DE3586479T2 - Markierte antikoerperfragmente. - Google Patents

Markierte antikoerperfragmente.

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DE3586479T2 DE8585307064T DE3586479T DE3586479T2 DE 3586479 T2 DE3586479 T2 DE 3586479T2 DE 8585307064 T DE8585307064 T DE 8585307064T DE 3586479 T DE3586479 T DE 3586479T DE 3586479 T2 DE3586479 T2 DE 3586479T2
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Description

  • Die Erfindung betrifft biologisch verwendbare Moleküle, insbesondere solche, die mit paramagnetischen Ionen markiert sind. Diese markierten biologisch verwendbaren Moleküle sind bei diagnostischen Applikationen in vivo einsetzbar.
  • Seit einiger Zeit sind paramagnetische Metalle, z. B. Gd (III), Mg (II), Fe (III) und Cr (II) bekannt, die die Relaxationseigenschaften der kernmagnetischen Resonanz für die Bildverstärkung beeinflussen können.
  • Die Wirksamkeit paramagnetischer Metallionen bei diagnostischen Anwendungen in vivo hängt von dem Vermögen ab, das Metall an den Zielort zu bringen und durch das Metall die Wasserrelaxation in jenem Bereich bei einem NMR-Abbildungsversuch zu beeinflussen.
  • Bei der anhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 85306486.3 (Veröffentlichung Nr. 0174853), eingereicht am 12. September 1985, ist ein Antikörper-Konjugat der Formel
  • beschrieben und beansprucht, in der Ab der Rest eines Fab'-Fragments eines monoklonalen Antikörpers ist, der im Anschluß an die enzymatische Entfernung des Fc-Fragments und die reduktive Spaltung der die schweren Ketten verbindenden Disulfidbindung seine Antigen-bindende Aktivität aufrechterhält, R ein zweiwertiges organisches Kettenglied ist und R' eine zur Chelatbildung mit einem Radionuklid-Metallion befähigte Gruppe ist.
  • Es ist dort auch beschrieben und beansprucht ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörper-Konjugats zur diagnostischen oder therapeutischen Verwendung in vivo, bei dem man
  • (a) das Fc-Fragment von einem monoklonalen Antikörper enzymatisch zu einem Tumor-assoziierten Antigen spaltet, das unter Bildung eines F(ab')&sub2;-Dimeren spaltet, in dem die schweren Ketten durch eine einzelne Disulfidbindung verbunden sind,
  • (b) das F(ab')&sub2;-Dimere unter Bildung von zwei Fab'-Fragmenten mit einer freien Sulfhydrylgruppe reduziert, und (c) die Fab'-Fragmente mit einem Kupplungsmittel der Formel
  • umsetzt, worin R und R' die oben angegebene Bedeutung haben. In der anhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 89116236.4
  • (Veröffentlichung Nr. 0350972), die eine Trennanmeldung der am 12. September 1985 eingereichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 85306486.3 (Veröffentlichung Nr. 0174853) ist, wird das Kupplungsmittel der Formel (B) beschrieben und beansprucht.
  • In der anhängigen Europäischen Patentanmeldung Nr. 90111068.4 (Veröffentlichung Nr. 0397213), die eine Trennanmeldung der Europäischen Patentanmeldung Nr. 89116236.6 (Veröffentlichung Nr. 0350972) ist, wird beschrieben und beansprucht ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörper-Radionuklid-Konjugats aus einem Antikörper-Konjugat der Formel (A), worin R' eine Gruppe ist, die zur Chelatbildung mit einem Radionuklid-Metallion befähigt ist und eine größere Chelatbildungsaffinität für das Radionuklidion als 4,5-Dihydroxy-m-benzoldisulfonsäure hat, und aus einem Radionuklid-Metallion, bei dem man einen Radionuklid-Metallion-Übertragungskomplex, der ein Chelat aus 4,5-Dihydroxy-m-benzoldisulfonsäure oder deren Salz und einem Radionuklid-Metallion aufweist, mit dem genannten Antikörper-Konjugat umsetzt, wobei die Umsetzung in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert durchgeführt wird, bei dem das genannte Antikörper-Konjugat beständig ist.
  • Antikörper-Fragmente können auf verschiedenen Wegen hergestellt werden. Das Antikörpermolekül kann enzymatisch behandelt werden, um die endständigen Carboxylteile der schweren Ketten (das Fc-Fragment) zu entfernen, wobei ein zweiwertiges F(ab')&sub2;- Fragment verbleibt, d. h. zwei Fab'-Segmente, die durch eine oder mehrere, die schweren Ketten verbindende Disulfidbindungen verbunden sind. Das F(ab')&sub2;-Fragment kann dann an den die zwei schweren Ketten verbindenden Disulfidbindung(en) selektiv reduziert werden, was zur Bildung von zwei einwertigen Fab'-Fragmenten führt, die jeweils eine einzige Antigen-bindende Stelle haben.
  • Antikörpermoleküle enthalten eine Anzahl reaktionsfähiger Seitenketten, die als Kupplungsstellen für Anbindung eines Metallions an den Antikörper dienen können. Beispielsweise kann das Metall an den Antikörper durch ein Kupplungsmolekül konjugiert werden, das mit den Carboxylgruppen von Asparaginsäure- oder Glutaminsäureresten, den Aminogruppen der Lysinreste oder den aromatischen Gruppen des Tyrosins oder Histidins reaktionsfähig ist. Unglücklicherweise sind diese Reste ungeordnet über das Antikörpermolekül verteilt. Infolgedessen kann die Ankopplung eines Metalls durch diese reaktionsfähigen Gruppen an irgendeiner von einer Reihe von Stellen längs des Antikörpermoleküls erfolgen. Die Ankopplung der das Metall tragenden Hälfte an oder in der Nähe der Antigen-Bindungsstelle auf dem Antikörpermolekül könnte die Fähigkeit des Antikörpers zur Antigenbindung hemmen mit der Folge, daß die Wirksamkeit des Antikörper-Metall-Konjugats als diagnostisches oder therapeutisches Mittel verloren geht oder reduziert wird. Es besteht ein Bedarf an einem Verfahren zur Ankopplung eines Metallions, wie etwa eines paramagnetischen Metallions, an einem Antikörper, welches keinen bemerkenswerten nachteiligen Einfluß auf die Immunoreaktionsfähigkeit des Antikörpers hat.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
  • Die einzige Figur stellt eine Reihe von Bindungskurven dar, bei denen die Bindung eines Anti-CEA Fab'/Kupplungsmittel-Konjugats der Erfindung an Zellextrakte des menschlichen Kolon-Adenocarcinoms verglichen wird mit der von intaktem monoklonalem Anti-CEA IgG und F(ab')&sub2;-Fragment.
  • Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Konjugat Antikörper-paramagnetisches Ion der Formel
  • geschaffen, worin Ab der Rest eines Fab'-Fragments eines Antikörpers ist, der im Anschluß an die enzymatische Entfernung dem Fc-Fragments und die reduktive Spaltung der die schweren Ketten verbindenden Disulfidbindung seine Antigen-bindende Aktivität beibehält, R ein zweiwertiges organisches Kettenglied ist und R'' einen Chelatkomplex zwischen einem paramagnetischen Metallion und einer Gruppe R' darstellt, die eine zur Chelatbildung mit einem paramagnetischen Metallion befähigte Gruppe ist.
  • Diese Materialien sind für diagnostische und therapeutische Anwendungen in vivo einsetzbar. Die Antikörper-paramagnetisches Ion-Konjugate, die hergestellt werden durch Umsetzung eines erfindungsgemäßen difunktionellen Kupplungsmittels mit der freien Sulfhydrylgruppe eines Antikörper-Fab'-Fragments mit nachfolgender Chelatbildung mit einem paramagnetischen Metallion, behalten die Antigen-bindende Aktivität, d. h. die Immunoreaktivität der ganzen Antikörper, von denen sie sich ableiten, bei. Das difunktionelle Kupplungsmittel enthält eine Maleinimidgruppe, die bei pH 6-8 spezifisch mit der freien Sulfhydrylgruppe des Fab'-Fragments und einer Gruppe reagiert, die zur Bildung eines Chelatkomplexes mit dem paramagnetischen Metallion befähigt ist.
  • Vor der Kupplung mit dem paramagnetischen Metallion können die Antikörper-Konjugate durch die allgemeine Formel
  • dargestellt werden, worin Ab der Rest eines Fab'-Fragments eines Antikörpers ist, der im Anschluß an die enzymatische Entfernung des Fc-Fragments und die reduktive Spaltung der die schweren Ketten verbindenden Disulfidbindung seine Antigen-bindende Aktivität aufrechterhält, R ein zweiwertiges organisches Kettenglied ist und R' eine zur Chelatbildung mit einem paramagnetischen Ion oder Metallion befähigte Gruppe ist.
  • Das Antikörper-Konjugat der Formel I wird durch die chelatbildende Gruppe mit einem paramagnetischen Ion komplexiert unter Bildung eines Konjugats Antikörper-paramagnetisches Ion, das therapeutisch, z. B. als diagnostisches Abbildungsmittel in vivo, benutzt werden kann.
  • Die Antikörper-Konjugate der Formel I werden durch Umsetzung des difunktionellen Kupplungsmittels mit einem Fab'-Fragment eines Antikörpers hergestellt. Das verwendete Fab'-Fragment leitet sich von einem Antikörper ab, der zur Beibehaltung der Antigenbindenden Aktivität befähigt ist, nachdem er enzymatischen und chemischen Behandlungen unterzogen wurde, die den ganzen Antikörper zu einem Fab'-Fragment mit wenigstens einer freien Sulfhydrylgruppe umsetzen. Der ganze Antikörper wird zuerst mit einem Enzym behandelt, das eine positionsspezifische Spaltung der zwei schweren Ketten bewirkt, wobei der Fc-Teil an den endständigen Carboxylenden der schweren Ketten entfernt wird. Das resultierende F(ab')&sub2;-Antikörperfragment wird milden reduzierenden Bedingungen unterworfen, die bevorzugt die die zwei schweren Ketten verbindenden, zwischenkettigen Disulfidbindungen spalten, ohne daß gleichzeitig die zwischenkettigen Disulfidbindungen gespalten werden. So werden zwei Fab'-Fragmente erzeugt, von denen jedes wenigstens eine an den schweren Ketten hängende, freie Sulfhydrylgruppe hat. Die Sulfhydrylgruppe dient als eine Reaktionsstelle, an der das Fab'-Fragment mit dem Kupplungsmittel unter Bildung des Antikörper-Konjugats verbunden wird. Da sich diese Stelle von der Antigen-bindenden Stelle entfernt befindet, wird die Antigenbindung nicht durch das konjugierte Kupplungsmittel beeinträchtigt.
  • Wie oben angegeben, werden die freie Sulfhydrylgruppen enthaltenden Fab'-Fragmente durch enzymatische Entfernung des Fc- Teils der ganzen Antikörper mit nachfolgender Reduktion des resultierenden F(ab')&sub2;-Dimeren hergestellt. Es ist erwünscht, die gleichzeitige Spaltung der Disulfidbindungen der leicht-schweren Kette dadurch zu verhindern, daß man die Reduktion unter relativ milden chemischen Bedingungen durchführt, bei denen die zwischenkettigen Disulfidbindungen zwischen den zwei schweren Ketten selektiv reduziert werden. Vorzugsweise hat der verwendete Antikörper eine so angeordnete enzymatische Spaltungsstelle, daß die Entfernung des Fc-Teils die zwei durch eine einzelne Disulfidbindung verbundenen Hälften des F(ab')&sub2;-Dimeren zurückläßt. Die einzelne Disulfidbindung kann vorzugsweise unter milden reduzierenden Bedingungen gespalten werden, die die leicht-schweren Kettenbindungen auftrennt. Antikörper, die enzymatisch z. B. durch Pepsin oder Papain zu F(ab')&sub2;-Dimeren spalten, in denen die zwei Hälften durch mehrfache Disulfidbindungen verbunden sind, werden im allgemeinen für den erfindungsgemäßen Einsatz nicht bevorzugt, da die zur Spaltung der Mehrfachbindungen zwischen den schweren Ketten erforderlichen, relativ scharfen chemischen Bedingungen auch voraussichtlich die leicht-schweren Kettenbindungen spalten würden.
  • Antikörper, die mit Papain in Gegenwart eines Thiol aktivierenden Mittels enzymatisch spalten, liefern Fab-Fragmente, die bei der Erfindung unbrauchbar sind, da die resultierenden Antikörperfragmente keine für die Kupplung notwendigen freien Sulfhydrylgruppen haben.
  • Die bei der praktischen Durchführung der Erfindung brauchbaren Antikörper umfassen Antikörper für alle Antigene, die als wirksame in vivo-Tumormarker bekannt sind, wie carcinoembryonisches Antigen, alpha-Fetoprotein, menschliches Choriongonadotropin oder seine β-Untereinheit, Kolon-spezifisches Antigen-p, Tumorspezifisches Glycoprotein und dergleichen.
  • Antikörper der Unterklasse IgG&sub1; werden bei der praktischen Durchführung der Erfindung bevorzugt verwendet. Diese Unterklasse der Antikörper ist die überwiegende Unterklasse monoklonaler Antikörper, die durch Hybridoma-Zellen gebildet werden. Die monoklonale Antikörper erzeugenden Hybridoma-Zellen werden durch Vereinigung einer Myelom-Zelle und einer Antikörper bildenden Lymphocyte hergestellt (G. Kohler und C. Millstein, Nature (London), 256, 495-497 (1975)). Ein Beispiel eines Antikörpers zur Verwendung bei der Bildung der bei der praktischen Durchführung der Erfindung benutzten Fab'-Fragmente ist ein monoklonaler Antikörper des IgG&sub1;-Typs für das Tumor-assoziierte Antigen CEA. Dieser Murin-monoklonale Anti-CEA-Antikörper (Unterklasse IgG&sub1;) kann mit voraktiviertem, Thiol-freiem Papain nach dem Verfahren von Parham et al (J. Immunol. Methods, 53, 133-173 (1982)) unter Bildung eines F(ab')&sub2;-Fragments mit einer einzigen, die schweren Ketten verbindenden Disulfidbindung gespalten werden. Dieses Fragment wird dann mit einem reduzierenden Mittel, wie 2-Mercaptoäthanol oder Cystein, unter milden reduzierenden Bedingungen reduziert, die bevorzugt die die schweren Ketten verbindende Zwischenketten-Disulfidbindung in zwei Fab'-Fragmente mit je einer einzigen anhängenden Sulfhydrylgruppe spalten. Die Reduktion wird zweckmäßigerweise durch Inkubation in einer gepufferten Lösung bei einem oder in der Nähe von einem neutralen pH-Wert durchgeführt. Die Temperatur der Inkubation ist nicht kritisch; Raumtemperatur ist geeignet. Die Inkubation erfolgt im allgemeinen über etwa 1 bis 2 Stunden. Cystein ist das bevorzugte Reduktionsmittel für die bevorzugte Spaltung der die schweren Ketten verbindenden zwischenkettigen Disulfidbindung. Die Konzentration des Cysteins bei der Reduktionsreaktion kann etwa 2,5 bis etwa 40 mM, vorzugsweise 5 bis 20 mM sein. Bei geringeren Cysteinkonzentrationen werden wesentliche Mengen F(ab')&sub2; nicht reduziert, während höhere Konzentrationen zu der unerwünschten Spaltung der die schweren und leichten Ketten verbindenden Disulfidbindungen führen.
  • Das Antikörper-Konjugat der Formel I wird hergestellt durch Umsetzung des Fab'-Fragments mit einem Kupplungsmittel, das durch die Formel
  • dargestellt wird.
  • In der Formel II ist R ein zweiwertiger organischer Rest, der zur Verbindung der Maleinimidgruppe mit der R'-Gruppe dient. Es kann jeder zweiwertige organische Rest eingesetzt werden, der nicht mit den Seitenketten an dem Antikörpermolekül reagiert. R ist vorzugsweise -(CH&sub2;)n-, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, oder Phenylen. R ist beispielhaft - (CH&sub2;)n-, worin n die Zahl 5 oder 7 ist.
  • R' ist eine Gruppe, die zur Chelatierung des paramagnetischen Ions befähigt ist. Bei der Auswahl einer geeigneten chelatbildenden Gruppe ist eine Anzahl von Kriterien zu berücksichtigen. Die chelatbildende Gruppe sollte eine genügend hohe Stabilitätskonstante haben, um den Austausch des paramagnetischen Ions mit zirkulierendem Transferrin zu minimieren. Der Chelatkomplex sollte unter physiologischen Bedingungen thermodynamisch bestandig sein. Er sollte sich von einem Chelatbildner ableiten, der für den Wirt ungiftig ist. Außerdem sollte die chelatbildende Gruppe schwach sauer sein, so daß das Molekül infolge Bioträgerabbau extrazellulär abgesondert und dann in dem Urin ausgeschieden wird.
  • Es folgen beispielhafte Kupplungsmittel, die dazu dienen können, das paramagnetische Ion an das Fab'-Fragment anzufügen:
  • Verbindungen der Formel IIa und analoge Verbindungen können nach dem folgenden Reaktionsschema hergestellt werden:
  • Verbindungen der Formel IIb und analoge Verbindungen können nach dem folgenden Reaktionsschema hergestellt werden:
  • Das Kupplungsmittel der Formel II wird mit dem Antikörper- Fab'-Fragment unter Bildung des Antikörper-Konjugats der Formel I umgesetzt. Die Umsetzung kann wie folgt dargestellt werden:
  • worin Ab-SH das Antikörper-Fab'-Fragment darstellt und R und R' die oben definierten Bedeutungen haben.
  • Die Reaktion erfolgt in einer geeigneten Pufferlösung, wie z. B. 20 mM Phosphat, pH 7,0. Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch und liegt vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur. Bei Raumtemperatur geht die Reaktion in etwa 1 Stunde zuende. Das Produkt ,kann durch herkömmliche chromatographische Mittel isoliert werden, etwa durch Chromatographie an einer DEAE-Säule.
  • Das Antikörper-Konjugat der Formel I wird unter Chelatbildungsbedingungen mit einem paramagnetischen Metallion komplexiert. Es können alle paramagnetischen Metallionen eingesetzt werden, die bei therapeutischen oder diagnostischen Verfahren in vivo brauchbar sind und die für die Bindung an das Antikörper-Fragment erwünscht sind. Als solche paramagnetischen Ionen kann man nur beispielhaft nennen Gadolinium (III), Eisen (III), Mangan (II) und Chrom (II). Der Komplex kann durch Umsetzung des Konjugats der Formel I mit dem paramagnetischen Ion in einer gepufferten Lösung gebildet werden, in der das Konjugat physiologisch beständig ist. Das paramagnetische Ion kann nötigenfalls der Lösung als Komplex mit einem Chelatbildner-Zwischenprodukt zugeführt werden, d. h. mit einem Chelatbildner, der einen Chelatkomplex bildet, der das Metallion bei dem physiologischen pH-Wert des Antikörper-Konjugats löslich macht, aber weniger thermodynamisch beständig als der Ghelatkomplex ist, der mit dem Antikörper-Konjugat der Formel I gebildet wird. Die Kupplung des paramagnetischen Ions an das Antikörper-Konjugat der Formel I erzeugt ein Konjugat Antikörperparamagnetisches Ion der Formel
  • worin Ab und R die oben beschriebenen Bedeutungen haben und R'' einen Chelatkomplex zwischen dem paramagnetischen Ion und der oben beschriebenen Gruppe R' darstellt.
  • Das Antikörper-Metallion-Konjugat der Formel III kann in einem physiologisch zulässigen Puffer für die therapeutische oder in vivo diagnostische Verwendung formuliert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Fab'-Fragment eines Murin-monoklonalen Antikörpers für CEA (Unterklasse IgG&sub1;) an ein Kupplungsmittel der Formel II konjugiert, in der R -(CH&sub2;)&sub7;- ist und R' die Gruppe -N[CH&sub2;CH&sub2;N(CH&sub2;CO&sub2;H)&sub2;]&sub2; ist.
  • Die folgenden Beispiele sollen die praktische Durchführung
  • der Erfindung weiter erläutern. In den Beispielen haben die folgenden Bezeichnungen und Abkürzungen die unten angegebenen Bedeutungen.
  • Kupplungsmittel [((7-Maleinimidoheptyl)imino)bis(äthylennitrilo)]tetraessigsäure
  • Mab Monoklonaler Antikörper
  • SDS Natriumdodecylsulfat
  • EDTA Äthylendiamintetraessigsäure
  • ³H-NEM N-[Äthyl-2-³H]-maleinimid
  • MES 2-N-Morpholinäthansulfonsäure
  • Tiron 4,5-Dihydroxy-1,3-benzoldisulfonsäure
  • IgGSORB Staphylococcus aureus, Stamm. Cowan I Formalin-fixiert, durch Wärme abgetötet.
  • Beispiel III ist ein Vergleichsbeispiel, das ein Verfahren zur Chelatkomplexherstellung beschreibt ähnlich dem zur Einführung eines paramagnetischen Ions benutzten Verfahren, wobei aber anstelle eines paramagnetischen Ions ein Radionuklid-Metallion eingesetzt wurde. Die Beispiele IV bis VI sind ebenfalls Vergleichsbeispiele, die die Verwendung des Chelatkomplexes des Beispiels III beschreiben und die Wirksamkeit von Antikörper-Metallion-Konjugaten ähnlich denen der vorliegenden Erfindung erläutern, die aber anstelle eines paramagnetischen Ions ein Radionuklid-Metallion enthalten. Herstellung von Zellextrakten des menschlichen Kolon-Adenocarcinoms Zellextrakte wurden hergestellt aus Kolon-Adenocarcinom. Gewebe wurde zerstückelt und 3 Minuten bei 4ºC in 10 mM tris-HCl (pH 7,2), 0,2 mM CaCl&sub2; (1 gm/10 ml) homogenisiert und dann 10 Minuten bei 1000·g zentrifugiert. Die Tablette wurde in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung erneut suspendiert und bei 4ºC 1 Minute mit Intervallen von 15 Sekunden beschallt. Das beschallte Material wurde 15 Minuten mit 10 000·g zentrifugiert. Der Überstand wurde für Festphase-Radioimmunountersuchungen benutzt (Vergleichsbeispiel V).
    • Beispiel I Herstellung von [((7-Maleinimidoheptyl)imino)bis- (äthylennitrilo)]tetraessigsäure (a) Herstellung von (6-Gyanohexyl)bis(2-phthalimidoäthyl)amin
  • Ein Gemisch aus 6-Bromhexylcyanid (13,88 g, 0,073 Mol), Bis(2-phthalimidoäthyl)amin (26,52 g), 0,073 Mol) und Triäthylamin (7,37 g, 0,073 Mol) in DMF (120 ml) wurde 20 Stunden auf 100ºC erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde der gebildete Niederschlag durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde in Eis (1000 ml) eingegossen.
  • Die wäßrige Lösung wurde mit Dichlormethan (3·200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck ergab ein Rohprodukt, das an Kieselgel chromatographiert wurde (Hexane - 30% Äthylacetat/Hexane Gradienteneluierung). Die unreinen Fraktionen wurden erneut chromatographiert, um insgesamt 14,1 g (6-Cyanohexyl)bis(2-phthalimidoäthyl)amin (41 %) als Öl zu ergeben. Das Produkt ergab einen Fleck auf T1c. Das IR-Spektrum war in Übereinstimmung mit der zugeschriebenen Struktur.
    • (b) Herstellung von (6-Cyanohexyl)bis(2-aminoäthyl)amin
  • Eine Lösung von (6-Cyanohexyl)bis(2phthalimidoäthyl)amin (13,8 g, 0,029 Mol) und Hydrazin (2,15 g, 0,067 Mol) in Methanol (150 ml) wurde 1,5 Stunden unter Rückfluß gehalten und über Nacht stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand in Wasser (200 ml) aufgenommen und mit HCl auf einen pH-Wert von 2 gebracht. Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde mit festem NaOH basisch gemacht. Die Lösung wurde dann unter Vakuum konzentriert und mit Dichlormethan (4·50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter vermindertem Druck verdampft. Die Kugelrohrdestillation des Rückstands ergab reines (6-Cyanohexyl)bis(2-aminoäthyl)amin als eine wasserweiße Flüssigkeit (4,1 g - 67%), die bei 0,07 mm Hg zwischen 120 und 140ºC (Blasentemperatur) aufgefangen wurde. Das IR-Spektrum war in Übereinstimmung mit der zugeschriebenen Struktur, ebenso die Elementaranalyse.
    • (c) Herstellung von [((6cyanohexyl)imino)bis(äthylennitrilo)]tetraessigsäure.
  • Eine Lösung von Chloressigsäure (7,0 g, 0,0074 Mol) in Wasser (20 ml) wurde durch Zusatz der erforderlichen Menge einer Lösung von Natriumhydroxid (5,92 g, 0,148 Mol) in Wasser (30 ml) neutralisiert. (6-Cyanohexyl)bis(2-aminoäthyl)amin (3,72 g, 0,0175 Mol) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde sieben Stunden auf 45ºC erwärmt. Während dieser Zeit wurde der pH-Wert der Lösung durch Zusatz der übrigen NaOH-Lösung zwischen 10 und 11 gehalten. Nach zweitägigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung mit konzentrierter HCl auf pH 7 gebracht, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in heißem Methanol (300 ml) aufgenommen und filtriert. Die Entfernung des Methanols unter Vakuum ergab [((6Cyanohexyl)imino)bis(äthylennitrilo)]tetraessigsäure. Dieses Material wurde in Chargen von 2 g an einer 2·30 cm Säule aus Ionenaustauscherharz BioRad AG 7·8 in der Formiatform (Gradienteneluierung, 0-1M Ameisensäure) chromatographiert, wobei sich insgesamt 4,3 g (55%) der Tetrasäure ergaben. Das Produkt war ein Fleck auf T1c (Äthanol, 7% wäßr. NH&sub3;, 4 : 1, - Siliziumdioxidplatte). Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum war in Übereinstimmung mit der zugeschriebenen Struktur.
    • (d) Herstellung von [((7-Aminoheptyl)imino)bis(äthylennitrilo)]tetraessigsäure.
  • Eine Lösung von [((6-Cyanohexyl)imino)bis(äthylennitrilo)]tetraessigsäure (0,85 g, 0,0019 Mol) in Essigsäure (50 ml) wurde mit Platinoxid (0,15 g) behandelt und über Nacht bei 3,15 kg/cm² hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt, und das Filterkissen wurde' mit Wasser gespült. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei sich ein Rohprodukt ergab, das an einem Ionenaustauscherharz Bio Rad AG 1·8 in der Formiatform chromatographiert wurde. Die Eluierung mit Wasser ergab reine [((7-Aminoheptyl)imino)bis(äthylennitrilo)]tetraessigsäure (0,70 g, 82 %). Das Produkt war ein Fleck auf T1c. Das Proton-NMR-Spektrum und das Kohlenstoff-NMR-Spektrum waren in Übereinstimmung mit der zugeschriebenen Struktur.
    • (e) Herstellung von [((7-Maleinimidoheptyl)imino)bis(äthylennitrilo)]tetraessigsäure.
  • Eine Lösung von [((7-Aminoheptyl)imino)bis(äthylennitrilo)]tetraessigsäure (0,72 g, 1,6 mMol) in gesättigtem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat (15 ml) wurde in einem Eisbad gekühlt, und N-Carboxymethoxymaleinimid (hergestellt nach Helv. Chim. Acta, 58, 531 (1975)) (0,25 g, 1,6 mMol) wurde in einer Portion zugesetzt. Nach 20minütigem Rühren wurde das Eisbad entfernt, und die Rührung wurde 30 Minuten fortgesetzt. Die Lösung wurde mit IN HCl auf pH etwa 6 gebracht und unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde an einer 2·30 cm Säule aus Ionenaustauscherharz Bio-Rad AG 1·8 in der Formiatform (Gradienteneluierung, 0-1 M Ameisensäure) chromatographiert, wobei 0,61 g leicht unreines Produkt anfielen. Dieses Material wurde wie oben erneut chromatographiert, wobei sich reine [((7-Maleinimidoheptyl) imino)bis(äthylennitrilo)]tetraessigsäure (0,42 g, 50%) ergab.
  • Das Produkt zeigte einen Fleck auf T1c (Äthanol, 7 % wäßriges NH&sub3; 4 : 1 Kieselgelplatte).
  • Die Maleinimide konnten auf T1c als weiße Flecken auf hellgelbem Hintergrund durch Besprühen mit Reagenz A und anschließend mit Reagenz B festgestellt werden.
  • Reagenz A: 0,1% 5,5'-Dithio-bis-2-nitrobenzoesäure (DTNB) in Äthanol/tris-HCl-Puffer (pH 8,2), 1 : 1.
  • Reagenz B: 2% Natrium-2-mercaptoäthansulfonat in 80%-igem wäßrigen Äthanol.
    • Beispiel II Herstellung von Konjugat des Anti-CEA-Fab' und der [((7-Maleinimidoheptyl)imino)bis(äthylennitrilo)]tetraessigsäure (a) Herstellung von F(ab')&sub2;-Fragment aus Anti-CEA-monoklonalem Antikörper (Unterklasse IgG&sub1;).
  • Murin-anti-CEA-monoklonaler Antikörper (Unterklasse IgG&sub1;) wurde aus ascitischer Flüssigkeit durch (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Fällung und Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt. Die enzymatische Fragmentierung von intaktem Antikörper IgG&sub1; unter Bildung von F(ab')&sub2; erfolgte unter Benutzung von Thiol-freiem, voraktiviertem Papain nach Parham et al, J. Immunol. Methods, 53, 133-73 (1982). Gereinigtes F(ab')&sub2;-Fragment wurde durch sequentielle Säulenchromatographie über Whatman DE-52- und Sephadex G-100- Harze erhalten. Die denaturierende Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) zeigte, daß das isolierte Protein eine Reinheit von mehr als 95 % hatte.
    • (b) Bestimmung der Anzahl der zwischenkettigen Disulfidbindungen in dem F(ab')&sub2;-Fragment
  • Das durch Papain-Spaltung des IgG&sub1;anti-EA-monoklonalen Antikörpers erzeugte F(ab')&sub2;-Fragment hatte nach Bestimmung eine die zwei schweren Ketten verbindende, zwischenkettige Disulfidbindung. Diese Bestimmung erfolgte durch Reduktion des F(ab')&sub2;-Antikörper-Fragments mit Dithiothreit unter milden Reduktionsbedingungen, um die die zwei schweren Ketten verbindenden zwischenkettigen Disulfidbindungen und die die schweren und leichten Ketten verbindenden, zwischenkettigen Disulfidbindungen aufzutrennen und dabei die innerkettigen Disulfidbindungen intakt zu lassen. Die reduzierten Fragmente wurden dann mit³H-NEM, das mit den freien Sulfhydrylgruppen reagiert, umgesetzt und über SDS-Polyacrylamid-Gele gefahren, wobei sich Bänder entsprechend den schweren und leichten Ketten ergaben, deren freie Sulfhydrylgruppen tritiummarkiert waren. Das Gel wurde Protein-gefärbt, mit Fluorophor getränkt, getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt' um die relative Intensität in den Bändern der schweren und leichten Ketten zu bestimmen. Die Fluorophor-getränkten Bänder wurden ausgeschnitten und in einen Szintillationszähler gebracht. Unter Benutzung der Zählungen pro Minute für das der leichten Kette zugeordnete Band als ein Maß für eine Sulfhydrylgruppe wurde gefunden, daß die schwere Kette zwei Sulfhydryle enthält, von denen eine der zwischenkettigen Disulfidbindung der leichten Kette entspricht. Daher entspricht das andere Sulfhydryl einer einzigen zwischenkettigen Disulfidbindung zwischen den schweren Ketten des durch die Papain-Spaltung des gesamten CEA-Antikörpers gebildeten F(ab')&sub2;-Fragments.
    • (c) Herstellung von anti-CEA-Fab'-Fragment
  • Das eine einzige zwei schwere Ketten verbindende, zwischenkettige Disulfidbindung enthaltende anti-CEA-F(ab')&sub2;-Fragment wurde mit Cystein unter einer N&sub2;-Atmosphäre bei einer Protein-Konzentration von 1 bis 10 mg/ml reduziert. Die optimale Konzentration des Reduktionsmittels und die Inkubationszeit wurden so eingestellt, daß mehr als 85 % des F(ab')&sub2; zu Fab' reduziert wurden und weniger als 15 % zu individuellen leichten und schweren Ketten reduziert wurden. Die optimalen Reaktionsbedingungen wurden wie folgt bestimmt.
  • F(ab')&sub2;-Fragmente von monoklonalem anti-CEA (Unterklasse IgG&sub1;), die durch Papain-Spaltung des ganzen Antikörpers gebildet worden waren, wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur in einem Puffer von pH etwa 7,4 bei Cystein-Endkonzentrationen von 0, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 und 40 mM reduziert. Die resultierenden reduzierenden Fragmente wurden mit NEM umgesetzt, das die freien Sulfhydrylgruppen in einer dem Kupplungsmittel [(7-Maleinimidoheptyl)imino)bis(äthylennitrilo]tetraessigsäure analogen Weise alkyliert. Die mit verschiedenen Cystein-Konzentrationen erzeugten reduzierten Fragmente wurden in getrennten Streifen mit dem ganzen Antikörper und mit F(ab')&sub2;-Fragment als Kontrollproben auf SDS-Polyacrylamid- Gele gefahren, und die Gele wurden Protein-gefärbt. Die Beobachtung der gefärbten Gele zeigte an, daß mit wachsender Cystein-Konzentration das F(ab')&sub2;-Band allmählich verschwand und ein in dem Molgewicht dem Fab'-Fragment entsprechendes Band erschien. Die fortgesetzte Zunahme in der Cystein-Konzentration führte zu einem Verschwinden des Fab'-Bandes bei gleichzeitigem Auftreten von zwei niedermolekularen Bändern entsprechend der individuellen schweren und leichten Kette. Die optimale Cysteinkonzentration, d. h. die Konzentration, bei der das F(ab')&sub2;-Band verschwand, aber die Bänder der individuellen schweren und leichten Kette noch nicht auftraten, wurde zu 10 mM ermittelt.
  • Ähnliche Untersuchungen ergaben typische Cystein-Konzentrationen (für optimale Reduktion von F(ab')&sub2; zu Fab') von 5 mM bis 15 mM und Inkubationszeiten von 2 bis 4 Stunden bei den folgenden N&sub2;-durchgasten Puffern: 25 mM NaPO&sub4;, 2 mM Na&sub2;EDTA, 0,02% Gew./Vol. NaN&sub3; pH 7,4; 57,4 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 17,6 mM KH&sub2;PO&sub4;, 75 mM NaCl, 5 mM Na&sub2;EDTA, 0,02% Gew./Vol. NaN&sub3; pH 7,2 (RIA-Puffer); oder 25 mM Tris, 2 mM Na&sub2;EDTA, 0,02% Gew./Vol. NaN&sub3;, pH 8,0.
    • (d) Konjugationsreaktion
  • Das nach der oben beschriebenen Arbeitsweise hergestellte reduzierte anti-CEA-Fab'-Protein wurde unter einer N&sub2;-Atmosphäre durch erschöpfenden Pufferaustausch in 50 mM MES, 2 mM Na&sub2;EDTA, pH 6,5 bis 6,8, durch Membranfiltration mit einer PM10-Membran von überschüssigem Thiol-Reagenz befreit. Ein aliquoter Teil der resultierenden Lösung wurde mit ³H-NEM von bekannter spezifischer Aktivität titriert, um die Anzahl der durch das Reduktionsverfahren erzeugten freien 5H-Gruppen je Fab'- Molekül zu bestimmen. Der Rest wurde mit 10-25 mM Kupplungsmittel des Beispiels I, d. h. [((7-Maleinimidoheptyl)imino)bis(äthylen nitrilo)]tetraessigsäure, 2 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4ºC umgesetzt.
    • Vergleichsbeispiel III Herstellung des Chelatkomplexes von Indium-111 und Anti-CEA-Fab'-Konjugat
  • Zur Herstellung eines Antikörper-Radionuklid-Konjugats wurden 10 ul ¹¹¹InCl&sub3; (etwa 50 bis 100 uCi) in 50 mM HCl (Rad-Pharm) zu 5 ul 10mM Tiron, 4 mM HCl, pH 2,4, zugesetzt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 10 ul 200 mM MES, pH 6,0, und 10 ul 2-15 mg/ml des nach der Arbeitsweise des Beispiels II hergestellten Konjugats von anti-CEA-Fab' und Kupplungsmittel zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, worauf 2-5 ul zur elektrophoretischen Analyse auf einen Celluloseacetat-Streifen getüpfelt wurden. Die Elektrophorese wurde unter Benutzung von 50 mM Hepes, pH 7,0, als Elektrodenpuffer durchgeführt. In dem elektrophoretischen Feld blieb das ¹¹¹In-chelatierte anti-CEA-Fab'-Konjugat an der Ausgangsstelle, und das nicht umgesetzte Indium-111 wanderte als separate Sitze. In einer getrennten Elektrophorese wurden 7 ul des Chelatkonjugat-Reaktionsgemisches vor der Elektrophorese erst mit 2 ul einer 200 mM Na&sub2;EDTA, pH 6,0, inkubiert. Die Zugabe der EDTA verursachte eine Verschiebung der Chelatkonjugat-Spitze, wodurch angezeigt wurde, daß das chelatierte Antikörper-Konjugat beständiger als das ¹¹¹In-Tiron-Chelat war.
  • Das anti-CEA-Fab'/Indium-111-Konjugat kann in Form einer physiologisch annehmbaren, gepufferten Lösung als Tumor-Abbildungsmittel intravenös verabreicht werden, z. B. zur Abbildung der Kolon- Tumore unter Benutzung der bekannten Photoscanning-Verfahren.
    • Vergleichsbeispiel IV Immunoaffinität des Konjugats von Anti-CEA-Fab' und [((7-Maleinimidohephyl)imino)bis(äthylennitrilo)]tetraessigsäure
  • Die Immunoaffinität des nach der Arbeitsweise des Beispiels II erzeugten Konjugats monoklonales anti-CEA-Fab'/Kupplungsmittel wurde durch Radioimmuntersuchung mit CEA-Antigen bestimmt. IgGSORB (Staph A) (Enzyme Center, Boston, Massachusetts), das mit Ratteanti-Maus- Kappa (300 ug Ratte-anti-Maus-Kappa/1 ml Staph A) beschichtet war, diente zur Trennung des gebundenen von dem freien Antigen. Verdünnungsreihen des anti-CEA-Fab'/Kupplungsmittel-Konjugats (Proteinkonzentration 3,7·10&supmin;&sup8; M) wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit einer fixierten Menge ¹²&sup5;I-markiertem CEA-Antigen (218 ng) und veränderlichen Mengen unmarkiertem CEA-Antigen inkubiert. Anschließend an die Inkubation wurden 20 ul beschichtetes IgGSORB jedem Behälter zugesetzt, und die Inhalte wurden 3 Stunden inkubiert. Das IgGSORB wurde dreimal durch wiederholte Zentrifugierung und erneute Suspendierung in RIA-Puffer gewaschen. Die schließlich erhaltene Tablette wurde in einen Gamma-Zähler getan und auf Gamma-Emission analysiert. Zur Kontrolle wurden Radioimmunountersuchungen in der gleichen Weise unter Benutzung des ganzen monoklonalen anti-CEA-IgG und des F(ab')&sub2;-Fragments gefahren.
  • Die Bindungskurven (Zählungen pro Minute gegen Verdünnung des Antikörpers) wurden für jeden Antikörper oder jedes Fragment sowie für jede Konzentration des unmarkierten Antigens aufgestellt. In jedem Fall verringerte der Zusatz von unmarkiertem CEA die Bindungsaktivität. Die maximale Bindung für das monoklonale anti-CEA-IgG war 30 000 cpm (Zählungen pro Minute), für das anti-CEA-F(ab')&sub2; war sie 25 000 cpm und für das monoklonale anti-CEA-Fab'/Kupplungsmittel-Konjugat war sie 19 000 cpm. Doppeltreziproke Bindungsdarstellungen (1/gebunden gegen 1/frei) wurden bei unterschiedlichen Antikörperverdünnungen für den Antikörper und die Fragmente aufgestellt. Aus den Neigungen und den Abschnitten wurde die Bindungsaffinität für jeden Antikörper oder jedes Fragment und für jede Verdünnung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben. Sie zeigen, daß die durchschnittliche Bindungsaffinität des monoklonalen anti-CEA-Fab'/Kupplungsmittel-Konjugats etwa die gleiche war wie die des monoklonalen anti-CEA-IgG und des anti-CEA-F(ab')&sub2;. Tabelle I Antikörper Verdünnung Neigung Abschnitt (Y) Korrelationskoeffizient Affinität Durchschnittliche Affinität IgG F(ab')&sub2; Fab'/Kupplungsmittel
    • Vergleichsbeispiel V Bindungsprofil bei der Festphase-Radioimmunountersuchung
  • Fünfzig ul Zellextrakte des menschlichen Kolon-Adenocarcinoms wurden dem Polyvinylplattenbehälter zugesetzt und auf einer Bahnrührplatte der Trocknung überlassen. Dann wurden 200 ul 1%-iges Rinderserumalbumin (BSA) in Phosphat-gepufferter Salzlösung zugesetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurden 150 ul Antikörper (monoklonaler anti-CEA-IgG, F(ab')&sub2;- Fragment oder antiCEA-Fab'/Kupplungsmittel-Konjugat) unterschiedlichen Verdünnungen zugesetzt und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Behälter wurden dreimal gewaschen, und radiojodiertes Ratten-anti-Maus-Kappa wurde zugesetzt und eine Stunde inkubiert. Die Behälterinhalte wurden fünfmal mit Phosphat-Puffer gewaschen und dann auf Gamma-Emissionen analysiert.
  • Für jeden Antikörper oder jedes Fragment wurde eine Bindungskurve (Zählungen pro Minute gegen Antikörperverdünnung) aufgestellt. Die Übereinanderliegenden Kurven sind in der Figur gezeigt. Aus der Figur ist ersichtlich, daß das monoklonale anti-CEA-Fab'/Kupplungsmittel-Konjugat eine Bindungskurve zeigt, die im wesentlichen mit der des monoklonalen anti-CEA-IgG und des anti-CEA-F(ab')&sub2; identisch war.
    • Vergleichsbeispiel VI Bioverteilung von In-111/Anti-CEA-Fab'-Konjugat und I¹²&sup5;-unspezifischen Fab'-Fragmenten
  • Weibliche, aus der Kreuzung entfernt verwandter Individuen gezüchteter, Hsd athymischer nackter Mäuse (nu/nu) von Harlin Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, Indiana) wurden subcutan mit 10&sup7; LS 174 CEA geimpft, das menschliche Tumoszellen erzeugt. Als nach drei (3) Wochen die Tumore etwa 6 Gramm erreicht hatten, wurden zwei (2) Tieren entweder In-111-chelatmarkiertes Fab'-Fragment eines nach der Beschreibung in Beispiel IV hergestellten anti-GEA- monoklonaien Antikörpers oder das I-¹²&sup5;-markierte Fab'-Fragment eines isotyp angepaßten unspezifischen monoklonalen Antikörpers injiziert. Jede Gruppe von Tieren erhielt 12,5 uCi in einem ml Phosphat-gepufferter Salzlösung. Nach 24 Stunden wurde jedes Tier getötet, und Organe, Tumor und Blut wurden durch Gamma-Szintigraphie vereinigt. Die Tabelle II zeigt die Bioverteilung der spezifisch In-111-markierten und unspezifisch I-125-markierten Antikörper-Fragmente. Es ist ersichtlich, daß sich das spezifisch markierte Antikörper-Fragment an dem Tumor 5,2-fach stärker als der unspezifische Antikörper lokalisierte (Lokalisierungsindex). Die höheren Dosen von In-111 in der Niere und der Leber sind einer im Vergleich zu In-III schnelleren Ausscheidung des I-125 aus diesen Organen zuzuschreiben und weniger einer Differenz in der Aufnahme, wie sich aus der Kinetik der Leber- und Nierenaufnahme und -ausscheidung ergab (Werte nicht gezeigt). TABELLE II Bioverteilung von In-111-markierten spezifischen und I-125-unspezifischen Antikörper-Fab -Fragmenten in tumorhaltigen nackten Mäusen % Dosis/Gramm IN-111 I-125 Tukmor Niere Leber Lungen Herz Blut Tumor/Blut Lokalisierungsindex

Claims (7)

1. Konjugat aus Antikörper und paramagnetischem Ion der Formel
worin Ab der Rest eines Fab'-Fragments eines Antikörpers ist, das im Anschluß an die enzymatische Entfernung des Fc-Fragments und die Reduktionsspaltung der die schweren Ketten verbindenden Disulfid-Bindung seine Antigen-bindende Aktivität beibehält, R ein divalentes, organisches Kettenglied ist und R'' einen Chelatkomplex zwischen einem paramagnetischen Metallion und einer Gruppe R' darstellt, die eine zur Chelatbildung mit einem paramagnetischen Metallion befähigte Gruppe ist.
2. Konjugat nach Anspruch 1, in dem R unter -(CH2)n- ausgewählt ist, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 20 und Phenylen ist.
3. Konjugat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in dem R -C&sub7;H&sub1;&sub4;- oder -C&sub5;H&sub1;&sub0;- ist.
4. Konjugat nach Anspruch 1, 2 oder 3, in dem R' unter -N[CH&sub2;CH&sub2;N(CH&sub2;CO&sub2;H)&sub2;]&sub2; und CH[N(GR&sub2;CO&sub2;H)&sub2;]CH&sub2;N(CH&sub2;CO&sub2;H)&sub2; ausgewählt ist.
5. Konjugat nach Anspruch 1, in dem R -(CH&sub2;)&sub7;- und R' -N[CH&sub2;CH&sub2;N(CH&sub2;CO&sub2;H)]&sub2; ist.
6. Konjugat nach Anspruch 1, in dem R -(CH&sub2;)&sub5;- und R' -CH[N(CH&sub2;CO&sub2;H)&sub2;]CH&sub2;N(CH&sub2;CO&sub2;H)&sub2; ist.
7. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats nach Anspruch 1, bei dem man ein Antikörper-Fab'-Fragment eines Antikörpers mit einem Kupplungsmittel paart, das eine Verbindung der Formel
aufweist, worin R ein divalenter, organischer Rest und R' eine zur Chelatbildung mit einem paramagnetischen Metallion befähigte Gruppe ist, und anschließend einer Chelatbildung mit einem paramagnetischen Ion unterzieht.
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