DE3750906T2

DE3750906T2 - Chemisch modifizierte Proteine und deren Herstellung.

Info

Publication number: DE3750906T2
Application number: DE3750906T
Authority: DE
Inventors: Masahiko Fujino; Hayao Ueno
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1986-03-10
Filing date: 1987-03-06
Publication date: 1995-06-29
Anticipated expiration: 2007-03-07
Also published as: EP0236987A3; JP2514950B2; EP0236987B1; ATE116338T1; DE3750906D1; JPS6310800A; US5109120A; CA1336967C; EP0236987A2; ES2065880T3; GR3015558T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein biologisch aktives Protein mit verlängerter Blutzirkulationsdauer oder reduzierter Immunogenität und Verfahren zur Herstellung davon.
Von biologisch aktiven Proteinen wird erwartet, dass sie als effektive Medikamente verwendet werden können. Der Fortschritt in der rekombinanten Gentechnologie hat kürzlich die Herstellung von solchen Proteinen in grossem Massstab erlaubt. In einigen Fällen allerdings bleibt die biologische Aktivität des dem lebenden Körper verabreichten Proteins nur für eine kurze Zeit erhalten, bedingt durch die extrem schnelle Eleminierung während der Zirkulation. Zusätzlich kann die Verabreichung von biologisch aktiven Proteinen, die aus anderen Organismen als dem Menschen erhalten werden, wie zum Beispiel Mikroorganismen oder Tieren, zu kritischen Symptomen, bedingt durch eine Immunantwort, führen. Deshalb ist eine technologische Entwicklung gewünscht, die die Clearance-Rate des Proteins verzögert und weiterhin dessen Immunogenität (Antigenität) reduziert, wobei die Aktivität erhalten bleibt.
Für die Zwecke einer reduzierten Clearance und Immunogenität gibt es eine Methode zur Modifizierung biologisch aktiver Proteine mit Polyethylenglykol.
Polyethylenglykol selbst ist kaum antigen und es ist bekannt, dass sich die Immunogenität des Proteins reduziert, wenn es mit einem immunogenen Protein kombiniert wird. Von mit Polyethylenglykol modifizierten Proteinen wird berichtet, dass sie erhöhte Blutzirkulationsdauer haben und daher die biologische Aktivität für eine längere Zeit behalten. Verfügbare Mittel zum Kuppeln von Polyethylenglykol an ein Protein umfassen ein Verfahren unter Verwendung von Polyethylenglykol-methylether und Cyanurchlorid (oder Fluorid) und ein Verfahren, das Carboxyl-Derivate von Polyethylenglykol verwendet (US-P- 4,179,337). Da das erstere einen relativ hohen, alkalischen pH bei der Reaktion benötigt, kann es nicht for biologisch aktive Proteine angewendet werden, die unter alkalischen Bedingungen inaktiviert werden. Darüber hinaus ist die Toxizität von Cyanur selbst verdächtig. Im letzteren können Kupplungsreagenzen wie Carbodiimid inter oder intramolekulare Vernetzung des Proteins verursachen; weiterhin kann eine Zerstörung der aktiven Konformation des Proteins durch die Neutralisierung der positiv geladenen Gruppen des Proteins bei der Reaktion auftreten. Bei einer andere Methode, wo entweder Alkyl- oder Alkanoyl-polyethylenglykolaldehyd in ein biologisch aktives Protein in Gegenwart von einem borartigen reduzierenden Mittel eingeführt wird, kann das reduzierende Mittel die mit der Aufrechterhaltung der biologisch aktiven Konformation des Proteins verknüpften Disulfidbindungen spalten und kann die biologische Aktivität des Proteins reduzieren und das Protein durch eine Änderung der höheren Ordnungsstruktur unlöslich machen (EP-A-0 154 316).
Bei der Arbeit an der Verbesserung der oben beschriebenen herkömmlichen Methoden haben die Erfinder nun gefunden, dass die Clearance eines biologisch aktiven Proteins aus der Blutzirkulation reduziert werden kann durch chemisches Modifizieren von mindestens einer Aminogruppe des Proteins mit einer Gruppe der Formel
wobei R ein Wasserstoffatom darstellt oder Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, in eine positive ganze Zahl von 500 oder weniger darstellt und n eine ganze Zahl von 1 bis 4 darstellt.
Weitere Studien basierend auf diesem Befund resultierten in der Entwicklung der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft: (1) ein chemisch modifiziertes Protein mit Disulfldbindung und einer Gruppe der Formel
worin R ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt, m eine positive ganze Zahl von 500 oder weniger darstellt und n eine ganze Zahl von 1 bis 4 darstellt und die Gruppe mindestens an eine primäre Aminogruppe des Proteins gebunden ist; (2) ein Verfahren zur Herstellung eines chemisch modifizierten Proteins enthaltend eine Gruppe der Formel (I), wobei diese Gruppe an mindestens eine primäre Aminogruppe des Proteins gebunden ist, welches Verfahren Umsetzung eines Proteins mit einem Imidoester der Formel
worin R, m und n dieselbe Bedeutung haben wie in der vorhergehenden Formel (I), und R' eine Gruppe -OR" darstellt worin R" Alkyl, Aryl oder Aralkyl darstellt;
oder mit einem Salz eines Imidoesters der Formel
worin R, R', m und n dieselbe Bedeutung wie oben haben, x eine positive ganze Zahl ist, X ein Säurerest ist, umfasst und (3) die Verwendung der Verbindung II als chemisch modifizierendes Agens zur Herstellung eines chemisch modifizierten Proteins mit einer Disulfldbindung und der Gruppe der Formel I, wobei die Gruppe an mindestens eine primäre Aminogruppe des Proteins gebunden ist.
Proteine, die als Rohmaterial in der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, beinhalten solche, die eine biologische Aktivität haben. Natürliche Proteine, erhalten aus Tieren einschliesslich des Menschen, aus Mikroorganismen oder aus Pflanzen, Proteine, hergestellt durch Genengineering, und synthetische Proteine können alle verwendet werden, solange sie biologisch aktiv sind. Zum Beispiel Zytokine wie Interferone [Interferon-α (IFN-α), Interferon-β (IFN-β) und Interferon-γ (IFN-γ)] und Interleukin-2 (IL-2); Hormone, wie etwa Wachstumshormone und Insulin; Enzyme, wie Urokinase, Superoxiddismutase (SOD) und Asparaginase; und andere Proteine wie Immunoglobuline, Trypsin Inhibitoren, alle Arten von Proteasen und Peptidasen, alle Arten von Cytochromen, Inseln-aktivierende Proteine (IAPs), alle Arten von Inhibitorproteinen und Neokarzinostatin können verwendet werden. Bevorzugt unter diesen biologisch aktiven Proteinen sind verschiedene IFNs (rIFN-α, rIFN-β, rIFN-γ) und rIL-2 hergestellt durch Genrekombinationstechniken, SOD erhalten aus Tieren oder aus Mikroorganismen.
Diese Proteine haben bevorzugt ein Molekulargewicht von ungefähr 5 000-50 000, besonders bevorzugt von 10 000-30 000.
Die primäre Aminogruppe des Proteins umfasst N-terminale Aminogruppen und &epsi;-Aminogruppen von Lysinresten.
Ein Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen dargestellt durch R in den obigen Formeln (I) und (II) beinhaltet die folgenden Reste: Methyl, Ethyl, n- Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, sec-Butyl, t-Butyl, n-Pentyl, Isopentyl, n- Hexyl, Isohexyl, n-Heptyl, Isoheptyl, n-Octyl., Isooctyl, n-Nonyl, Isononyl, n- Decyl, Isodecyl, n-Undecyl, n-Dodecyl, n-Tridecyl, n-Tetradecyl, n- Pentadecyl, n-Hexadecyl, n-Heptadecyl und n-Octadecyl. Reste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind besonders bevorzugt.
Die durch m repräsentierte positive ganze Zahl in den besagten Formeln ist 500 oder weniger, bevorzugt 7 bis 150.
Die in den besagten Formeln durch n dargestellte Zahl ist bevorzugt 2 oder 3.
Die Gruppe der Formel (I) hat bevorzugt ein Molekulargewicht von 25 000 oder weniger, vorzugsweise von 350 bis 7 000.
Der Rest R' in Formel (II) stellt eine Gruppe der Formel -OR" dar, worin R" ein Alkyl, ein Aryl oder ein Aralkyl darstellt.
Die durch R" in der obigen Formel dargestellten Alkyle haben vorzugsweise 1 bis 8 Kohlenstoffatome. Solche Alkyle umfassen Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, sec-Butyl, t-Butyl, n-Pentyl, n- Hexyl, n-Heptyl und n-Octyl. Solche mit ein bis vier Kohlenstoffatomen sind besonders bevorzugt.
Das Alkyl kann einen oder zwei Substituenten von Chlor oder Fluor haben. Die Aryle dargestellt durch R" umfassen unsubstituierte Phenyle und Phenyle, die eine oder zwei Alkyle aus 1 bis 3 Kohlenstoffatomen (z.B. Methyl, Ethyl, Propyl) als Substituent(en) haben.
Die durch R" dargestellten Aralkyle umfassen Benzyl, Phenethyl und Phenylpropyl.
Die chemisch modifizierten Proteine der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden durch Reagieren eines Proteins wie zum Beispiel eines biologisch aktiven Proteins und eines Imidoesters dargestellt durch Formel (II).
Salze dargestellt durch die Formel
können ebenfalls anstelle von Imidoestern gemäss Formel (II) verwendet werden. (In der Formel haben R, R', m und n dieselbe Bedeutung wie oben. x und X bedeuten eine positive ganze Zahl bzw. einen Säurerest.
In Salzen, dargestellt durch Formel (III), bedeutet x die Basennummer von einer Säure HxX. Jede organische oder anorganische Säure kann für HxX verwendet werden, dabei sind HCl, CF&sub3;COOH, HClO&sub4;, H&sub2;SO&sub4;, CH&sub3;COOH, CCl&sub3;COOH und H&sub3;PO&sub4; bevorzugt.
Wenn ein biologisch aktives Protein unter Verwendung der Verbindung (II) oder (III) modifiziert wird, kann das molare Verhältnis der Verbindung zu dem Protein in einem Bereich von 1:1 bis 10 000:1 gewählt werden. Das Ausmass der Modifikation kann wahlweise durch Veränderung von entweder des Molverhältnisses von Protein/Verbindung (II) oder (III), oder der Konzentrationen des Proteins und der Verbindung (II) oder (III) in dem Reaktionsgemisch gewählt werden. Jedes Lösungsmittel kann verwendet werden, solange es nicht die Reaktion stört und das Protein inaktiviert. So kann zum Beispiel Wasser, ein Phosphatpuffer, ein Boratpuffer, ein Trispuffer und ein Acetatpuffer benutzt werden. Ein organisches Lösungsmittel, das nicht das Protein inaktiviert und die Reaktion stört, wie zum Beispiel ein Niederalkanol (z. B.Methanol, Ethanol, i-Propanol), Acetonitril, Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid, können dazugegeben werden. Zusätzlich kann die Verbindung (II) oder (III) zur Reaktionsmischung direkt oder nach Verdünnen in entweder einem Puffer oder einem organischen Lösungsmittel dazugegeben werden, solange das Solvens die Reaktion weder stört noch das Protein inaktiviert. Es macht keinen Unterschied, ob das Protein oder die Verbindung (II) oder (III) zuerst zum Reaktionsmedium gegeben wird; gleichzeitige Zugabe des Proteins und der Verbindung (II) oder (III) ist ebenfalls erlaubt. Der Reaktions-pH-Wert kann innerhalb eines weiten Bereiches von 3 bis 14 gewählt werden, aber leicht alkalische Bedingungen (pH 7 bis 9) sind bevorzugt. Zusätzlich kann das Ausmass der Modifikation des biologisch aktiven Proteins durch Variieren des Reaktions-pH-Wertes verändert werden. Die Reaktionstemperatur kann innerhalb eines Bereiches gewählt werden, in dem die Denaturierung des Proteins nicht auftritt, ist aber bevorzugterweise zwischen 0 und 40º C. Eine Reaktionszeit von 0.5 bis 72 Stunden, generell 3 bis 30 Stunden, wird für die Reaktion ausreichend sein.
Das gewünschte chemisch modifizierte Protein kann durch Reinigen der Reaktionsmischung mittels konventioneller Methoden für die Proteinreinigung, wie z.B. Dialyse, Aussalzen, Ultrafiltration, Ionaustauschchromatographie, Gelfiltration, hochauflösende Flüssigkeitschromatographie oder Elektrophorese, erhalten werden. Der Grad der Modifikation der Aminogruppen kann bestimmt werden durch zum Beispiel Aminosäureanalyse nach Säurehydrolyse.
Der Imidoester (III) kann aus Polyethylenglykol-Derivaten der Formel
R(O-CH&sub2;CH&sub2; -O(CH&sub2; -CN (IV),
worin R, m und n dieselbe Bedeutung wie oben haben, hergestellt werden. Das folgende Verfahren für seine Herstellung ist einfach und bevorzugt:
Die Verbindung (IV) wird zuerst in einem dehydrierten Niederalkanol gelöst (HO-R", worin R" dieselbe Bedeutung wie oben definiert hat). Die mit wasserfreier Säure (z.B. trockenes Hydrogenchlorid) durchblasene Alkanollösung wird bei -70º C bis +30º C, bevorzugt bei -20º C, stehengelassen. Die resultierende Reaktionsmischung kann unter Verwendung normaler chemischer Methoden, wie Konzentrierung, Wiederausfällung oder Rekristallisation gereinigt werden. Die solchermassen erhaltene Verbindung (III) kann für lange Zeit unter trockenen Bedingungen bei tiefer Temperatur, bevorzugt in einem Kühlschrank oder Gefrierschrank, gelagert werden. Verbindung (II) kann durch Behandeln von Verbindung (III) mit einer alkalischen Verbindung, wie z.B. Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd, erhalten werden.
Polyethylenglykol-Derivate (IV) können nach den folgenden Methoden erhalten werden: Polyethlenglykol-Derivat (IV) (n=3) kann durch Behandeln der Verbindung mit der Formel
R(O-CH&sub2;CH&sub2; -O-OH (V),
worin R und m dieselbe Bedeutung wie oben haben, mit der Ausnahme, dass R nicht Wasserstoff ist, mit Na, NaH, K oder einem Alkoxid von Na oder K, gefolgt von der Zugabe von Bromobutyronitril [Br(CH&sub2;)&sub3; CN] erhalten werden; Verbindung (IV) (n=2) kann durch Eintropfen von Acrylnitril in Verbindung (V), die mit einer kleinen Menge von NaH behandelt wurde, in einem inerten Solvens wie etwa Benzol erhalten werden. In beiden Fällen kann die Reaktionsmischung mittels normaler chemischer Verfahren, wie etwa Extraktion, Konzentration, Rekristallisation, Repräzipitation, Chromatographie oder Destillation gereinigt werden.
Das chemisch modifizierte Protein der vorliegenden Erfindung hat die Gruppe der Formel (I) direkt an mindestens einige primäre Aminogruppen des biologisch aktiven Proteins gebunden.
Die Gruppen der Formel (I) sollten ein Molekulargewicht entsprechend 1 bis 10 %, bevorzugterweise 2 bis 8 %, des Molekulargewichts des modifizierten Proteins haben.
Wenn das rohe Protein nur eine Aminogruppe an einem N-Terminus hat, so hat das gemäss der vorliegenden Erfindung erhaltene chemisch modifizierte Protein eine Gruppe der Formel (I) direkt an die besagten Aminogruppen gebunden. Wenn das biologisch aktive Protein eine oder mehrere Lysin Moleküle hat, so hat das modifizierte Protein die Gruppe der Formel (I) direkt an einige dieser &epsi;-Aminogruppen gebunden, bevorzugt 5 bis 80 % (Durchschnitt), insbesondere 10 bis 50 % (Durchschnitt) der &epsi;- Aminogruppen. In diesem Falle kann die N-terminale Aminogruppe die Gruppe der Formel (I) direkt gebunden haben oder auch nicht.
Das chemisch modifizierte Protein der vorliegenden Erfindung hat eine nützliche biologische Aktivität ähnlich der des korrespondierenden unmodifizierten biologisch aktiven Proteins und kann daher in Medikamenten verwendet werden.
Verglichen mit den entsprechenden bekannten unmodifzierten biologisch aktiven Proteinen, ist das vorliegende chemisch modifizierte Protein nicht nur in seiner Clearance bei der Zirkulation im lebenden Körper verringert und bleibt daher über eine längere Periode wirksam, sondern es hat auch eine geringere Toxizität und Antigenität.
Dementsprechend kann es gefahrlos für den gleichen Zweck und in der gleichen Weise wie gut bekannte biologisch aktive Proteine verwendet werden. Das vorliegende chemisch modifizierte Protein kann oral oder parenteral Säugern (z.B. Affe, Hund, Schwein, Hase, Maus, Ratte, Mensch) in der Form einer geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung (z.B. Kapsel, Injektion) mit herkömmlichen Trägern und Verdünnern verabreicht werden.
Zum Beispiel kann das chemisch modifizierte rIL-2 der vorliegenden Erfindung als präventives oder therapeutisches Mittel für Tumoren verwendet werden; es wird in einer Dosis ähnlich der des unmodifizierten rIL-2 verabreicht, d.h. in sehr kleinen Mengen in Form einer Injektion oder als Kapseln.
Das chemisch modifizierte rIFN-γ der vorliegenden Erfindung, verwendet als Mittel mit antiviraler Wirkung, Antitumorwirkung, zellulärer Wachstumsinhibition oder immunpotenzierender Aktivität, wird erwachsenen Menschen in einer Dosis von 1.0 x 10&sup5; bis 1.0 x 10&sup8; Einheiten/Tag durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion verabreicht.
Das chemisch modifizierte rIFN-αA der vorliegenden Erfindung, wenn es als therapeutisches Mittel mit Antitumorwirkung oder antiviraler Wirkung verwende wird, kann Patienten mittels Injektion in einer Menge entsprechend 1.0 x 10&sup5; bis 1.0 x 10&sup6; Einheiten/Tag von rIFN-αA mittels Injektion verabreicht werden.
Das chemisch modifizierte SOD der vorliegenden Erfindung, wenn es als antiinflammatorisches Mittel verwendet wird, kann in einer Menge von 1 bis 5 mgkg/Tag SOD in der Form einer Injektion oder Tabletten einem Tier verabreicht werden.
Die Verbindung (II) sowie (III) kann als Rohmaterial oder als Ausgangsmaterial für die Herstellung der vorliegenden chemisch modifizierten Proteine mit der Gruppe (I) verwendet werden.
In der vorliegenden Beschreibung sind in einigen Fällen die Aminosäuren durch Abkürzungen basierend auf der IUPAC-IUB Nomenklatur (etabliert durch die Kommission für biochemische Nomenklatur) dargestellt, wie zum Beispiel: Lys = Lysin.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt den aktivitätserhaltenden Effekt des modifizierten Proteins in Rattenblutplasma, wie in Beispiel 1 beschrieben (vi).
Fig. 2 zeigt den ausscheidungsverzögernden Effekt in Rettenblutplasma, wie in Beispiel 2 (iii) beschrieben.

BEISPIELE DER BEVORZUGTEN AUSFUEHRUNGSFORM

Die vorliegende Erfindung ist im nachfolgenden detaillierter mit einem Referenzbeispiel und einigen Arbeitsbeispielen der bevorzugten Ausführungsform beschrieben.

Referenzbeispiel 1 Synthese von Polyethylenglykolimidoester

Drei Gramm von Polyethyleneglykol-monomethylether mono-β- cyanoethylether, synthetisiert aus Polyethylenglykol-monomethylether mit einem mittleren Molekulargewicht von 350, wurden in 3 ml wasserfreiem Methanol gelöst. Zu der resultierenden Lösung wird trockenes Hydrogenchlorid bei -20º C bis zur Sättigung durchgeblasen, das Reaktionsgefäss verschlossen und in einem Gefrierschrank für 3 Tage stehengelassen. Nachdem trockener Ether zugegeben wurde, wurde die Lösung wieder im Gefrierschrank gekühlt. Vier Stunden später wurde die obere Etherphase dekantiert und trockener Ether nochmals zu der verbleibenden Lösung gegeben. Die Lösung wurde nach gutem Rühren wieder in den Gefrierschrank gestellt und ergab etwa eine Stunde später ein festes Produkt. Nachdem der Ether entfernt war, wurde das feste Produkt gut mit wasserfreiem Ether gewaschen und im Gefrierschrank gekühlt. Nachdem sich das feste Produkt abgesetzt hatte, wurde die Etherphase dekantiert. Dieser Prozess wurde zweimal mit grundlichem Waschen des festen Produktes wiederholt. Das feste Produkt wurde unter reduziertem Druck in einem sowohl Phosphorpentoxid als auch festes NaOH enthaltenden Trockenapparat für eine Stunde getrocknet und ergab Imidoester von Polyethylenglykol-monomethylether mit einem mittleren Molekulargewicht von 350 (das wirkliche Molekulargewicht ist grösser als 350 durch das Gewicht von
da das als Rohmaterial verwendete Polyethylenglykol ein mittleres Molekulargewicht von 350 hat.) Dieses Produkt ist bei Raumtemperatur eine syrupöse Flüssigkeit. Ein Triplett, entsprechend
wurde bei der Position von δ = 2.3 im ¹H-NMR Spektrum des Produktes detektiert (in d&sub6;-DMSO, 90 Mhz). Absorptionen entsprechend zu -CN sind im IR Spektrum des Produktes verschwunden.
Das Produkt wurde in einige kleine Behälter aufgeteilt, verschlossen und in einem Gefrierschrank gelagert.
Polyethylenglykol-mono-β-cyanoethylether, hergestellt aus Polyethylenglykol-monomethylether mit einem mittleren Molekulargewicht von 550, 750, 1 900 und 5 000, wurden der gleichen Behandlung wie oben unterzogen und ergaben entsprechende Imidoester von Polyethylenglykolmonomethylether.

Beispiel 1 Modffizierung von Interleukin-2

(i) Vier mg Interleukin-2 (rIL-2), das unter Einsatz von Escherichia coli DH1/pTF4 (IFO 14299, FERM BP-628) mittels der in der (ungeprüften) japanischen Patentpublikation Nr. 115528/85 oder in der europäischen Patentpublikation Nr. 145,390 beschriebenen Methode erhalten wurde, wurden in 2 ml 25 mM Phosphatpufferlösung (pH 7.6) gelöst und mit Eis gekühlt. Bei Rühren unter Eiskühlung wurde die resultierende Lösung zu 17 mg des in Referenzbeispiel I erhaltenen Imidoesters von Polyethylenglykol-monomethylether (mittleres Molekulargewicht: 550) gegeben, der pH der Reaktionsmischung unter Verwendung von 0.2N NaOH umgehend wieder auf 7.6 eingestellt und fünf Stunden umgesetzt. Die resultierende Reaktionsmischung wurde auf eine Sephadex G-25 (Pharmacia AB, Schweden) Säule (0.9 x 50 cm) gegeben, die mit 25 mM Ammoniumacetat (pH 6.0) equilibriert war, und mit dem gleichen Puffer unter Ueberwachung der Absorption bei 280 nm Wellenlänge eluiert und ergab ungefähr 8 ml in der Hauptfraktion. Die Rückgewinnungsrate des Proteins war 60 %. Drei ml der Fraktion wurden nach Lyophilisieren mit 6N HCl bei 110ºC in einem verschlossenen, entgasten Röhrchen während 24 Stunden hydrolysiert und danach einer Aminosäureanalyse unterzogen. Die Analysendaten zeigten, dass 2.8 der elf Lys Reste von rIL-2 mit Polyethylenglykolimidoester modifiziert worden waren.
(ii) In der gleichen wie in (i) beschriebenen Weise wurden jeweils 24 mg und 57 mg eines Polyethylenglykolimidoesters, erhalten aus Polyethylenglykol-monoimidoestern mit einem mittleren Molekulargewicht von 750 bzw. 1 900, durch die Verfahren wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben, zu rIL-2 gegeben. Die Aminosäureanalyse des Reaktionsprodukts zeigte, dass 2.9 beziehungsweise 2.0 der elf Lys Reste von rIL-2 mit Polyethylenglykolimidoester modifiziert worden waren.
(iii) Messungen der natürliche Killerzellen (NK) induzierenden Aktivitäten der drei mit Polyethylenglykolimidoester modifizierten rIL-2s, erhalten in (i) und (ii), ergaben die Werte 14 900, 16 500 und 7 180 Einheiten/ml.
(iv) Ungefähr 3 mg von jeweils unmodifiziertem rIL-2 und den zwei in (ii) erhaltenen mit Polyethyleneglykolethern modifizierten rIL-2s wurden Ratten intravenös zur Messung ihrer biologischen Aktivität in Blutplasma verabreicht. Das Folgende wurde gefunden: In Ratten, welche modifiziertes rIL-2 erhielten, verblieb die im Blutplasma beobachtete NK-Zelleninduzierende Aktivität für eine längere Periode wirksam, als die in Ratten beobachtete, welche unmodifiziertes rIL-2 erhielten. Das Anhalten der Aktivität stieg mit der Erhöhung des Molekulargewichts des Polyethylenglykol.
Die in den Messungen erhaltenen Resultate sind in Fig. 1 gezeigt.
In Fig. I zeigen - - und - - in (ii) erhaltene chemisch modifizierte rIL-2s der vorliegenden Erfindung. Genauer zeigen - - und - - und - - den Zeitverlauf der Killerzellen-induzierenden Aktivität im Blutplasma nach Injektion des mit einem Polyethylenglykolimidoester mit einem mittleren Molekulargewicht von 750 modifizierten rIL-2, des modifizierten rIL-2, erhalten aus Polyethylenglykolimidoester mit einem mittleren Molekulargewicht von 1 900, und des unmodifizierten rIL-2, das als Kontrolle verwendet wurde.

Beispiel 2 Modifizierung von Interferon-γ (rIFN-γ)

(i) Drei ml rIFN-γ Lösung (ungefähr 1.7 mg/ml), die unter Verwendung von Escherichia coli 294/pHIT trp 2101 und durch Reinigen unter Anwendung des anti-rIFN-γ-Antikörpers, hergestellt durch Maus B Hybridom Gamma 2-11.1 (hinterlegt bei C.N.C.M. des Institut Pasteur, Frankreich, unter der Hinterlegungsnummer 1-242) mittels der in der europaischen Patentpublikation Nr. 110044 oder der (ungeprüften) japanischen Patentpublikation Nr. 186995/84 beschriebenen Methode, wurde auf eine mit Sephadex G-25 gepackte Säule aufgetragen, die mit einem 20 mM Phosphatpuffer (pH 7.5), enthaltend 10mM N-Acetyl-Cystein, equilibriert war, und mit dem gleichen Puffer eluiert und ergab ungefähr 4.5 ml in der Hauptfraktion. Mit Rühren unter Eiskühlung wurde die resultierende rIFN-γ Fraktion zu 50 mg des in Referenzbeispiel 1 erhaltenen Imidoesters von Polyethylenglykol-monomethylether (mittleres Molekulargewicht: 750) zugegeben und der pH der Reaktionsmischung sofort wieder unter Verwendung von gesättigter NaHCO&sub3; Lösung auf 7,5 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde in einem Eisbad for mehr als 4 Stunden gerührt und dann über Nacht in einen Kühlschrank gestellt. Nach Entfernen des resultierenden Niederschlags mittels Zentrifugation wurden ungefähr 3 ml des Ueberstandes auf eine Säule (1.2 x 45 cm) aufgetragen, die mit Sephadex G-75 gepackt und mit einer 25 mM Amoniumacetatpufferlösung (pH 6.0) zur Elution equilibriert war. Es wurden ungefähr 5 ml in der Hauptfraktion erhalten. Zugabe von Glutathion in reduzierter Form zu der Fraktion bis zu einer Konzentration von 10 mM ergab eine Lösung enthaltend rIFN-γ modifiziert mit Polyethylenglykolimidoester. Die Messung der rIFN-γ Aktivität (Enzym-Immunoassaymethode: EIA Methode) und die antivirale Aktivität der resultierenden Lösung zeigten einen Wert von 3.4 x 10&sup4; ng rIFN-γ/ml beziehungsweise von 2.31 x 10&sup4; IU/ml. Teile des oben beschriebenen Ueberstandes wurden durch eine mit 0.1 M Essigsäure equilibrierte Sephadex G-75-Säule (0.9 x 50 cm) gegeben und ergaben eine Proteinfraktion. Nach Lyophilisieren wurde die Proteinfraktion mit 6N HCl bei 110ºC in einem verschlossenen, entgasten Röhrchen wahrend 24 Stunden hydrolysiert, gefolgt von einer Aminosäureanalyse. Ungefähr 7 der zwanzig Lys Reste des rIFN-γ wurden als modifiziert gefunden.
(ii) Hundert mg Imidoester von Polyethylenglykol-monomethylether (mittleres Molekulargewicht: 1 900), erhalten in Referenzbeispiel 1, und rIFN-γ wurden in der gleichen Weise wie in (i) beschrieben behandelt und ergaben rIFN-γ modifiziert mit Polyethylenglykolimidoester. Die rIFN-γ Aktivität (EIA Methode) und die antivirale Aktivität waren 3.6 x 10&sup4; ng rIFN-γ/ml beziehungsweise 7.7 x 10³ IU/ml. Eine Aminosäureanalyse zeigte, dass ungefähr zwei der zwanzig Lys-Reste des rIFN-γ modifziert worden waren.
(iii) Unmodifiziertes rIFN-γ und gemäss (i) und (ii) modifizierte rIFN-γ s, wurden jeweils intravenös Ratten in einer Dosis von 7.90 x 10&sup4;, 4.62 x 10³ bzw. 1.54 x 10³ IU verabreicht. rIFN-γ Aktivitäten in Blutplasma wurden dann durch die EIA Methode bestimmt und bewiesen, dass die mit Polyethylenglykolimidoester modifizierten rIFN-γs klarerweise langsamer in der Clearance waren als das unmodifzierte rIFN-γ.
Die in den Messungen erhaltenen Resultate sind in der Fig. 2 gezeigt; - -, - - und - - zeigen den Zeitverlauf der Veränderung der rIFN-γ Plasmaktivitäten nach Injektion der modifizierten rIFN-γs, erhalten gemäss (i) und (ii), bzw. des unmodifizierten rIFN-γ, das als Kontrolle verwendet wurde.

Beispiel 3 Modifizierung von Interferon-αA (rIFN-αA)

(i) Fünf ml einer rIFN-αA Lösung (enthaltend ungefähr 4 mg Protein), erhalten über die in der (ungeprüften) japanischen Patentpublikation Nr. 79897/1982 oder der Europäischen Patentpublikation Nr. 43,980 beschriebenen Methode, wurde über Nacht gegen 0.05 M Phosphatpuffer (pH 7.0) dialysiert. Zum Rückstand wurden 250 mg des gemäss Referenzbeispiel 1 erhaltenen Imidoesters aus Polyethylenglykol-monoethylether (mittleres Molekulargewicht: 5 000) unter Eiskühlung und Rühren dazugegeben und danach der pH der Lösung unter Verwendung von 0.2 N NaOH umgehend auf 7.5 eingestellt. Nach Rühren während 3.5 Std. wurde die Reaktionsmischung auf eine Sephadex G-75-Säule (0.9 x 50 cm), equilibriert mit 25 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 6.0), aufgetragen und mit dem gleichen Puffer eluiert. Die erhaltene Hauptproteinfraktion wurde dann mittels Immersible CX-10 (Milipore Inc., USA) konzentriert und ergab ungefähr 17 ml rIFN-αA modifiziert mit Polyethylenglykolimidoester (Proteingehalt: 105 µ/ml). Aminosäureanalyse des Säurehydrolysates zeigte, dass 3.1 der elf Lys-Reste des rIFN-αA modifiziert worden waren. Die Produktaktivität wurde mit 3.0 x 10&sup7; IU/ml (EIA Methode) bestimmt.
(ii) rIFN-αA wurde mit 100 mg des in Referenzbeispiel 1 erhaltenen Imidoesters aus Polyethylenglykol-monomethylether (mittleres Molekulargewicht: 750), in der gleichen Weise wie in (i) beschrieben behandelt und ergab ungefähr 21 ml einer Lösung, enthaltend rIFN-αA modifiziert mit Polyethylenglykolimidoester (Proteingehalt: 10&sup7; µg/ml). Aminosäureanalyse des Produktes zeigte, dass 6.2 der elf Lys-Reste des rIFN-αA modifiziert worden waren. Aktivitätsmessungen mittels EIA Methoden ergaben den Wert 7.21 x 10&sup6; IU/ml.
Wenn die in (i) und (ii) erhaltenen modifizierten rIFN-αAs jeweils einzelnen Ratten verabreicht wurden, wurde offensichtlich reduzierte Clearance aus dem Blut gefunden.

Beispiel 4 Modifizierung von Superoxiddismutase (SOD)

(i) 5.5 mg SOD, erhalten unter Verwendung von Serratia Marcescens ATCC 21074 mittels der in Agricultural and Biological Chemistry , 47, 1537 (1983), der (ungeprüften) japanischen Patentpublikationen Nrn. 29285/1982 und 16685/1983, der europäischen Patentpublikationen Nrn. 45,222 und 70,656 beschriebenen Methoden, wurden in 2 ml 0.1 M Boratpuffer (pH 8.7) aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde über Nacht mit 65 mg des gemäss Referenzbeispiel 1 erhaltenen Imidoesters von Polyethylenglykolmonomethylether (mittleres Molekulargewicht: 5 000) bei pH 8.5 in einem kalten Raum über Nacht umgesetzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde dann auf eine Sephadex G-100-Säule (1.8 x 50 cm) gegeben und mit 0.05M Phosphatpuffer (pH 7.0) eluiert. Es wurde eine Hauptproteinfraktion erhalten, welche nach Konzentrierung ungefähr 16.5 ml Lösung mit modifizierter SOD ergab, die 0.282 mg/ml Protein enthielt.
(ii) Serratia-abgeleitetes SOD erhalten in (i), wurde zu 330 mg von Polyethylenglykol-monomethylether-imidoester mit dem gleichen Molekulargewicht wie oben gegeben. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde dann in der gleichen Weise wie in (i) beschrieben behandelt und ergab 22 ml einer Lösung mit modifizierter SOD, enthaltend 0.226 mg/ml Protein.
(iii) Fünf ml von jeder der in (i) und (ii) erhaltenen Lösungen mit modifizierter SOD, wurden gqen destilliertes Wasser über Nacht dialysiert. Das jeweils resultierende Rückstand wurde nach Lyophilisieren mit 6 N HCl bei 100ºC während 24 Std. hydrolysiert; 23% bzw. 29% der SOD Lys-Reste wurden als modifiziert gefunden.
(iv) Die Aktivitäten von den in (i) und (ii) erhaltenen modifizierten SODs und unmodifizierter SOD wurden verglichen. Die verbliebene Aktivität der in (i) erhaltenen modifizierten SOD und der in (ii) erhaltenen modifizierten SOD waren 65 % bzw. 60 % von der der unmodifizierten SOD.
Für die beiden in (i) und (ii) erhaltenen modifizierten SODs wurde jeweils gefunden, dass sie, verglichen mit der unmodifizierten SOD, langsamer in ihrer Clearance aus Blut und niedriger in ihrer Antigenität sind.

Claims

1. Ein chemisch modifiziertes Protein mit Disulfidbindung und einer Gruppe der Formel:

worin R ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt, m eine positive ganze Zahl von 500 oder weniger darstellt, n eine ganze Zahl 1-4 darstellt und die Gruppe an mindestens eine primäre Aminogruppe des Proteins gebunden ist.

2. Das modifizierte Protein gemäss Anspruch 1, worin das Molekulargewicht der Gruppe der Formel (I) 25,000 oder weniger ist.

3 Das modifizierte Protein gemäss Anspruch 1, worin das Protein ein Molekulargewicht von 5,000 bis 50,000 hat.

4. Ein Verfahren zur Herstellung eines chemisch modifizierten Proteins mit Disulfidbindung und einer Gruppe der Formel:

worin R ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt, m eine positive ganze Zahl von 500 oder weniger darstellt, n eine ganze Zahl 1-4 darstellt und die Gruppe an mindestens eine primäre Aminogruppe des Proteins gebunden ist,

welches Reagieren eines Proteins mit einem Imidoester der Formel:

worin R ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt, R' eine Gruppe -OR" ist, worin R" Alkyl, Aryl oder Aralkyl darstellt, m eine positive ganze Zahl von 500 oder weniger darstellt, n eine ganze Zahl von 1 bis 4 darstellt,

oder mit einem Salz eines Imidoesters der Formel:

worin R, R', m und n die gleiche Bedeutung wie oben haben, x eine positive ganze Zahl und X ein Säurerest ist, umfasst.

5. Verwendung einer Verbindung, dargestellt durch die Formel:

worin R ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt, R' eine Gruppe -OR" ist, worin R" Alkyl, Aryl oder Aralkyl darstellt, m eine positive ganze Zahl von 500 oder weniger darstellt, n eine ganze Zahl von 1 bis 4 darstellt, oder dem Salz davon, zum Herstellen eines chemisch modifizierten Proteins mit Disulfldbindung und einer Gruppe der Formel:

worin R, m und n die gleiche Bedeutung wie oben haben, die Gruppe an mindestens eine primäre Aminogruppe des Proteins gebunden ist, als ein chemisch modifizierendes Agens für Proteine.