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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von Riboflavin durch Fermentation. Im besonderen betrifft
sie ein Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch
Kultivieren einer Riboflavin-produzierenden Hefe, die
zu Saccharomyces oder einer Variante davon gehört.
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Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann
Riboflavin durch Fermentation unter Verwendung von
Essigsäure als Kohlenstoffquelle effizient hergestellt
werden.
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Riboflavin ist verwendbar als z. B. pharmazeutische
Verbindung, als Zusatzstoff für Futtermittel und als
Farbstoff für Lebensmittel.
Stand der Technik
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Konventionelle Verfahren zur Herstellung von
Riboflavin durch Fermentation umfassen das Kultivieren
von z. B. Eremothecium ashbyii, Ashbya gossypii
Candida flareri oder Costridium acetobutylicum
in einem Zucker-enthaltenden Medium, um dadurch Riboflavin
in dem Kulturmedium herzustellen und zu akkumulieren
(vgl. Progress Industrial Microbiology, Vol. 1,
S. 139 (1959)).
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Einige von uns haben früher über ein Verfahren zur
Herstellung von Riboflavin durch Fermentation berichtet,
worin Essigsäure als Kohlenstoffquelle verwendet wird
(vgl. Agr. Biol. Chem., 28, 559, 566 und 765 (1964)).
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In der US-A-643 226, korrespondierend zur
EP-A-84 109 683.7 ist ein Fermentationsverfahren unter
Verwendung einer Variante, wie einer Purin-benötigenden
Variante, die zu der Gattung Saccharomyces gehört und
einer gegenüber 3-Amino-1,2,4-triazol resistenten
Variante, die zu derselben Gattung gehört, beschrieben.
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In der vorstehenden Literatur wird der Name Candida
robusta zur Bezeichnung eines Pilzes verwendet. Jedoch
haben nachfolgende Untersuchungen ergeben, daß ein
typischer Stamm von C. robusta Sporen hat. Folglich hat
Lodder C. robusta in Saccharomyces cerevisiae
umklassifiziert (vgl. The Yeast, Ausgabe 1970).
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Bei dem Stamm, der wie in der vorstehenden Literatur
beschrieben verwendet wurde, wurde jedoch keine Spore
beobachtet. Daher scheint er ein asporogener Typ von S.
cerevisiae zu sein. Folglich wird er in der vorliegenden
Beschreibung als S. cerevisiae (C. robusta) bezeichnet.
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Obwohl die vorstehend erwähnten Pilze bekannt sind, hat es
noch viele zu lösende Probleme bei der Herstellung von
Riboflavin durch Fermentation im industriellen Maßstab
gegeben. Dafür ist es Voraussetzung, einen Pilz zu
erhalten, der schnell Riboflavin produziert und selbiges
zu einer hohen Konzentration anhäuft. Bei der Verwendung
eines bekannten auxotrophen Pilzes ist es notwendig,
teures Material, das von diesem benötigt wird, zum Medium
zuzufügen. Aus industriellem Gesichtspunkt ist es folglich
sehr wichtig, die Menge des benötigten Materials, das
zugefügt werden muß, zu verringern oder selbiges unnötig
zu machen.
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Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe
zugrunde, einen Pilz mit einer hohen
Riboflavinproduktivität zu erhalten und ein neues
Verfahren zur Herstellung von Riboflavin unter Verwendung
desselbigen zur Verfügung zu stellen.
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Weiterhin gibt es ein Problem bei der Herstellung von
Riboflavin durch Fermentation unter Verwendung eines
Riboflavin-produzierenden Pilzes, der zu der Gattung
Saccharomyces gehört, indem, daß der Pilz gegenüber einem
Ammoniumion, das von der Stickstoffquelle in dem Medium
freigesetzt wird, sensitiv ist, so daß die Anhäufung von
Riboflavin und das Wachstum des Pilzes bei einer
Ammoniumionenkonzentration von z. B. 2000 ppm oder darüber
verringert ist.
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Der vorliegenden Erfindung liegt daher die weitere Aufgabe
zugrunde, ein neues und verbessertes Verfahren zur
industriellen Herstellung von Riboflavin unter Verwendung
eines Stammes bereitzustellen, der eine geringe Abnahme
hinsichtlich der Akkumulation von Riboflavin sogar bei
einer Ammoniumionenkonzentration von 2000 ppm und darüber
im Medium zeigt.
Zusammenfassung der Erfindung
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Verwendung des
nachstehend definierten Pilzes, speziell einer Hefe,
bewirkt.
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Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Herstellen von
Riboflavin umfaßt die Schritte des Kultivierens einer
Purin-benötigenden Revertante in einem Kulturmedium, wobei
die Revertante von einer Riboflavin-produzierenden und
zu der Gattung Saccharomyces gehörenden Hefe abstammt
und resistent gegenüber 3-Amino-1,2,4-triazol und
Ammoniumionen ist und des Gewinnens des produzierten
Riboflavins.
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Die erfindungsgemäße Verwendung der Hefe, produziert
Riboflavin, ohne daß die Akkumulation abnimmt, wenn die
Konzentration des Ammoniumions im Kulturmedium angestiegen
ist.
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Die Erfindung wird nachstehend dargestellt.
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Der Ausdruck "resistent gegenüber Ammoniumionen" bedeutet
hierin Resistenz gegenüber einem Material, welches ein
Ammoniumion im Medium freisetzt. Beispiele eines solchen
Materials sind Ammoniumsalze, wie Ammoniumchloride,
Ammoniumsulfate, Ammoniumnitrate, Ammoniumacetat oder
Ammoniumfumarat, Ammoniakwasser und Harnstoff.
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Zu verwendende Mikroorganismen:
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Jede gegenüber Ammonium resistente Variante kann für die
vorliegende Erfindung verwendet werden, mit der Maßgabe,
daß sie von einem Riboflavin-produzierenden Pilz, der
zu der Gattung Saccharomyces gehört, abstammt.
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Ein bevorzugtes Beispiel desselbigen ist Saccharomyces
cerevisiae NH-268 (FERM BP-965). Diese ist eine gegenüber
Ammoniumionen und 3-Amino-1,2,4-triazol resistente
Variante, die durch ein konventionelles Verfahren durch
Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin von
einem Elternstamm der gegenüber
3-Amino-1,2,4-triazol-resistenten und Purin-benötigenden
Revertante TR-29 (FERM BP-782) abgeleitet ist. Da NH-268
Resistenz gegenüber Ammoniumionen zeigt, ist er vom
Elternstamm unterscheidbar.
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Verfahren zum Herstellen des Stamms:
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Der erfindungsgemäß verwendete Stamm kann auf schnelle
Weise durch Verwendung eines Purin-benötigenden und
Riboflavin-produzierenden Pilzes, der zu der Gattung
Saccharomyces gehört, als Elternstamm und durch Behandeln
desselben auf konventionelle, die Variation induzierende
Weise erhalten werden.
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Z.B. wird S. cerevisiae TR-29, welcher eine gegenüber
3-Amino-1,2,4-triazol resistente und Purin-benötigende
Revertante ist, mit ultraviolettem Licht bestrahlt oder
mit einer Chemikalie, wie
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, behandelt und auf
einem Agarmedium, das ein Ammoniumion in hoher
Konzentration enthält, wie in Tabelle 1 gezeigt,
ausplattiert, und die so gewachsenen Kolonien werden als
ein gegenüber Ammoniumionen resistenter Stamm selektiert.
Tabelle 1 Zusammensetzung des Selektionsmediums
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Bestandteil Konzentration
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Essigsäure 20 g/l
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(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 50 g/l
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MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,5 g/l
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KH&sub2;PO&sub4; 1,5 g/l
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Biotin 2 ug/l
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Hefeextrakt 1,0 g/l
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Agar 15 g/l
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H 7,0
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Die Resistenz gegenüber Ammoniumionen der so erhaltenen
Variante kann durch den folgenden Wachstumstest bestätigt
werden.
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100 ml Flüssigmedium, welches 2% Glucose, 0,5%
Polypepton, 0,3% Hefeextrakt und 0,3% Malzextrakt
enthält, wird mit S. cerevisiae TR-29, welcher der
Elternstamm ist, und mit der davon abgeleiteten und
gegenüber Ammoniumionen resistenten Variante NH-268
angeimpft und diese werden darin 40 Stunden lang
bei 30ºC unter Schütteln kultiviert. Das erhaltene
Kulturmedium wird in ein, wie in Tabelle 2 gezeigtes
Medium zu einem Verhältnis von 12% überimpft und
5 Tage lang bei 30ºC unter Schütteln darin kultiviert.
Tabelle 2
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Bestandteil Konzentration
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Calciumacetat 103 g/l
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(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; (oder NH&sub4;Cl) 5-10 (4-8) g/l
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MgSO&sub4;·7H&sub2;O 1 g/l
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KH&sub2;PO&sub4; 2 g/l
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ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 11 mg/l
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H 7
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Das Wachstum wird durch die optische Dichte bei 610 nm
bestimmt. Tabelle 3 zeigt das relative Wachstum bei
verschiedenen Ammoniumionenkonzentrationen, welches
bestimmt wurde durch Festlegung des Wachstums bei einer
Ammoniumionenkonzentration von 1350 ppm als 100. Tabelle 3
läßt vermuten, daß S. cerevisiae NH-268 offensichtlich
resistent gegenüber einem Ammoniumion ist.
Tabelle 3 Relatives Wachstum
Ammoniumsulfat (Ammoniumion, ppm) Ammoniumchlorid
Kultivierungsverfahren
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Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus wird auf
folgende Weise kultiviert. Beispiele für die
Kohlenstoffquelle sind organische Säuren, wie Essig- oder
Gluconsäure, Zucker, wie Glucose, Sucrose oder Xylose,
und Alkohole, wie Ethanol oder Glycerin.
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Beispiele für die Stickstoffquelle sind verschiedene
Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Animoniumcarbonat, Harnstoff, Aminosäuren
oder Polypepton.
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Zusätzlich zu den Kohlenstoff- und Stickstoffquellen ist
es bevorzugt, anorganische Salze, wie Kaliumphosphat oder
Magnesiumsulfat zu verwenden. Weiterhin können
Spurennährstoffe, umfassend Vitamine, wie Biotin,
Aminosäuren oder Nukleinsäurebasen, die wahlweise, falls
benötigt, zugefügt werden, die Akkumulation von Riboflavin
beschleunigen. Diese Ausführungsform kann in dem
Verfahren, wie vorstehend beschrieben, in dem
ein Zinkion verwendet wird, effektiv angewendet werden.
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Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aerober Bedingung
durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums liegt im Bereich von
2 bis 10. Das beste Ergebnis kann durch Einstellen des
pH-Werts auf 6 bis 9 erhalten werden. Die Kultivierung
kann bei einer Temperatur, die für das Wachstum des zu
verwendenden Pilzes und für die Herstellung von Riboflavin
geeignet ist, im Bereich von 20 bis 37ºC durchgeführt
werden.
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Riboflavin kann aus dem so erhaltenen Kulturmedium in
bekannter Weise gewonnen werden. D.h. das Kulturmedium
wird auf 60 bis 120ºC erhitzt, um dadurch Riboflavin
zu lösen, und zentrifugiert, um die Hefezellen vom Filtrat
zu trennen. Das Filtrat kann, falls notwendig,
konzentriert und danach mit Hydrosulfit oder
Titaniumtrichlorid reduziert werden, um dadurch Riboflavin
zu präzipitieren. Das so erhaltene Riboflavin kann durch
Oxidierenlassen in der Atmosphäre und durch
Rekristallisieren aus dem Lösungsmittel, wie z. B. Wasser
oder einer wäßrigen Essigsäurelösung, gereinigt werden.
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Riboflavin kann durch Herstellen einer heißen Wasserlösung
aus der Produktmischung der erfindungsgemäßen
Riboflavinfermentation, durch Abtrennen von Feststoffen,
wie dem Pilz, und durch Erhalten von Riboflavin aus der
Lösung durch Kristallisation gereinigt werden. Dieses
Verfahren stellt Riboflavin mit einer sehr hohen Reinheit
her.
Beispiel 1
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100 ml Flüssigmedium, enthaltend 2% Glucose, 0,5
Polypepton, 03% Hefeextrakt und 0,3% Malzextrakt werden
mit S. cerevisiae NH-268 und S. cerevisiae TR-29 angeimpft
und diese werden darin 40 Stunden lang bei 30ºC unter
Schütteln kultiviert. Das vorkultivierte Medium wurde
in ein, wie in Tabelle 4 gezeigtes Fermentationsmedium
zu einer Rate von 16% überimpft und darin 11 Tage lang
bei 30ºC unter Schütteln kultiviert. Im Fall von S.
cerevisiae TR-29, d. h. dem Elternstamm, betrug
die Menge des im Kulturmedium angehäuften Riboflavins
3,10 g/l. Andererseits betrug die im Fall von S.
cerevisiae NH-268 beobachtete Menge 3,40 g/l, was einen
Anstieg zeigt.
Tabelle 4
Zusammensetzung des Fermentationsmediums zum Herstellen
von Riboflavin
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Bestandteil Konzentration
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Calciumacetat 132 g/l
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(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 6 g/l
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MgSO&sub4;·7H&sub2;O 1 g/l
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KH&sub2;PO&sub4; 2 g/l
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ZnSO4·7H&sub2;O 11 mg/l
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pH 7
Beispiel 2
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Dieselben, wie im Beispiel 4 verwendeten Stämme wurden auf
dieselbe Weise kultiviert, wie hierin beschrieben, mit der
Ausnahme, daß die Ammoniumsulfatkonzentration des
Fermentationsmediums, wie in Tabelle 5, 10 Tage lang
variiert wurde. Wie in Tabelle 5 dargestellt, zeigte S.
cerevisiae NH-268 eine kleine Verminderung der im
Kulturmedium angehäuften Riboflavinmenge bei einem
Anstieg der Ammoniumionenkonzentration, verglichen mit
dem Fall des Elternstamms, d. h. S. cerevisiae
TR-29.
Tabelle 5 Angehäuftes Riboflavin (g/l)
Ammoniumion, ppm (Ammoniumsulfat, g/l)