DE3689846T2 - Erhöhte ausscheidung von heterologen proteinen durch wirtszellen durch verwendung von substituierten promotoren. - Google Patents

Description

Technischer Bereich der Erfindung
• Diese Erfindung betrifft Expressionssysteme und rekombinante DNA-Moleküle, die eine verbesserte Sekretion von heterologen Proteinen durch Wirte bewirken, Wirte, die solche rekombinanten DNA-Moleküle enthalten, und Verfahren zur Herstellung von gewünschten Proteinen unter Verwendung solcher Wirte.
Hintergrund der Erfindung
• Durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellte Proteine sind manchmal schwierig zu isolieren, da das Protein aus dem transformierten Mikroorganismus beispielsweise mit Hilfe einer den Mikroorganismus üblicherweise zerstörenden Zellysis extrahiert werden muß. Es ist schwierig, durch solche Extraktionsverfahren genügend reines Protein in hoher Ausbeute zu erhalten, da eine große Zahl verschiedener organischer Bestandteile bei der Durchführung der Lysis freigesetzt wird.
• In einer attraktiven Alternative zu den üblichen Trennverfahren wird der Wirt dazu veranlaßt, das gewünschte Protein in seine Umgebung auszuscheiden. Ein sezerniertes Protein kann aus dem Kulturmedium leichter isoliert werden und der Mikroorganismus das Trennverfahren überleben, um mehr gewünschtes Protein zu produzieren und auszuscheiden.
• Die meisten, von Prokaryoten und Eukaryoten natürlich ausgeschiedenen Proteine werden zunächst in Form von Vorläufer-Molekülen synthetisiert, die einen verlängerten Amino-Terminus aus mehreren Aminosäuren enthalten. Aufgrund dieser als Sekretions-Leader- oder Signalsequenz bezeichneten Verlängerung kann das Vorläuferprotein die Zellmembran des Mikroorganismus durchdringen und in das Kulturmedium oder in den periplasmatischen Raum der Zelle gelangen. Während der Sekretion wird die Sekretions-Leadersequenz vom Protein abgespalten, was zum Vorhandensein von reifem Protein im Kulturmedium oder periplasmatischen Raum führt.
• Trotz der üblicherweise sehr niedrigen bakteriellen Sekretionsrate ist bakterielle Sekretion bei DNA-Rekombinationsverfahren verwendet worden. Vgl. beispielsweise US- Patente mit den Nrn. 4,411,99 4 und 4,338,397 und Villa- Komaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 3727- 31.
• Die allgemeine Sicherheit von Hefen und die menschliche Erfahrung mit der Hefezüchtung haben die Wahl von Hefen zur Verwendung als Wirte in DNA-Rekombinationsverfahren wünschenswert werden lassen. Die beschriebenen Versuche hatten jedoch den Nachteil, daß die aus rekombinanten Hefen ausgeschiedenen reifen Proteine nur in niedrigen Ausbeuten erhalten wurden. Vgl. beispielsweise Chang, C. N. et al., "Recognition and Cleavage of Hybrid Invertase Signals and Mature Forms of Human Interferon (IFN-α2) in Yeast," Meeting Abstracts, The Molecular Biology of Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1983), 393, Meyhack B. und Hinnen A., "High Levels of Expression of Foreign Genes Under the Control of the Yeast PHQ5 Promoter," Meeting Abstracts, The Molecular Biology of Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1983), 156, Emr S. D., "An MFα1-SUC2 (α-Factor-Invertase) Gene Fusion for Study of Protein Localization and Gene Expression in Yeast", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 7080-84, Brake, A. et al., "α-Factor-Directed Synthesis and Secretion of Mature Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisiae", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 4642-46, Bitter, G. A. et al., "Secretion of Foreign Proteins from Saccharomyces cerevisiae Directed by α-Factor Gene Fusions", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 5330-34, Singh, A. et al., "Synthesis, Secretion and Processing of α-Factor- Interferon Fusion Proteins in Yeast", Nucl. Ac. Res. 12 (1984), 8927-38, europäische Patentanmeldung 123 228, europäische Patentanmeldung 128 733 und Singh, A. et al., "Saccharomyces cerevisiae Contains Two Discrete Genes Coding for the α-Factor Pheromone", Nucl. Ac. Res. 11 (1983), 4049- 63.
Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung löst die vorstehend beschriebenen Probleme durch Bereitstellung von Expressionssystemen, die die erhöhte Sekretion von heterologen Proteinen ermöglichen. Es wurde festgestellt, daß die Verwendung eines Promotors von höchstens intermediärer Stärke und einer heterologen DNA-Sekretions-Signalsequenz in einem Multicopy-Vektor im Vergleich zu Wirten, die mit einem einen starken Promotor enthaltenden Multicopy-Vektor transformiert sind, zu einer höheren Ausbeute eines gewünschten Proteins aus dem Wirt führt.
• Eine erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt daher eine DNA-Sequenz, das heißt eine Expressions- und Sekretions-Kontrollsequenz, zur Produktion eines bestimmten Proteins und zu seiner Sekretion aus einem Wirt, in dem das Protein erzeugt wird, wobei die Sequenz (a) einen Promotor, der in diesem Wirt aktiv ist und höchstens intermediäre Stärke aufweist, umfaßt und (b) eine heterologe DNA- Sekretions-Signalsequenz, die von diesem Wirt erkannt wird und mit einem Startcodon, das funktionell mit diesem Promotor verbunden ist, beginnt. Die Expressions- und Sekretions-Kontrollsequenz kann anschließend mit einer DNA- Sequenz funktionell verbunden werden, die ein gewünschtes Protein codiert, und zur Transformation eines Wirts verwendet werden, um das gewünschte Protein zu produzieren und auszuscheiden. Hefe ist ein bevorzugter Wirt, und die Actin (ACT)- und Iso-1-cytochrom c (CYC1)-Promotoren sind bevorzugte Promotoren für Hefewirte. S. cerevisiae ist der am stärksten bevorzugte Wirt. Bei S. cerevisiae als Wirt ist die Sekretions-Signalsequenz vorzugsweise die Sekretions- Signalsequenz des MFal-Gens.
• Die vorliegende Erfindung betrifft auch Wirte, die durch die vorstehend diskutierten rekombinanten DNA-Moleküle transformiert wurden, und Verfahren zur Verwendung von transformierten Wirten bei der Produktion und Sekretion von gewünschten Proteinen.
Kurze Beschreibung der Figuren
• Fig. 1A stellt die Struktur des MFα1-Sekretionsvorläufers dar. Die punktierten Bereiche zeigen Spacer- Bereiche an, die die MFα1-Repeats trennen. Bei der Sekretion wird der Sekretions-Leader an der durch den Pfeil markierten Stelle gespalten.
• Fig. 1B stellt ein allgemeines Schema der Konstruktion eines Hefe-Sekretions-Vorläufers dar, der den an das gewünschte heterologe Protein fusionierten Alpha-Paarungsfaktor (MFα1)-Sekretions-Leader umfaßt. Bei der Sekretion wird der Sekretions-Leader an der durch den Pfeil markierten Stelle gespalten.
• Fig. 2 stellt die Konstruktion einer Genfusion zwischen der MFα1-Expressions-Kontrollsequenz und dem SMC-Gen und die Insertion der fusionierten MFα1/SMC-Sequenz in einen Hefe-Expressionsvektor dar.
• Fig. 3 zeigt zwei graphische Darstellungen: Wachstum anhand (der optischen Dichte bei 600 nm) und SMC-Mengen in der Kulturflüssigkeit des mit Expressionsvektoren vom Typ URA3 transformierten Hefestamms BJ1991. Die CYC1-Promotorkonstruktion (p446/1) wird durch ( ), die ACT-Promotorkonstruktion (p364/1) durch ( ) und die MFα1-Promotorkonstruktion (p336/1) durch ( ) dargestellt.
• Fig. 4A stellt die Konstruktion von Actin-Promotorfragmenten mit EcoRI-Enden dar.
• Fig. 4B stellt die DNA-Struktur der Enden des Act in- Promotors und der Vektoren pEX-5, pEX-7 und pEX-8 dar.
• Fig. 5 stellt die Konstruktion von SMC-Sekretionsvektoren aus den ACT- und CYC1-Promotoren basierenden dar.
• Fig. 6 stellt die Struktur von auf dem LEU2-Hefegen basierenden SMC-Sekretionsvektoren dar.
• Fig. 7 zeigt zwei graphische Darstellungen: Wachstum (anhand der optischen Dichte bei 600 nm) und SMC-Mengen in der Kulturflüssigkeit des mit Expressionsvektoren vom Typ LEU2 transformierten Hefestamms BJ1991. Die CYC1-Promotorkonstruktion (504/5) wird durch ( ) die ACT-Promotorkonstruktion (p482/18) durch ( ) und die MFα1-Promotorkonstruktion (pMF-SMC, neu angeordnet) durch ( ) dargestellt.
• Fig. 8 stellt die Konstruktion von Sekretionsvektoren für TNF dar.
• Fig. 9 stellt die Konstruktion von Sekretionsvektoren für TPA dar.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Zum besseren Verständnis wird die Erfindung nachstehend genauer erläutert. In dieser Erläuterung werden die nachstehend beschriebenen Begriffe verwendet:
• Clonieren - Verfahren zum Erhalt einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die von einem solchen Organismus oder einer solchen Sequenz durch asexuelle Reproduktion abstammen.
• Rekombinantes DNA-Molekül oder Hybrid-DNA - Ein Molekül, das aus DNA-Sequenzen aus unterschiedlichen Genomen besteht, die außerhalb von lebenden Zellen mit ihren Enden zusammengefügt worden sind und die in lebenden Zellen gehalten werden können.
• Protein - Ein Polypeptid, das eine lineare Anordnung von mehr als fünfzig Aminosäuren enthält, beispielsweise ein Proinsulin, Serumalbumin, menschliches Wachstumshormon, Parathyroidhormon und Interferon. Wie hier jedoch verwendet, fünfzig Aminosäuren.
• Polypeptid - Eine lineare Anordnung von Aminosäuren, die untereinander über Peptidbindungen zwischen den Amino- und Carboxyl-Gruppen von benachbarten Aminosäuren verbunden sind.
• Expression - Der Vorgang, bei dem von einem Gen ein Polypeptid oder Protein produziert wird. Sie ist eine Kombination von Transkription und Translation.
• Transkription - Der Vorgang, bei dem mRNA von einem Gen erzeugt wird.
• Translation - Der Vorgang, bei dem ein Protein oder Polypeptid von mRNA erzeugt wird.
• Promotor - Der DNA-Bereich, der für die Bindung der RNA-Polymerase zur Initiation der Transkription verantwortlich ist. In bakteriellen Expressionssystemen liegt ein Promotor vor der Ribosomen-Bindungsstelle. Ein starker Promotor ist ein Promotor, der eine starke Affinität für die RNA-Polymerase aufweist und von dem dementsprechend erwartet wird, daß er zum Erhalt von hohen Expressionsraten hilfreich ist. Ein Promotor von intermediärer Stärke weist eine geringere Affinität für die RNA-Polymerase auf.
• In rekombinanten Systemen kann die Stärke eines Promotors durch den Wirt, das gewünschte Protein und den Expressionsvektor des rekombinanten Systems beeinflußt werden. Die Auswirkungen dieser Faktoren werden nachstehend ausführlicher beschrieben. In Systemen, die das gewünschte Protein nicht sezernieren, d. h., in intrazellulären Expressionssystemen, sind die mRNA-Mengen und die Mengen an exprimiertem Protein der Promotorstärke proportional. In intrazellulären Expressionssystemen sind keine Veränderungen der Plasmid-Kopienzahl bei einer Veränderung der Promotorstärke beobachtet worden. Mellor, J. et al., "Factors Affecting Heterologous Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae", Gene 33 (1985), 215-26. Von den Erfindern wurde festgestellt, daß in Expressionssystemen mit Sekretion die Promotorstärke die Zahl der innerhalb eines bestimmten Wirts produzierten Kopien eines Multicopy-Expressionsvektors beeinflussen kann. In Expressionssystemen mit Sekretion produziert ein Wirt viele Kopien eines Multicopy-Vektors, der einen intermediären oder schwachen Promotor enthält, jedoch weniger Kopien eines Multicopy-Vektors, der einen starken Promotor enthält. Eine Bewertung der Stärke eines Promotors kann auf der Grundlage des Prozentsatzes der Gesamt-mRNA in einer Zelle, der durch die Expressions- Kontrollsequenzen dieses Promotors produziert wird, vorgenommen werden. Tabelle 1 zeigt eine Liste von Genen, einschließlich der mit ihnen verbundenen Promotoren und der betreffenden mRNA, wie in der Literatur beschrieben. Eine Charakterisierung der Promotorstärke ist ebenfalls enthalten. Tabelle 1 Gen Protein Prozentsatz der Gesamt-mRNA Zitat Charakterisierung der Promotorstärke sehr stark Enolase Alkoholdehydrogenase Histon 2B stark Ribosomales Protein P1 Actin intermediär iso-1-Cytochrom c schwach
• 1. Bennetzen, J. L. und Hall, B. D. "Codon Selection in Yeast", J. Biol. Chem. 257 (1982), 3026-31.
• 2. Kim, C. H. und Warner, J. R. "Messenger RNA for Ribosomal Proteins in Yeast", J. Mol. Biol. 165 (1983), 78- 89.
• 3. Himmelfarb, H. J. et al., "Isolation of the SUP45 Omnipotent Suppressor Gene of Saccharomyces cerevisiae and Characterization of its Gene Product", Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 816-22.
• 4. Dobson, M. J. et al., "Expression in Saccharomyces cerevisiae of Human Interferon-Alpha Directed by TRP1 5' Region", Nucl. Ac. Res. 11 (1983), 2287-2302.
• üblicherweise werden Promotoren von glycolytischen Genen für "stark" gehalten. Der Fachmann wird jedoch verstehen, daß Promotoren innerhalb von verschiedenen Stämmen eines Wirts, bei unterschiedlichen gewünschten Proteinen oder in verschiedenen Multicopy-Vektoren nicht die gleiche Stärke aufweisen müssen. In S. cerevisiae ist der MFα1-Promotor beispielsweise in MATα-Stämmen aktiv, in MATa-Stämmen jedoch inaktiv. Dem Fachmann wird bekannt sein, daß die Promotorstärke von vielen Faktoren abhängt. Nur weil ein Promotor im Hinblick auf eine bestimmte Kombination von Wirt, Vektor und gewünschtem Protein inakzeptabel ist, bedeutet dies nicht, daß der Promotor auch für eine andere Kombination von Wirt, Vektor und gewünschtem Protein nicht akzeptabel ist.
• Die erfindungsgemäßen Promotoren sollten so gewählt werden, daß die Kombination von Promotorstärke und Kopienzahl des Multicopy-Vektors optimale Ausbeuten an gewünschtem Protein liefert. Promotoren von intermediärer Stärke liefern die beste Kombination von Promotorstärke und Kopienzahl. Schwächere Promotoren in Kombination mit hohen Kopienzahlen sind auch im schutzbereich der Erfindung. Starke Promotoren beeinflussen die Kopienzahl der Multicopy- Vektoren innerhalb des transformierten Wirts nachteilig, und es werden von diesen Transformanten inakzeptable Ausbeuten erhalten. Es sollte ein Promotor gewählt werden, der eine maximale Stärke aufweist ohne die Plasmid-Kopienzahl wesentlich zu reduzieren. Üblicherweise sollte ein Promotor als von höchstens intermediärer Stärke im Hinblick auf eine bestimmte Kombination von Wirt, Vektor und gewünschtem Protein betrachtet werden, wenn der Prozentsatz an Gesamt-mRNA im Wirt bezogen auf den Promotor weniger als 0,3% und vorzugsweise höchstens 0,15% ist.
• Ribosomen-Bindungsstelle - Der Bereich der DNA, der eine Stelle auf der mRNA codiert, die die mRNA bei der Bindung an das Ribosom unterstützt, so daß die Translation beginnen kann. In bakteriellen Expressionssystemen liegt eine Ribosomen-Bindungsstelle hinter (stromabwärts von) dem Promotor und vor (stromaufwärts von) dem Startsignal der Translation der DNA-Sequenz, die zur Erzeugung des gewünschten Proteins exprimiert werden muß.
• Gen - Eine DNA-Sequenz, die als Matrize für mRNA eine Sequenz von Aminosäuren codiert, die für ein spezifisches Polypeptid oder Protein charakteristisch ist.
• Expressions-Kontrollsequenz - Eine DNA-Sequenz, die die Expression von Genen kontrolliert und reguliert, wenn sie mit diesen Genen funktionell verbunden ist. Zu solchen Sequenzen gehören das lac-System, das β-Lactamase-System, das trp-System, die tac- und trc-Systeme, die wichtigsten Operator- und Promotorregionen des Phagen λ, die Kontrollregion des fd-Hüllproteins, die frühen und späten Promotoren von SV40, die vom Polyoma-Virus und Adenovirus stammenden Promotoren, Metallothionein-Promotoren, der Promotor der 3- Phosphoglycerat-Kinase oder anderer glycolytischer Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, z. B. Pho5, die Promotoren der α-Paarungsfaktoren der Hefe und weitere im Stand der Technik bekannte Sequenzen, die die Expression von Genen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und ihrer Viren und deren Kombinationen kontrollieren. Bei Säugerzellen kann das Gen mit einem eukaryotischen Promotor verbunden sein, beispielsweise dem für die frühe Region von SV40, der an das die Dihydrofolat-Reduktase codierende Gen gekuppelt ist, und selektiv in Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters vermehrt werden, um eine Zellinie herzustellen, die viele Kopien von aktiv transkribierten eukaryotischen Genen enthält. Dem Fachmann dürfte bekannt sein, daß nicht jede vorstehend als Beispiel aufgeführte Expressions-Kontrollsequenz zur Verwendung bei allen Kombinationen von Wirt, gewünschtem Protein und Vektor geeignet sein kann.
• Vorläufer eines Proteins - Ein Protein mit einer funktionell mit dem Protein verbundenen Signalsequenz. Üblicherweise wird der Vorläufer innerhalb einer Wirtszelle synthetisiert, z. B. Präproinsulin, Präserumalbumin, menschliches Präwachstumshormon, Präparathyroidhormon und Präinterferon. Ein reifes Protein wird erfindungsgemäß durch Sekretion des Vorläufers durch die Zellmembran eines Wirts erhalten, wobei der Vorläufer die Signalsequenz verliert oder diese gespalten wird.
• Nucleotid -- Eine monomere, aus einem Zuckermolekül (Pentose) , einem Phosphat und einer Stickstoff-enthaltenden, heterocyclischen Base bestehende DNA- oder RNA-Einheit. Die Base ist mit dem Zuckeranteil über ein glycosidisches Kohlenstoffatom (1'-Kohlenstoffatom der Pentose) verbunden und diese Kombination einer Base und eines Zuckers wird Nucleosid genannt. Die Base charakterisiert das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U").
• DNA-Sequenz - Eine lineare Anordnung von Nucleotiden, die miteinander über Phosphodiesterbindungen zwischen dem 3'- und 5'-Kohlenstoffatom von benachbarten Pentosen verbunden sind.
• Codon - Eine DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplett), die über Messenger-RNA ("mRNA") eine Aminosäure, ein Translations-Startsignal oder ein Translations- Terminationssignal codiert. Zum Beispiel codieren die Nucleotidtripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG die Aminosäure Leucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translations-Stopsignale und ATG ist ein Translations-Startsignal.
• Plasmid - Eine nicht-chromosomale, doppelsträngige DNA-Sequenz, die ein intaktes "Replicon" in der Weise umfaßt, daß das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in einen Wirtsorganismus eingeführt wird, können als Folge der Plasmid-DNA die Eigenschaften dieses Organismus verändert oder transformiert werden. Zum Beispiel transformiert ein Plasmid, das das Gen für Tetracyclin- Resistenz (Tet®) trägt, eine zuvor Tetracyclin-empfindliche in eine dagegen resistente Wirtszelle. Eine durch ein Plasmid transformierte Wirtszelle wird als "transformierter Wirt" oder "Transformante" bezeichnet.
• Phage oder Bacteriophage - Bakterien-Virus, zu dem DNA-Sequenzen gehören, die in einer Proteinhülle oder Umhüllung ("Capsid") enthalten sind.
• Clonierungsvehikel - Ein Plasmid, eine Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz, die zur Replikation in einer Wirtszelle befähigt ist und die durch eine oder eine kleine Zahl von Endonuclease-Erkennungsstellen gekennzeichnet ist, an denen solche DNA-Sequenzen in einer vorherbestimmbaren Weise gespalten werden können, ohne daß dies mit dem Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA verbunden ist, z. B. der Replikation, Produktion von Hüllproteinen oder dem Verlust von Promotor- oder Bindungsstellen, und die einen Marker trägt, der für die Verwendung bei der Identifizierung von transformierten Zellen geeignet ist, z. B. eine Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz. Ein Clonierungsvehikel wird oft als Vektor bezeichnet. In der vorliegenden Erfindung muß der Vektor ein "Multicopy- Vektor" sein, d. h., er muß fähig sein, viele Kopien von sich innerhalb des Wirts zu erzeugen. Singlecopy-Vektoren, die nicht zur Erzeugung von Kopien fähig sind, gehören nicht zu dem.
• Wirt - Ein Organismus, der nach der Transformation durch ein Clonierungsvehikel es diesem ermöglicht, zu replizieren und seine anderen biologischen Funktionen zu erfüllen, z. B., die Produktion von Polypeptiden oder Proteinen durch Expression der Gene eines Plasmids.
• DNA-Signalsequenz - Eine DNA-Sequenz, die als Matrize für mRNA eine Sequenz von üblicherweise hydrophoben Aminosäuren am Amino-Terminus des Polypeptids oder Proteins codiert, d. h., eine "Signalsequenz" oder "Sekretions- Leadersequenz" des Proteins. Zur Sekretion wird eine solche DNA-Signalsequenz funktionell mit der Sequenz des gewünschten Protein verbunden und unmittelbar vor ihr und nach dem Translations-Startsignal (z. B. ATG) angeordnet. Es wird angenommen, daß nur ein Teil einer Signalsequenz eines Protein-Vorläufers für den Transport des Protein-Vorläufers durch die Zellmembran eines Wirts und für die richtige Spaltung der Vorläufer-Signalsequenz wesentlich ist, um das Protein während der Sekretion freizusetzen. Kombinationen von Signalsequenzen oder Teilen von Signalsequenzen können auch unter der Voraussetzung verwendet werden, daß ein korrektes Prozessieren im Wirt stattfindet. Daher gehören zum Begriff "DNA-Signalsequenz", wie hier verwendet, die DNA- Sequenzen, die den Teil einer für die Sekretion erforderlichen Signalsequenz codieren.
• Um ein gewünschtes Protein erfindungsgemäß zu exprimieren, wird ein erfindungsgemäßes Expressionssystem mit einer das gewünschte Protein codierenden DNA-Sequenz funktionell verbunden und zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet. Der Wirt kann anschließend unter geeigneten Wachstumsbedingungen gezüchtet werden. Das ge-wünschte Protein kann anschließend aus der Kultur isoliert werden. Optimale Ergebnisse werden natürlich von mehreren Variablen abhängen, einschließlich der passenden Wahl eines Wirts, Promotors, Vektors und der Züchtungsbedingungen.
• Es sind viele Wirte bei DNA-Rekombinationsverfahren verwendet worden, und sie sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Ein breites Spektrum von Wirten kann im erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein. Diese Wirte schließen beispielsweise Bakterien ein, beispielsweise E. coli (beispielsweise E. coli HB101 oder E. coli MC1061), Bacillus, Streptomyces und Pseudomonas, Pilze, beispielsweise Hefen, Tierzellen, beispielsweise CHO-Zellen, Maus-, Schweine-, Rinder-, Hühner- oder Fischzellen, Pflanzenzellen in Gewebekultur, menschliche Gewebezellen oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Wirte.
• Die Selektion eines geeigneten Wirts wird durch eine Reihe von auf dem Fachgebiet bekannten Faktoren bestimmt. Zu diesen gehören beispielsweise die Kompatibilität mit dem gewählten Vektor, Leichtigkeit der Gewinnung des gewünschten Proteins, Expressionscharakteristika, biologische Sicherheit und Kosten. In der vorliegenden Erfindung muß der Wirt sowohl den verwendeten Promotor als auch die verwendete Sekretions-Signalsequenz erkennen können. Ferner muß die Toxizität des gewünschten Proteins auf den Wirt berücksichtigt werden, sowie die Lebensfähigkeit des Wirts nach der Transformation mit einem Multicopy-Vektor. Es kann keine absolute Wahl des Wirts für ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül oder Polypeptid anhand eines dieser Faktoren allein getroffen werden. Statt dessen müssen diese Faktoren in der Erkenntnis gegeneinander abgewogen werden, daß nicht alle Wirte bei der Expression einer bestimmten DNA-Sequenz, die mit einer bestimmten Expressions-Kontrollsequenz funktionell verbunden ist, gleich effektiv sein können. Obwohl die vorliegende Erfindung nicht auf S. cerevisiae beschränkt ist, ist Hefe ein bevorzugter Wirt und S. cerevisiae ist besonders bevorzugt.
• Verschiedene Promotoren können in den erfindungsgemäßen Expressionssystemen unter der Voraussetzung verwendet werden, daß der Promotor im gewählten Wirt aktiv ist und höchstens intermediäre Stärke aufweist.
• Die Toxizität des gewünschten Proteins gegenüber dem Wirt beeinflußt die Wahl des Promotors; zur Sekretion eines wenig toxischen Proteins kann ein vergleichsweise stärkerer Promotor als zur Sekretion eines toxischeren Proteins verwendet werden. Der mit einem Promotor in einem Multicopy- Vektor verbundene codierende Bereich beeinflußt ebenfalls die Stärke des Promotors. Der pgk-Promotor ist beispielsweise sehr stark, wenn er mit seinem eigenen codierenden Bereich (PGK) verbunden ist, jedoch schwach, wenn er mit einem alpha-Interferongen verbunden ist. Mellor, J. et al., "Factors Affecting Heterologous Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae", Gene 33 (1985), 215-26. Bei der Wahl eines Promotors sollte auch bekannt sein, daß die Verbindung eines starken Promotors mit einem heterologen Gen den starken Promotor beträchtlich schwächen kann, siehe Mellor et al., a. a. O . . Da die Promotorstärke von so vielen Variablen beeinflußt wird, schließt die Tatsache, daß ein Promotor zu stark zur Verwendung in einer bestimmten Kombination von Wirt-Vektor-gewünschtem Protein ist, nicht aus, daß der Promotor in einer anderen Kombination verwendet wird.
• Zu den Promotoren, die zur Verwendung in erfindungsgemäß hergestellten, rekombinanten DNA-Molekülen in Frage kommen, gehören für die Hefe S. cerevisiae die Promotoren des ACT (Actin)-Gens, CYC1 (iso-1-Cytochrom c)-Gens und URA3-Gens. Kim und Warner, J. Mol. Biol. 165 (1983), 79-89 (mRNA-Menge etwa 0,008%). Zu den zur Verwendung in S. cerevisiae nicht geeigneten starken Promotoren für Expressionssysteme mit Sekretion gehören beispielsweise die G3PDH- und die Enolase-Promotoren.
• Bevorzugte Promotoren in Expressionssystemen mit Sekretion zur Verwendung in Bakterien, beispielsweise E. coli und B. subtilis, sollten höchstens von intermediärer Stärke sein. Starke Promotoren, beispielsweise die trp-' trc- und lac-Promotoren sollten generell vermieden werden. Intermediäre Promotorstärke könnte jedoch zweckmäßigerweise mit regulierbaren Promotoren, beispielsweise den trp- oder lac-Promotoren, eingestellt werden, wenn mittelmäßig induzierende Wachstumsbedingungen gewählt werden.
• In den Beispielen wurden Promotoren verwendet, die während sämtlicher Wachstumsphasen aktiv sind. Wenn die Promotoren während des Wachstums abgeschaltet sein sollen, würde vermutlich keine Regulierung der Kopienzahl des Vektors erfolgen, es sei denn die Promotoren würden induziert. Regulierbare Promotoren würden jedoch wahrscheinlich keinen Vorteil bringen. Vermutlich würde das Einschalten eines starken Promotors in einer Sekretionskonstruktion mit hoher Kopienzahl sofort eine Lyse des Wirts bewirken, wie bei der Insulin-Sekretion durch E. coli.
• Wie vorstehend beschrieben, wurde von den Erfindern festgestellt, daß ein Wirt in Expressionssystemen mit Sekretion wenige Kopien (d. h., niedrige Kopienzahl) eines Multicopy-Vektors erzeugt, wenn der Promotor im System von Wirt-Vektor-gewünschtem Protein stark ist, und mehr Kopien (d. h., höhere Kopienzahl) eines Multicopy-Vektors, wenn der Promotor schwächer ist, wobei eine erhöhte Ausbeute des gewünschten Proteins erhalten wird. Die Verwendung eines schwächeren Promotors als des in Beispiel 3 beschriebenen CYC1-Promotors (z. B. CYC7 oder trp1) kann die auf eine höhere Kopienzahl zurückzuführenden Ausbeuten nicht weiter erhöhen, da bereits maximale Kopienzahlen für die CYC1- Promotorkonstruktion beobachtet werden (Tabelle 2). Die Promotoren mit geringster Stärke sind durch die Promotorstärke begrenzt, und die stärksten Promotoren liefern nur begrenzte Kopienzahlen. Obwohl keine Festlegung auf irgendeine Theorie beabsichtigt ist, scheint es, daß hohe Kopienzahlen kombiniert mit starken Promotoren hohe Mengen an mRNA und eine Hypersekretion des gewünschten Proteins oder beides zur Folge haben. In einer Population von Transformanten, die Zellen enthalten, die mit starke Promotoren aufweisenden Vektoren transformiert sind, ist ein Gemisch von Kopienzahlen in der Population vorhanden. Die Zellen, die hohe Kopienzahlen mit starken Promotoren aufweisen, werden das Wachstum einstellen und eventuell lysieren, während die Transformanten mit niedrigeren Kopienzahlen und dem gleichen starken Promotor überleben werden. Die Population wird schließlich nur eine Transformation mit niedriger Kopienzahl enthalten. Vgl. allgemein Silhavy, T. J. et al., "Mechanisms of Protein Localization", Microbiol. Res. 47 (1983), 313-34.
• Der Multicopy-Vektor und insbesondere die darin für die Insertion der erfindungsgemäßen Expressionssysteme gewählten Stellen werden durch mehrere Faktoren bestimmt, z. B. der Zahl der gegen ein bestimmtes Restriktionsenzym empfindlichen Stellen, der Größe des zu exprimierenden Proteins, den Expressionseigenschaften, beispielsweise der Lage von Start- und Stopcodons relativ zu den Vektorsequenzen, und weiteren dem Fachmann bekannten Faktoren. Die Wahl eines Vektors erfolgt durch Abwägen dieser Faktoren, wobei nicht jede Wahl für einen bestimmten Zweck gleich effektiv ist. Die bevorzugten Vektoren sind Plasmide, beispielsweise solche, die einen von chromosomaler oder nicht-chromosomaler DNA stammenden Replikationsursprung enthalten. In der Hefe S. cerevisiae werden die verschiedenen ARS-Vektoren und Vektoren vom 2 u-Typ (Botstein et al.) bevorzugt. In E. coli können Multicopy-Plasmide, beispielsweise die Plasmide CoiE1, pBR322 und RP4 oder M13 und Lambda-Phagen-Vektoren, verwendet werden. Für Tierzellen werden nicht-integrierende Multicopy-Vektoren bevorzugt, beispielsweise Vektoren auf der Grundlage des Rinder- Papilloma-Virus. Die Wahl des Vektors wird auch durch die Wahl des Promotors beeinflußt. Optimale Promotor- und Vektorsysteme haben eine geringere Toxizität des ausgeschiedenen Proteins (aufgrund einer zu hohen Kopienzahl oder Überproduktion wegen eines zu starken Promotors) zur Folge, und daher können erhöhte Mengen an ausgeschiedenem Produkt erhalten werden.
• Die erfindungsgemäßen heterologen Sekretions- Signalsequenzen müssen vom Wirt erkannt und richtig prozessiert werden. Die Signalsequenz kann eine natürlich vorkommende Signalsequenz, einen wirksamen Teil einer natürlich vorkommenden Signalsequenz oder eine Kombination von zwei oder mehr Signalsequenzen oder wirksamen Teilen von Signalsequenzen umfassen. Die Signalsequenz muß sowohl mit dem Promotor als auch mit dem Startsignal ATG funktionell verbunden sein. Die Signalsequenz beginnt vorzugsweise mit dem Translations-Startsignal. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Signalsequenz aus den Signalsequenzen ausgewählt, die vom Wirt bereits verwendet werden, um die Sekretion seiner eigenen Proteine zu unterstützen.
• Das gewünschte Protein kann jedes Polypeptid oder Protein, sowie Fusionen, Präproteine, unreife Proteine oder jede gewünschte Sequenz von Aminosäuren einschließen. Gewünschte erfindungsgemäße Proteine schließen jedoch vorzugsweise Proteine und andere Aminosäuresequenzen ein, die durch einen Mikroorganismus oder eine Zelle ausgeschieden werden können. Zu den Beispielen solcher sezernierbarer Proteine und anderer Aminosäuresequenzen gehören Serumproteine, analgetische Polypeptide, beispielsweise β-Endorphin, Somatostatin, Insulin, Wachstumshormon (vom Menschen und Rind), luteinisierendes Hormon, ACTH, Polypeptid- Präproteine des Pankreas, Präproinsulin, Proinsulin und die A- und B-Ketten von Insulin. Die gewünschten erfindungsgemäßen Proteine können Proteine und andere Aminosäuresequenzen umfassen, die durch den gewählten Wirt natürlich in das Medium ausgeschieden werden.
• Das gewünschte erfindungsgemäße Protein muß nicht unbedingt durch den gewählten Wirt ausgeschieden werden. Wie dem Beispiel 6 zu entnehmen ist, braucht der Wirt das mit der gewählten Signalsequenz funktionell verbundene gewünschte Protein nur zu produzieren und richtig in das endoplasmatische Retikulum zu prozessieren. Wenn das gewünschte Protein den Sekretionsweg des Wirts benutzt, können für das gewünschte Protein Vorteile, beispielsweise eine Glycosylierung, erreicht werden. Die Sekretion ist jedoch das bevorzugte Ergebnis für das gewünschte Protein.
• Die vorliegende Erfindung kann in Säugerzellen nützlich sein, wenn nicht-integrierende Multicopy-Vektoren, beispielsweise vom Rinder-Papilloma-Virus (DiMaio, D. et al., "Bovine Papilloma-Virus Vector that Propagates as a Plasmid in Both Mouse and Bacterial Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 30-34) stammende Vektoren, zusammen mit einem Promotor mit intermediärer Stärke verwendet werden.
• Die nachstehend beschriebenen, nicht-einschränkenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1 Herstellung von MFαl/SMC-DNA-Sequenzen
• Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer transformierten Hefe, die in einem späteren Beispiel zu Vergleichszwecken verwendet wird. Die transformierte Hefe dieses Beispiels weist ein Plasmid auf, das einen MFα1- Promotor enthält (der, wie nachstehend beschrieben, in Hefe ein starker Promotor ist), der mit einem MFα1-Sekretions- Leader und einer SMC codierenden DNA-Sequenz funktionell verbunden ist. Weitere Beispiele beschreiben den Ersatz des MFα1-Promotors durch ACT- und CYC1-Promotoren und einen Vergleich der von den unterschiedlich transformierten Hefen ausgeschiedenen Mengen. Weitere Beispiele beschreiben ferner die Herstellung von transformierten Hefen, die Plasmide aufweisen, die durch DNA-Sequenzen gekennzeichnet sind, die andere gewünschte Proteine als SMC codieren.
• Zunächst wurden das Gen für Prä-MFα1 und die mit ihm verbundenen Expressions-Kontrollsysteme isoliert, und anschließend wurden der MFαl-Promotor und die Signalsequenz mit einer DNA-Sequenz für SMC funktionell verbunden.
• Die den Vorläufer von MFα1 codierende DNA-Sequenz ist von Kurjan, J. und Herskowitz, I. "Structure ofa Yeast Pheromone Gene (MFα): A Putativ α-Factor Precursor Contains Four Tandem Copies of Mature α-Factor", Cell 30 (1982), 933- 43, sequenziert worden. Das diesen Prä-MFαl und die mit ihm verbundenen Expressions-Kontrollsequenzen codierende Gen wurde aus S. cerevisiae unter Verwendung der Bank isoliert, die von Nasmyth, K. A. und Reed, S. I. "Isolation of Genes by Complementation in Yeast: Molecular Cloning of a Cell- Cycle Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2119-23, hergestellt wurde. Statt Verwendung der von Nasmyth und Reed beschriebenen cdc28-Mutante zur Isolierung und Clonierung des cdc28-Gens wurde das nachstehend beschriebene Oligonucleotid verwendet, das den Aminosäuren 97 bis 102 des veröffentlichten Prä-MFα1 entsprach:
• (5') GTA CAT TGG TTG C/GCC G/A/TGG (3')
• Der MFα1-Sekretionsvorläufer, der einen Sekretions- Leader und vier MFα1-Repeats umfaßt, ist in Fig. 1A dargestellt. Die punktierten Regionen zeigen Spacer-Bereiche zwischen den MFα1-Repeats an. Vor dem Ersatz der vier MFα1- Repeats durch ein gewünschtes heterologes Protein, wie in Fig. 1B dargestellt, wurden das Prä-MFα1-Gen und die mit ihm verbundene Expressions-Kontrollsequenz, die auf einem 1,7 kb-EcoRI-Fragment lagen, in pUC18, den gewählten Clonierungsvektor, subcloniert. Das erhaltene Plasmid (p220/3) enthielt nun einen MFα1-Promotor, eine MFa1- Signalsequenz und eine MFα1 codierende DNA-Sequenz. Zur Abtrennung der MFα1 codierenden Sequenz vom MFα1-Promotor und der MFα1-Signalsequenz wurde mit dem Plasmid p220/3 eine Mutagenese unter Verwendung des von Oostra, B. A. et al., "Transforming Activity of Polyoma Virus Middle-T Antigen Probed by Site-Directed Mutagenesis", Nature 304 (1983), 456-59, beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Als Ergebnis der Mutagenese wurde eine passende BglII-Stelle an der Verbindung zwischen dem Sekretions-Leader und der für die Repeats in der MFαl-DNA-Sequenz codierenden Sequenz eingeführt, wie nachstehend beschrieben:
• modifiziertes Oligomer: (3') TA TTT TCT CTA GAA CTT CGA ACC (5')
• Originalsequenz: (3') TA TTT TCT CTC CGA CTT CGA ACC (5') Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp
• Das erhaltene Plasmid erhielt die Bezeichnung p254 (Fig. 2). Es wurde weiter modifiziert, um eine unbeabsichtigte Spaltung an einer am 5'-Ende des MFα1-Promotors festgestellten BglII-Stelle zu verhindern. Diese unerwünschte BglII-Stelle wurde durch Spaltung mit BglII und Auffüllen der überstehenden Enden unter Verwendung des großen (Klenow) Fragments der DNA-Polymerase I und Desoxynucleotidtriphosphaten und anschließender Ligierung unter Verwendung der T4- Ligase verändert. Um das Plasmid anders spalten zu können (Beispiele 5 und 6) , wurde durch ein Verfahren, das der vorstehend beschriebenen Mutagenese entspricht, an einer Position, die der gleichen Lys-Arg-Spaltstelle entsprach, eine StuI-Stelle eingeführt:
• modifiziertes Oligomer:(5') TA AAA AGG CCT CTT GAA GC (3')
• BglII-Sequenz:(5') TA AAA AGA GAT CTT GAA GC (3') Lys Arg
• Anschließend wurde eine MFα1/SMC (Sekretions- Leader/gewünschtes Protein) -Fusion durch Insertion eines 500 bp-HindIII-Fragments hergestellt, das ein synthetisches SMC- Gen beginnend mit einer einzigen NcoI-Stelle trug, in die HindIII-Stelle von Plasmid p254 (vorstehend beschrieben), das den MFα1-Promotor und den Sekretions-Leader enthielt, und es wurde das Plasmid F-9, wie in Fig. 2 dargestellt, erhalten. Das synthetische SMC-Gen wurde von Buell, G. et al., "Optimizing the Expression in E. coli ofa Synthetic Gene Encoding Somatomedin-C (IGF-1)", Nucl. Ac. Res. 13 (1985), 1923-38, beschrieben. Anschließend wurde das Plasmid F-9 mit BglII und NcoI gespalten, mit gleichzeitiger S1- Behandlung und erneuter Ligierung, um den A Anteil von Plasmid F-9 zu entfernen und pS30/25 zu erhalten, wie in Fig. 2 dargestellt. Die richtige Fusion des MFal- Sekretions-Leaders und der strukturellen SMC-DNA-Sequenz wies die nachstehend beschriebene Sequenz auf (Glycin ist die erste Aminosäure von SMC):
• (Sekretions-Leader) -AAA-AGA-GGT-CCA- (SMC) Lys Arg Gly Pro
• Als Ergebnis wurde die SMC-DNA-Sequenz mit dem MFαl- Sekretions-Leader funktionell verbunden, so daß das SMC- Protein durch Hefe richtig ausgeschieden wird.
• Wie in Fig. 2 dargestellt, wurde die MFα1/SMC-Fusion in einen Hefe-Shuttle-Vektor eingeführt, der den Replikationsursprung von E. coli und Hefe (ori bzw. 2 u Replikationsursprung) sowie selektierbare Marker für beide Organismen (E. coli: bla; Hefe: URA3) trug. Die SMC- Sekretionsraten von mit diesem Expressionsvektor transformierten S. cerevisiae sind in Fig. 3 dargestellt.
Beispiel 2 Herstellung von ACT/MFα1/SMC-DNA-Sequenzen
• Die Actin codierende DNA-Sequenz in Hefe wurde von Gallwitz, D, und Sures, I. "Structure of a Split Yeast Gene: Complete Nucleotide Sequence of the Act in Gene in Saccharomyces cerevisiae", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2546-50, beschrieben. Die Actin codierenden mRNA-Mengen (Gallwitz, D. et al., "The Actin Gene in the Yeast Saccharomyces cerevisiae: 5' and 3' End Mapping, Flanking and Putative Regulatory Sequences", Nucl. Ac. Res. 9 (1981), 6339-50) lassen darauf schließen, daß der ACT-Promotor ein Promotor von intermediärer Stärke ist, vgl. Tabelle 1. Vgl. auch Himmelfarb, a. a. O . .
• Zur Verwendung des ACT-Promotors in den Konstruktionen dieses und der nachstehend beschriebenen Beispiele wurden günstige Restriktionsstellen am Ende des Promotors eingefügt. Das in Fig. 4 dargestellte Plasmid pYA301 enthält das ACT-Gen und seine mit ihm verbundenen Expressions-Kontrollsequenzen auf einem 4 kb-EcoRI-BamHI-Fragment. Das Plasmid pYA301 ist ein 4 kb-EcoRI-BamHI-Subclon von pYA208 (Gallwitz und Sures, a. a. O.), der in pBR322 inseriert ist. Das Plasmid pYA301 wurde an der einzigen XhoI-Stelle gespalten und mit Bal31 behandelt. Im Anschluß an eine empirisch bestimmte Behandlungszeit mit Bal31 wurde das Plasmid mit EcoRI gespalten, und seine überstehenden Enden wurden unter Verwendung des großen (Klenow) Fragments der DNA-Polymerase I aufgefüllt. Schließlich wurde das behandelte Plasmid in verdünntem Zustand erneut ligiert. Etwa die Hälfte der erhaltenen Plasmide, die alle zusammen als pΔ4 bezeichnet wurden, enthielten eine EcoRI-Stelle. Diese EcoRI-Stellen sind durch Anfügen des aufgefüllten EcoRI-Endes an das Bal31-ACT-Promotorende gebildet worden. Die Strukturen von unterschiedlichen pΔ4-Promotorenden in der Nachbarschaft des ATG-Startcodons des erneut ligierten Plasmids sind in Fig. 4B dargestellt.
• Um den isolierten ACT-Promotor mit den MFα1- Signalsequenz-SMC-Fusionen funktionell zu verbinden, wurde das 3'-Ende des ACT-Promotors an den Amino-Terminus der MFα1/SMC-Fusion angeglichen. Dies wurde durch Einführung einer EcoRI-Stelle stromaufwärts (d. h., früher in der Transkriptions-Leserichtung) des ATG-Startcodons des MFα1- Sekretions-Leaders unter Durchführung der nachstehend beschriebenen Mutagenese unter Verwendung des von Oostra et al., a. a. O., beschriebenen Verfahrens durchgeführt:
• Modifiziertes Oligomer: (5') A ATA TAA ACG AAT TCA AGA ATG AG (3')
• Originalsequenz: (5') A ATA TAA ACG ACC AAA AGA ATG AG (3')
• Das erhaltene Plasmid erhielt die Bezeichnung p269/20.
• Das BamHI-EcoRI-Fragment von pEX-7 (Fig. 4), das vorstehend isoliert wurde und das den ACT-Promotor enthielt, wurde an das EcoRI-SalI-Fragment von Plasmid p269/20 (das den MFα1-Sekretions-Leader trug) angefügt und in einen mit BamHI und SalI gespaltenen pUC8-Vektor inseriert, wie in Fig. 5 dargestellt. Das erhaltene Plasmid (p309/1) wurde durch Ersatz der MFα1-Sekretions-Leader-Region von Plasmid p309/1 durch die an das SMC-Gen angefügte Sekretions-Leader- Region von Plasmid pS30/25 weiter modifiziert. Das Plasmid pS30/25 ist in Fig. 2 dargestellt. Die Modifikation wurde durch Spaltung von Plasmid p309/1 mit PstI und HindIII durchgeführt. Das große Fragment wurde isoliert und an ein Fragment von pS30/25 angefügt, das durch partielle Spaltung dieses Plasmids mit PstI und HindIII erhalten wurde. Das erhaltene Plasmid p355/1 (ACT-Pro-motor/MFαl-Sekretions- Leader/strukturelle SMC-DNA-Sequenz) wurde, wie in Fig. 5 dargestellt, in einen Hefe-Shuttle-Vektor transferiert, wobei das Plasmid p364/1 gebildet wurde. Die SMC- Sekretionsraten der mit diesem Plasmid transformierten Hefe sind in Fig. 3 dargestellt.
Beispiel 3 Herstellung von CyCl/MFαl/SMC-Plasmiden
• Unter induzierenden Bedingungen betragen die Iso-1- Cytochrom c (CYC1)-Mengen etwa 0,2% des zellulären Gesamtproteins der Hefe und die codierenden mRNA-Mengen etwa 0,05% der gesamten Poly(A)-RNA. Zitomer, R. S. und Hall, B. D. "Yeast Cytochrome c Messenger RNA. In Vitro Translation and Specific Immunoprecipitation of the CYC1 Gene Product", J. Biol. Chem. 251 (1976), 6320-26. Der CYC1-Promotor ist daher ein schwacher Promotor.
• Zur Konstruktion einer CYC1-Promotor /MFα 1-Sekretions- Leader/SMC-codierenden Sequenz wurde ein EcoRI-HindIII- Fragment, das den MFα1-Sekretions-Leader trug, der an das SMC-Gen richtig fusioniert worden ist, aus Plasmid p355/1 isoliert, was in Fig. 5 dargestellt ist. Dieses Fragment wurde zwischen die EcoRI- und HindIII-Stellen von pEX-2 inseriert, um das Plasmid p446/1 zu erhalten (Vgl. Fig. 5).
• pEX-2 wurde von Ernst, J. F. und Chan, R. C. "Characterization of S. cerevisiae Mutants Supersensitive to Aminoglycoside Antibiotics", J. Bacteriol. 163 (1985), 8-14, beschrieben.
• Der Vektor p446/1 exprimierte die MFα1/SMC-Fusion unter der Kontrolle des CYC1-Promotors. Die SMC-Sekretionsraten der mit diesem Vektor transformierten Hefe sind in Fig. 3 dargestellt.
Beispiel 4 Vergleich der Sekretion von SMC unter Verwendung der MFα1-, ACT- und CYC1-Promotoren sowohl mit dem URA3-Gen als auch dem LEU2-Gen in Expressionsvektoren
• Die Konstruktion der dreiteiligen SMC-Expressionsvektoren auf der Grundlage des MFα1-Sekretions-Leaders und der MFα1-, ACT- und CYC1-Promotoren ist vorstehend beschrieben worden. Jeder dieser Vektoren enthielt das URA3- Gen der Hefe zur Selektion in Hefe. Es wurden auch Vektoren auf der Grundlage einer Selektion unter Verwendung des LEU2- Gens der Hefe konstruiert. Die Expression des Leu2-Gens des Plasmids ist aufgrund einer partiellen Deletion niedrig; es ist somit eine höhere Kopienzahl der Expressionsvektoren vom LEU2-Typ erforderlich, um das Wachstum von Transformanten auf Leucin-freien Medien zu ermöglichen. Erhart, E. und Hollenberg, C. P. "The Presence of a Defective LEU2-Gene on 2u DNA Recombinant Plasmids of Saccharomyces cervisiae is Responsible for Curing and High Copy Number", J. Bacteriol. 156 (1983), 625-35. Für eine Diskussion der Verwendung von Hefen, die das URA3-Gen oder das LEU2-Gen aufweisen, in rekombinanten DNA-Experimenten vergleiche Botstein, D. et al., "Sterile Host Yeast (SHY): a Eukaryotic System for Biological Containment for Rekombinant DNA Experiments", Gene 8 (1979), 17-24.
• Die Vektoren vom LEU2-Typ wurden durch Insertion der gewählten Promotor-/MFα1-Sekretions-Leader-/strukturellen SMC-Sequenz in das Plasmid pJDB207 unter Verwendung von Verfahren, die den bei den URA3-Plasmiden verwendeten entsprachen, konstruiert. Die Strukturen der erhaltenen Plasmide sind in Fig. 6 dargestellt. Das Plasmid pJDB207 wurde von Beggs, J. D. "Multiple-copy Yeast Vectors", Molecular Genetics in Yeast, Alfred Benzon Symposium 16 (1981), 383-95, beschrieben.
• Der Hefestamm BJ1991 wurde mit den drei Vektoren vom URA-Typ, die vom Plasmid pEX-2 stammen (das von Ernst, J. F. und Chan, R. C. vorstehend beschrieben wird), und den drei Vektoren vom LEU2-Typ transformiert. Zwei der rekombinanten Hefestämme wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (Deutsche Kultursammlung) hinterlegt. Ein Stamm, YE439, ist ein Vektor vom LEU2-Typ mit der ACT- Promotor/MFα1-Sekretions-Leader-/strukturellen SMC-Sequenz. Er wurde am 30. Oktober 1985 hinterlegt und erhielt die Bezeichnung DSM 3578. Ein weiterer Stamm, YE466, ist ein Vektor vom LEU2-Typ mit der CYC1-Promotor/MFα1-Sekretions- Leader-/strukturellen SMC-Sequenz. Er wurde am 30. Oktober 1985 hinterlegt und erhielt die Bezeichnung DSM 3579. Die Transformanten wurden in "SD"-Medium, das von Sherman, F. et al., "Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981) beschrieben wird und das Tryptophan und Leucin (für Vektoren vom URA3- Typ) oder Tryptophan und Uracil (für Vektoren vom LEU2-Typ) enthielt, bis zu einer optischen Dichte von 2 bei 600 nm gezüchtet. Diese Kulturen wurden zur Animpfung eines Produktionsmediums verwendet, das aus SD-Medium bestand, das 4% Casaminosäuren und Tryptophan (das Inokkulum war 10% des Endvolumens des Produktionsmediums) bestand. Zu geeigneten Zeiten während des Wachstums wurden unter Verwendung einer "Microfuge" 0,5 ml der Kulturen pelletiert. Die Zellpellets wurden durch 5-minütiges Kochen in Natriumdodecylsulfat (SDS)-Probenpuffer U. K. Lämmli, "Cleavage of the Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4", Nature 227 (1970)' 680-85, in 1/10 des Volumens der Ausgangskultur erneut gelöst. Anschließend wurden die SMC-Mengen in den erneut gelösten Zellpellets und in der Kulturflüssigkeit nach der Verdünnung unter Verwendung eines Radioimmuntests (Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, California) bestimmt.
• Bei allen sechs Konstruktionen waren weniger als 10% des Gesamt-SMC Zell-gebunden. Das im Kulturmedium vorhandene SMC wurde gereinigt und analysiert, wobei festgestellt wurde, daß die Aminosäuren am Amino-Terminus und am Carboxy- Terminus dem menschlichen SMC entsprachen und daß die biologische Aktivität des ausgeschiedenen SMC der von menschlichem SMC entsprach.
• Überraschenderweise führte der schwächste verwendete Promotor, CYC1, zu den höchsten SMC-Sekretionswerten, die in den Fig. 3 und 7 und der Tabelle 2 dargestellt sind. Dies war unerwartet, da vom stärksten Promotor erwartet wurde, daß er die höchsten Sekretionswerte liefern würde. Unerwarteterweise wuchsen die die CYC1-Konstruktionen tragenden Transformanten am langsamsten und zeigten eine deutliche Optimum-Kurve der SMC-Sekretion, wodurch das Auftreten einer Zellysis und eines Abbaus von SMC (vgl. Fig. 7) angezeigt wurde.
• Um den Grund für die unerwarteten Ergebnisse festzustellen, wurden nach drei Tagen im Produktionsmedium die SMC-Plasmid-Kopienzahl und die Transkript-Mengen in den Transformanten, die hier beschrieben sind, analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Es wurde in den Sekretionssystemen ein umgekehrtes Verhältnis zwischen der Kopienzahl und der Promotorstärke festgestellt. Es stellte sich heraus, daß das Sekretionssystem mit dem schwächsten Promotor (CYC1) die höchsten Kopienzahlen aufwies. Die MFα1- Konstruktionen wiesen die niedrigsten Kopienzahlen auf. Es wurde festgestellt, daß die durchschnittliche Menge an SMC- Transkripten sowohl bei URA3- als auch LEU2-Konstruktionen der Kopienzahl proportional war. Andererseits waren bei LEU2-Konstruktionen die mRNA-Mengen den Sekretionsmengen proportional. Bei URA3-Konstruktionen wurde bei einer erhöhten mRNA keine signifikante Erhöhung der SMC- Sekretionsmengen beobachtet. Obwohl keine Festlegung auf eine Theorie beabsichtigt ist, haben die URA3-Konstruktionen anscheinend nicht die gleiche Wirkung auf die SMC- Sekretionsmengen, da ein hoher Prozentsatz der URA3-Plasmide verloren geht.
• Ein hoher Prozentsatz von URA3-Transformanten weist tatsächlich wenige oder keine URA3-Expressions-Plasmide auf. Diese unproduktiven Transformanten tragen wenig zur gesamten SMC-Sekretion bei. Vermutlich weist ein hoher Prozentsatz von URA3-Transformanten auch hohe Kopienzahlen und eine hohe Promotorstärke auf. Diese Transformanten tragen wenig zur SMC-Sekretion bei, da sie langsam wachsen und ihre Zellen eine reduzierte Lebensfähigkeit aufweisen. Dieser angenommene Mechanismus gilt nicht für LEU2-Vektoren, da die Mindestkopienzahl der Vektoren vom LEU2-Typ bei in Leucinfreien Medien gezüchteten Transformanten etwa 35 ist (Erhart und Hollenberg, a. a. O.). Da ferner das verwendete Produktionsmedium Leucin (jedoch kein Uracil) enthält, sind erhöhte Kopienzahlen zum Wachstum von LEU2-Vektor- Transformanten in diesem Medium nicht erforderlich. Daher erscheinen mit LEU2 transformierte Hefestämme im Hinblick auf Kopienzahl und mRNA-Gehalt homogener als URA3-Vektoren.
• Bei den URA3-Transkripten stiegen die mRNA-Mengen mit sinkender Promotorstärke, obwohl die Sekretionsmengen ziemlich konstant blieben. Dieser Trend scheint die niedrigeren Kopienzahlen für URA3-Konstruktionen wiederzugeben. Es scheint, daß bei LEU2-Transformanten eine Kopienzahl von mindestens 40 erforderlich ist, um Mindestmengen an mRNA und SMC-Sekretion zu erhalten.
• Tabelle 2 zeigt nicht das tatsächliche Verhältnis von SMC zu Actin-Transkripten und die Zahlen dienen nur Vergleichszwecken.
• Die Transformations-Häufigkeiten für alle sechs Plasmid-Konstruktionen sind auch in Tabelle 2 dargestellt. Etwa ähnliche Transformations-Häufigkeiten wurden bei allen Vektoren vom URA3-Typ erhalten. Es wurden jedoch dramatische Unterschiede bei Vektoren vom LEU2-Typ beobachtet. Mit den MFal-Promotor-Konstruktionen konnte Hefe überhaupt nicht transformiert werden, relativ hohe Häufigkeiten wurden bei der ACT-Promotor-Konstruktion beobachtet und niedrigere Transformations-Häufigkeiten im Vergleich zur Kontrolle (pJDB207) und der ACT-Konstruktion waren für die CYC1- Konstruktion charakteristisch. Es wurde eine einzige Transformante des Vektors vom LEU2-Typ mit der MFα1- Konstruktion erhalten; diese Transformante enthielt jedoch ein neu arrangiertes Plasmid, das zur Synthese von niedrigen SMC-Mengen führte, wie in Tabelle 2 in Klammern dargestellt. Dieses Ergebnis weist darauf hin, daß der MFαl-Promotor keine ausreichend hohe Kopienzahl ermöglicht, um die Wirkungen des LEU2-Defekts zu überwinden.
• Daher scheinen die Sekretionsrate, Lebensfähigkeit der Zelle, Promotorstärke und Kopienzahl des Vektors zusammenzuhängen. Tabelle 2 Konstruktion Plasmid Promotor Selektion Transformanten/ug % Verlust Kopienzahl RNA SMC (mg/l) Kontrolle
Beispiel 5 Sekretion von TNF
• Fusionen des MFα1-Sekretions-Leaders an das den menschlichen Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) codierende Gen wurden unter Verwendung des vorstehend für MFα1/SMC-Fusionen beschriebenen Verfahrens konstruiert, wie es in Fig. 8 dargestellt ist. Anschließend wurde die Wirkung des Promotor- Austausches auf die TNF-Sekretion analysiert.
• Die nachstehenden drei Fragmente wurden ligiert, um den Vektor pTNF11 zu konstruieren (vgl. Fig. 8): (1) ein 1,2 kb-EcoRI-StuI-Fragment, das den Promotor und den Sekretions-Leader von MFα1 trug, der in einer StuI-Stelle endete (vorstehend beschrieben), (2) ein 9 kb-EcoRI-HindIII- Fragment von pEX-2, das den 2u-Replikationsursprung der Hefe und das URA3-Gen zur Selektion in Hefe trug (vorstehend beschrieben) und (3) ein das TNF-Gen tragendes HindIII- Fragment (0,9 kb) mit glatten Enden. Verfahren zur Isolierung dieses dritten Fragments wurden von Pennica, D. et al., "Human Tumor Necrosis Factor: Precursor Structure, Expression and Homology to Lymphotoxin", Nature 312 (1984), 724-29, beschrieben. Das HindIII-Fragment mit glatten Enden wurde unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotid- Linkern erzeugt, um das 5'-Ende des TNF-Gens durch Erweiterung einer AvaI-Stelle, die in der Nähe des 5'-Endes des TNF-Gens lag (Valin ist die erste Aminosäure von TNF) wiederherzustellen. Die Verbindung von MFal an das TNF-Gen wies die nachstehend beschriebene Sequenz auf:
• (5') AAA AGG GTA CGT TCT TCC (3') Lys Arg Val Arg Ser Ser
• MFα1 TNF.
• Die Konstruktion eines TNF-Sekretions-Vektors auf der Grundlage des ACT-Promotors anstelle des MFαl-Promotors ist auch in Fig. 8 dargestellt. Die nachstehend beschriebenen Fragmente wurden zur Konstruktion von pACT-TNF-EX ligiert: (1) ein 1,2 kb-PstI-HindIII-Fragment von pTNF11, das den größten Teil des MFα1-Sekretions-Leaders, der an das TNF-Gen fusioniert war, trug (vorstehend beschrieben), (2) ein 0,5 kb-BamHI-PstI-Fragment von p355/1, das in Fig. 5 dargestellt ist und den ACT-Promotor und einen Teil des MFα1- Leaders trug (vorstehend beschrieben), und (3) das 9 kb- BamHI-HindIII-Fragment von pEX-2 (vorstehend beschrieben).
• Der Hefestamm BJ1991 wurde mit pTNF11 oder pACT-TNF- EX transformiert und auf Ura&spplus;-Prototrophe selektiert. Die Transformanten wurden in flüssigem SD-Medium ohne Uracil selektiv gezüchtet. Schüttelflaschen, die das vorstehend von Sherman, F. et al., beschriebene YPD-Medium enthielten, wurden mit Minimal-Kulturen (10% Endvolumen) beimpft und bei 30ºC auf einem Rundschüttler inkubiert. Während der Inkubation wurden zu geeigneten Zeiten 1 ml-Proben der Hefekultur unter Verwendung einer "Mikrofuge" 1 Min. zentrifugiert. Anschließend wurde das Zellpellet mit Zymolase behandelt, um Sphäroplasten zu erzeugen. Anschließend wurden die Sphäroplasten unter Verwendung von 1% Triton X-100 bei 20% des ursprünglichen Kulturvolumens lysiert, worauf die Zelltrümmer durch einen kurzen Zentrifugationsschritt entfernt wurden.
• Mit den TNF enthaltenden Proben wurde auf 12,5% SDS- Acrylamidgelen eine Elektrophorese durchgeführt, und die Proteine wurden mit Standardverfahren auf Nitrozellulose übertragen. Der Protein-Blot wurde mit Kaninchen-Antikörpern als Sonde auf menschliches TNF untersucht, und die Bereiche des Blots, die die TNF/anti-TNF-Komplexe enthielten, wurden unter Verwendung von mit Peroxidase gekoppelten anti- Kaninchen-Schweine-Antikörpern sichtbar gemacht. Die Ergebnisse der maximalen Expression von TNF in der Kulturflüssigkeit und in Zellextrakten sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen an, daß eine signifikante Erhöhung der Sekretion von TNF erhalten wurde, wenn der MFα1-Promotor durch den ACT-Promotor ersetzt wurde. Nur 10- 20% des gesamten produzierten TNF waren zellgebunden. Tabelle 3 Maximale Mengen der TNF-Expression durch Hefe-Transformanten Plasmid Zellen (mg/Liter) Medium
Beispiel 6 Sekretion von TPA
• Das Gen, das den Plasminogen-Aktivator (TPA) von menschlichem Gewebe codiert, trägt eine günstige BglII-Stelle an einer Position, die der ersten Aminosäure von TPA entspricht. Pennica, D. et al., "Cloning and Expression of Human Tissue-type Plasminogen Activator cDNA in E. coli", Nature 301 (1983), 214-21. Um eine richtige Fusion an den MFα1-Sekretions-Leader zu ermöglichen, wurde eine günstige BglII-Stelle an der MFαl-Position eingeführt, die der Lys- Arg-Verbindung entsprach. Die Struktur des MFα1/TPA- Fusionspunktes in den nachstehenden Konstruktionen ist wie nachstehend beschrieben:
• (5') AAA AGA TCT TAC (3') Lys Arg Ser Tyr
• MFα1 TPA.
• Ein BglII-Fragment, das den MFα1-Promotor und Sekretions-Leader trägt, wurde in die einzige BglII-Stelle des zuvor konstruierten Vektors pPAY4 inseriert, wie in Fig. 9 dargestellt. Auf diese Weise wurden der PhO5- Promotor und Sekretions-Leader durch den MFαl-Promotor und Sekretions-Leader ersetzt. Der erhaltene Expressionsvektor pMF-TPA wurde durch Ersetzen der PHO5- und MFα1-Promotoren durch den ACT-Promotor weiter modifiziert, wie in Fig. 9 dargestellt, um den Expressionsvektor pACT-MF-TPA zu erhalten. Der in beiden TPA-Konstruktionen enthaltene PHO5- Promotor wird in normalen (viel Phosphat enthaltenden) Produktionsmedien reprimiert. Dementsprechend sind die nachstehend beschriebenen Expressionsergebnisse auf die Aktivität des MFα1-Promotors zurückzuführen, da die Tests in normalen (viel Phosphat enthaltenden) Medien durchgeführt wurden.
• Jedes der Expressions-Plasmide pACT-MF-TPA und pMF- TPA wurde zur Transformation von Hefezellen des Stamms BJ1991, wie vorstehend beschrieben, verwendet, wobei auf Leu&spplus;-Prototrophe selektiert wurde. Die Transformanten wurden in SD-Medium selektiv gezüchtet. YPD-Medium enthaltende Schüttelflaschen wurden mit den SD-Kulturen beimpft (10% des Endvolumens) und bei 30ºC inkubiert. Während der Inkubation wurden zu geeigneten Zeitpunkten die Zellextrakte, wie vorstehend in Beispiel 4 beschrieben, präpariert.
• Die TPA-Aktivität in Zellfraktionen wurde durch eine Hofbildung auf Fibrinogen-Plasminogen-Agarplatten bestimmt, wie von Granelli-Piperno, A. und Reich, E. "A Study of Protease and Protease-Inhibitor Complexes in Biological Fluids", J. Exp. Med. 148 (1978), 223-34, beschrieben. Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß der Austausch des MFαl-Promotors gegen den ACT-Promotor vorteilhaft ist, um die Sekretion von heterologen Proteinen durch Hefe unter Verwendung von alpha-Paarungsfaktor-Fusionen zu erhalten. Tabelle 4 Maximale Mengen der TPA-Expression durch Hefe-Transformanten Plasmid Zellen (ug/Liter) Medium
• Wie in Tabelle 4 dargestellt, war der größte Teil des produzierten TPA zellgebunden; nur 5% des insgesamt produzierten TPA erschienen im Medium. Der nachstehend beschriebene Befund wies jedoch darauf hin, daß das Hefe-TPA den Sekretions-Weg eingeschlagen hatte:
• (1) das exprimierte TPA war biologisch aktiv, wodurch eine korrekte Faltung angezeigt wurde. Versuche, TPA in Hefe ohne Sekretions-Signalsequenz zu exprimieren, produzierten nicht-aktives TPA und
• (2) das zellgebundene TPA war glycosyliert. Es ist mindestens eine Sekretion in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums erforderlich, damit eine Glycosylierung stattfindet.

Claims (21)

1. DNA-Sequenz zur Verwendung bei der Expression und Sekretion eines Proteins, umfassend:

(a) einen Hefe-Promotor, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den ACT- und den CYC1-Promotoren besteht,

(b) eine heterologe Hefe-Sekretions-Signalsequenz, die funktionell mit dem Promotor verbunden ist, und

(c) eine das Protein codierende DNA-Sequenz, die mit der heterologen Hefe-Sekretions-Signalsequenz funktionell verbunden ist.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die heterologe Hefe- Sekretions-Signalsequenz die MFαl-Sekretions-Signalsequenz ist.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Serumproteinen, analgetischen Polypeptiden, β-Endorphin, Somatostatin, SMC, Insulin, menschlichem Wachstumshormon, Rinder- Wachstumshormon, luteinisierendem Hormon, ACTH, Preproteinen von Polypeptiden des Pankreas, TPA, TNF, Preproinsulin, Proinsulin, der A-Kette von Insulin und der B-Kette von Insulin besteht.

4. Multicopy-Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

5. Multicopy-Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei der Multicopy-Expressionsvektor ein Plasmid ist.

6. Multicopy-Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei das Plasmid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Plasmiden vom ARS-Typ und Plasmiden vom 2u-Typ besteht.

7. Wirt, der mit der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche l bis 3 transformiert ist.

8. Wirt, der mit dem Multicopy-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 4 bis 6 transformiert ist.

9. Wirt nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei der Wirt eine Hefe ist.

10. Wirt nach Anspruch 9, wobei der Wirt Saccharomyces cerevisiae ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins, umfassend die Züchtung des Wirts nach einem der Ansprüche 7 bis 10.

12. Multicopy-Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei das Plasmid das Plasmid p504/5 im Hefestamm YE466 (DSM 3579) ist.

13. Multicopy-Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei das Plasmid das Plasmid p418/18 im Hefestamm YE439 (DSM 3578) ist.

14. Multicopy-Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei das Plasmid das Plasmid p482/18, wie in Fig. 6 dargestellt, ist.

15. Multicopy-Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei das Plasmid p364/1, wie in Fig. 5 dargestellt, ist.

16. Multicopy-Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei das Plasmid p446/1, wie in Fig. 5 dargestellt, ist.

17. Multicopy-Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei das Plasmid pACT-TNF1-Ex, wie in Fig. 8 dargestellt, ist.

18. Multicopy-Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei das Plasmid pACT-MF-TPA, wie in Fig. 9 dargestellt, ist.

19. Wirt, der mit dem Muiticopy-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 12 bis 18 transformiert ist.

20. Transformierter Wirt nach Anspruch 19, wobei der Wirt eine Hefe ist.

21. Transformierter Wirt nach Anspruch 20, wobei der Wirt Saccharomyces cerevisiae ist.