Kationenaustauscher gebundene Insulin durch Einsatz saurer Wasser-LtTsuagsmittel-Gemische mit einem pH-Wert von 1,3-2,5 nahezu selektiv eluiert wird.
- Während bekannte Verfahren zur Elution des am lonenaustauscher adsorbierten Insulins eine Veränderung der Ionenstärke und/ oder des pH-Wertes bevorzugen, werden bei der vorgeschlagenen Lösung die diesen Methoden anhaftenden Nachteile wie z. B.
- eine Verunreinigung der Eluate mit Salzen und eine Umladung des Ionenaustauschers dadurch vermieden, daß die Elution des Insulins durch stufenweise oder kontinuierliche Veränderung der Lösungsmittelkonzentration und der Art des Lösungsmittels im sauren pH-Bereich erreicht wird.
- Durch Variation von Beladung des Ionenaustauschers, der Durchflußgeschwindigkeit und der Art des eingesetzten Lösungsmittels läßt sich eine weitere teilweise Fraktionierung der eluierenden Begleitstoffe erreichen, so daß eine zusätzliche Reinigung des Insulins möglich wird.
- Das as erhaltene Insulineluat kann nach den bekannten Methoden aufgearbeitet werden, bevorzugt wird aber die direkte Kristallisation des Insulins aus dem Eluat, ohne eine vorherige Isolierung des Insulins in fester Form vorzunehmen. Die erreichten Insulinausbeuten liegen bei 85-90 s der zur Adsorption eingesetzten Insulinmenge.
- Geeignete lonenaustauscher sind solche makroporösen Kopolymere, die aus Aorylsäurederivaten mit Divinylbenzol und Furktionalisierung gewonnen werden (X. B. kommerzielle Wofatite(R) des CKB).
- Geeignete organische Lösungsmittel sind z. B. flüssige, aliphatische Alkohole, flüssige, niedrig siedende aliphatische Ketone und Halbacetale und zumindest teilweise mit Wasser mischbare Ester sowie Mischungen daraus.
- Geeignete Säuren zur Einstellung der pH-Werte sind z. B. organische Säuren wie z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Weinsäure, Zitronensäure, anorganische Säuren wie z. B.
- Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäuxe.
- Die Durchführung des Austauscherprozesses kann im "batch"-sowie im Säulenverfahren durchgeführt werden. Vorsugsweise wird das Säulenverfahr en angewendet.
- Ausführungsbeispiele: 1. 6,0 1 alkoholischer Pankreasextrakt (Schwein, Rind) mit einem Insulingehalt von 50/ug/ml werden naoh vorheriger Reinigung auf eine Säule, die 100 ml Wofatit CA 20 enthält, aufgebracht.
- Nach Beendigung des Adsorptionsvorganges wäscht man den lonenaustauscher mit 2 Säulenvolumen 0,1 N Essigsäure, 60 % Ethanol. Bei einer Temperatur von 40 0C und einer Durchflußgeschwindigkeit von 300 ml/h. Anschließend erfolgt die Einstellung des pH-Wertes am Ionenaustauscher mit 2 N Essigsäure.
- Die Elution des Insulins vom lonenaustauscher wird mit 0,1 N Phosphorsäure, 25 % Ethanol durchgeführt. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt 20 ml/h, die Temperatur 40 0C. Die Insulinfraktion besitzt eine Xonzentration von 3,2 mg Insulin/ml. Nach Zugabe von Zitronensäure und -ionen erfolgt die direkte Kristallisation des Insulins aus dem Eluat.
- Ausbeute: 3517 IE/kg Pankreas (74,7 %) Aktivflät: 24 IE/mg Insulin 2. Auf bekannte Art gewonnener Pankreasextrakt von 300 kg Schweinepankreas werden auf eine Säule, die 20 1 carboxylierten (R) Kationenaustauscher enthält, aufgebracht.
- Naoh Beendigung des Adsorptions- und Waschprozesses erfolgt die pH-Einstellung des Ionenaustauschers mit 2 N Essigsäure. Die Elution der am Ionenaustauscher gebundenen Verunreinigungen wird mit 30 1 0,04 N Salzsäure, 10 * Aceton durchgeführt. Die Elution des Insulins erfolgt anschließend mit 0,02 N HCl/20 % Aceton.
- Die I?urchflußgeschwindigkeit der Elution beträgt 4,0 l/h, die Temperatur 40 °C. Das Elutionsvolumen der Insulinfraktion beträgt 15,0 1, die Insulinkonzentration 4,2 mg/ml. Nach Zusatz von 7,50 1 3,3 figer Zitronensäure und 225 ml 5 figem Zinkohlorid kristallisiert man das Insulineluat direkt.
- Ausbeute: 3816 IE/kg Pankreas (74 %) Aktivität: 24 IE/mg Insulin
Claims (11)
- Patentansprüche: 1. Verfahren zur Gewinnung von Insulin aus Lösungsmittel enthaltenden Pankreasextsakten durch Einsatz von oarboxylierten gationenaustauschern hydrophober Matrix, gekennzeichnet dadurch, daß das am Ionenaustauscher gebundene Insulin durch Wasser-Losungsmittel-Gemische im sauren pH-3ereich eluiert wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Lösungsmittel-Konzentration während der Elution o bis 30 X beträgt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Lösungsmittel-Konzentration vorzugsweise 10 bis 20 % beträgt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der pH-'Wert während der Elution 1,3 bis 3,5 beträgt.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch daß der pE-Wert während der Elution vorzugsweise 2,0 bis 2,5 beträgt.
- 6. Verfahren nach Anspraoh 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Lösungsmittel aliphatische Alkohole, aliphatische Ketone, Halbacetale sowie Ester aus aliphatischen EArbonsäuren und aliphatischen Alkoholen oder Mischungen hiervon verwendet werden.
- 7. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Wasser-Lösungsmittel-Gemische Zusätze von aromatiachen Verbindungen enthalten.
- 8. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß zur pH-Einstellung Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Weinsäure, Oxalsäure, Zitronensäure, Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure verwendet werden.
- 9. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Ionenaustauscher makroporöse Mischpolymerisate auf Acrylatbasis, mit Divinylbenzol, seinen Derivaten oder anderen Vernetzern verwendet werden.
- 10. Verfahren nach Anspruch 1 und 90 ekennzeiohnet dadurch, daß als Ionenaustauscher Wofat iteR) verwendet werden.
- 11. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß das Insulin aus dem Eluat ohne weitere Aufarbeitung direkt kristallisiert wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853511270 DE3511270A1 (de) | 1985-03-28 | 1985-03-28 | Insulin aus pankreasextrakten |
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|---|---|---|---|
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3511270A1 true DE3511270A1 (de) | 1986-10-09 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Country Status (1)
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1666048A4 (de) * | 2003-09-18 | 2009-07-01 | Tsygankov Vladimir Vladimirovi | Verfahren zur herstellung von insulin aus einer natürlichen quelle und insulin |
| WO2013048330A1 (en) * | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method for purification of cleaved pro-insulin |
-
1985
- 1985-03-28 DE DE19853511270 patent/DE3511270A1/de not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1666048A4 (de) * | 2003-09-18 | 2009-07-01 | Tsygankov Vladimir Vladimirovi | Verfahren zur herstellung von insulin aus einer natürlichen quelle und insulin |
| WO2013048330A1 (en) * | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method for purification of cleaved pro-insulin |
| US9409967B2 (en) | 2011-09-30 | 2016-08-09 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Method for purification of cleaved pro-insulin |
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