DE3587687T2

DE3587687T2 - Monoklonale Antikörper für HbA1c.

Info

Publication number: DE3587687T2
Application number: DE89100369T
Authority: DE
Inventors: Wallace Haigh; William Dr Knowles; Vincent Dr Marchesi
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1984-10-29
Filing date: 1985-10-17
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2005-10-18
Also published as: JPH0751087A; EP0185870A2; ES8705633A1; EP0185870B2; FI854187A0; DK130791D0; ES548270A0; IE852655L; DK165327B; EP0316306A3; JPH0723891B2; EP0316306B1; AU594651B2; DE3586679T3; NZ213959A; DK494085A; IL76827A; JPS61172064A; EP0185870A3; CA1339952C

Description

Diese Erfindung betrifft die Bestimmung der glucosylierten Form von Hämoglobin, die als Hb A1c bekannt ist. Die Bestimmung des Glucosylierungsgrads von Hämoglobin im Blut einer Einzelperson ist ein nützlicher Index für die Glucosespiegelkontrolle bei Diabetikern. Monoklonale Antikörper werden zur Verfügung gestellt, die spezifisch den glucosylierten N-terminalen Peptidrest in Hb A1c erkennen.
Hämoglobin ist ein tetrameres Protein, das aus vier Ketten (Untereinheiten) von Aminosäuren mit jeweils etwa 143 Einheiten besteht, und hat ein Gesamtmolekulargewicht von etwa 64.000. An einem Ende des Moleküls (dem NH&sub2;-Terminus der β-Untereinheit) liegt eine Valineinheit vor, die mit Glucose reagieren kann. Die Glucosylierung von Hämoglobin geschieht durch eine nicht-enzymatische Reaktion von Glucose und der α-Aminogruppe von Valin. Nach Bildung einer Schiff-Base zwischen den Reaktanten findet bei der Glucose eine Amadori-Umlagerung statt, wodurch 1-Deoxyfructo-valin gebildet wird. Dieser Komplex ist kovalent und im wesentlichen irreversibel. Die Glucosylierungsreaktion wird bestimmt durch die Konzentration der Reaktanten, z. B. Hämoglobin und Glucose. Bei einer normalen (Nicht-Diabetiker) Person sind etwa 3% des Gesamthämoglobins glucosyliert. Hämoglobintetramere mit 1-Deoxyfructo-valin am N-Terminus einer P-Kette werden als glucosyliertes oder A1c-Hämoglobin bezeichnet.
Die Glucosespiegel bei Diabetikern sind hinreichend hoch, um den Glucosylierungsgrad in direkter Abhängigkeit vom Glucosespiegel im Blut zu erhöhen, was die Ernsthaftigkeit des diabetischen Zustands widerspiegelt. Mit Hämoglobin steigt der A1c-Spiegel auf etwa 5 bis 12% an. Da die Lebensdauer von Hämoglobin im Blutkreislauf etwa 120 Tage beträgt, wird eine Messung des glucosylierten Hämoglobins einen Wert ergeben, der für diesen Zeitraum einen durchschnittlichen Glucosespiegel widerspiegelt. Bemerkenswerterweise wird eine glucosereiche Mahlzeit nicht in einem hohen glucosylierten Hämoglobin- oder Serumalbuminspiegel reflektiert. Daher ergibt die Messung des Gehalts an glucosyliertem Hämoglobin ein echteres Bild des durchschnittlich im Kreislauf befindlichen Glucosespiegels und so ein echteres Bild des Langzeitzustands des Patienten.
US-PS 4 247 533 offenbart eine analytische Technik, bei der dem Bericht nach in einem speziellen Schaf durch Injektion von Hb A1c Antikörper gegen Hb A1c erzeugt wurden und mit nicht-glucosyliertem Hämoglobin absorbiert wurden, wodurch polyklonale Antikörper entstanden, die zwischen Hb A1c und nicht-glucosyliertem Hb unterschieden. Solche Antikörper bilden dann die Basis für einen Test zur Bestimmung des Anteils von glucosyliertem Hämoglobin in einer Probe. Der Test erfordert jedoch ein geeignet immunisiertes Schaf und Antikörperabsorption, um die geeignete Spezifität zu erzielen. Es ist daher kostspielig und schwierig, spezifische polyklonale Antikörper herzustellen. Die Antikörperpräparate, die auf diesem Absorptions- Weg hergestellt wurden, haben dem Bericht nach einen niedrigen Titer und niedrige Affinität. Die Reproduzierbarkeit dieses Weges ist ebenfalls fragwürdig, da es keine Berichte aus jüngerer Zeit gibt, die seine Verwendung für die Analyse von klinischen Proben von menschlichem Hämoglobin beschreiben.
Ein weiterer Versuch, Antikörper zu erhalten, die spezifisch auf Hb A1c sind, wird in US-PS 4 478 744 gefunden. In dieser Arbeit wurde ein synthetisches Peptidimmunogen anstelle des normalen Hämoglobinmoleküls als Immunisierungsmittel eingesetzt. Dieses Material wurde in ein Tier injiziert, das normalerweise kein Hb A1c in seinem Blut hat, z. B. einem Schaf. Das synthetische Peptidimmunogen umfaßte einen glucosylierten Peptidrest mit einer Aminosäuresequenz, die dem Teil zwischen den ersten 4 bis 10 Aminosäuren in der N-terminalen Hämoglobinsequenz entsprach. Folgeuntersuchungen, die nachfolgend wiedergegeben werden, ergaben, daß das polyklonale Schaf-Antiserum, das gegen das synthetische Peptidimmunogen erzeugt wurde, keine detektierbare Spezifität für die glucosylierte Form Hb A1c hat.
Allgemeine Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind in der Literatur gut beschrieben, einschließlich in David et al, Clinical Chemistry, Bd. 27, Nr. 9 (1981), Seiten 1580 bis 1585.

DEFINITIONEN

AMINOSÄURE ABKÜRZUNG
Arginin Arg
Asparaginsäure Asp
Glutaminsäure Glu
Lysin Lys
Serin Ser
Asparagin Asn
Glutamin Gln
Glycin Gly
Prolin Pro
Threonin Thr
Alanin Ala
Histidin His
Cystein Cys
Methionin Met
Valin Val
Isoleucin Ile
Leucin Leu
Tyrosin Tyr
Phenylalanin Phe
Tryptophan Trp
Die vorliegende Erfindung zielt auf die hochspezifische Bestimmung von glucosylierten Proteinen, wie glucosyliertem Hämoglobin und Albumin und insbesondere Hb A1c in biologischen Flüssigkeiten, wie Blut, ab. Es wurde gefunden, daß monoklonale Antikörper, die gegen die synthetischen glucosylierten N-terminalen Peptidreste, die in Hb A1c auftreten, erzeugt wurden, spezifisch an solche Reste in der glucosylierten β-Untereinheit von Hämoglobin binden. Die Antikörper können auf einer Reihe von Wegen nach herkömmlichen monoklonalen Techniken hergestellt werden. Prinzipiell werden die Antikörper gegen ein synthetisch abgeleitetes Immunogen hergestellt, das den gewünschten glucosylierten N-terminalen Peptidrest umfaßt, der chemisch an einen immunogenen Träger gebunden ist, wobei das glucosylierte Peptid mindestens 2 und vorzugsweise etwa 5 bis 15 Aminosäureeinheiten hat, die Hb A1c entsprechen. Die resultierenden Antikörper sind spezifisch auf das glucosylierte synthetische Peptid und das entsprechende exponierte Epitop im Hämoglobin A1c-Molekül.
Die Figuren sind Graphen, die Daten aus Experimenten darstellen, die in den nachfolgenden Beispielen beschrieben werden und sich auf die Immunodetektion von Hb A1c beziehen.
Fig. 1 ist ein Graph, der die Inhibierung der Ab-3-Bindung an A1c durch das Glycopeptid 1 (Peptid 1) darstellt. Der Antikörper wurde mit Glycopeptid vor Übertragung auf eine A1c-beschichtete Mikrotiterplatte präinkubiert. Der monoklonale Antikörper, der an A1c bindet, wurde unter Verwendung eines sekundären Antikörper-Enzyms verwendet. Die Ergebnisse werden in Fig. 1 als Prozent Inhibierung aufgetragen, wobei 0% Inhibierung der Wert ist, der ohne kompetitive Substanz erhalten wurde. Die O-O-Linie stammt von einem identischen Peptid, dem das Kohlehydrat fehlt, was bedeutet, daß das Kohlehydrat für die Antikörperbindung wesentlich ist. Alle Punkte sind Mittelwerte aus drei Messungen.
Fig. 2 ist ein Graph, der die Inhibierung der Ab-3-Bindung an A1c durch Glycopeptid 3 abbildet (Peptid 3). Das Kompetitivexperiment wurde wie in Fig. 1 beschrieben durchgeführt.
Fig. 3 ist ein Graph, der die Inhibierung von Ab-3 und Ab-4 durch Glycopeptid 4 (Peptid 4) bezüglich der A1c-Bindung abbildet. Das Kompetitivexperiment wurde wie für Fig. 1 beschrieben durchgeführt.
Fig. 4 ist eine typische Standardkurve bei optimalen Assaybedingungen. Der Standard aus vollständigem Blut wurde unter Verwendung von verschiedenen Anteilen von denaturiertem vollständigen Blut von einem Diabetiker mit 12,66% A1c, wie gemessen durch HPLC-Ionenaustausch, mit vollständigem Blut von einem normalen Spender (3,83% A1c) hergestellt. Alle Punkte der Dreifachmessungen sind eingetragen.
Fig. 5 ist eine Standardkurve unter Verwendung eines synthetischen Peptidstandards. Der Assay wurde wie für Fig. 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle der Verwendung von vollständigem Blut verschiedene Mengen von synthetischem Glycopeptid als kompetitive Substanz verwendet wurden. Alle Werte der Dreifachbestimmungen wurden aufgetragen.
Fig. 6 ist ein Graph, der einen Vergleich der Immunoassaymethode mit der Boronat-Affinitätsmethode für Spender abbildet. Der Mittelwert aus Dreifachbestiumingen wird als Immunoassaykoordinate aufgetragen.
Fig. 7 ist ein Graph, der die Exposition des Hämoglobin A1c-Epitops unter verschiedenen Denaturierungsbedingungen zeigt.
Fig. 8 ist ein Graph, der die Ergebnisse der Immunisierung eines Schafs mit dem synthetischen Glycopeptid von Beispiel 1(b) zeigt.
Fig. 9 ist ein Graph, der zeigt, daß monoklonale Maus-Antikörper spezifisch für A1c-Hämoglobin sind.
Die Immunoassaybestimmung von Hb A1c unter Verwendung des vorliegenden Antikörper-Reagens kann im wesentlichen nach einer beliebigen herkömmlichen Technik durchgeführt werden. Solche Techniken schließen die eher klassischen Techniken ein, wie Immunodiffusion, Immunoelektrophorese, Agglutinierungstechniken und Komplementfixierung, ebenso wie die eher gängigen Techniken, die die Verwendung von spezifisch detektierbaren Markern, wie Radioimmunoassay- und Nicht-Radioisotopenmethoden, umfassen. Die Durchführung eines Immunoassays für Hb A1c unter Anwendung der vorliegenden Erfindung schließt die folgenden wesentlichen Schritte ein: Behandlung der betreffenden wäßrigen Testprobe zur effektiven Denaturierung einer signifikanten Menge eines solchen Proteins darin, so daß das gewünschte lineare Peptidepitop exponiert wird; Kontaktieren der denaturierten Probe mit dem Antikörper-Reagens und Bestimmung der Bindung des Antikörper-Reagens an ein solches Protein. Der Bestimmungsschritt wird selbstverständlich, je nach der eingesetzten Immunoassay-Grundtechnik, variieren. Eine gewöhnliche Technik zur Durchführung dieser Bestimmung schließt die Verwendung eines markierten Reagens ein, das entweder mit dem Analyten oder dem Antikörper- Reagens in Wechselwirkung tritt und auf eine Weise eingesetzt wird, daß es die Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem Analyten und dem Antikörper- Reagens anzeigt oder mit einer solchen Bildung konkurriert.
Die letzterwähnten Techniken können in einer breiten Vielzahl von Formen durchgeführt werden, wie etwa der Ausführungsform unter Verwendung von kompetitiver Bindung, worin man ein markiertes Reagens mit dem Proteinanalyten um die Bindung an das Antikörper-Reagens konkurrieren läßt. Die Menge an markiertem Reagens, das an das Antikörper-Reagens gebunden ist, oder die freie Spezies, die aus dem markierten Reagens besteht, das so nicht gebunden ist, wird auf geeignete Weise gemessen und kann eindeutig mit der Menge des Proteinanalyten in der Probe verknüpft werden. Da das Antikörper-Reagens der vorliegenden Erfindung auf ein lineares Epitop in dem Proteinanalyten gerichtet ist, kann das markierte Reagens eine markierte Form des denaturierten Proteins oder ein denaturiertes Fragment davon sein oder, bevorzugt, eine markierte Form eines Peptidrests, der die Aminosäuresequenz des linearen Epitops umfaßt. Das letztere bevorzugte Reagens kann durch gängige Peptidsyntheseverfahren und -vorrichtungen hergestellt werden und erfordert keine Isolierung, Reinigung und Denaturierung des Proteinmoleküls selbst.
Eine weitere verwendbare Immunoassaytechnik zur Detektion von Proteinanalyten ist eine, die als Sandwich-Technik bekannt ist. In diesem Verfahren setzt man zwei Arten von Antikörper-Reagenzien ein, wovon der eine markiert ist und der andere darauf eingestellt ist, eine Trennung des letztendlich markierten Antikörper-Reagens, das an den Proteinanalyten gebunden ist, von dem, der ungebunden ist, zu bewerkstelligen. Das unmarkierte zweite Antikörper-Reagens liegt typischerweise in einer immobilisierten oder immobilisierbaren Form vor, wie es Stand der Technik ist.
Bei Radioimmunoassays müssen die freien Spezies und die gebundenen Spezies physikalisch unterschieden oder getrennt werden, um die Markierung zu messen, da das Signal, das durch die Markierung erzeugt wird, qualitativ dasselbe bei beiden Spezies ist. Eine solche Technik ist im Stand der Technik aufgrund des Erfordernisses der Phasentrennung als heterogene Technik bekannt. Andere heterogene Immunoassaytechniken sind bekannt, einschließlich enzymmarkierter Immunoassays, welche manchmal als ELISA-Techniken (siehe US-PS 3 654 090) bezeichnet werden, und Fluoreszenz-Immunoassays (siehe US-PS 4 201 763; 4 133 639 und 3 992 631)
Vor recht kurzer Zeit wurden zahlreiche Immunoassaytechniken entwickelt, welche den Trennungsschritt durch die Verwendung einer Markierung umgehen, deren detektierbares Signal bei der Bindung des markierten Reagens durch einen Bindungspartner, z. B. einen Antikörper, moduliert wird. Solche Techniken sind als homogene Techniken bekannt und sind, wenn sie zur Verfügung stehen, bevorzugt zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, da keine Trennungen erforderlich und keine Radioisotope beteiligt sind. Einige solcher Techniken sind Fluoreszenz-Quenching und -Verstärkung (siehe US-PS 4 160 016), Energieübertragungs-Immunoassay (siehe US-PS 3 996 345) und Doppelantikörper-sterische Hinderungs-Immunoassay (siehe US-PS 3 935 074 und 3 998 943). Besonders bevorzugte homogene Immunoassaytechniken sind solche, die eine Markierung verwenden, die an einer enzymkatalysierten Reaktion teilnimmt. Beispiele sind die substratmarkierten Immunoassays (siehe US-PS 4 279 992 und GB-Patentanmeldung 1 552 607), der prosthetische Gruppen (FAD)-markierte Immunoassay (siehe US-PS 4 238 565), der Enzymmodulator-markierte Immunoassay, z. B. unter Verwendung von Inhibitormarkern (siehe US-PS 4 134 972 und 4 273 866) und der enzymmarkierte Immunoassay (siehe US-PS 3 817 837).
Das monoklonale Antikörper-Reagens der vorliegenden Erfindung ist gekennzeichnet durch seine spezifische Bindungsaffinität zum linearen Peptidepitop in Hb A1c. Daher wird der Begriff "Antikörper-Reagens", wie hierin verwendet, einen beliebigen Stoff bezeichnen, wie auch immer er erhalten wurde, der eine monoklonale Antikörper-Bindungsstelle, die für ein solches Peptidepitop spezifisch ist, umfaßt. Ein solcher Ausdruck schließt daher vollständige Antikörper ebenso ein wie geeignete Fragmente oder polyfunktionalisierte Formen davon. Wenn er in Form eines vollständigen Antikörpers vorliegt kann er zu einer der Klassen und Subklassen bekannter Immunoglobuline gehören, z. B. IgG, IgM usw . . Ein beliebiges Fragment eines solchen Immunoglobulins, das eine spezifische Bindungsaffinität für das Peptidepitop behält, kann ebenfalls verwendet werden, beispielsweise Fragmente von IgG, die herkömmlicherweise bekannt sind als Fab, Fab' und F(ab')&sub2;. Zusätzlich können Aggregate, Polymere, Derivate, Konjugate und Hybride von Immunoglobulinen oder deren Fragmenten verwendet werden, wo es angezeigt ist. Die Immunoglobulinquelle für das monoklonale Antikörper-Reagens kann durch eine beliebige verfügbare monoklonale Technik erhalten werden. Somit können die Immunoglobuline durch somatische Zellhybridisierung erhalten werden, wodurch ein Ergebnis erzielt wird, das man gewöhnlich als monoklonale Antikörper bezeichnet. Hybridoma-Zellinien werden zur Produktion von Antikörpern gegen nur den linearen Peptidepitopteil des Proteinmoleküls gezüchtet, anstatt gegen das gesamte Protein, und solche Zellinien und deren Antikörper werden gescreent, um diejenigen monoklonalen Antikörper zu identifizieren und zu isolieren, die selektiv mit dem gewünschten Epitop reagieren werden. Bei einem Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper wird ein Fragment der Proteinkette, das der natürlich auftretenden linearen Peptidepitopsequenz entspricht und diese umfaßt, an einen Proteinträger gekoppelt und in ein Labortier zur Erzielung einer Immunantwort injiziert. Alternativ dazu kann das Immunogen eine linearisierte oder denaturierte Form des Proteins oder eines Fragments davon umfassen. Lymphocyten, wie Milzzellen des immunisierten Tieres, werden mit Myelomazellen zur Herstellung von Hybridoma fusioniert, welche dann kultiviert und zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gescreent werden. Die monoklonalen Antikörper werden nach solchen untersucht (gescreent), die selektiv für das Peptidepitop sind, und die spezielle Zellinie wird zur Verwendung bei der Herstellung weiterer Mengen des monoklonalen Antikörpers kloniert.
Zur Herstellung von Antikörpern gegen ein synthetisches Peptidimmunogen im Labortier, z. B. BALB/c-Mäusen, Ratten oder dergleichen, wird ein Peptid, das das gewünschte Epitop umfaßt, aus dem natürlich auftretenden Protein hergestellt und isoliert oder wird chemisch synthetisiert und gereinigt. Ein solches Proteinfragment wird alle kritischen Aminosäureeinheiten des gewünschten Epitops enthalten und kann weitere Aminosäureeinheiten enthalten, von denen wahlweise einige oder alle der Sequenz der Aminosäuren im jeweils interessierenden Protein entsprechen.
Um sicherzustellen, daß das epitophaltige Peptidfragment optimal antigen ist, kann es vorteilhafterweise mehrfach an ein immunogenes Trägermaterial gekoppelt werden. Das immunogene Trägermaterial kann aus beliebigen herkömmlicherweise bekannten Materialien ausgewählt werden, die funktionelle Gruppen haben, die zur Kopplung an den Peptidrest zur Verfügung stehen. In den meisten Fällen wird der Träger ein Protein oder Polypeptid sein, obwohl andere Stoffe, wie Kohlehydrate, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Nucleinsäuren und dergleichen von hinreichender Größe und Immunogenität in gleicher Weise verwendet werden können. Meistenteils werden immunogene Proteine und Polypeptide Molekulargewichte zwischen 4000 und 10.000.000 haben, vorzugsweise mehr als 15.000 und noch häufiger größer als 50.000. Im allgemeinen werden Proteine, die aus einer Tierspezies entnommen wurden, immunogen sein, wenn sie in den Blutkreislauf einer anderen Spezies eingebracht werden. Besonders nützliche Proteine zu diesem Zweck sind Albumine, Globuline, Hämocyanine, Gluteline und dergleichen. Weiterhin können bezüglich der herkömmlichen immunogenen Trägermaterialien des Standes der Technik und Techniken zur Kopplung von Haptenen daran folgende Referenzen angeführt werden: Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, New Jersey, USA, 1976); Butler, J. Immunol. Meth. 7 : 1-24 (1974; Weinryb and Shroff, Drug Metab. Rev. 10 : 271-283 (1974); Broughton and Strong, Clin. Chem. 22 : 726-732 (1976); und Playfair et al, Br. Med. Bull. 30 : 24-31 (1974).
Die Anzahl an Epitopen, die an einen gegebenen immunogenen Trägerstoff gekoppelt ist, wird nur durch die Anzahl der verfügbaren Kopplungsstellen am Träger beschränkt und kann so hoch sein wie einige Tausend, im Fall von bestimmten synthetischen Polypeptiden mit hohem Molekulargewicht, wie Polylysin. Die Epitopdichte auf einem speziellen Träger wird vom Molekulargewicht des Trägers und der Dichte verfügbarer Kopplungsstellen abhängen. Optimale Epitopdichten liegen in Anbetracht der Leichtigkeit und Reproduzierbarkeit der Synthese des Immunogens und der Antikörper-Response im Bereich zwischen etwa 10 und etwa 50% der verfügbaren Kopplungsgruppen auf dem beteiligten Träger.
Die Peptidfragmente werden an den Trägerstoff durch ein beliebiges herkömmliches Kopplungsverfahren gebunden. Funktionelle Gruppen an den nativen Aminosäuren im Fragment oder funktionelle Gruppen, die durch chemische Modifizierung des Fragments eingeführt wurden, werden normalerweise verwendet, um direkt oder durch bifunktionelle Kopplungsmittel an funktionelle Gruppen am Träger zu koppeln. Bevorzugt ist, das Peptidfragment so zu gestalten, daß es eine einzige und in einer einzigen Weise reaktive funktionelle Gruppe hat, um eindeutige Kopplung an den Träger zu erzielen.
Es wurde gefunden, daß monoklonale Antikörper, die gegen die synthetischen glucosylierten N-terminalen Peptidreste, die in Hb A1c vorliegen, erzeugt wurden, spezifisch an solche Reste in der glucosylierten β-Untereinheit von Hämoglobin binden. Die Antikörper können auf einer Reihe von Wegen nach herkömmlichen monoklonalen Techniken hergestellt werden. Prinzipiell werden die Antikörper gegen ein synthetisch erzeugtes Immunogen hergestellt, das den gewünschten glucosylierten N-terminalen Peptidrest chemisch gebunden an einen immunogenen Träger umfaßt, wobei das glucosylierte Peptid mindestens 2 und vorzugsweise etwa 5 bis 15 Aminosäureeinheiten hat, die Hb A1c entsprechen. Die resultierenden monoklonalen Antikörper sind spezifisch für das glucosylierte synthetische Peptid und das entsprechende exponierte Epitop des Hämoglobin A1c-Moleküls.
Monoklonale Antikörper, die spezifisch für Hb A1c aus menschlichem Blut sind, werden durch Hybridoma ausgeschieden, die aus der Fusion von Myelomzellen und Lymphocyten, die einem Tier entnommen wurden, das mit einem synthetischen Peptidimmunogen immunisiert worden war, abgeleitet sind. Das synthetische Peptidimmunogen wird vorzugsweise von der Formel sein:
[Glyco-(NH)Val-His-AA-R]-n-Träger
worin Glyco-(NH)Val einen nicht enzymatisch glucosylierten Valinrest darstellt, His die zweite Aminosäure in der nativen β-Hb-Untereinheit-Sequenz darstellt, AA eine Bindung oder ein oder mehrere Aminosäurereste ist, R eine geeignete verbindende Gruppe ist, "Träger" ein immunogenes Trägermaterial ist und n (die Epitopdichte) durchschnittlich 1 bis die Anzahl verfügbarer Kopplungsstellen am Träger beträgt. Die verbindende Gruppe R kann aus einem beliebigen gewünschten Kopplungsreagens bestehen und AA kann einen oder mehrere weitere Aminosäurereste umfassen, die dem Kohlehydrat-tragenden N-Terminus der β-Untereinheit von menschlichem Hämoglobin entsprechen. Beispielsweise kann -AA- ausgewählt werden aus der folgenden Aminosäuresequenz oder einem beliebigen kontinuierlichen Fragment daraus, das mit der Leucineinheit beginnt: -Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-. Außerdem kann die verbindende Gruppe R aus zusätzlichen Aminosäureeinheiten bestehen, die nicht in normalem menschlichen Hämoglobin gefunden werden, doch die vorteilhaft durch Peptidsyntheseverfahren hinzugefügt werden und als nützliche funktionelle Gruppen zur Kopplung an den Trägerstoff dienen können. Eine besonders nützliche verbindende Gruppe ist -Tyr-Tyr-Cys, die eine einzige Thiolgruppe zur kontrollierbaren Kopplung der glucosylierten Peptideinheit an Trägerstoffe zur Verfügung stellt.
Der monoklonale Hb A1c-Antikörper der vorliegenden Erfindung ist hauptsächlich durch seine Spezifität zur Bindung an die glucosylierte Form der N-terminalen Peptidsequenz der β-Untereinheit von menschlichem Hämoglobin gekennzeichnet. Dieser glucosylierte Rest ist das unterscheidende Strukturmerkmal von Hb A1c. Ein Antikörper der vorliegenden Erfindung erfordert ein Epitop oder eine Determinante, welche mindestens die 1-Deoxyfructosylkohlehydrat-Einheit umfaßt, welche durch Amadori-Umlagerung des Reaktionsprodukts zwischen Glucose und dem terminalen Amin gebildet wurde, und eine Peptidsequenz, die davon ausgeht und mindestens eine der Aminosäureeinheiten der Hb A1c-N-terminalen Sequenz in einer Position, wie sie der nativen Hb A1c-Sequenz entspricht, umfaßt. Die anderen Aminosäureeinheiten in der Peptidsequenz, die das Epitop charakterisieren, können gleich oder verschieden sein wie diejenigen, die in der nativen Hb A1c-Sequenz auftreten. Auf diese Weise ist das Epitop durch mindestens zwei Kontakt oder Bindungsstellen mit dem Antikörper charakterisiert, wobei die Stellen einzigartig typisch für die glucosylierte N-terminale Hb A1c-Sequenz sind. Vorzugsweise wird der Antikörper spezifisch einen glucosylierten Peptidrest der Formel:
Glyco-(NH)Val-His-AAbinden, worin Glyco-(NH)Val und AA wie oben definiert sind. Man fand, daß besonders bevorzugte monoklonale Antikörper spezifisch für den glucosylierten Dipeptidrest sind, unabhängig von der Natur von AA. Antikörper mit einer Spezifität, die glucosylierte Peptidsequenzen von größerer Länge erfordert, sind ebenfalls erhältlich, wobei AA eine Sequenz von 1 bis 12, vorzugsweise 1 bis 6 Aminosäuren ist, die dem N-Terminus der β-Untereinheit von menschlichem Hämoglobin entspricht. Eine solche Spezifität des monoklonalen Antikörpers erlaubt die spezifische Detektion des exponierten glucosylierten N-terminalen Peptidrests in Hb A1c unter im wesentliche Ausschluß anderer glucosylierter Peptidepitope bei Hämoglobin und anderen Proteinen und Peptiden, die nativ in menschlichem Blut vorliegen.
Der glucosylierte N-terminale Peptidrest am nativen Hb A1c-Molekül wird dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon durch geeignete Denaturierung oder Verdauung des Proteins in der zu untersuchenden Probe zugänglich gemacht. Eine Hypothese, die dem Erfolg der vorliegenden Erfindung beim Erhalt von spezifischen Antikörpern zugrunde liegt, wo Versuche des Standes der Technik fehlschlugen, wird im folgenden diskutiert, doch sollte ihre Richtigkeit nicht als kritisch für die erfinderische Tätigkeit der vorliegenden Erfindung gewertet werden. Die N-terminale Sequenz der β-Untereinheit von menschlichem Hämoglobin ist der entsprechenden Sequenz von Maus-Hämoglobin recht ähnlich, wobei die ersten vier Aminosäuren identisch sind. Zweitens wird Maus-Hämoglobin etwa in demselben Ausmaß wie menschliches Hämoglobin glucosyliert. Damit würde die N-terminale Sequenz der β-Untereinheit im nativen menschlichen Hämoglobinmolekül von der Maus nicht als fremd erkannt werden und eine Immunantwort würde nicht erwartet werden. Dies ist die Logik der Arbeiten des Standes der Technik, die entsprechend ein Tier (Schaf) wählten, das eine recht verschiedene Hämoglobin-Proteinsequenz hat und die nicht glucosyliert wird, in der Hoffnung, so eine Immun-Response zu erhalten. Jedoch ergab die vorliegende Erfindung, daß, wenn der glucosylierte N-terminale Rest dem Maus- Immunsystem in Form eines synthetischen Peptidimmunogens ausgesetzt wird, das Epitop in einer Konfiguration dargeboten wird, auf die die Maus immunologisch antworten kann. Durch somatische Zellklonierungstechniken können Hybridomas, die hochspezifische Antikörper ausscheiden, isoliert werden. Die ausgeschiedenen Antikörper werden an den glucosylierten N-terminalen Peptidrest im nativen Hämoglobinmolekül binden, wenn er hinreichend zur Wechselwirkung mit der Kombinationsstelle am Antikörper exponiert wurde. Die Art und Weise der Exposition des Epitops wird in größerer Ausführlichkeit nachfolgend diskutiert.
Der sterische Zugang des Antikörper-Reagens an das Epitop kann auf eine beliebige effektive Weise erhalten werden. Man weiß, daß die Exposition des Epitops im intakten Protein durch physikalische oder chemische Denaturierung oder Verdauung zumindest in der Gegend des Epitops erreicht werden kann. Eine solche Denaturierung oder Verdauung kann auf die Gegend des Epitops beschränkt werden oder kann eine allgemeinere oder sogar im wesentlichen vollständige Denaturierung der Tertiär- und außerdem der Sekundärstruktur des Proteins oder eine teilweise oder vollständige Verdauung des Proteins einschließen.
Die Denaturierung kann auf eine Reihe von Wegen erreicht werden, einschließlich herkömmlicher Behandlung des Proteins durch physikalische Mittel, wie Hitze, Ultraschall, hohen oder niedrigen pH und, wie bevorzugt, chemische Denaturierung durch Verdauung oder Wechselwirkung mit einem chaotropen Agens oder Chaotropen in Lösung. Nützliche chaotrope Agenzien schließen ohne Beschränkung ein: Guanidin, Harnstoff und verschiedene Detergenzien, wie Natriumdodecylsulfat (SDS) und andere ohne Beschränkung, einschließlich Deoxycholat und verschiedene Gallensalze, 3-(3-Cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio-1-propansulfonat, organische Lösungsmittel, wie Methanol, Propanol, Acetonitril, und gewisse Salze, wie Kaliumthiocyanat. Nicht-ionische Detergenzien, wie Triton X®, Tween®, Nonidet NP-40® und Octylglucoside können ebenfalls als proteindenaturierende Mittel fungieren. Einschluß von Reagenzien (z. B. Mercaptoethanol oder Dithiothreitol), die Disulfidbindungen reduzieren, kann das Denaturierungsverfahren effizient beschleunigen. Proteindenaturierung kann am wirkungsvollsten erreicht werden, wenn Kombinationen von chemischen und/oder chemischen und physikalischen Mitteln verwendet werden (z. B. Guanidin und Hitze, Guanidin und SDS oder Guanidin und Dithiothreitol). Besonders starke Chaotrope, wie Guanidin, werden besonders bevorzugt. Natürlich werden Denaturierungsbedingungen, die zu substantieller Aggregation, Unlöslichkeit oder Ausfällung des Proteins führen, so daß eine insignifikante Menge des exponierten Epitops für die Lösung zur Antikörperbindung zugänglich ist, vermieden. Eine hinreichende Menge an denaturiertem Protein muß in Lösung oder Suspension bleiben, um eine brauchbare Immunbindung zu erhalten. Das Ausmaß der notwendigen Solubilisation wird von den Umständen der beabsichtigten oder gewünschten Bindung abhängen.
Eine signifikante Menge eines gewünschten Proteins in einer bestimmten Testprobe kann denaturiert werden, um das Peptidepitop zur Antikörperbindung zu exponieren, indem man die Probe mit einer wäßrigen Lösung des Chaotrops, das in hinreichender Konzentration vorliegt, kombiniert, wodurch eine signifikante Menge des Proteins in der resultierenden wäßrigen Mischung denaturiert wird. Wo vollständiges Blut die Probe ist, dient das Chaotrop auch dazu, rote Blutzellen zu lysieren, wodurch Hb freigesetzt wird und Proteasen inaktiviert werden. Im Fall von Guanidin wird die Konzentration in der Mischung vorzugsweise größer sein als etwa 1 molar, wo-. bei eine etwa 3 molare Konzentration besonders brauchbar ist. Der Denaturierungsprozeß wird durch Erhitzen der Mischung während eines kurzen Zeitraums signifikant beschleunigt. Man hat herausgefunden, daß bei einer Temperatur unter 37ºC die Denaturierung durch das Chaotrop eine bis mehrere Stunden dauern kann, wohingegen bei Temperaturen von über 50ºC hinreichende Denaturierung in einer Minute oder weniger erzielt werden kann. Um eine signifikante Denaturierung des Proteins und anderer proteinhaltiger Reagenzien, die nachfolgend zu der Mischung zugegeben werden, zu verhindern, wird die Probe-Chaotrop-Mischung normalerweise als separater Schritt öder durch Zugabe von Reagenslösungen auf eine Konzentration verdünnt, so daß das Chaotrop im wesentlichen ineffektiv zur Denaturierung solcher Reagenzien ist, jedoch die Exposition des Epitops erhalten wird, indem eine signifikante Renaturierung des interessierenden Proteins verhindert wird. Bei Guanidin erfordert dies bevorzugt eine Verdünnung auf eine Konzentration von weniger als etwa 1,0 molar, wobei etwa 0,3 molar besonders bevorzugt ist.
Nicht-beschränkende Beispiele von proteolytischen Enzymen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zur Verdauung schließen ein: Trypsin, Chymotrypsin, Prolin-spezifische Endoprotease, Pepsin und Papain. Zur Durchführung eines Immunoassays werden Inhibitoren für die proteolytischen Enzyme, wie sie bekannt sind, zur Assaymischung in einer hinreichenden Menge zugegeben, um Verdauung proteinhaltiger Assaystoffe zu verhindern.
Speziell werden Hybridoma-Zellinien erzeugt, um Antikörper nur gegen den glucosylierten Teil des Hämoglobinmoleküls zu erzeugen, anstatt gegen das gesamte Protein, und solche Zellinien und deren Antikörper werden gescreent, um diejenigen monoklonalen Antikörper zu identifizieren und zu isolieren, welche danach selektiv mit dem glucosylierten Hb A1c-Epitop reagieren werden. Um solche Antikörper herzustellen, wird ein Fragment der Proteinkette, das der natürlich auftretenden glucosylierten Peptidsequenz entspricht, an einen Proteinträger gekoppelt und wird in ein Labortier injiziert, um eine Immunantwort hervorzurufen. Lymphocyten, wie Milzzellen, vom immunisierten Tier werden mit Myelomazellen fusioniert, wodurch Hybridomas erzeugt werden, welche kultiviert und zur Produktion von monoklonalen Antikörpern gescreent werden. Die monoklonalen Antikörper werden nach solchen gescreent, die selektiv für das glucosylierte Peptidepitop sind, und die spezielle Zellinie wird zur Verwendung bei der Herstellung weiterer Mengen des monoklonalen Antikörpers kloniert.
Um Antikörper im Labortier, z. B. BALB/c-Mäusen, Ratten oder dergleichen zu produzieren, muß ein glucosyliertes Hämoglobinfragment entweder aus natürlich vorkommendem Humanhämoglobin produziert und isoliert werden oder chemisch synthetisiert und gereinigt werden. Das Hämoglobinfragment sollte den 1-Deoxyfructose-Rest und mindestens zwei Aminosäureeinheiten, vorzugsweise 3, 4, 5 oder sogar mehr, enthalten, die dem N-Terminus der β-Untereinheit von Hämoglobin entsprechen (Valin-Histidin). Vorteilhafterweise schließt er etwa 5 bis 15 und bevorzugt 7 bis 10 Einheiten ein.
Um sicherzustellen, daß das glucosylierte Peptidfragment optimal antigen ist, kann es vorteilhafterweise an einen Trägerstoff gekoppelt werden, der ein großes immunogenes Molekül umfaßt, wie Rinderserumalbumin (BSA) oder Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH). Das Fragment sollte auch das natürliche umgelagerte Addukt der Glucose-Valin-Reaktion tragen, das von Anfang an vorliegen kann, wie im Fall des isolierten, natürlich vorkommenden Hämoglobinfragments, oder kann vorzugsweise am synthetischen Peptid während seiner Synthese oder vor der Kopplung des Peptids an den großen Proteinträger gebildet werden. Der Träger kann auf eine beliebige Weise zugegeben werden, die nicht die Antigenizität des Fragments zerstört.
Das glucosylierte Fragment kann durch chemische oder enzymatische Verdauung von natürlich auf tretendem Hb, z. B. Hb A1c, hergestellt werden. Dieses Fragment kann an einen Träger unter Verwendung von klassischen Kopplungsverfahren gekoppelt werden, z. B. Glutaraldehyd oder Carbodiimid, und das Konjugat als Immunogen verwendet werden.
Eine bevorzugte Weise der chemischen Synthese eines Teils der bekannten Hämoglobinsequenz schließt die Zugabe einer oder mehrerer Aminosäureeinheiten (die nicht in der normalen Sequenz gefunden werden) zur Optimierung seiner Antigenizität und Kopplungseigenschaften ein. In diesem Fall trägt die Endeinheit eine Thiol (SH)-Gruppe, wodurch sie an den Liganden auf herkömmliche Weise gekoppelt werden kann, etwa durch Reaktion mit einem bifunktionellen Bindungsreagens, wie m-Maleimidobenzoyl-N- sulfosuccinimidester (MBS).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wurden zum Lysinende eines synthetischen Hb-Fragments, das die 8 Einheiten NH&sub2;-Valin-Histin-Leucin- Thryronin-Prolin-Glutaminsäure-Glutaminsäure-Lysin-COOH enthielt, Tyrosin, Tyrosin und Cystein zugegeben, was in einem 11-Einheiten-cysteinterminierten Peptid resultierte.
Dies kann auf herkömmliche Weise durch nicht-enzymatische Reaktion mit Glucose glucosyliert werden. Das Glucopeptid wird danach an einen großen Träger gekoppelt, wodurch das Antigen hergestellt wird, das zur Produktion der Antikörper verabreicht wird. Lymphocyten aus dem Tier, die Antikörper auf das glucosylierte Peptidepitop produzieren, werden dann auf herkömmliche Weise unter Herstellung von Hybridomas fusioniert, welche dann geklont werden, und diejenigen, die monoklonale Antikörper der gewünschten Spezifikation produzieren, werden weiter subgeklont. Die Zellinie(n), deren monoklonale Antikörper die größte Selektivität für das glucosylierte Epitop zeigen, im Gegensatz zu nicht-glucosyliertem Hb, werden dann fortgepflanzt und die Antikörper geerntet. Übersichtsartikel über solche monoklonale Antikörpertechniken können gefunden werden in: Lymphocyte Hybridomas, Herausgeber: Melchers et al, Springer-Verlag (New York 1978), Nature 266 : 495 (1977), Science 208 : 692 (1980), und Methods in Enzymology 74 (Teil B): 3-46 (1981).
Die Antikörper können dann auf herkömmliche Weise verwendet werden, um mit Blutproben, die unbekannte Mengen an glucosyliertem Hb enthalten, zu reagieren, und das Ausmaß der Reaktion kann mit Standards verglichen werden, um den Grad der Glucosylierung zu bestimmen. Die Ablesung kann durch Fluoreszenz, durch Immunoassay oder dergleichen erfolgen, indem geeignet ablesbare Gruppen an die monoklonalen Antikörper auf bekannte Weise gebunden werden, ohne daß sie ihre Bindungskraft für das glucosylierte Epitop in Hb A1c verlieren.
Alternativ kann ein Assay, der auf einem Reagens-Teststreifen beruht, durchgeführt werden, worin ein Carboxylgruppen-tragendes Material, wie Carboxylmethylcellulose, auf einen Streifen aus Holz oder Kunststoff aufgezogen wird. Dann wird der Streifen in die lysierte und denaturierte unbekannte Blutprobe eingetaucht, wodurch das Hämoglobin adsorbiert wird, sei es glucosyliert oder nicht. Der Streifen wird dann in eine Lösung der monoklonalen Antikörper eingetaucht, die an einer Stelle geeignet markiert sind (z. B. Enzym, Fluoreszenz, Cofaktoren etc.), die nicht mit der Bindung an das Hb A1c-Epitop interferiert. Die Menge an gebundenem Antikörper wird durch die Menge an Markierung auf dem Streifen bestimmt und ist ein Indikator für die Menge des glucosylierten Hb in der unbekannten Probe. Das Anbringen der Markierung und seine Ablesung werden auf herkömmliche Weise vorgenommen.
Die verbindende Gruppe R in der obigen Formel kann im wesentlichen eine beliebige vorteilhafte und stabile Struktur darstellen. Eine solche Verbindungsgruppe R wird gewöhnlich in Form einer aliphatischen Kette vorliegen, die gewöhnlich zwischen 1 und etwa 20 Atome umfaßt, ausschließlich Wasserstoff und einschließlich Heteroatomen, wie Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel. Der glucosylierte Rest kann durch eine Reihe von Gruppen zur Bildung der Bindungskette R angebunden werden, einschließlich Methylen, Ether, Thioether, Imino und dergleichen. Der Fachmann wird eine breite Vielzahl von Verbindungsgruppen zur Verfügung haben, aus denen er zur Herstellung des Immunogens wählen wird. Normalerweise wird das glucosylierte Peptid so hergestellt, daß es mit einer funktionellen Gruppe, wie Amino, Carboxyl, Thiol, Hydroxyl oder Maleimido, endet, die bei einer Kopplungsreaktion für eine geeignete Gruppe im Trägermolekül aktiv ist.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden speziellen Beispiele erläutert, soll jedoch dadurch nicht beschränkt werden.

BEISPIEL 1

Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern für das Glycopep +tidepitop in Hb A1c:

(a) Ein Peptid mit 11 Aminosäuren, umfassend die 8 N-terminalen Einheiten von β-Hämoglobin plus 2 Einheiten Tyrosin plus 1 Einheit Cystein, wurde synthetisiert gemäß Gutte, B. und R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 91 : 2, 501 (1969), was das folgende Peptid ergab:
NH&sub2;-Valin-Histidin-Leucin-Threonin-Prolin-Glutaminsäure-Glutaminsäur-e- Lysin-Tyrosin-Tyrosin-Cystein-COOH.
Um dieses Peptid zu glucosylieren, wurden 200 mg dieses gereinigten Peptids mit 0,25 molarer Glucose in 20 ml wasserfreiem Pyridin 48 Stunden bei Raumtemperatur im Dunklen umgesetzt. Die Mischung wird im Vakuum getrocknet. Der resultierende Sirup wird in 20 millimolarem Kaliumphosphat, pH 2,95, resuspendiert und durch HPLC gereinigt.
Die glucopeptidtragenden Fraktionen werden in 0,1 M Triethylammoniumacetat bei pH 8,5 gelöst und über Affigel-601-Boronataffinitätsharz (Biorad) chromatografiert, wobei das Glucopeptid selektiv adsorbiert wird. Das Harz wird mit 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 8,5, gewaschen und das Glucopeptid mit 0,1 M Triethylammoniumacetat bei pH 5,0 eluiert. Das Eluat wird lyophilisiert.
Das Produkt wird in 1 ml Wasser resuspendiert, umgesetzt mit einem 500-fachen molaren Überschuß von Dithiothreitol (um die SH-Gruppe des Cysteins wiederherzustellen) und das reduzierte Peptid durch HPLC wiederum gereinigt und lyophilisiert. Dieses Glucopeptid wird bei -20ºC unter Stickstoff bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.
(b) Ein KLH-MBS-Konjugat, wie zuvor beschrieben, Lerner, R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 78 : 3403 (1981) wird mit dem Produkt von (a) in einem zweifachen molaren Verhältnis von Glucopeptid zu Maleimid auf dem Träger in 50 millimolarem (mM) Kaliumphosphat, pH 7,2, 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt.
(c) Die Lösung in (b) wird mit gleichen Volumina von Freund's vollständigem Adjuvans gemischt, wodurch eine Wasser-in-Öl-Emulsion gebildet wird, und 200 ug Konjugat werden in BALB/c-Mäuse injiziert. Die Mäuse werden nach 30 und 60 Tagen aufgefrischt, geopfert und ihre Milz zur Fusion gemäß Köhler and Milstein, Nature 256 : 495 (1975) verwendet, wodurch zahlreiche Hybridomas hergestellt werden. Die Hybridomas werden gescreent, um diejenigen zu identifizieren, die monoklonale Antikörper produzieren, welche spezifisch für das glucosylierte Peptidepitop sind.
Das Screening für A1c-spezifische monoklonale Antikörper wird unter Verwendung einer ELISA-Vorgehensweise ausgeführt, wobei das Antigen auf Polystyrol-Mikrotiterplatten (Linbro) absorbiert wird. Die Antigene sind gereinigtes menschliches A1c und nicht-glucosyliertes Ao-Hämoglobin. Das A1c wird aus einem roten Blutzellenhämolysat unter Verwendung zweier verschiedener chromatografischer Verfahren gereinigt. Die erste Reinigung besteht aus der Bindung von glycosyliertem Hämoglobin an ein Boronat-Affinitätsharz, wie beschrieben von Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA, Produkt Nr. 42.000. Typischerweise werden 1 bis 5 g Hämoglobin auf 100 ml Boronatharz aufgebracht und die gebundene (Glycohämoglobin)-Fraktion eluiert, wie beschrieben von Pierce Chemical Co., GlycoTest Bulletin, Produkt Nr. 42.000. Die eluierte Glycohämoglobinfraktion wird in einem Puffer von niedriger Ionenstärke äquilibriert und auf einem Ionenaustauscherharz chromatografiert, wie beschrieben von McDonald, M. et al, J. Biol. Chem., 253 : 2327-2332 (1978). Der A1c-"Peak" wird durch isoelektrische Fokussierung und durch Kohlehydratanalyse unter Verwendung des Thiobarbitursäure-Assays analysiert, und die Resultate bestätigen, daß diese Reinigung ultrareines A1c-Hämoglobin erzeugte, und zwar dadurch, daß das gereinigte Material sowohl Kohlehydrat enthielt, wie auch sich von normalem Ao-Hämoglobin im isoelektrischen Punkt unterschied. Ahnlich wurde Ao-Hämoglobin gereinigt durch seine Eigenschaft, nicht an das Boronat-Affinitätsharz zu binden, und chromatografiert durch Ionenaustausch als der Ao-"Peak" bei der ionenaustauscherchromatografischen Reinigung. Die reinen A1c- und Ao-Hämoglobine werden auf separaten Mikrotiterplatten (2 ug/100 ul PBS pro Vertiefung) über Nacht bei 4ºC adsorbiert. Die Platten werden in 1% BSA in PBS 60 Minuten bei Raumtemperatur blockiert, und dann viermal mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gewaschen. Der Überstand aus jeder Hybridoma-Zellinie wird zu der A1c- und Ao-Platte zugegeben und bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubiert. Die Platten werden viermal in PBS gewaschen und ein sekundärer Antikörper (Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Peroxidase, Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana, USA in einer 1 : 5000-Verdünnung in 1% BSA in PBS) wird aufgebracht und wird 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wird viermal in PBS gewaschen und 200 ul einer Substratlösung zugegeben (24,3 mM Zitronensäure, 51,4 mM Natriumphosphat, pH 5,3, mit 2,2 mM o-Phenylendiamin und 5,2 mM Wasserstoffperoxid). Die Reaktion wird nach 20 Minuten durch Zugabe von 50 ul 8 M H&sub2;SO&sub4; abgebrochen und das Produkt der Peroxidasereaktion bei 492 nm abgelesen.
Von 200 anfänglichen Hybridomas, die Antikörper gegen Hämoglobin produzierten, werden 9 als spezifisch für das A1c-Epitop identifiziert, wohingegen 191 sowohl mit A1c wie auch mit nicht-glucosyliertem Hämoglobin reagieren. Da präimmunisiertes Mausserum keine detektierbare Antikörperantwort auf Ao- oder A1c-menschliches Hämoglobin durch das ELISA-Verfahren zeigt, besteht die Hauptimmunantwort gegen die Sequenz aus 8 Peptiden, die A1c und Ao gemeinsam haben. Da das synthetische Peptidimmunogen aus 8 Aminosäureresten der Hämoglobinsequenz besteht, ist die Haupt-Mausimmunantwort gegen das Peptid gerichtet und nicht gegen das Kohlehydrat (191 der 200 Hybridoma, die sowohl mit Ao und A1c reagieren). Wie erwartet, weist das immunisierte Mausserum auch in weitem Umfang kreuzreagierende Antikörper auf, die sowohl mit Ao und A1c reagieren, was nahe legt, daß keine Spezifität für A1c erhalten wird, wenn nicht Hybridomas auf ihre Reaktivität gegen A1c hin und nicht gegen Ao-Hämoglobin gescreent werden. Die bevorzugten Hybridomas, die Antikörper gegen A1c-Hämoglobin und nicht gegen Ao-Hämoglobin produzieren, wurden beim ATCC hinterlegt und bezeichnet als ATCC HB 8639 und ATCC HB 8869, hinterlegt am 11. Oktober 1984 bzw. am 10. Juli 1985.
(d) Identifizierung der Peptide, die mit A1c um die Bindung an Antikörper konkurrieren:
Die folgenden Peptide werden durch enzymatische Verdauung des glucosylierten 11-Aminosäure-Mutterpeptids Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys- Tyr-Tyr-Cys (Glycopeptid 1) erzeugt.
Alle Peptidfragmente werden durch HPLC gereinigt und durch Aminosäuresequenz analysiert. Trypsin-Verdauung des Mutterpeptids erzeugte Glyco-Val- His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys (Glycopeptid 2), eine prolinspezifische Endoprotease erzeugt Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro (Glycopeptid 3). Das Peptid Glyco-Val-His-FAD (Glycopeptid 4), worin das Dipeptid an N&sup6;-Aminohexyl-FAD gekoppelt und dann glucosyliert wird, wird nach dem Verfahren von Carrico and Johnson hergestellt, US-PS 4 255 566, und wurde zur Verfügung gestellt durch Dr. Kin Yip und Dr. R. Buckler, Ames Division, Miles Laboratories, Inc., Elkart, Indiana, USA.
In einem typischen Konkurrenz-Assay werden 8 Nanomol bis 8 Picomol jedes Peptids in 100 ul PBS-7,2 mM Na&sub2;HPO&sub4;&sub1; 2,8 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 127 mM NaCl, pH 7,4, mit 100 ul monoklonalem Zellkulturüberstand während 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Mischung wird auf eine Polystyrol-Mikrotiterplatte, die mit 1 ug A1c-Hämoglobin pro Vertiefung überzogen wurde, aufgegeben. Wenn das Peptid mit dem Antikörper konkurriert, ist der Antikörper nicht frei, an das immobilisierte A1c zu binden. Die Platte wird viermal mit PBS gewaschen. Ein zweiter Antikörper (Kaninchen-Anti-Maus-IgG, gekoppelt mit Meerrettichperoxidase) wird 30 Minuten lang zugegeben und die Platte in PBS gewaschen. Das Substrat (o-Phenylendiamin, 2,2 mM) und Wasserstoffperoxid (0,012%) werden zugegeben und die erzeugte Farbe bei 492 nm gemessen. Die quantitative Bestimmung des Produkts spiegelt das Ausmaß der Konkurrenz wieder, z. B. zeigt kein Produkt an, daß das konkurrierende Peptid den Antikörper für die Bindung an das immobilisierte A1c vollständig blockierte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß alle vier der vorher beschriebenen Glycopeptide, einschließlich Glyco-Val-His-FAD, effektive Kompetitivsubstanzen (Konkurrenten) sind. Einer der Antikörper, Ab-4, wird für die Bindung an A1c durch Glycopeptide 1 bis 4 vollständig blockiert (siehe Fig. 1 bis 3). Ein weiterer Antikörper, Ab-3, wird durch Glycopeptide 1 bis 3 blockiert, jedoch nicht durch Glycopeptid 4 (siehe Fig. 1 bis 3).
Peptide, denen das Kohlehydrat fehlt, zeigen keine Konkurrenzinhibierung, was nahelegt, daß das Kohlehydrat eine wesentliche Komponente des Epitops ist und die Spezifität für die Antikörpererkennung des A1c-Hämoglobins liefert (siehe Fig. 1).

BEISPIEL 2

Kompetitiver Immunoassay für Hb A1c:

Dieser kompetitive Immunoassay beruht auf der Verwendung-einer festgelegten Menge an Hapten-Marker (wie beschrieben in Beispiel 5) der mit A1c in lysiertem vollständigen Blut um die Bindung an den immobilisierten Antikörper konkurriert. Da der Antikörper sowohl A1c wie auch das Hapten erkennt, bestimmt die Konzentration von A1c in der Probe die Menge an Hapten- Marker, die an den Antikörper bindet. Da der Antikörper immobilisiert ist, können alle nicht-gebundenen Reaktanten durch einen einfachen Waschschritt entfernt werden. Die gebundene Markierung kann dann gemessen werden und mit einem Standard zur Quantifizierung von A1c in den ursprünglichen Blutproben verglichen werden.
Der Assay wird unter Verwendung von vollständigem Blut als Probe entwickelt und kann in die nachfolgend aufgelisteten Schritte unterteilt werden:

(1) Lyse der Zellen - Denaturierung von Hämoglobin:

Da der Assay schlußendlich weniger als 0,3 ul vollständiges Blut erfordert, wird ein genau pipettierbares Volumen Blut (5 bis 50 ul aus einer Fingerspitze oder aus vollständigem Blut) in einer Denaturierlösung (3 M Guanidin-HCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) verdünnt und auf 56ºC 2 bis 15 Minuten erwärmt. Niedrigere Temperaturen funktionieren ebenfalls, jedoch wird dann zusätzliche Zeit für die vollständige Denaturierung der Probe erforderlich. Die Denaturierung (a) inaktiviert die Gerinnungsmechanismen, falls Proben nicht in Antikoagulanzien präpariert werden; (b) lysiert die roten Blutkörperchen; (c) denaturiert Proteasen, Enzyme usw. und exponiert das A1c-Epitop auf Hämoglobin optimal; (d) scheint entweder zu sterilisieren oder das Wachstum von Mikroorganismen in der denaturierten Blutprobe zu inhibieren, selbst wenn die Probe nicht aseptisch präpariert und behandelt wird (z. B. Blut aus einer Fingerspitze); und (e) führt zu einer stabilen klinischen Probe, die tagelang bei Raumtemperatur ohne Auswirkung auf den schlußendlichen Assay aufbewahrt werden kann.

(2) Verdünnung und Konkurrenzreaktion:

Ein Aliquot des denaturierten vollständigen Bluts wird in ein 10-faches Volumen Puffer pipettiert, das den Hapten-Marker enthält. Dies verdünnt effektiv das Hämoglobin auf die geeignete Konzentration für den Assay und verdünnt das Denaturierungsmittel auf eine niedrige Konzentration, so daß der Antikörper oder die Enzymaktivität nicht gestört wird. Die Antikörper-beschichtete Perle wird dann eine bestimmte Zeit lang zugegeben, währenddessen der Antikörper entweder an das A1c-Hämoglobin oder das Hapten-HRP bindet.

(3) Waschen und Ablesen:

Nach der kompetitiven Inkubierung wird die Perle gewaschen und nach Zugabe eines geeigneten Substrats der Marker abgelesen. Das Signal wird dann mit einem Standard verglichen und die Menge an A1c, die in der ursprünglichen vollständigen Blutprobe vorlag, bestimmt.
Die Details der verwendeten Assays werden nachfolgend zusammengefaßt:

Beschichtungsverfahren der Perle:

Polystyrol-Perlen (1/4 inch Durchmesser mit verspiegelter Oberfläche) werden erhalten von Precision Ball Company, Chicago, Illinois, USA. Die gelieferten Mengen werden nach den Perlen untersucht, die die geringste Abweichung bei verschiedenen Immunoassay-Bestimmungen der selben Probe zeigten. Vor dem Beschichten werden die Perlen mit absolutem Methanol und danach mit Wasser gewaschen. Die Methanolwäsche schien die Korrelation der Variation für verschiedene Bestimmungen derselben Probe signifikant zu verringern. Eine Antikörper-Lösung (5 ug Antikörper pro 100 ul in 0,2 M Natriumborat, pH 8,5, 0,02% Natriumazid) wird dann zu den feuchten Perlen zugegeben und die Perlen über Nacht bei 4ºC rotiert. Die Perlen werden dann gewaschen, mit 1% BSA in PBS, das 0,02% Natriumazid enthielt, blockiert. Typischerweise werden 500 bis 1000 Perlen auf einmal beschichtet und während eines Zeitraums von Wochen verwendet, wobei offensichtlich kein Verlust an Antikörper-Aktivität auftrat. Beschichtungsexperimente mit radioaktiven Antikörpern zeigen, daß 0,5 ug Antikörper pro Perle binden.
Die Perlen werden in diesem Immunoassay nur wegen ihrer Eigenschaft, relativ hohe Mengen Protein zu binden, verwendet. Die hydrophobe Absorption von Protein auf Polystyrol ist vorteilhaft, könnte aber sicher durch eines von mehreren anderen Verfahren ersetzt werden, bei denen Proteine kovalent an Polystyrol, funktionalisierte Harze oder Silica gebunden werden. Das Polystyrol kann auch in Form eines Rohres oder einer Küvette vorliegen.
Das Arbeitsprotokoll wird wie folgt zusammengefaßt:
(a) Verdünne 50 ul vollständiges Blut in 1,0 ml Denaturierlösung (3 M Guanidin-HCl, 10 mM Tris, pH 7,5), Erhitze auf 56ºC 15 Minuten, Verdünne wiederum 100 ul in 1,0 ml Denaturierungsmittel.
(b) Gib 50 ul der obigen Lösung zu 0,5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,5, die Hapten-HRP enthält. Die Inkubationen, Waschschritte und enzymatischen Reaktionen werden in vorteilhafter Weise in 48 Vertiefungen-Polystyrol-Kulturplatten ausgeführt.
(c) Gib Antikörper-beschichtete Perle zu und inkubiere 30 Minuten bei Umgebungstemperatur unter Rütteln.
(d) Wasche Perlen mit Puffer (PBS) (gewöhnlich 3-1 ml Wechsel)
(e) Gib o-Phenylendiamin-Substrat und Wasserstoffperoxid zu.
(f) Unterbrich die Reaktion und lies das Produkt nach 20 Minuten ab. Der obige Assay wird zur Aufnahme der unten beschriebenen klinischen Daten verwendet. Die Standardkurve ist in Fig. 4 gezeigt. Kompetitive Reaktion unter Verwendung von Glycopeptid 1 ist in Fig. 5 gezeigt. Auswertung von normalen und diabetischen Blutspendern wird in Fig. 6 gezeigt. Die Boronat- Affinitätsbestimmung wird exakt so ausgeführt, wie von Pierce Chemical Co. (GlycoTest, Produkt Nr. 42.000) beschrieben.

BEISPIEL 3

Optimale Exposition des A1c-Epitops:

Die optimale Reaktivität des menschlichen A1c-Epitops wird nach Behandlung des nativen Hämoglobins (in vollständigem Blut oder Hämolysat) mit Verfahren oder Reagenzien, die das Epitop für die Antikörper-Bindungsstelle exponieren, beobachtet. Die optimale Exposition des Epitops kann durch eine physikalische Denaturierung (Hitze, Ultraschall usw.), durch ein chemisches Verfahren, einschließlich klassischer Denaturierungsmittel (Harnstoff, Guanidin, SDS, Protease) oder durch Kombination physikalischer und chemischer Verfahren bewirkt werden. Am wirkungsvollsten ist ein Verfahren, worin vollständiges Blut (50 ul) zu einer 1 ml-Lösung von 3 M Guanidinhydrochlorid, 10 mM Tris-HCl, pH 4, zugegeben wird und auf 56ºC länger als 1 Minute erhitzt wird. Die resultierende Probe funktioniert bei nachfolgenden Immunoassays für das A1c-Epitop optimal. Die Lösung kann 10-fach in Puffer verdünnt werden, wobei effektiv das Guanidin auf 0,3 M verdünnt wird, eine Konzentration, die wenig, wenn überhaupt irgendeinen Effekt auf normale Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen und Enzymaktivitäten hat, wodurch ein geeignetes Medium für die nachfolgenden Immunoassays zur Verfügung gestellt wird.
Der kompetitive Immunoassay von Beispiel 2 wird verwendet. Der Konkurrent ist das A1c, das im vollständigen Blut eines Diabetikers enthalten ist. Die vollständige Blutprobe wird in 3,0 M Guanidin bei 20ºC, 37ºC oder 56ºC während Zeiten von 0 bis 320 Minuten eingebracht. Die Ergebnisse (Fig. 7) zeigen, daß mit der Zeit bei 20ºC oder 37ºC das Epitop exponiert wird und somit effektiv mit dem Hapten-HRP-Konjugat konkurriert. Bei 56ºC wird das Epitop maximal nach 5 Minuten exponiert, der früheste Punkt, der bei diesem Assay bestimmt wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß im nativen Hämoglobin-A1c-Tetramer das Epitop "vergraben" und unzugänglich ist und nicht mit dem linearen synthetischen Glycopeptid-HRP-Konjugat konkurriert. Wenn jedoch Hämoglobin-A1c denaturiert wird, wird das neu exponierte Epitop ein effektiver Konkurrent für das lineare Glycopeptid-Enzym-Konjugat.

BEISPIEL 4

Vergleich der Antikörperspezifität - Schaf-polyklonale gegen Mausmonoklonale Antwort:

Ein Schaf wird an 5 Stellen IM in vollständigem Freund'schen Adjuvans mit dem Glycopeptid-KLH-Konjugat (4 mg) von Beispiel 1(b) immunisiert. Auffrischinjektionen werden ähnlich nach 30 und 60 Tagen vorgenommen. Die Auffrischinjektion bei 60 Tagen erfolgt in Freund'schem unvollständigen Adjuvans. Präimmunserum und Immunserum wird bezüglich seiner A1c- und Ao-Spezifität in einem ELISA-Assay, wie in Beispiel 1(c) beschrieben, bezüglich des Titers bestimmt. Die Ergebnisse (siehe Fig. 8) zeigen, daß das synthetische Glycopeptid eine Immunantwort gegen menschliches Hämoglobin stimuliert, daß jedoch die Immunoglobuline nicht spezifisch für A1c-Hämoglobin sind. Im Gegensatz dazu sind Maus-monoklonale Antikörper für A1c recht spezifisch für A1c, wenn sie im selben Assay gemessen werden (dem ELISA-Assay von Beispiel 1(c), siehe Fig. 9). Versuche, Antikörper, die spezifisch für A1c sind, aus dem Schaf-Antiserum durch Immunoaffinität zu reinigen, waren nicht erfolgreich.

BEISPIEL 5

Herstellung von Hapten-Marker-Konjugaten:

Ein Konjugat des Glycopeptids 1 (HRP) wurde hergestellt. Das Hapten- HRP-Konjugat wurde durch Umsetzung von 15 mg Merrettich-Peroxidase (Horseradish peroxidase HRP) mit einem 10-fachen molaren Überschuß MBS (siehe Beispiel 1(b)) in 50 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA, pH 7,0, hergestellt. Das MBS-HRP-Konjugat wurde durch Gelfiltration (unter Verwendung des obigen Puffers) gereinigt und 0,34 mg des Glycopeptidhaptens (Peptid 1) wurden zugegeben. Das endgültige Hapten-HRP-Konjugat wurde durch Gelfiltration auf HPLC gereinigt und wurde in einer Verdünnung von 1 : 1000 bis 1 : 100.000 im kompetitiven Immunoassay von Beispiel 3 eingesetzt.

BEISPIEL 6

Streifen-Immunoassay für Hb A1c:

(a) 1 mg des monoklonalen Antikörpers von Beispiel 1(c) in 0,1 molarem Natriumborat-Puffer, pH 8,5, können mit einem 200-fachen molaren Überschuß Fluoresceinisothiocyanat (FITC) gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt werden. Der Fluorescein-markierte monoklonale Antikörper kann durch Gelfiltration gereinigt werden.
(b) Ein Streifen (Polystyrol, Cellulose, etc.), der COOH-Gruppen enthält, wird in 0,5 ml unbekanntes denaturiertes Hämolysat, pH 7,5, getaucht. Der Streifen wird mit Puffer bei pH 7,5 gewaschen und wird in die gepufferte Lösung des fluoreszierenden monoklonalen Antikörpers von (a) 5 Minuten bei Raumtemperatur eingetaucht. Der Streifen wird wiederum gewaschen und der Grad der Fluoreszenz des Streifens zeigt den Grad von A1c Hb in der unbekannten Probe an.

BEISPIEL 7

Kopplung des monoklonalen Antikörpers an den Reagenzstreifen und seine Verwendung in einem Immunoassay:

Whatman #1-Filterpapier (7 cm) wird in 20 ml eiskaltes d-H&sub2;O gelegt und der pH der Lösung wird auf zwischen 10,5 und 11,5 mit 5 M NaOH eingestellt. Die Lösung wird während der Aktivierung kontinuierlich beobachtet und der pH wird durch tropfenweise Zugabe von 5 M NaOH zwischen 10,5 und 11,5 gehalten. Ein kleiner Rührfisch wird auf den Boden des Becherglases, das das Filterpapier enthält, gelegt. Das Becherglas wird dann in eine eisgefüllte Petrischale gestellt, die auf einen Magnetrührer gestellt wird. 1 g festes BrCN wird in das Becherglas gegeben und dieses wird unter Rühren 20 Minuten (auf Eis) inkubiert. Das Filterpapier wird aus der Lösung entfernt und in 100 ml eiskaltem destillierten Wasser (d-H&sub2;O) gewaschen. Es wird dann in eiskaltem 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4;-Zitronensäurepuffer, pH 6,8, gewaschen. Der Antikörper (1 mg/ml in 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4;-Zitronensäurepuffer, pH 6,9) wird zugegeben und die Kopplung des Antikörpers wird 1 Stunde fortgesetzt. Ethanolamin (10 ml einer 1 mM Lösung) wird zugegeben, um unumgesetzte Stellen zu blockieren (15 Minuten) und das Papier wird mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 140 mM NaCl, pH 7,5) gewaschen, um unumgesetzte Komponenten zu entfernen.
Dieser Reagenzstreifen wird in eine standardisierte Menge eines unbekannten denaturierten Hämolysats eingetaucht, das einen markierten Konkurrenten für die Antikörperbindung von A1c-Hämoglobin enthält. Ein vorteilhafter Konkurrent ist das Glycopeptid (Glycopeptid 1), das kovalent an Meerrettichperoxidase gekoppelt wurde (Hapten-HRP). Der Streifen wird entfernt und mit PBS gewaschen. Die Menge an Hämoglobin, die an den Streifen gebunden wurde, wird gemessen (die Menge ist invers proportional dem A1c in der Probe und das A1c-Hämoglobin kann durch Vergleich mit Standardproben quantifiziert werden).

BEISPIEL 8

Enzym-gebundener Immunosorbens-Assay für A1c:

Ein festes Volumen von denaturiertem Bluthämolysat (100 ul) wird auf Polystyrol-Mikrotiterplatten gegeben und man läßt es bei Raumtemperatur 60 Minuten binden. Die Platte wird viermal in PBS, enthaltend 0,05% Tween-20 (PBST), gewaschen. Der monoklonale Antikörper (gekoppelt an Meerrettichperoxidase) wird (100 ul, 1 ug/ml) in PBST zugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Der überschüssige Antikörper wird durch vier Wäschen mit PBST entfernt. Das Substrat (o-Phenylendiamin, 2,2 mM) und H&sub2;O&sub2; (0,012%) in PBS werden zugegeben und das Reaktionsprodukt bei 492 nm gemessen. Die Farbintensität spiegelt die Menge an A1c, die im Hämolysat vorliegt, wieder, wenn sie mit Standardwerten verglichen wird.

BEISPIEL 9

Radioimmunoassay für A1c:

100 ul denaturiertes Bluthämolysat (220 Nanomol Hämoglobin) werden mit 7 Nanomol jodiertem Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Cys (500.000 cpm/7 Nanomol) gemischt. Ein monoklonaler Antikörper wird in einer Menge zugegeben, welche ausreicht, um 50% des glucosylierten Peptids zu binden, wenn das Bluthämolysat das normale (etwa 3%) A1c-Hämoglobin enthält. Höhere Hämoglobin-A1c-Werte konkurrieren um das Peptid, wodurch die Gesamtzahl an Counts, die durch den Antikörper gebunden wurden, reduziert wird. Der Antikörper kann durch Immunopräzipitation mit einem zweiten Antikörper (Kaninchen-Anti-Maus-IgG) oder durch Adsorption an Protein A-beschichtete Partikel wiedergewonnen werden. Das jodierte Peptid, das an den Antikörper gebunden wurde, kann in einem y-Isotopenzähler quantifiziert werden und spiegelt die Menge an A1c wieder, die im Bluthämolysat vorlag, wenn man mit Standards vergleicht.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon, das eine Antikörper- Bindungsstelle umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch an die glucosylierte N-terminale Peptidsequenz in der β-Untereinheit von menschlichem Hämoglobin bindet.

2. Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch an einen glucosylierten Peptidrest der Formel

Glyco-(NH)Val-His-AAbindet, worin Glyco(NH)Val einen nicht-enzymatisch glucosylierten Valinrest darstellt und AA eine Bindung oder ein oder mehrere weitere Aminosäurereste ist.

3. Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß AA eine Sequenz von 1 bis 12 Aminosäuren ist, die dein N-Terminus der β-Untereinheit von menschlichem Hämoglobin entspricht.

4. Monoklonaler Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er in einer Maus gegen ein Immunogen erzeugt wurde, das ein glucosyliertes Peptid, das chemisch an ein immunogenes Trägermaterial gebunden wurde, umfaßt, wobei das glucosylierte Peptid mindestens zwei Aminosäureeinheiten hat, die dem N-Terminus der β-Untereinheit von Hämoglobin entsprechen, oder einer denaturierten Form von Hämoglobin oder einem Fragment davon, das den glucosylierten N-Terminus der β-Untereinheit umfaßt, entsprechen.

5. Monoklonaler Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das spezifisch an die glucosylierte N-terminale Peptidsequenz bindet, wenn sie hinreichend exponiert wird, so daß ein sterischer Zugang ermöglicht wird.

6. Monoklonaler Antikörper oder Fragment nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die glucosylierte Peptidsequenz an den Antikörper durch physikalische oder chemische Denaturierung oder Verdauung exponiert wird.

7. Monoklonaler Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die glucosylierte Peptidsequenz an den Antikörper durch chemische Denaturierung durch Kontakt mit einem chaotropen Agens, vorzugsweise Guanidin, Harnstoff, Kaliumthiocyanat oder ein Detergens exponiert wird.

8. Monoklonaler Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der spezifisch an die besagte glucosylierte N-terminale Peptidsequenz oder Hämoglobin bindet, das an eine feste Oberfläche adsorbiert wurde, welche vorzugsweise aus Polystyrol oder Cellulose besteht.

9. Hybridoma-Zellinie, welche monoklonale Antikörper ausscheidet, die spezifisch an die glucosylierte N-terminale Peptidsequenz in der β-Untereinheit von Hämoglobin bindet.

10. Monoklonale Antikörper gegen Hämoglobin-A1c, hergestellt von Hybridomas mit den ATCC-Registrationsnummern HB 8639 oder HB 8869.