DE3721400A1 - Verfahren zur untersuchung einer azellularen biologischen fluessigkeit auf zellulare onkogen-dna bzw. deren fragmente - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von zellularer Onkogen- DNA, bzw. deren Fragmente, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Verfahren zur Feststellung der zellularen Onkogen-DNA einschließlich Trennung von DNA, Denaturierung und Hybridisierung und dgl. sind auf dem Gebiet der molekularbiologischen Forschung bekannt. Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit, Spezifizität und extreme Sensitivität der in vitro Hybridisierung zwischen DNA und DNA sowie zwischen RNA und DNA sind aus der Literatur bekannt, die als Standardmethode für spezifische Problemlösungen Anwendung gefunden hat.

Die Hybridisierung mit DNA unter Verwendung von festem Substrat zur Immobilisierung ist seit 1965 bekannt (J. Mol. Biol. 12: 829-942; 1965). Seitdem wurden mehrere Verbesserungen dieser Methode sowie der Methoden der Trennung der DNA aus Zellen und Geweben veröffentlicht.

Die erhöhte Aktivität von zwei oder mehreren zellularen Onkogenen durch Mutation, Verstärkung (Amplifikation) oder andere Störungen der Gen- Regulation ist eine wesentliche Ursache der malignen Transformation und der Diversifikation der bösartigen Zellen.

Amplifikation der zellularen Onkogene auf z. B. das Zweifache bis Hundertfache, kommen als Ursache der malignen Transformation am Anfang in Frage oder treten während der Progression oder der Diversification der bösartigen Zellen in Fällen von 30% bis 50% der bösartigen Krankheiten auf. Nicht alle Sorten von Onkogenen haben die Neigung zu Amplifikation. Interessanterweise haben diejenige Onkogene diese Neigung, die in aktivierter Form am häufigsten in bösartigen Krankheiten vorkommen; drei aus vier in Gruppe A, zwei aus acht in Gruppe B und null aus sechs in Gruppe C, die Gruppen sind auf Seite 17 angegeben.

Durch Punkt-Mutation entstehende, neue, in normalem Zustand nicht vorhandene Onkogene sind in 15% bis 30% der Fälle von bösartigen Krankheiten mit dem Transfektionsverfahren in 3T3 NIH Zellen nachweisbar. Es ist neuerdings bekannt, daß die Mutation in wesentlich höherem Prozentsatz der bösartigen Krankheiten eine bedeutende Rolle spielt.

Die folgenden Ursachen und Umstände kann man als maßgebend betrachten, für den erhöhten bzw. qualitativ veränderten DNA-Inhalt des Blutplasmas in bösartigen Krankheiten möglicherweise verantwortlich zu sein:

• 1. Amplifizierung der Onkogene, die das Mehrfache bis zu mehrfach Hundertfache des normalen Zustandes erreichen kann.
• 2. Neue Onkogene, die durch Mutation auftreten und in normalen Zellen überhaupt nicht vorhanden sind.
• 3. Erhöhte Leckage von DNA bzw. deren Fragmente aus den malignen Zellen
  • a) aus lebenden Zellen durch defekte Membranen,
  • b) aus sterbenden oder toten bösartigen Zellen.
• 4. Gesteigerter Zell-Umsatz in bösartigen Zuständen.
• 5. Größere Sterberate der bösartigen Zellen.
• 6. Erhöhte Permeabilität der Kapillaren und Gefäße in den bösartigen Tumoren für Zellen und Makromoleküle wegen der ungeeigneten und unvollständigen Entwicklung der sonst reichlich vorhandenen Gefäße.
• 7. Akkumulation der bösartigen Zellen, Hauptsächlich sterbender Zellen, in den Kapillaren und Arteriolen der malignen Tumore, so können Zellelemente und Makromoleküle ohne größeren Abbau direkt in die Blutbahn langen.
• 8. Erhöhte Resistenz der DNA gegen degradierende Enzyme, weil sie geschützt sind wegen
  • a) Bindung zu Proteine,
  • b) Bindung zu RNA als DNA-RNA Komplexe und
  • c) Anwesenheit in ds.DNA Form.
• 9. Längerer Aufenthalt in der Blutbahn, weil die Clearance-Mechanismen, die für die Entfernung der DNA bzw. deren Fragmente aus der Kreislauf verantwortlich sind, wegen der ständigen ′′Überflutung′′ der Zirkulation mit diesen Substanzen in den bösartigen Zuständen oder wegen noch nicht bekannter Ursachen, ausgeschöpft sind.

Diese Ursachen und Umstände sind in verschiedenen Kombinationen und in verschiedenem Maße in den verschiedenen Sorten von bösartigem Krankheiten und in deren verschiedenen Phasen für den veränderten DNA-Inhalt in der Blutbahn verantwortlich.

Da die rechtzeitige Erkennung die wichtigste Voraussetzung für eine Remission bzw. für die Heilung bösartiger Krankheiten ist, ist ein Universal-Malignitätsrest notwendig, der im breiten Spektrum maligner Krankheiten schon kleine Mengen maligner Zellen aufspüren bzw. nachweisen kann.

Einen derartigen universalen Test gibt es noch nicht. Nur zwei Verfahren haben bis jetzt als Verlaufskontrolltest routinemäßig Anwendung gefunden: Der Alpha-Feto-Proteintest für Leberkrebs und Teratocarzinom und das carcionoembryonale Antigen (CEA) für Krebssorten des digestiven Systems.

In 1985 wurde ein Flotationsverfahren nach 16stündigem Ultrazentrifugieren des Serums bekannt, das eine auf Krebs charakteristische Lipoprotein- Fraktion nachweisen kann, die auch RNA mit Poly(A)⁺RNA Komponenten enthält. Dieses Verfahren wurde aber in präkanzerösen Zuständen, in benignen monoklonalen Gammopathien und in vielen anderen Zuständen noch nicht erprobt. Die Sensitivität dieses Flotationsverfahrens ist realtiv gering, 0,2 mikrogramm/ml, im Vergleich zu dem hochgradig sensitiven Hybridisierungsverfahren. Damit kann man vielleicht erklären, daß das Flotationsverfahren in einigen klinisch gesicherten Krebsfällen negativ ausgefallen ist. Es ist wahrscheinlich, daß die RNA in der Lipoprotein Fraktion nur ein Teil der Gesamt-Plasma-RNA ist, die aus den bösartigen Zellen in die Blutbahn gelangt sind (Gesamt-Plasma-RNA bösartigen Ursprungs). Ferner ist die lange Ultrazentrifugation ein großer Nachteil des Flotationsverfahrens.

Jüngstens wurden auch zwei Immuntests als diagnostische Krebs-Test vorgeschlagen. Ein Verfahren für die Isolierung des sogenannten ′′Cancer Associated Protein′′ (CAP) wurde veröffentlicht mit der Absicht der Verwendung als ein Krebstest (Immuntest).

In 1985 wurde als Möglichkeit für Krebstests der Nachweis im Urin von Onkogen-Polypeptiden durch monoklonalen Antikörper mittels Immunoblot gedacht. Mit Polypeptiden von drei Onkogenen durchgeführte Untersuchungen haben gezeigt, daß der Unterschied zwischen normalen und phathologischen Werten nicht sehr goß ist und die Schwangerschaft höhere Werte produziert als eine bösartige Krankheit. Für die vollständige Beurteilung muß jedes Onkogen-Polypeptid für verschiedene Größen untersucht werden, was ein sehr großer Zeit- und Materialaufwand ist. Ferner zeigten die normalen Werte eine große Streuung, und so kann ein bedeutendes Überlappen der normalen und der pathologischen Werte vorkommen. Zum Beispiel Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern gegen nur ein Onkogen- Polypeptid zeigten positive Werte in 25-29% der bösartigen und in 6-9% der nicht-bösartigen Fälle.

Ein sehr wesentlicher Nachteil dieses wie jeder anderen Methode, die auf dem immunologischen Nachweis der Proteine oder Polypeptiden von Krebszellursprung basieren, ist, daß die Anwesenheit von spezifischen Antikörpern, die durch den Wirt gebildet, oder für Therapiezwecke eingeführt werden, unrealistische Ergebnisse verursachen und überhaupt ein bedeutender Störfaktor sein können.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis der DNA, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen in einer azellularen biologischen Flüssigkeit, wie Blutplasma anzugeben. Da es hierfür notwendig ist, erst die DNA aus dem Blutplasma zu trennen, ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein zuverlässiges Verfahren zur Trennung der DNA aus dem Blutplasma anzugeben.

Durch die Behandlung des Blutplasmas zur Trennung des DNA-Inhaltes, durch Immobilisierung der DNA in denaturierter Form an einem festen Substrat und durch Kontakt des festen Substrats mit der markierten denaturierten Onkogen-DNA um diese miteinander, wenn die Plasma-DNA und Onkogen-DNA-Probe komplementäre Sequenz(en) haben, zu binden (zu hybridisieren), wird ein zuverlässiges Nachweisverfahren erreicht. Diese Tatsache wird durch den Nachweis der Markierungssubstanz, oder im Falle der radioisotopischen Markierung durch Autoradiographie bestimmt.

Die in die Blutbahn gelangte DNA, deren Fragmente aus dem Blutplasma extrahiert werden können, kann dessen Onkogen-Inhalt durch in vitro molekulare Hybridisierung nachgewiesen werden. Der Nachweis von Onkogenen bzw. deren Fragmente im Blutplasma in vitro ist um so mehr geeignet für diesen Zweck, weil sie nicht nur äußerst spezifisch sondern auch hochgradig empfindlich ist und so wenig wie 0,5 bis 1 pg DNA/ml spezifisch nachgewiesen werden kann.

Erfindungsgemäß werden die Gesamt-Plasma DNA wie die in die Blutbahn gelangte DNA, bzw. deren Fragmente aus dem Blutplasma von Patienten mit bösartigen Krankheiten isoliert und auf die Anwesenheit der DNA zellularer Onkogene mit in vitro molekularer Hybridisierung untersucht.

Man konnte feststellen, daß Plasma-DNA in nicht-malignen und malignen Zuständen isoliert werden kann. Wenn die isolierte DNA des Blutplasmas auf Onkogen-Inhalt durch molekulare Hybridisierung in vitro mit markierten Onkogen-DNA Proben untersucht wurde, konnten wesentliche Unterschiede (qualitative und quantitative) zwischen bösartigen und nichtbösartigen Krankheiten festgestellt werden.

Die qualitativen und quantitativen Unterschiede ermöglichen, daß erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung der Onkogen DNA im Blutplasma als Nachweis auf aktive maligne Prozesse angewendet werden kann. Die praktische Anwendbarkeit des Verfahrens zur Feststellung der DNA, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen aus menschlichen Blutplasma ist ein Universal-Malignitätstest für den Nachweis bösartiger Prozesse.

Der wesentlichste Vorteil dieser Erfindung ist es, daß sie ein Verfahren angibt, das als Universial-Malignitätstest dienen kann: Dieser Test beruht auf den Grundprinzipien der bösartigen Transformation durch die Aktivierung von zellularen Onkogenen und der Besonderheiten der bösartigen Zellen und Tumore.

Der zweite bedeutende Vorteil dieses Verfahrens ist die große Empfindlichkeit (1 pg/ml).

Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Erfindung ist im Gegenteil zu Immuntests, daß die spezifische Antikörper, die sich durch den Wirt gebildet haben, oder für Therapiezwecke in die Blutbahn eingeführt wurden, die Ergebnisse nicht beeinflussen können.

Gegenüber Nachweisverfahren, die auf immunologischem Nachweis der Proteine oder Polypeptiden von Krebszellursprung basieren, hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß eine Störung des Ergebnisses durch spezifische Antikörper entfällt.

Dieses Verfahren hat Vorteile auch gegenüber dem Nachweis der Onkogen Transkripte aus dem Plasma als Malignitätstest. Die Gefahr des Abbaus der DNA ist wesentlich kleiner als bei den RNA-Transkripten, wo das ubiquitäre RNase-Enzym eine Reihe von Vorsichtsmaßnahmen während des ganzen Prozesses verlangt, die bei dem Onkogen DNA Nachweise nicht notwendig sind.

Der größte Vorteil gegenüber dem Malignitätstest durch Nachweis der Onkogen-Transkripte bzw. deren Fragmente ist: Der Nachweis der Onkogen- DNA ist fähig zu beweisen, daß die Aktivierung des Onkogens durch Punkt-Mutation verursacht wurde und zeigt ferner, welcher Punkt des Onkogens durch Mutation verändert wurde. Aus diesem Grund kann man wissen, wie das Onkogen-Produkt (OKP) verändert ist. Die Mutation betrifft besondes das ras^Ki Onkogen, und zwar in der Position Codon 12. Diese Veränderung führt zu einem Onkogenprodukt, in dem die Aminosäure gly in der Position 12 (p12) mit val (besonders in Kolon und Harnblase-Krebs), arg (besonders in Lungenkrebs) oder mit cys (besonders in Lungenkrebs) verwechselt wird. Oligonukleotid-Proben für diese Onkogene zum Zweck dieser Hybridisierung sind im Handel erhältlich (Oncogene Science Inc., Mineola, NY 11501).

Da dieses Onkogen-Produkt nur in den Tumorzellen vorhanden ist und in den normalen Zellen überhaupt nicht anwesend ist, bietet dieses durch Mutation veränderte Onkogen-Produkt diagnostisch und therapeutisch einen einmaligen ausschließlichen spezifischen Angriffspunkt an den bösartigen Zellen.

So kann man, zum Beispiel, durch Immunoimaging, intravenöse Verwendung von monoklonalen Anti-Onkogen-Produkt Antikörpern, verbunden mit einem Radioisotop, bösartige Zellen im Körper schon in einem Stadium der bösartigen Krankheit, wenn die üblichen bildgebenden Maßnahmen noch negative Resultaten geben, visualisieren.

Mit monoklonalen anti-OKP spezifischen Antikörpern, allein oder in Verbindung mit radioaktiven oder chemotherapeutisch wirkenden Substanzen, kann man ausschließlich nur die bösartigen Zellen beeinflussen bzw. vernichten, ohne die normalen Zellen zu beschädigen.

Der Nachweis zellularer Onkogen-DNA bzw. deren Fragmente aus dem Blutplasma bietet weitere, für die Therapie maßgebende Informationen:

• 1. a. Der Grundcharakter maligner Prozesse und ihr Verhalten im Wirt ist wesentlich dadurch bestimmt, welche Onkogene aktiviert wurden (Genetic Scripture, Zell-Onkogenprofil). Dies konnte bisher nur histologisch in Tumorgeweben durch in vitro Nukleinsäure-Hybridisierung bestimmt werden. Der erfindungsgemäße Malignitätsrest kann diese Auskunft zumindest teilweise aus dem Blutplasma liefern (Plasma-Onkogen-Profil), lange bevor die relativ kleine Tumorzellmasse visualisierbar und für histologische Untersuchungen erreichbar ist.
• b. Während der malignen Prozesse in vitro sowie während des Bestehens der bösartigen Krankheit in Patienten können neue Onkogene zusätzlich aktiviert werden, was zu einer bedeutenden Progression der Bösartigkeit führen kann. Diese Gefahr kann mit dem Malignitätstest während der Verlaufskontrolle frühzeitig dadurch erkannt werden, daß eine neue Onkogen-DNA aus dem Blutplasma identifiziert wird, welche bisher im Plasma nicht vorhanden war.
• c. Der Nachweis der Onkogen-DNA ist besonders geeignet, um die Amplifikation der Onkogene zu untersuchen und zu beobachten. Während des Krankheitsablaufs kann eine Verstärkung (Amplifikation) der aktivierten Onkogene auftreten, wodurch eine wesentlich erhöhte Aggressivität und Progression der bösartigen Zellen verursacht werden kann. Das Auftreten einer solchen Verstärkung kann mit dem quantitativ ausgeführten Maglignitätstest schon frühzeitig während der Verlaufskontrolle beobachtet werden. Das bedeutet, daß ein Subklon der Tumorzellen, der das amplifizierte Onkogen hat, frühzeitig, bevor er sich ausbreiten konnte und die Prognose sehr verschlechtern könnte, erkannt werden kann. Dieser Subklon kann im Frühstadium durch spezifische Immuntherapie oder Immonochemotherapie beeinflußt und gegebenenfalls vernichtet werden. Amplifikation der zellularen Onkogene (auf das Zwei- bis Hundertfache) tritt entweder im Primärtumor oder während der Progression und Diversifikation der bösartigen Zellen und in ungefähr 30% bis 50% der Fälle der bösartigen Krankheiten auf.
• 2. Genprodukte der aktivierten zellularen Onkogene spielen eine wichtige, sogar vitale Funktion in den transformierten bösartigen Zellen, viele von ihnen fungieren als Protein-Kinase-Enzyme in der Zellmembran.

Die Veränderung bzw. Beeinträchtigung dieser Funktion durch Angriff auf die bösartigen Zellen immunspezifisch, gezielt auf ihre Onkogenprodukte mit monoklonalen Antikörpern allein oder gebunden mit radioaktiv oder chemotherapeutisch wirkenden Substanzen kann zur heilenden Wirkung führen, bevor die Tumorzellmasse sich verbreiten konnte. Ein Plasma-Onkogenprofil bei Früherkennung zeigt die spezifischen Therapiemöglichkeiten. Die Verlaufskontrolle mit neuen Onkogen-Proben ermöglicht es, neu aufgetretene Onkogen-DNA zu erkennen. Ein quantitativ durchgeführter Malignitätstest bietet während des Krankheitsverlaufs eine Früherfassung einer eventuellen Amplifizierung eines zellularen Onkogens und gibt spezifische Hinweise, wie man diesen neuen Subklon von bösartigen Zellen unterdrücken bzw. vernichten kann, bevor eine größere Progression oder Agressivität verursacht ist.

Im folgenden wird die Erfindung genauer erläutert.

Aus dem frischgewonnenen Blut wird das Plasma schnell separiert. Dann wird das Plasma mit einem Detergens, wie Natriumduodezylsulphat (SDS) und einem proteolytischen Enzym, wie Proteinase K (Boehringer Mannheim) mit einem wäßrigen Medium vermischt und wird dann bei 37 Grad C für 60 min in einer Pufferlösung (pH 7,5) inkubiert. Die viskose Mischung wird durch Vortexing periodisch umgerührt. Nach der Inkubation wird durch organisches Lösungsmittel, wie Phenol, dreimal extrahiert. Das Ergebnis ist eine organische Phase, die den größten Anteil der Proteine, und eine wäßrige Phase, die im wesentlichen die gesamte DNA enthält. Phenol wird nach Zentrifugieren entfernt. Die Interphase wird mit zusätzlichem Phenol und Puffer reextrahiert. Nach der dritten Extraktion wird die DNA in Anwesenheit von 0,25 M Na-azetat bei pH 5,2 mit eiskaltem Äthanol bei -20 Grad C inkubiert, prezipitiert und zentrifugiert. Das DNA-Sediment (das nicht immer sichtbar ist) wird in dem gewünschten Puffer gelöst.

Die DNA wird einer DNase-Enzym-freien RNase-Behandlung bei 37 Grad C für 1 h unterzogen. Danach wird die DNA zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Äthanol wie oben prezipitiert und in dem gewünschten Lösungsmittel gelöst.

Die im Wasser gelöste DNA wird denaturiert durch Erhitzen auf 100 Grad für 10 min und durch Mischen mit gleichem Volumen 1 M NaOH, und bei Zimmertemperatur 20 min inkubiert. Dann wird das Alkali neutralisiert auf einen neutralen Wert (pH 8,0) durch Zumischung von 1 M HCl und die Salzkonzentration wird durch Zugabe von 1 M NaCl, 0,3 M Nazitrat, 0,5 M Tris. CL (pH 8,0) erhöht. Dann wird in Eis gekühlt. Die Erhöhung der Salzkonzentration dient der Erhöhung der Bindefähigkeit der DNA an das feste Substrat (siehe unten).

Die resultierende Lösung von denaturierter DNA wird in gewünschter Menge auf einem festen Substrat, wie reine Nitrozellulose, aufgetragen, um eine Immobilisierung der denaturierten DNA an dem festen Substrat zu bewirken. Das resultierende feste Substrat wird einer Wäsche bei Zimmertemperatur mit 50 ml vol 6 × SSC unterzogen und getrocknet, dann in einem Vakuumherd bei 80 Grad C für 2 h gebacken. Das gebackene feste Substrat wird danach behandelt, um ein weiteres Binden von Nukleinsäure an das feste Substrat zu verhindern.

Die (radioisotopisch oder nicht-radioisotopisch) markierte Onkogen DNA-Probe wird denaturiert und in einer Lösung mit dem festen Substrat, auf dem die Plasma-DNA schon immobilisiert ist, in Kontakt gebracht, um damit unter ausgewählten thermischen und chemischen Bedingungen zu hybridisieren. So wird bewirkt, daß die markierte Onkogen DNA-Probe durch Wasserstoffbindungen mit der komplementären Sequenz(en) der auf dem festen Substrat imobilisierenden Plasma-DNA, wenn sie diese komplementären Sequenzen haben, verbunden (hybridisiert) ist.

Nach einem vorbestimmten Zeitraum wird das feste Substrat einer Wäsche unterzogen, um die nicht spezifisch gebundene, markierte Onkogen DNA- Probe zu entfernen.

Das feste Substrat wird anschließend einer Analyse unterzogen, um das Stattfinden der Hybridisierung zwischen der Plasma-DNA und der markierten Onkogen-DNA Probe nachzuweisen. Das wird im Falle der radioisotopischen Markierung durch Autoradiographie, im Falle der nichtradioisotopischen Markierung durch Nachweis der Markierungssubstanz mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion bestimmt.

Eine Menge von gereinigter molekularisch klonierter DNA, die die Sequenz als Kode für Onkogen enthält, wird entweder radioisotopisch oder nicht-radioisotopisch markiert. Die radioisotopische Markierung wird durch Nick-Translation nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113: 237-251, 1977) durchgeführt, um hohe spezifische Aktivität zu erreichen. Für diese Verfahrensweise verwendbare Radioisotope sind beispielsweise besonders 32^P aber auch I¹²⁵, I¹³¹ und H³.

Die nicht-radioisotopische Markierung der Onkogen-DNA Proben wird beispielsweise mit Biotin, auch durch Nick-Translation (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633-6637, 1981) und jüngstens mit Photobiotin (Nucleic Acid Research 13: 745-761, 1985) durchgeführt. Die Markierung mit Photobiotin ist besonders unkompliziert, schnell und preisgünstig. Ein Photobiotin-Markierungs- und Nachweis-Kit wird kommerziell angeboten (BRESA, Adelaide, South Australia). Die Markierung mit Biotin hat einen sehr wichtigen Vorteil: Abgesehen davon, daß sie nicht radioaktiv ist, kann man Ergebnisse innerhalb einiger Stunden durch Farbreaktion sehen. Man muß nicht Tage warten, wie bei der Autoradiographie.

Onkogen-DNA Proben, Onkogen-Oligonucleotid-Proben, markiert oder unmarkiert, sind kommerziell erhältlich (ONCOR, Inc. Gaithersburgh, Ma. USA 20877; ONCOGENE SCIENCE Inc. Mineola, NY. 11501 USA).

Das folgende Beispiel dient zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken:

Beispiel

Es wird 20 ml Blut mit 20 IE/ml Heparin entnommen, und das Blutplasma wird so schnell wie möglich separiert. Es wird in zwei Einweg-Plastik- Zentrifugen-Röhrchen je 5 ml Blutplasma pipettiert. Eines wird tiefgekühlt für eventuelle Wiederholung oder für ergänzende Untersuchungen als Reserve aufbewahrt. Das andere wird gleich in Bearbeitung genommen.

Es wird ein Gemisch aus 0,4 M Tris. Cl (pH 7,5); 50 mM Äthylendiaminotetraessigsäure (EDTA); 0,6 M NaCl; 2% (Gew.-/Vol) Natriumduodecylsulfat (SDS) und Proteinase K (Endkonzentration 200 mikrogramm/ml, Boehringer) hinzugefügt und bei 37 Grad C für 60 Min inkubiert mit häufigem Vortexing.

Anschließend wird gleiches Volumen von Phenol und Chloroform-Isoamylalkohol (24 : 1) eingemischt und durch Schütteln extrahiert, sodann durch Zentrifugieren die organische und die unorganische (wäßrige) Phase getrennt. Die unorganische Phase wird separiert und aufbewahrt. Die Interphase wird mit Phenol-Chloroform wie oben extrahiert. Die wäßrigen Phasen werden gemeinsam wieder mit Phenol und Chloroform noch zweimal extrahiert.

Nach der dritten Extraktion wird zu der wäßrigen Phase Natriumazetat von 2,5 M (pH 5,2) zugemischt, um die Endkonzentration von 0,25 M zu erreichen. Zwei Volumina von eiskaltem Äthanol werden zugefügt, gut vermischt und bei -20 Grad C inkubiert und danach zentrifugiert.

Das DNA-Sediment (nicht immer sichtbar!) wird in TE (pH 8,0) (10 mM Tris. Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0) gelöst und mit DNase-freier RNase (Endkonzentration 10 mikrogramm/ml) bei Zimmertemperatur für 60 min inkubiert, danach wird mit Phenol-Chloroform zweimal extrahiert und mit Äthanol wie oben präzipitiert.

Die Extrahierung der DNA ist wesentlich erleichtert, und es wird eine serienweise Untersuchung ermöglicht durch die Anwendung des Instruments "Nucleic Acid Extractor" (Analytic System, Foster City, Ca, 94404, USA). Das oben geschriebene Verfahren ist leicht adaptierbar für den "Nucleic Acid Extractor". Hiermit kann eine Person in drei Stunden die DNA aus acht Blutplasmen simultan isolieren.

Die DNA gelöst im Wasser in der gewünschten Konzentration wird auf 100 Grad C für 10 min erhitzt, dann schnell in Eis gekühlt, mit gleichem Volumen von 1 M NaOH gemischt und bei Zimmertemperatur für 20 min inkubiert. Damit wurde die Denaturierung der DNA erreicht.

Die denaturierte DNA wird mit einer Lösung von 1 M NaCl, 0,3 M Nazitrat, 0,5 M Tris. Cl (pH 8,0) und 1 M HCl gemischt, dann in Eis gekühlt.

Ein entsprechendes Volumen von der resultierenden Lösung (10 mikrogramm DNA) wird auf einem festen Substrat wie reines Nitrozellulose aufgetragen, wobei das entsprechende Volumen von der denaturierter DNA Lösung in eine Vertiefung einer "Mikrofilter"-Platte mit 96 Vertiefungen eingebracht (Minifold I Filtration und Inkubations-Platte, Schleicher & Schüll, Keene, New Hampshire, 03431, USA) (Bio-Rad, Richmond, Ca, 94 804, USA) und unter gelindem Vakkum unter Bildung eines Flecks von 3,0 mm Durchmesser, filtriert wird. Der resultierende Filter wird von einer Lösung von 50 ml von 6 × SSC bei Zimmertemperatur gewaschen, getrocknet und bei 80 Grad C für 2 h im Vakuumherd gebacken.

Nach dem Backen wird der resultierende Filter einer Behandlung, der sogenannten Prehybridisierung in Prehybridisierungslösung unterzogen. Prehybridisierungslösung: Formamid 50% (Vol/Vol); 5 × Denhardt's Lösung; 5 × SSPE; 0,1% SDS; 100 mikrogramm/ml denaturierte DNA aus Heringssperma und 1 mikrogramm/ml Poly A. (Denhardt's Lösung: Ficoll 5 g; Polyvinylpirrololidon 5 g; Rinderserumalbumin (Pentax Fraktion V. 5 g und H₂O zu 500 ml). Der Filter wird in dieser Prehybridisierungslösung bei 42 Grad C für 6-8 h inkubiert. (20 × SSPE: 174 g NaCl; 27,6 g NaH₂PO₄; 7,4 g EDTA ad 1 l H₂O, pH 7,4).

Die markierte DNA-Onkogen Probe wird durch Erwärmung auf 100 Grad C für 5 min denaturiert und schnell in Eis abgekühlt. In denaturierter Form wird zu die Prehybridisierungslösung, in der der Filter schon inkubiert ist, zugemischt und weiter inkubiert bei 42 Grad C für 12-20 h.

Nach der Inkubierung wird die Lösung, in der die Inkubation durchgeführt wurde, weggegossen und der Filter 3-4mal für 5-10 min (je Wäsche) einer Wäsche bei Zimmertemperatur im großen Volumen von 2 × SSC und 0,1% SDS unterzogen. Der Filter wird zwei weiteren Wäschen für 1-1,5 h in einer Lösung von 1 × SSC und 0,1% SDS bei 68 Grad C unterworfen. Wenn der Hintergrund noch immer hoch ist, sind weitere Wäschen bei höheren Stringenzien (Schärfen) notwendig: Für 60 min in einer Lösung von 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 60 Grad C.

Das folgende, gut bekannte, käufliche 18 molekularisch klonierte menschliche Onkogen wurde als Onkogen-DNA Probe gebraucht, die hier ungefähr nach Häufigkeit ihres Vorkommens mit erhöhter Aktivität in menschlichen Bösartigkeiten gruppiert sind:

Oligonucleotid-Proben: ras^Ki (codon 12), siehe auch S. 9. Die Proben wurden radioisotopisch mit P³² markiert (spezifische Aktivität: 10⁸ cpm/ mikrogramm) durch Nick-Translation nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 133: 237-251, 1977) oder unmarkiert erhalten. Die unmarkierten DNA Proben wurden entweder mit Biotin (nach Leary, Proc. Nat. Acad. Sci. 80 : 4045-4049, 1983) oder mit Photobiotin markiert. Reagenzien für die nicht-radioisotopische Markierung durch Nick-translation nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 133: 237-251, 1977) mit Biotin und für die Visualisierung der Resulate der Hybridisierung mit Enymaffinitätsverfahren durch Farbreaktion werden in Handel angeboten (Amersham, Little Chalfont, England). Markierungen mit Photobiotin erfolgt nach Vorschrift des Herstellers (BRESA, Adelaide, South Australia): Nach kurzer Bestrahlung mit sichtbarem Licht geht Photobiotin eine stabile Bindung mit Nukleinsäuren ein. Die so mit Biotin markierte DNA kann mit 2-Butanol Extraktion mit Äthanol- Precipitation isoliert werden und kann als stabile markierte Probe für ein halbes Jahr in 0,1 mM EDTA bei -15 Grad C stabil aufbewahrt werden.

Das Nitrocellulose-Papier im Falle radioisotopischer Markierung wird zwischen klaren Azetatfolien eingesetzt und in die Nähe eines für die Röntgenstrahlen empfindlichen Filmes gebracht. Ein Verstärkerschirm wird an der entgegengesetzten Seite angebracht und lichtdicht verpackt. Nach einer bestimmten Zeit wird der Film entwickelt. Die Anwesenheit der DNA bzw. deren Fragmente, die mit der Onkogen-DNA Probe hybridisieren, wird durch die Anwesenheit eines Flecks auf dem Film bestimmt.

Im Falle nicht-radioisotopisch markierter Onkogen-DNA Proben, wie im Falle der mit Photobiotin markierten Onkogen-DNA Proben, werden die DNA Proben in 0,1 M EDTA aufgetragen, sonst wird die Prehybridisierung so ausgeführt wie mit radioisotopisch markierten DNA Proben, aber die Dauer der Prehybridisierung ist kürzer: 4-8 h. Die Hybridisierung wird durchgeführt wie mit radioaktiven Proben, aber bei höherer Temperatur (55 Grad C) für 20 h in einer Lösung: 4 Vol Prehybridisierungspuffer; 1 Vol von etwa 0,5 g/ml Natrium Dextransulfat und 20 ng/ml Biotin-markierte DNA Probe (Onkogen-DNA Probe).

Die getrockneten Nitrocellulose-Papiere werden bei 42 Grad C für 30 min in STMT Puffer (1 M NaCl; 0,1 M Tris. Cl, pH 7,5; 2 mM MgCl₂ 0,05%v/v Triton X-100) mit 30 mg von Bovin Serum Albumin inkubiert. Nachdem das Nitrocellulose-Papier getrocknet ist, wird es bei Zimmertemperatur für 10 min in STMT-Puffer mit 1 mikrogramm/ml Sigma Avidin-alkalische Phosphatase- Komplex inkubiert, dann wird mit häufigem Schütteln in STMT Puffer (3 × 10 min) und STM Puffer (1 m NaCl, Tris. Cl, pH 9,5, 5 mM MgCl₂) für 2 × 5 min inkubiert.

Für Farbreaktionen wird das Nitrocellulose Papier bei Zimmertemperatur im Dunkeln mit Substrat-Lösung (STM Puffer aber nur mit 0,1 M NaCl) mit 0,33 mg/ml Nitro-blau-tetrazolium, 0,17 mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphat und 0,33% v/v N,N-dimethylformamid vermischt. Die Reaktion wird durch Waschen des Nitrocellulose Papiers mit 10 mM Tris. Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA beendet.

Die erfindungsgemäße Arbeitsweise zum Nachweis der DNA-Transkripten, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen im menschlichen Blutplasma umfaßt mehrere günstige Reaktionsweisen und Schritte, um eine hohe Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit zu ergeben.

Die Verwendung von Proteinase K erleichtert die Entfernung der Proteine, die Guanidinium-Isothiocyanat-Behandlung die Denaturierung der Proteine sowie die Spaltung der DNA-Protein Komplexe. Der Rest der Proteine wird durch organische Extraktion entfernt. Der Abbau und das Entfernen der RNA wird durch RNase-Behandlung erreicht, weil die RNA sonst bei der Hybridisierung interferieren könnte. Das Backen sorgt für die Zuverlässigkeit der festen Bindung der DNA an das Nitrocellulose- Filter. Die Behandlung des Nitrocellulose-Filters nach dem Backen verhindert unspezifische Bindungen und sorgt auch für Zuverlässigkeit. Die Wäsche des Nitrocellulose-Filters nach Hybridisierung entfernt überflüssige, oder unspezifisch gebundene, markierte Onkogen-DNA Proben und trägt auch zur Zuverlässigkeit bei.

Es sind zahlreiche Modifizierungen möglich.

Eine quantitative Auswertung des positiven Tests ist möglich.

Eine semiquantitative Auswertung kann auch durchgeführt werden. In diesem Fall wird die Intensität des schwarzen Flecks am Röntgenfilm durch Densitometrie gemessen und können quantitative Vergleiche gemacht werden (Reflectance Densitometer, Bio-Rad, Richmond CA 94804, USA).

Quantitativer Test

Wenn ein Blutplasma-DNA mit einer Onkogen Probe einen positiven Test gezeigt hat, kann die relative Menge durch das Dilutionsverfahren bestimmt werden. In diesem Fall wird aus der Blutplasma-DNA eine 1 : 2-Serialverdünnung gemacht und wird jede Verdünnung durch Hybridisierung getestet. Die höchste Verdünnung, aus der noch ein positives Signal ausgeht, ist der Titer. So können bei der Verlaufskontrolle eines Patienten, während der Beobachtungszeit, quantitative Vergleiche durchgeführt werden. Auf diese Weise kann man z. B. die Amplifizierung eines der aktivierten Onkogene beobachten: Wenn während der Verlaufskontrolle der Titer eines Onkogens unproportionell erhöht wird im Vergleich zu anderen Onkogenen, bedeutet das die Amplifizierung dieses Onkogens.

Der Test ist positiv:

• 1. Wenn eine der durch Mutation veränderten Onkogen-Proben (Oligonucleotid- Probe) mit der Plasma-DNA ein positives Signal gibt.
• 2. Wenn, zwei oder mehrere zellulare Onkogene, die nicht durch Mutation aktiviert sind, im Blutplasma nachweisbar sind.
• 3. Wenn, die Anwesenheit eines der Onkogene, das nicht durch Mutation aktiviert ist, in höherem Titer nachweisbar ist.

Die Möglichkeiten 2 oder 3 können aber gelegentlich auch in nichtbösartigen Krankheiten vorkommen, besonders in Zuständen mit Fieber und großem Zellabbau. In diesen Fällen wird der Zeitablauf entscheidend sein: In bösartigen Krankheiten bleibt die Positivität, oder steigt sie sogar, während sie in den nicht-bösartigen Fällen abklingt.

Im allgemeinen bekommt man einen positiven Test im Fall einer bösartigen Krankheit meistens, wenn die Plasma-DNA erst nur mit der Onkogen- Gruppe A (siehe oben) hybridisierte, weil diese Onkogene in allen bzw. beinahe in allen Sorten von Bösartigkeiten aktiviert sind. Seltener braucht man die Hybridisierung auf die Gruppe B auszuweiten.

Wenn man die Krebsart kennt (in der Verlaufskontrolle) oder Verdacht hat auf eine Krebsart, kann man solche Onkogene als Proben verwenden, die in dieser Krebsart besonders häufig aktiviert sind. Es werden noch immer neue Onkogene entdeckt. Diese kann man zukünftig gegebenenfalls auch als Probe benutzen.

Wenn man aber wissen möchte, welche aktivierten Onkogene in der Blutbahn anwesend sind (Plasma-Onkogen-Profil), muß man die Blutplasma- DNA mit allen Onkogenen von Gruppe A und B und seltener von Gruppe C hybridisieren. Dasselbe muß man tun, wenn man das Erscheinen von neuen Onkogenen in der Blutbahn während der Krankheitsablauf erfassen möchte, was aufgrund der prognostischen und therapeutischen Bedeutung sehr wichtig ist.

Claims (16)

1.Verfahren zur Untersuchung einer azellularen biologischen Flüssigkeit auf die Anwesenheit von zellularer Onkogen-DNA bzw. deren Fragmente, bei dem man

• a) aus der azellularen biologischen Flüssigkeit die DNA trennt und die DNA auf einem festen Träger in denaturierter Form immobilisiert,
• b) den festen Träger mit markierten Onkogen-DNA-Proben in Kontakt bringt, um diese mit der Plasma-DNA zu hybridisieren, wenn komplementäre Sequenz vorliegt, und
• c) das Produkt auf die Anwesenheit markierter DNA bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die azellulare biologische Flüssigkeit menschliches Blutplasma ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe radioisotopisch markierte Onkogen-DNA ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe nicht radioisotopisch markierte, vorzugsweise mit Biotin markierte Onkogen-DNA ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Blutplasma vor der Trennung der DNA und der Immobilisierung der DNA auf dem festen Träger mit einem organischen Lösungsmittel behandelt wird, um Eiweißmaterial in einer organischen Phase zu entfernen und um die DNA in der wäßrigen Phase zu erhalten.

6. Verfahren nach Anspruch 3 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung auf Anwesenheit markierter DNA mittels autoradiographischer Technik durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung auf Anwesenheit markierter DNA mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als festes Substrat reine Nitrocellulose verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß für die Immobilisierung ein Vakuum eingesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) das Plasma mit einem Detergens und proteolytischen Enzym in Kontakt bringt;
• b) das Produkt der Stufe a) mit einer proteindenaturierenden Lösung, wie Guanidinium-isothiocyanat vermischt und behandelt;
• c) das Produkt der Stufe b) mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert unter Bildung einer im wesentlichen proteinfreien wäßrigen Phase, die die DNA enthält;
• d) das Produkt der Stufe c) mit einem Detergens und einem proteolytischen Enzym in Kontakt bringt, inkubiert, und dann die Extraktion der Stufe c) wiederholt;
• e) das Produkt der Stufe d) mit (2 vol) Äthanol präzipitiert, wäscht und in sterilem Wasser löst;
• f) das Produkt der Stufe e) einer RNase Enzym Behandlung unterzieht und die vorhandene DNA abzubauen und zu entfernen und dann die Extraktion der Stufe d) wiederholt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) das Produkt der Stufe f) behandelt und dann denaturiert;
• b) das Produkt der Stufe a) auf ein festes Substrat aufträgt und durch Backen im Vakuum immobilisiert;
• c) das feste Substrat der Stufe b) mit einer Lösung von markierter Onkogen-DNA Probe in Kontakt bringt, um sie mit der auf dem festen Substrat immobilisierenden DNA zu hybridisieren;
• d) das Produkt der Stufe c) im Fall radioisotopisch markierter Onkogen- DNA Probe, durch Autoradiograhpie bestimmt;
• e) das Produkt der Stufe c) im Fall nicht-isotopisch markierter Onkogen-DNA Probe durch Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion bestimmt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das feste Substrat der Stufe b) behandelt, um eine weitere Bindung von Nukleinsäure daran zu hindern.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das feste Substrat der Stufe c) wäscht, um nicht spezifisch gebundene markierte Onkogen-DNA zu entfernen.

14. Verfahren nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die verbliebene, mit der Plasma-DNA verbundene Radioaktivität durch Autoradiographie bestimmt.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die verbliebene nicht-radioaktive Markierungssubstanz des festen Substrats, die durch die Hybridisierung zwischen Plasma-DNA und der markierten Onkogen-DNA gebunden ist, mittels Enzymaffinitätsrest durch Farbreaktion bestimmt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als Onkogen-DNA-Probe eine individuelle Onkogen-DNA oder eine Mischung individueller Onkogen-DNAs nimmt.