DE3788026T2

DE3788026T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen.

Info

Publication number: DE3788026T2
Application number: DE87112349T
Authority: DE
Inventors: Kazunori Ichinohe; Yukitaka Mino; Yoshihiko Nakamura; Hitoshi Nakashima; Kazuhiro Sagamihara- Nishizima; Takashi Noto; Katsuto Watanabe; Masaichi Yamamura
Original assignee: Kawasumi Laboratories Inc
Current assignee: SB Kawasumi Laboratories Inc
Priority date: 1986-08-27
Filing date: 1987-08-25
Publication date: 1994-04-21
Anticipated expiration: 2007-08-26
Also published as: KR880002997A; US5071760A; EP0258795A3; AU7748287A; AU600968B2; KR910007820B1; US5057429A; EP0258795B1; EP0258795A2; CA1305934C; DE3788026D1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie Instrumente und Einrichtungen zum Kultivieren von Gewebezellen.
Bekannte Kultivierungsmethoden für Gewebe- oder tierische Zellen sind die Kolbenkultivierung unter Verwendung flüssiger Medien; eine Drehzellkultur, welche bewirkt, daß die Zellen an der Innenwand einer Rollflasche anhaften oder darin treiben; eine andere Weise, welche bewirkt, daß die Zellen an den Oberflächen von Kügelchen anhaften und dort kultiviert werden; oder eine weitere Art, welche bewirkt, daß die Zellen an einer hohlen Membran eines halbdurchlässigen semipermeablen Films anhaften und bei der deren Rückseite eine Kultivierungsflüssigkeit zugeführt wird.
Jedoch können bei diesen herkömmlichen Methoden die Zellen beim Auswechseln der Kulturmedien für die in der Rollflasche treibenden Zellen einsinken oder sich durch die Zentrifugalwirkung niederschlagen. Diese Vorgehensweise ist nicht nur schwierig, sondern auch gefährlich in bezug auf eine Verunreinigung. Weiterhin ist bei der Drehzellkultur wegen der Befestigung der Kügelchen das Sammeln der Zellen schwierig, und sie benötigt eine thermostatische Kammer oder einen besonderen Inkubator. In der hohlen Membran des halbdurchlässigen Films ist die Ausbeute gering, weil die Zellen daran anhaften, und wenn eine Kultivierung großer Mengen notwendig ist, sollte die Fläche des Hohlfaserfilms verbreitert werden. Zusätzlich ist eine Einrichtung notwendig zum Zirkulieren und Zuführen der Kultivierungsflüssigkeit und insgesamt wird die Einrichtung von großen Ausmaßen und hohen Kosten sein.
Die FR-A-1 448 148 beschreibt bereits ein Verfahren und eine Einrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen, bei der die zu kultivierenden Zellen zusammen mit einem Kulturmedium innerhalb eines aus einem semipermeablen Filmmaterial gefertigten inneren Behälter enthalten sind, welcher innerhalb eines mit Kulturmedium und Gas gefüllten Gehäusebehälters angebracht ist. Während der Behälter aus dem semipermeablen Filmmaterial für das Kulturmedium und das Gas durchlässig ist, ist er für die Zellen nicht durchlässig. Auch die WO-A-87/00548 beschreibt eine ähnliche Einrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen, wobei das Kultermedium in dem äußeren Behälter mit Hilfe von Umwälzpumpen in Bewegung versetzt wird, um das Kulturmedium homogen zu machen. Zusätzlich werden die Zellen innerhalb des inneren Behälters aus dem semipermeablen Film mittels mechanisch oder hydraulisch erzeugter lokalisierter Kräfte, die Verformungen des semipermeablen Films bewirken, in Dispersion gehalten.
Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zum Kultivieren der Gewebezellen auf eine wirksame und ökonomische Weise bei hoher Konzentration oder hoher Aktivität zu schaffen.
Es ist ein anderes Ziel der Erfindung, Instrumente und Einrichtungen zum wirksamen und ökonomischen Durchführen des Kultivierungsverfahrens zu schaffen.
Zum Kultivieren der Gewebezellen sind diese zusammen mit Kultivierungsmedium und Gas in einem Behälter aus halbdurchlässigem Film eingeschlossen, und das Medium und das Gas werden außerhalb des halbdurchlässigen Films gehalten, um dadurch die Zellen durch den halbdurchlässigen Film mittels des Mediums in dem Behälter aus halbdurchlässigem Film ebenso wie durch Diffusionsphänomene durch das Konzentrationsgefälle des Mediums außerhalb des Films bei hoher Dichte zu kultivieren. Es ist vorzuziehen, die Zellen zu kultivieren, während der Behälter in für die Zellen vorteilhaften Winkeln gedreht oder geschwenkt wird.
Mit dem Behälter aus dem halbdurchlässigen Film ist eine Kultivierungseinrichtung zum Halten der zu kultivierenden Zellen vorgesehen, und mit einem anderen Behälter zum Halten der Kultivierungsflüssigkeit und des Gases außerhalb des Behälters aus halbdurchlässigem Film, sowie eine Verbindung zwischen den ersteren und letzteren Behältern.
Der halbdurchlässige Film kann eine Zellulose wie eine regenerierte Zellulose oder Zelluloseacetat sein oder ein Film wie Polyacrylnitril, Polymethylmesacrylat, Polysulfon, Polycarbonat, Polyamid, Polyethylen, Polypropylen, Ethylenvinylalkohol, Chitin oder Chitosan.
Die Porengrößen sind abhängig von den Größen der Zellen oder der Kultivierungsflüssigkeit, aber sie sind ausreichend, um die Kultivierungsflüssigkeit und das Gas durchzulassen und die Zellen nicht durchzulassen, vorzugsweise nicht mehr als 0,2 u. Wenn andere Additive als die Kultivierungsflüssigkeit zugegeben werden, sollten die Porengrößen so ausgewählt werden, daß die Größen der Additive berücksichtigt werden (wenn die Additive in den Behälter aus halbdurchlässigem Film zugegeben werden, sollte die Porengröße so gewählt sein, daß sie die Additive nicht durchlas sen und wenn sie der Kultivierungsflüssigkeit außerhalb des Films zugegeben werden, wird die Porengröße so gewählt, daß sie diese durchläßt, nicht jedoch von den Zellen erhaltene nützliche Produkte).
Vorzugsweise umgibt eine siebartige Umhüllung den Behälter aus halbdurchlässigem Film und die Kommunikationsmündung kann bei Bedarf mehrfach ausgeführt werden.
Beim Kultivieren der Zellen in dem Behälter wird der Behälter gedreht oder geschwenkt, um diese langsam in Bewegung zu versetzen, so daß die innere Flüssigkeit und die äußere Flüssigkeit durch den Film miteinander in wirksamen Kontakt treten, und verhindert wird, daß die Zellen an dessen innerer Wand anhaften und die Wirksamkeit der Ausbeute der Zellen vergrößert werden kann. Die Bewegungseinrichtung umfaßt eine Befestigungsplatte zum Tragen des Kultivierungsbehälters und einen Dreh- oder Schwenkmechanismus für die Befestigungsplatte. Das Drehsystem ist nicht auf spezielle Winkel beschränkt, jedoch können die gewünschten Ergebnisse bei beliebigen Winkeln von 300, 450 und 600 erhalten werden.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Skizze eines Kultivierungsbehälters nach der vorliegenden Erfindung;
Fig. 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Kultivierungsbehälters;
Fig. 3 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Kultivierungsbehälters nach der Erfindung, wobei (A) einer in zerlegtem Zustand ist und (B) eine perspektivische Ansicht von einem zusammengesetzten im halben Querschnitt zeigt;
Fig. 4 ist eine perspektivische Ansicht eines weiteren Ausführungsbeispiels des Behälters zur Verwendung bei dieser Erfindung;
Fig. 5 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel des Behälters, wobei (A) eine Skizze desselben ist und (B) eine Skizze eines Beutels aus halbdurchlässigem Film ist;
Fig. 6 ist eine perspektivische Gesamtansicht einer Drehzellenkultivierungseinrichtung, bei der der erfindungsgemäße Behälter verwendet werden wird;
Fig. 7 ist eine Ansicht, die eine Befestigungseinrichtung für den Behälter in der Einrichtung von Fig. 6 im zerlegten Zustand zeigt;
Fig. 8 ist eine Skizze zur Erläuterung eines Antriebsmechanismus für die Einrichtung von Fig. 6;
Fig. 9 ist eine Seitenansicht, die ein Bett zur Aufnahme der Drehzellenkultivierungseinrichtung zeigt;
Fig. 10 ist eine erläuternde Ansicht für die Betätigung einer Schwenkplatte zum Kultivieren der Zellen durch Schwenken des Behälters;
Fig. 11 ist eine Seitenansicht von Fig. 10;
Fig. 12 ist eine grafische Darstellung, die die zeitliche Änderung zwischen einem Zentrum O und Höhen von A, B, C, D zeigt;
Fig. 13 ist eine Skizze der Schwenkeinrichtung zum Bewegen der Schwenkplatte mit Perioden gemäß Fig. 12;
Fig. 14 bis 17 sind Skizzen zur Erläuterung der Betätigung der Schwenkplatte entsprechend den Perioden gemäß Fig. 12;
Fig. 18 bis 21 sind Skizzen der Änderungen bei der Betätigung der Schwenkeinrichtung in Ansprache auf Bewegungen der Schwenkplatte gemäß Fig. 14 bis 17, wobei (A) eine rückwärtige Seitenansicht von Fig. 13 und (B) eine Ansicht der rechten Seite von (A) ist;
Fig. 22 ist eine Skizze der Schwenkeinrichtung zur Betätigung des Kultivierungsbehälters mit einer anderen Periode;
Fig. 23 ist eine Ansicht der rechten Seite von Fig. 22;
Fig. 24 ist eine grafische Darstellung, die die zeitliche Änderung zwischen einem Zentrum O und Höhen A, B, C, D der durch die Einrichtung gemäß Fig. 22 und 23 betätigten Schwenkplatte zeigt;
Fig. 25 ist eine Skizze, welche die Kultivierung darstellt, wobei die Temperatur kontrolliert wird, wenn die Schwenkkultivierungseinrichtung in einer abgedichteten Kammer angeordnet ist;
Fig. 26 bis 33 sind Skizzen zur Erläuterung von Sequenzen beim Betreiben der erfindungsgemäßen Kultivierungseinrichtung;
Fig. 26 ist eine Skizze zur Erläuterung des Waschens des Kultivierungsbehälters;
Fig. 27 ist eine Skizze, die das Abdichten eines Verbindungsschlauchs zeigt, nachdem der äußere Beutel gewaschen worden ist;
Fig. 28 ist eine Skizze, die die Verbindung einer Zugabeeinrichtung für die schwebenden Zellen in den inneren Beutel zeigt;
Fig. 29 ist ein Adapter zur Verwendung bei der Erfindung;
Fig. 30 ist eine Skizze, die eine Verbindung des inneren Beutels mit einer Zugabeeinrichtung für sterilisierte Luft zeigt;
Fig. 31 ist eine Skizze einer Verbindung des äußeren Beutels mit einem Kultivierungsbeutel;
Fig. 32 ist eine perspektivische Ansicht, die den an der Schwenkkultivierungseinrichtung befestigten Behälter zeigt;
Fig. 33 ist eine Skizze einer Verbindung eines Zellgewinnungsbeutels mit dem inneren Beutel;
Fig. 34 ist eine grafische Darstellung, die die aktivierten Killerzellen von LAK-Zellen bei dem erfindungsgemäßen und einem herkömmlichen Verfahren zeigt;
Fig. 35 ist eine grafische Darstellung, die die Wachtumskurven von Raji-Zellen zeigt; und
Fig. 36 ist eine grafische Darstellung, die die Wachstumskurven von Hybridoma der Maus zeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSBEISPIELE DER ERFINDUNG

Fig. 1 ist eine skizzierte Ansicht, die ein Beispiel des erfindungsgemäßen Kultivierungsbehälters zeigt. Das Bezugszeichen 1 bedeutet einen Dichtungsbeutel, der aus einem weichen oder halbharten Kunststoff hergestellt ist, welcher mit einer einzigen Schicht oder einem Laminat aus Vinylchlorid, Ethylenacetatvinylcopolymer, Polypropylen, Polyethylen, Polyester, Teflon oder Polyamid behandelt ist, und es sind Verbindungsmündungen 2 vorgesehen zum Einfüllen der Kultivierungsflüssigkeit und des Gases an oberen und unteren Teilen. Eine einmal verwendete Mündung wird abgedichtet, um eine Wiederverwendung nicht zu gestatten.
Innerhalb des äußeren Beutels 1 ist ein Beutel 3 aus halbdurchlässigem Film vorgesehen und ein Teil 5 ist außerhalb des Beutels 3 ausgebildet, um die Kultivierungsflüssigkeit zu halten. Von dem oberen Teil des äußeren Beutels 1 springt eine Verbindungsmündung 4 zum Einfüllen der Zellen vor. Der Beutel 3 aus dem halbdurchlässigen Film ist von einer Schutznetzhülle 6 umgeben.
Der äußere Beutel 1 ist durch Verschweißen von zwei Lagen Kunststoff an ihrem Umfang gebildet. Die Kunststoffröhren als die Verbindungsmündungen 2, 4 sind mit dem Beutel 1 so verbunden, daß sie dessen oberes und unteres Ende abdichten und diese können mit Mündungen versehen sein (entsprechend einer Bluttransfusionsmündung zur Verwendung mit einem Blutbeutel). Die Schutzhülle 6 ist als Beutel ausgebildet und enthält den Beutel 3 aus halbdurchlässigem Film darin.
Die Kunststofflage ist an vier Ecken mit Löchern 7 versehen zur Befestigung, wenn das Drehen oder Schwenken durchgeführt wird.
Fig. 2 zeigt einen Kultivierungsbehälter, der Fig. 1 folgend zum Versuch hergestellt wurde, wobei die gleichen Teile mit den gleichen Bezugszeichen versehen wurden. Ein Unterschied gegenüber Fig. 1 ist, daß die mit dem Inneren des äußeren Beutels 1 in Verbindung stehenden Mündungen 2, 2 am unteren Teil des Beutels mehrfach vorgesehen sind. Die Verbindungsmündungen 2, 2 sind mit Schutzhüllen 2a abgedichtet.
Fig. 3 zeigt ein weiteres Beispiel des Kultivierungsbehälters, der dadurch gebildet ist, daß zwei Lagen des halbdurchlässigen Films 11, 11 und zwei Lagen der äußeren Schutznetzhüllen 12, 12 zwischen den äußeren Kunststofflagen 10, 10 gehalten sind und die Verbindungsmündungen 13, 14 zwischen den Lagen 11, 11 und zwischen der äußeren Lage 10 und der Schutzhülle 12 angebracht und am Umfang verschweißt sind. Somit ist der Beutel aus dem halbdurchlässigen Film von einem aus den Lagen 10, 10 gebildeten Beutel eingeschlossen, wobei ein Teil 15 zum Enthalten der Kulturflüssigkeit und des Gases außerhalb des Beutels ausgebildet ist.
Fig. 4 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung, wobei ein äußeres Dichtungsgehäuse 20 zylindrisch ist und ein halbdurchlässiger Film 21 in Form eines am unteren Ende abgedichteten Rohres darin aufgenommen ist und eine netzartige Schutzhülle 22 den äußeren Teil des Films 21 umgibt.
Auf der Außenseite des Films 22 ist eine Behälter 23 für Kulturmedium und Gas ausgebildet und eine Verbindungsmündung 24 ist zur Verbindung mit dem Behälter 23 an einer Seite des Dichtungsgehäuses 20 vorgesehen und eine Verbindungsmündung 25 ist am oberen Teil des Behälters 20 zur Verbindung mit dem Inneren des Films 21 vorgesehen.
Fig. 5 (A) zeigt eine Einrichtung zur Reduzierung dieses erfindungsgemäßen Verfahrens im Sinne einer Ausführung auf die einfachste Weise, wobei die Zellen und das Medium in einem Beutel 34 eingeschlossen sind, so daß diese in der Kultivierungsflüssigkeit 32 in dem Behälter 30 in Form einer Glas- oder Kunststoffflasche treiben, deren Mündung mit einem Stopfen 31 abgedichtet ist. Der Beutel 34 ist, wie in Fig. 5 (B) gezeigt, am unteren Teil 35 in Form eines Röhrchens abgedichtet und mit einem Gummistopfen 36 versehen, an den eine Zugabemündung 37 angeschlossen ist.
Fig. 6 ist eine perspektivische Gesamtansicht, die ein Beispiel einer rotierenden Zellkultivierungseinrichtung (Bewegungseinrichtung) zur Verwendung für die Bewegung der treibenden Zellen und des Mediums zeigt. Das Bezugszeichen 40 ist eine Drehplatte und 41 ist ein Gehäuse, worin ein Drehantriebsmechanismus für die Drehplatte 40 untergebracht ist.
Die Drehplatte 40 ist in geeigneter Weise gegenüber der Horizontalebene geneigt und an den vier Ecken mit Befestigungsmitteln 60 für den Kultivierungsbeutel versehen. Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist der Neigungswinkel 450
Fig. 7 zeigt den Aufbau der Befestigungsmittel 60 im Detail. Die Drehplatte 40 ist an ihren vier Ecken mit Stifthaltelöchern 40a versehen, wobei diese Löcher zum Zentrum der Drehplatte 40 hin ausgedehnt sind. Das Loch 40a ist mit einer Anzahl von bogenförmigen Ausschnitten 40b versehen, um den Stift 60 in mehreren Stufen zu halten.
In das Loch 40a ist der Stift 61 mit seinem unteren Teil 61b von der oberen Seite der Drehplatte 40 her eingesetzt und eine Befestigungsschraube 62 zieht diesen fest und der Stift 61 ist an der Drehplatte 40 befestigt. Ein Flansch 61a ist um den unteren Bereich des Stiftes 61 angeordnet und ein Stiftbereich 61b unterhalb des Flansches 61a hat einen Durchmesser, der in einen Ausschnitt 40b des Stifthaltelochs 40a paßt und ist mit einem (nicht gezeigten) Gewindeloch darin versehen.
Die Befestigungsschraube 62 ist auch mit einem Flansch 62a versehen und ein am Ende der Schraube 62 ausgebildeter Bereich 62b hat einen solchen Durchmesser, daß er in den Ausschnitt 40b des Lochs 40a paßt. Weiterhin ist ein Gewinde 62c in ein Loch des unteren Stiftes 61b eingeschraubt.
Die Schraube 62 ist mit dem Stift 61 verschraubt und die Flansche 61a, 62a sind am Umfang des Lochs 40a festgelegt, so daß der Stift 61 an der Drehplatte 40 befestigt ist.
Wenn die Lage des Stiftes 61 eingestellt wird, wird die Schraube 62 gelöst und der Stift 61 längs des Loches 40a bewegt und der untere Stift 61 wird zu dem gewünschten Ausschnitt 40b bewegt und der Stift 61 wieder mittels der Schraube 62 an der Drehplatte 40 befestigt.
Auf dem Stift 61 ist ein mit einer Befestigungsschraube 63a versehener zylindrischer Anschlagring 63 verschiebbar angebracht, und wenn die Schraube 63a festgezogen wird, kann der Anschlagring 63 an jedem Teil der Länge des Stifts 61 angebracht werden.
Fig. 8 ist eine skizzierte Ansicht, die einen Drehmechanismus für die Drehplatte 40 zeigt. In einem Gehäuse 41 ist eine Platte 49 zur Befestigung des Antriebsteils angebracht, die in geeigneter Weise geneigt ist (45º bei diesem Ausführungsbeispiel). Die Befestigungsplatte 49 ist versehen mit einem Motor 48, einem Geschwindigkeitsreduktionsgetriebekopf 42 und einem Lager 46. Das Bezugszeichen 43 ist eine Platte zum Tragen des Motors 48.
Zwischen dem Getriebekopf 42 und dem Lager 46 ist eine Welle mittels einer Kupplung 45 verbunden zu sehen. Eine Drehwelle 44 ist durch das Lager 46 drehbar gelagert und hat daran ein Teil 47 zum Tragen der Drehplatte 40 mittels Bolzen befestigt.
Eine Motorsteuereinheit 50 ist darin mit einem Mechanismus zur Steuerung der Drehung des Motors 48 mit einer bestimmten Geschwindigkeit untergebracht. Bei diesem Ausführungsbeispiel kann die Drehgeschwindigkeit der Drehplatte 40 innerhalb von 0,5 bis 10 U/min bestimmt werden.
Der Aufbau der Befestigungseinrichtung 60 für den Kultivierungsbeutel der Erfindung und der Drehmechanismus für die Drehplatte 40 sind nicht auf die gezeigten beschränkt, sondern sie können entsprechend den Erfordernissen verändert werden.
Wie in Fig. 9 gezeigt, ist die Drehzellenkultivierungseinrichtung in entsprechender Weise auf einer Vorrichtung 51 so getragen, daß der Winkel in geeigneter Weise für die zu kultivierenden Zellen eingestellt werden kann. Die Bewegungseinrichtung dreht die Kultivierungseinrichtung, aber sie kann sie lateral und longitudinal bewegen.
Die Fig. 10 und 11 erläutern den schwenkbetrieb.
Das Bezugszeichen 70 bezeichnet eine schwenkplatte zum Halten der Zellkultivierungseinrichtung, wobei ein Punkt O ein Zentrum der Schwenkplatte ist, A und C Punkte auf der durch das Zentrum O verlaufenden X-Achse sind und B und D Punkte auf der durch dasselbe verlaufenden Y-Achse sind.
Die Schwenkplatte 70 bewegt die Kultivierungseinrichtung lateral und longitudinal um die X- und Y-Achsen.
Fig. 11 ist eine Seitenansicht der Platte 70, die den Zustand bei der Bewegung der Platte 70 um die Y-Achse zeigt. Die Punkte A und C der Platte 70 werden vertikal in bezug auf die Höhe hO des Zentrums O bewegt. Die maximale Auslenkung der Bewegung von A und C ist mit +hA, -hA und +hC, -hC ausgedrückt ("+" ist der Maximalwert in einer Richtung höher als hO, und "-" ist der Maximalwert in einer Richtung niedriger als hO). Beim Bewegen der Platte 70 um die X-Achse sind die Auslenkungen der Bewegung von B und D mit +hB, -hB und +hD, -hD bezeichnet.

Bewegungssystem I

Es wird Bezug genommen auf ein erstes Ausführungsbeispiel der Schwenkplatte 70. Während sich die Platte 70 einmal vertikal um die X-Achse bewegt (tatsächlich bewegt sich die X-Achse leicht auf einem Kreis, vgl. Fig. 12), bewegt sich die Platte 70 einmal vertikal um die Y-Achse (tatsächlich bewegt sich auch die Y-Achse leicht auf einem Kreis).
Es sei Bezug genommen auf einen Fall, daß die vertikalen und gleichzeitigen Bewegungen der Platte 70 um die X- und Y-Achsen periodisch wiederholt werden. Die Zyklen von hO und hA, hB, hC, hD werden ausgedrückt mit einer Formel (1).
1 hA = cos ω t
2 hB = cos (ω t - π/2)
3 hC = cos (ω t - π)
4 hD = cos (ω t - 3/2π)
5 hO = 0 (1)
Hierbei ist h die Höhe, t die Zeit und ω die Winkelgeschwindigkeit. Die Winkelgeschwindigkeit wird durch die folgende Formel ausgedrückt.
ω = 2 π f (f ist die Schwingungsanzahl).
Dabei werden die positionsmäßigen Beziehungen von hO und hA, hB, hC, hD periodisch geändert, wie in Formel (2) gezeigt.
6 hA > hO, hC < hO, hB = hO, hD = hO
7 hA = hO, hC = hO, hB > hO, hD < hO
8 hA < hO, hC > hO, hB = hO, hD = hO
9 hA = hO, hC = hO, hB < hO, hD > hO (2)
6, 7, 8, 9 der Formel entsprechen t0, t1, t2, t3, t4 von Fig. 12.
Fig. 12 zeigt die periodischen Änderungen von hA, hB, hC, hD mit der Zeit. Es ist ersichtlich, daß die Vertikalbewegungen von A, B, C, D der Platte 70 Phasenbeziehungen haben. Die einmalige vertikale Bewegung der Platte 70, die an dem Beispiel von B in Fig. 12 erläutert werden soll, bedeutet daß die Höhe hB des Punktes B sich vertikal in einem Zyklus von hO → +hB → hO → -hB → hO vertikal bewegt.
Die Fig. 14 bis 17 zeigen die Bewegungen der Schwenkplatte 70 auf diesen Schwenkzyklus folgend.
(a) In Fig. 14 befindet sich der Punkt A auf der X- Achse auf der Höhe von +hA und der Punkt C ist auf der Höhe von -hC. Die Punkte B und D auf der Y-Achse haben dieselbe Höhe wie hO (zur Zeit t1 in Fig. 12).
Die Platte 70 beginnt sich um die Y-Achse zu bewegen und die Punkte A, C beginnen sich auf die gleiche Höhe wie hO zu bewegen und gleichzeitig beginnt B sich auf +hB um die X-Achse zu bewegen und D beginnt sich zu -hD zu bewegen (zur Zeit t1+Δt in Fig. 12).
(b) Nachfolgend, wie in Fig. 15 gezeigt, befindet sich B in der Höhe von +hB und D ist auf der Höhe von -hD, und A und C haben die gleiche Höhe von hO (zur Zeit t2 in derselben).
Die Schwenkplatte 70 beginnt sich um die X-Achse zu bewegen und B, D bewegen sich auf die gleich Höhe hO und gleichzeitig A auf -hA und C auf -hC (zur Zeit t2+Δt in derselben).
(c) Wie in Fig. 16 gezeigt, kommt der Punkt C auf die Höhe von hC, der Punkt A auf -hA und B, D auf die gleiche Höhe von hO (zur Zeit t3 in derselben).
Die Platte 70 beginnt sich um die Y-Achse zu drehen und allmählich kommen die Punkte A, C auf die Höhe von hO und D auf +hD und B auf -hB.
(d) Wie in Fig. 17 gezeigt, erhält der Punkt D die Höhe von +hD und A, C von hO (Zeit t4).
Danach gelangt B, D zu hO und der Punkt A zu +hA und C zu -hC (Zeit t4+Δt) und sie kehren wiederum zu der Bedingung (a) zurück und wiederholen die Bedingungen (a) bis (d).
Fig. 13 zeigt ein Beispiel einer Einrichtung zum Bewegen der den Zellkulturbehälter tragenden Schwenkplatte gemäß dem oben beschriebenen Prinzip. 70 ist die Schwenkplatte und 71 ist der Kulturbehälter. Befestigungsmittel für den Behälter 71 sind die gleichen wie bei Fig. 7. Das Zentrum O der Platte 70 wird mittels einer Verbindungskugel 79a an einem Ende einer von dem Gehäuse 74 getragenen Säule 78 um einen freien Winkel geschwenkt. Das Bezugszeichen 73 ist ein Antriebsmechanismus der Schwenkplatte 70. In dem Gehäuse 74 ist ein Motor 75 und Getrieberäder 76a, 76b und 76c untergebracht. Diese Getrieberäder greifen ineinander ein, wobei das Getrieberad 76b über eine Kupplung 77 mit dem Motor 75 gekoppelt ist. Ein weiteres Getrieberad 76a ist fest mit einem Zwischenelement 80 verbunden und das Getrieberad 76c ist fest mit einem Zwischenelement 81 verbunden. Das Zwischenelement 80 ist mit einem Ende einer Schubstange 82 gelenkig verbunden, deren anderes Ende mittels einer Verbindungskugel 79b schwenkbar in der X-Achse (oder Y-Achse) in der Platte 70 verbunden ist. Ähnlich ist das Zwischenelement 81 gelenkig mit einem Ende einer Schubstange 83 verbunden, deren anderes Ende mittels einer Verbindungskugel 79c gelenkig in der Y-Achse (oder X-Achse) in der Platte 70 verbunden ist.
Die Betätigung der in Fig. 13 gezeigten Schwenkeinrichtung soll im Vergleich mit dem Schwenken der Platte 70 unter Bezugnahme auf die Fig. 18 bis 21 erläutert werden.
Die Änderungen der Schwenkeinrichtung in den Fig. 18 bis 21 entsprechen denen der Fig. 14 bis 17, wobei (A) die Rückseite von Fig. 13 skizziert und (B) Ansichten der rechten Seite (A) sind.
(a') Eine Verbindung 85 zwischen dem Zwischenelement 80 und der Schubstange 82 ist in der Position (P1), so daß die Schubstange 82 den Punkt A der Platte 70 aufwärts auf +hA bewegt und der Punkt C abwärts zu -hC bewegt wird. Da die Verbindung 86 (Gelenkbereich) zwischen dem Zwischenelement 81 und der Schubstange 83 sich auf der Position (Q4) befindet, befinden sich die Punkte B, D der Platte 70 zu dieser Zeit auf der gleichen Position wie das Zentrum O (Fig. 18).
(b') Wenn sich die Zwischenelemente 80, 81 um 450 im Gegenuhrzeigersinn drehen, bewegt sich die Verbindung 85 zwischen dem Zwischenelement 80 und der Schubstange 83 in die Position (P2) und die Punkte A, C der Platte 70 sind in der gleichen Höhe wie der Punkt O.
Weil sich die Verbindung 86 zu dieser Zeit in der Position (Q1) befindet, wird der Punkt B der Platte 70 nach oben auf die Höhe +hB geschoben und der Punkt D wird abwärts auf die Höhe -hD bewegt (Fig. 19).
(c') Wenn die Zwischenelemente 80, 81 sich um weitere 450 drehen, bewegt sich die Verbindung 85 in die Position (P3), so daß der Punkt A der Platte 70 nach unten auf die Höhe von -hA gezogen wird und der Punkt C aufwärts auf die Höhe von +hC bewegt wird. Da die Verbindung 86 sich zu dieser Zeit auf der Position (Q2) befindet, haben die Punkte B, D der Platte 70 die gleiche Höhe wie der Punkt O (Fig. 20).
(d') Wenn die Zwischenelemente 80, 81 um 45º im Gegenuhrzeigersinn gedreht werden, ist die Verbindung 85 an der Position von (P4), so daß die Punkte A, C der Platte 70 in der gleichen Position wie der Punkt O sind.
Weil die Verbindung 86 sich auf der Position von (Q3) befindet, wird dann der Punkt B der Platte 70 nach unten auf die Höhe von -hB bewegt und der Punkt D nach oben auf die Höhe von +hD bewegt (Fig. 21).
Weiterhin, wenn die Zwischenelemente 80, 81 um 45º im Gegenuhrzeigersinn gedreht werden, wird der Zustand auf den oben genannten Zustand (a') zurückgeführt und die Zustände (a') bis (d') werden wiederholt.

Bewegungssystem II

Weiterhin soll bezug genommen werden auf den Fall, daß die Schwenkplatte n mal unregelmäßig um die X- und Y-Achsen vertikal betätigt wird, um es dadurch zu gestatten, die Beziehung zwischen hO, und hA, hB, hC, hD auszuwählen.
Fig. 22 ist eine Frontansicht der Schwenkplatte zur Ausführung des vorliegenden Beispiels und Fig. 23 ist eine Seitenansicht von Fig. 22. Das Bezugszeichen 70 ist die Schwenkplatte, deren Zentrum O mittels einer Verbindungskugel 90a um einen freien Winkel gegenüber einer Säule 91a schwenkbar ist. 91, 92 sind Schubstangen für die Platte 70, wobei über Verbindungskugeln 90b, 90c die erstere auf der X-Achse geschwenkt und die letztere auf der Y-Achse geschwenkt wird.
Das andere Ende der Schubstange 91 ist gelenkig an einem Ende einer Zahnstange 93 befestigt und das andere Ende der Schubstange 92 ist gelenkig an einer Zahnstange 94 befestigt. Die Zahnstange 93 wird mittels eines durch einen Motor 95 gedrehten Ritzels 96 bewegt. Die Zahnstange 94 wird mittels eines durch einen Motor 97 gedrehten Ritzels 98 bewegt.
Das Bezugszeichen 99 ist eine Einrichtung zum Steuern der Drehzahl und der Drehrichtung der Motoren 95, 97. Durch die Steuereinrichtung können die Motoren 95, 97 unabhängig oder gleichzeitig angetrieben werden.
(a'') Zuerst sind die Höhen hA, hB, hC, hD der Punkte A, B, C, D der Schwenkplatte 70 auf der gleichen Höhe wie hO des Punktes O (Zeit t1 in Fig. 24).
Wenn die Zahnstange 93 durch Antrieb des Motors 95 vorgeschoben wird, schiebt die Schubstange 91 die Platte 70 nach oben. Dadurch beginnt sich die Platte 70 um die Y- Achse zu drehen und der Punkt A bewegt sich vertikal auf +hA und der Punkt C auf -hC ( Zeit t1+Δt in Fig. 24).
(b'') Nachdem der Punkt A auf die Höhe von +hA kommt und der Punkt C auf die Höhe von -hC (Zeit t2 in Fig. 24), wird die Zahnstange 93 durch Umkehrung des Motors 95 zurückbewegt und die Schubstange 91 zieht die Platte 70 nach unten und die Punkte A, C beginnen allmählich sich auf die gleiche Höhe wie hO zu bewegen (Zeit t2+Δt in Fig. 24). Dann haben die Punkte B, D stets die gleiche Höhe wie hO bis zu der Zeit t1 bis t2+Δt.
(c'') Nachdem die Punkte A, B, C, D wiederum auf die gleiche Höhe wie hO zurückkehren (Zeit t3 in Fig. 24) wird die Zahnstange 94 durch den Motor 97 vorgeschoben und die Schubstange 92 schiebt die Platte 70. Dadurch beginnt die Platte 70 sich um die X-Achse zu drehen und der Punkt B beginnt sich allmählich zu +hB zu bewegen und der Punkt D zu -hD (Zeit t3+Δt in Fig. 24).
(d'') Nachdem der Punkt B nach +hB kommt und der Punkt D nach -hD (Zeit t4 in Fig. 24) bewegt sich die Zahnstange 94 durch Umkehrung des Motors 97 zurück und die Schubstange 92 zieht die Platte 70 nach unten. Daher beginnt sich die Platte 70 um die X-Achse zu drehen und die Punkte B, D bewegen sich allmählich vertikal auf die gleiche Höhe wie hO (Zeit t4+Δt in Fig. 24). Zu dieser Zeit haben die Punkte A, C die gleiche Höhe wie hO bis zu t3 bis t4+Δt.
(e'') Die Punkte A, B, C, D kehren zu der gleichen Höhe wie hO zurück und führen die Bewegungen als Wiederholung der folgenden Betätigungen durch.
Zur Zeit t5 und t5 + Δt die Betätigung von (c''),
zur Zeit t6 und t6 + Δt die Betätigung von (d''),
zur Zeit t7 und t7 + Δt die Betätigung von (a''), und
zur Zeit t8 und t8 + Δt die Betätigung von (b'').
Somit bewegt sich die Platte 70 bei diesem Beispiel während sie abwechselnd die vertikalen Bewegungen um das 1/2 fache um die X-Achse und das 1/2 fache um die Y-Achse wiederholt. Gemäß der Einrichtung von Fig. 22 und 23 kann das oben erläuterte Bewegungssystem I durchgeführt werden.
Im folgenden soll bezug genommen werden auf das Schwenken derselben.
(f'') Zuerst sind die Punkte A, B, C, D auf der gleichen Höhe wie hO (Zeit t9).
Wenn der Motor 97 rückwärts gedreht wird, um die Zahnstange 94 zurückzubewegen, wird der Punkt B der Platte 70 um die X-Achse in Richtung auf -hB bewegt und der Punkt D in Richtung auf +hD (Zeit t9+Δt in Fig. 24).
(g'') Nachdem der Punkt B die Position von -hB annimmt und der Punkt D +hD annimmt (Zeit t10 in derselben), wird der Motor 95 angetrieben und die Zahnstange 93 vorgeschoben, um die Platte 70 nach oben zu schieben, und die Platte 70 wird durch den Motor 97 über die Schubstange 92 nach unten gezogen. Von der Zeit t10+Δt bis zur Zeit t14 kann die Platte in der gleichen Weise geschwenkt werden wie sie von der Zeit t4+Δt bis zur Zeit t8 geschwenkt wird.
Weiterhin ist es bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel möglich, durch normale oder umgekehrte Drehung des Motors 95 die Schwenkplatte 70 gleichzeitig über die Schubstangen 91, 92 nach oben zu schieben oder nach unten zu ziehen.
Fig. 25 zeigt, daß die Schwenkeinrichtung 70 in Fig. 13 in einem abgedichteten Behälter 100 untergebracht ist, wobei die Temperatur darin so kontrolliert wird, daß sie für die Zellkultivierungsbedingungen optimal ist.
Weiterhin wird Bezug genommen auf eine Sequenz zum Kultivieren der Zellen mittels der in Fig. 2 gezeigten Kultureinrichtung und der Dreheinrichtung von Fig. 6.
Ein bei diesem Beispiel verwendeter äußerer Beutel des Kulturbehälters ist aus Polyvinylchlorid hergestellt. Die Dicke der Lage ist 0,4 mm und das Fassungsvermögen ist insgesamt 4000 ml, wobei die äußere Flüssigkeit 2000 ml beträgt und die Luft ungefähr 2000 ml beträgt. Der innere Beutel 3 ist aus regenerierter Zellulose hergestellt. Die Filmdicke ist 20 um, das Molekulargewicht 10000 und das Fassungsvermögen ist insgesamt 1000 ml, wobei die innere Flüssigkeit 500 ml beträgt und die Luft ungefähr 500 ml beträgt. Bei dem vorstehenden Betriebsbeispiel soll die Erläuterung unter Bezugnahme auf die Kultivierung von menschlichen Lymphozyten erfolgen. Die Erfindung ist auch insbesondere verfügbar zur hochdichten Kultivierung einer Zellinie, die von dem Blut abgeleitet ist wie Hybridoma der Maus.

(I) Waschen des Kulturbeutels

Der innere Beutel 3 ist gegen Austrocknung mit Glyzerin beschichtet. So für das Waschen ein physiologische Salzlösung notwendig.
Wie in Fig. 26 gezeigt, ist ein Verbindungsschlauch 111 an einem Ende mit einem die physiologische Salzlösung enthaltenden Beutel 110 verbunden und am anderen Ende mit einer Mündung 4 (Verbindungsmündung) zur Handhabung der inneren Flüssigkeit verbunden. Der Verbindungsschlauch 111 verfügt über Flüssigkeitsführungsnadeln 112, 113 und eine Klemme 114 im mittleren Teil. Die Klemme 114 ist zuerst geschlossen und wird geöffnet nachdem die Handhabungsmündung und der Beutel 110 verbunden worden sind, um dadurch die physiologische Salzlösung von ungefähr 500 ml von oben einzugießen.
Die Klemme 114 wird geschlossen und der Verbindungsschlauch 111 wird von dem Beutel 110 weggenommen, wonach zwei Teile um die Handhabungsöffnung 4 verknotet und überflüssige Teile abgeschnitten werden.
Der innere Beutel wird bezüglich eines Lecks überprüft und ungefähr 2000 ml physiologische Salzlösung werden in der gleichen Weise wie oben beschrieben in den äußeren Beutel 1 gegeben. Fig. 27 zeigt, daß nachdem die Salzlösung in den äußeren Beutel 1 gegeben worden ist, ein Verbindungsschlauch 111a bei 115, 115a abgedichtet wird. Für die äußere Handhabungsöffnung 2 (Verbindungsöffnung) wird zuerst eine ohne Schutzabdeckung 2a verwendet.
Der Kulturbeutel ist auf einer Drehbewegungseinrichtung wie der in Fig. 6 gezeigten vorgesehen und wird mit vier bis fünf U/min für ungefähr 15 Minuten gedreht.
(II.) Das Eingießen von in einem Medium von suspendierten Lymphozyten (innere Flüssigkeit) und Kulturmedium (äußere Flüssigkeit).

(1) Ausgießen der Waschflüssigkeit

Der Kulturbeutel wird von der Drehbewegungseinrichtung entfernt und der Verbindungsschlauch 111a wird von der Handhabungsmündung 2 für die äußere Flüssigkeit entfernt und ein neuer Verbindungsschlauch (Klemme geschlossen) angeschlossen. Die Klemme des Verbindungsschlauchs wird geöffnet und die Waschflüssigkeit in dem äußeren Beutel 1 wird aufgrund des hydrostatischen Drucks entleert, wonach der Verbindungsschlauch zum Abdichten zweimal festgeknotet wird und überflüssige Teile abgeschnitten werden.
Danach wird der innere Beutel 3 auf ein Leck überprüft und die Waschflüssigkeit in dem inneren Beutel 3 wird in der gleichen Weise wie oben beschrieben entleert und der Verbindungsschlauch abgedichtet und überflüssige Teile abgeschnitten.

(2) Einfüllen der inneren Flüssigkeit

Die in dem Medium suspendierten Lymphozyten werden in einer sauberen Bank in den inneren Beutel 3 gefüllt.
Die in dem Medium suspendierten Lymphozyten werden in der folgenden Prozedur eingefüllt.
Der Verbindungsschlauch 111 wird von der Handhabungsmündung 4 für die innere Flüssigkeit entfernt und ein Instrument 120 zum Eingießen von Flüssigkeit mit suspendierten Zellen wird wie in Fig. 28 gezeigt in einer solchen Weise angeschlossen, daß ein Zuführungsschlauch 122 mit einem Trichter 121 verbunden ist, wobei an dem Schlauch 122 eine Nadel 123 befestigt ist.
Nachdem die Nadel 123 in die Mündung 4 eingestochen worden ist, werden die in dem Medium suspendierten Lymphozyten aufgrund der Schwerkraft in den inneren Beutel 3 eingegossen.
Nach dem Eingießen des Mediums mit den suspendierten Lymphozyten wird das Eingießinstrument 120 weggenommen und ein in Fig. 29 dargestellter Adapter 130 angeschlossen, welcher durch eine Kappe 132 gebildet ist, die einen Gummistopfen an einem hinteren Bereich einer Flüssigkeitszuführungsnadel 131 aufweist.
Der Adapter 130 ist mit einem Instrument 140 zur Zuführung von sterilisierter Luft verbunden, wie in Fig. 30 gezeigt, welches durch Verbindung der Reihe nach von einer Einwegspritze 144, einem Dreiwegestopphahn 143, einem Einwegmembranfilter 142 und einer Einwegnadel 141 gebildet ist.
Nach dem Einstechen der Einwegnadel 141 in den Gummistopfen eines Arbeitsadapters 130 wird durch die Kolbenwirkung der Spitze 144 und Umschalten des Dreiwegestopphahns 143 sterilisierte Luft zugeführt, so daß der inneren Beutel 3 unter Druck gesetzt wird. Die Menge der sterilisierten Luft ist nicht besonders bestimmt. Nach dem Zuführen der sterilisierten Luft wird das Instrument 140 entfernt.

(3) Eingießen der äußeren Flüssigkeit

Wie in Fig. 31 gezeigt, wird ein vorher vorbereiteter Beutel 150 mit Kulturmedium mit einer Nadel 112b eines Verbindungsschlauchs 111b des gleichen Aufbaus wie oben beschrieben verbunden und der Verbindungsschlauch von der äußeren Handhabungsmündung 2 des äußeren Beutels entfernt und die andere Nadel 113b mit der Öffnung 2 verbunden. Danach wird die Klemme 114b geöffnet und die äußere Flüssigkeit wird aufgrund der Schwerkraft eingegossen.
Dann wird der Verbindungsschlauch 111d von der Mündung 2 weggenommen und mit einem Adapter 130 des gleichen Aufbaus wie oben beschrieben verbunden.
Das sterilisierte Filter 142 und die Einwegnadel 141 des Instruments 140 für die Zuführung der sterilisierten Luft werden gegen neue ausgetauscht und dem äußeren Beutel 1 in der gleichen Weise wie dem inneren Beutel 3 sterilisierte Luft zugeführt, um den äußeren Beutel 1 unter Druck zu setzen. Die Menge der sterilisierten Luft ist wie gesagt nicht bestimmt.

(III) Beginn der Kultivierung

Eine Drehbewegungseinrichtung wie in Fig. 6 gezeigt wird in einer auf 37ºC eingestellten thermostatischen Kammer oder einem Inkubator angebracht und der Kulturbeutel wird ausgerichtet wie in Fig. 32 gezeigt.
Der Kulturbeutel wird an der Drehplatte 40 angebracht durch Lösen der Schraube 63a in der Befestigungseinrichtung 60, um den Anschlagring 63 von dem Stift 61 zu entfernen, Anbringung jedes der Befestigungslöcher 7 auf dem jeweiligen Stift 61, Einsetzen des Anschlagrings 63 auf die Stifte 61, Festziehen der Schrauben 63a und Befestigen des Rings 63 auf dem Stift 61. Somit wird jede der Ecken des äußeren Beutels 1 an jeder der Ecken der Drehplatte 40 befestigt.
Wenn der Kulturbeutel in irgendeiner Weise schlaff wäre, könnte die ihm innewohnende Form nicht aufrechterhalten werden und eine gleichmäßige Bewegung nicht durchgeführt werden. Daher sollte der Kulturbeutel unter Spannung gesetzt werden.
Der Kulturbeutel wird unter Spannung gesetzt durch Lösen der Schraube 62 des Stiftes 61, Bewegen des Stifts 61 entlang des Lochs 40a in die richtige Stellung des Ausschnitts 40b und Befestigen des Stifts 61 mittels der Schraube 62. Der gleiche Vorgang wird an den übrigen Positionen ausgeführt, um den Kulturbeutel unter Spannung zu setzen.
Wenn der Kulturbeutel an der Drehplatte 40 befestigt ist, wird die Drehgeschwindigkeit festgelegt und der Motor 41 angetrieben. Da die Drehplatte 40 im Sinne eines Neigens bezüglich der Horizontalfläche gedreht wird, wird der Kulturbeutel periodisch aufrecht und auf den Kopf gekehrt, so daß die innere Flüssigkeit und die äußere Flüssigkeit innerhalb der abgedichteten Beutel in Bewegung versetzt werden. Die beiden Flüssigkeiten stehen durch den halbdurchlässigen Film als innerer Beutel in Kontakt und das Medium in der äußeren Flüssigkeit bewegt sich in die innere Flüssigkeit aufgrund eines Diffusionsphänomens.
Die Drehgeschwindigkeit der Platte 40 ist im allgemeinen 4 bis 5 U/min. Die Kultivierung durch diese Einrichtung wird in der thermostatischen Kammer oder dem Inkubator bei der für die Kultivierung in geeigneter Weise eingestellten Temperatur vorgenommen.
Der Kulturbeutel wird an der Drehplatte 40 befestigt und die letztere zur Ausführung der Kultivierung mit 4 bis 5 U/min gedreht.

(IV) Auswechseln des Kulturmediums (äußere Flüssigkeit)

Die Auswechslungsdauer wird als erreicht angesehen, wenn die äußere Flüssigkeit gelb wird. Es dient der Bequemlichkeit, das genau kontrollierte Kulturmedium in Kulturbeutel zu unterteilen.
Wenn das Kulturmedium ausgewechselt wird, wird die Drehung der Drehbewegungseinrichtung angehalten und der Kulturbeutel entfernt. Dann wird die Handhabungsöffnung 2 für die nichtbenutzte äußere Flüssigkeit mit einem Verbindungsschlauch (Klemme geschlossen) des gleichen Aufbaus wie in Fig. 26 gezeigt verbunden und die Klemme geöffnet, um die äußere Flüssigkeit aufgrund der Schwerkraft auszuleeren.
Nach dem Ausleeren der äußeren Flüssigkeit wird die Klemme geschlossen und ein vorher vorbereiteter Kulturbeutel mit einem weiteren Verbindungsschlauch verbunden (Klemme geschlossen), wonach der an die Öffnung 2 angeschlossene Verbindungsschlauch weggenommen und mit dem Verbindungsschlauch des besagten Kulturbeutels verbunden wird, und gleichzeitig wird die Klemme geöffnet, um die äußere Flüssigkeit aufgrund der Schwerkraft einzufüllen.
Wenn die äußere Flüssigkeit vollständig eingegossen worden ist, wird die Klemme geschlossen und der Verbindungsschlauch von dem Kulturbeutel weggenommen und zweimal verknotet und fest abgedichtet und unnötige Teile abgeschnitten. Wenn die Spannung des äußeren Beutels nachgelassen hat, wird sterilisierte Luft in der gleichen Weise wie oben beschrieben zugegeben.
Der Kulturbeutel wird an der Drehbewegungseinrichtung befestigt und die Kultivierung wieder vorgenommen.
(V) Beendigung der Kultivierung und Sammeln der in dem Medium (innere Flüssigkeit) suspendierten Lymphozyten.
Nach Beendigung der Kultivierung wird der Kulturbeutel von der Drehbewegungseinrichtung entfernt und ein Sammelbeutel 170, wie in Fig. 33 gezeigt, vorbereitet.
Der Sammelbeutel 170 ist mit einem Zuführungsschlauch 171 verbunden, an dessen Endbereich eine Flüssigkeitszuführungsnadel 172 vorgesehen ist. Der Zuführungsschlauch 171 ist nahe dem Beutel unter vorheriger Bildung einer Schleife 173 leicht verknotet. Der Arbeitsadapter wird von der Handhabungsöffnung 4 für die inneren Flüssigkeit weggenommen und die Nadel 172 des Sammelbeutels 170 wird daran angeschlossen und die innere Flüssigkeit wird aufgrund der Schwerkraft über den Zuführungsschlauch 171 in den Sammelbeutel 170 gesammelt.
Die Schleife 173 des Schlauchs 171 wird nach dem Sammeln fest verknotet und die Nadel 172 von der Handhabungsöffnung 4 entfernt. Ein weiterer Knoten wird nahe dieses Knotens angebracht und abgedichtet. Überflüssige Teile werden abgeschnitten.
Die oben beschriebenen Kulturbeutel, Mediumsbeutel, Sammelbeutel, Verbindungsschlauch, Arbeitsadapter, Instrument zum Eingießen der Zellen, sowie Instrument zur Zuführung sterilisierter Luft sind alle aus Kunststoff hergestellte Einwegprodukte.
Das folgende bezieht sich auf Beispiele des Kultivierens von Zellen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Einrichtungen.

Beispiel 1

Die Kulturflüssigkeit (RPMI 1640 500 ml) enthaltend menschliche Lymphozyten, Interleukin-2 (im folgenden als "IL-2" bezeichnet) und menschliches +AB-Serum (20%) wurde in den inneren Beutel 3 der Kultureinrichtung (Porengröße 24 Å) eingeschweißt. Die Kulturflüssigkeit (RPMI 1640 : 2000 ml) und die Luft (2000 ml) wurden in den äußeren Beutel gegeben.
Die Kultureinrichtung wurde auf der Drehplatte 40 der Bewegungseinrichtung (Drehwinkel: 300) befestigt und die Züchtung von LAK-Zellen (Lymphokin-aktivierte Killerzellen) wurde in einem Inkubator durchgeführt. Während der Durchführung, wurde die Kulturflüssigkeit von einer anderen Öffnung ausgewechselt.
Änderungen des aktivierten Killermerkmals der LAK-Zellen gemäß der Erfindung wurden mit dem herkömmlichen Verfahren (Rollflasche) verglichen und in Fig. 34 dargestellt, wo die Vertikalachse das aktivierte Killermerkmal und die Längsachse die Kultivierungstage bedeuten und die durchgezogene Linie die vorliegende Erfindung zeigt und die gestrichelte Linie den stand der Technik zeigt.
Das aktivierte Killermerkmal wurde für die Erfindung und den Stand der Technik in der Zunahme für 16 Tage beobachtet. Das aktivierte Killermerkmal wurde durch das ATP- Verfahren gemessen.
Der Vergleich zwischen der Erfindung und dem Stand der Technik ist in Tabelle 1 gezeigt. Im Vergleich mit dem Stand der Technik, wo die Kulturflüssigkeit und die Lymphozyten gemischt werden, ist gemäß der Erfindung die verwendete Menge des wertvollen IL-2 der Erfindung 1000u, wogegen die beim Stande der Technik 2500u ist. Die verwendete Menge des menschlichen AB-Serums bei der Erfindung ist 100 ml, während die beim Stand der Technik 1000 ml ist. Obwohl bei der Erfindung die verwendete Menge stark vermindert war, war somit das aktivierte Killermerkmal für die Erfindung und den Stand der Technik äquivalent. Bei Verwendung von Einwegprodukten, wie oben gesagt, konnte die sterile Handhabung leichter durchgeführt werden als die herkömmliche. Tabelle 1: Vergleich Kultivierung von Lymphozyten zu 1.0 · 10¹&sup0; Stand der Technik Erfindung Konzentration Zellkonzentration während der Kultivierung benötigte Menge an benötigte Menge an Kulturmedium Menge im halbdurchlässigen Film 0,5 l Menge außerhalb des halbdurchlässigen Films 6 l Kultivierungsdauer benötigte Menge an AB Serum Kultivierungsbehälter fünf Rollflaschen mit 2,0 Kapazität ein Kultivierungsbeutel Einrichtung Flaschenrolleinrichtung Bewegungseinrichtung Kultivierungsort ausschließlich Inkubator

Beispiel 2

Die Kulturflüssigkeit (Eagle's MEM) enthaltend Luft und Raji-Zellen und FCS wurden in dem inneren Beutel 3 des Kulturbehälters in abdichtender Weise eingebracht und die Kulturflüssigkeit (Eagle's MEM) und Luft in den äußeren Beutel 1 gegeben. Der Kulturbehälter wurde an der Drehplatte 40 befestigt und die Kultivierung durch den Inkubator ausgeführt.
Die Wachstumskurven der Raji-Zellen gemäß der Erfindung und dem herkömmlichen Verfahren (Kolbenkultivierung) sind in Fig. 35 gezeigt, wo die vertikale Achse die Konzentration der Zellen und die Längsachse die Kultivierungstage bedeuten und die durchgezogene Linie die Erfindung und die gestrichelte Linie den stand der Technik darstellt.
Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung und bei dem herkömmlichen Verfahren wurde die Kultivierung bei einer Zellkonzentration von so/mm³ begonnen. Während bei der letzteren eine Zellkonzentration von 455/mm³ in vier Tagen der Kultivierung erreicht wurden, nahm sie danach ab, aber bei der Erfindung setzte sich die Zunahme der Zellkonzentration auf 2060/mm³ nach sieben Kultivierungstagen fort.

Beispiel 3

Luft und Kulturflüssigkeit (NS-1) enthaltend Hybridoma der Maus und FCS wurden in den inneren Beutel 3 des Kulturbehälters dicht eingebracht und Luft und Kulturflüssigkeit (NS-1) in den äußeren Beutel eingebracht. Der Kulturbehälter wurde auf der Drehplatte 40 der Bewegungseinrichtung befestigt und die Kultivierung im Inkubator durchgeführt. Das Wachstumskurven der Hybridoma gemäß der Erfindung und dem Stand der Technik sind in Fig. 36 gezeigt.
Das herkömmliche Verfahren erreichte eine Zellkonzentration von 1000/mm³ in vier Kultivierungstagen und nahm dann ab, bei der Erfindung dauerte das Wachstum jedoch an bis zu einer Zellkonzentration von 1000/mm³ in sechs Kultivierungstagen.
Bei den Entwicklungen der Beispiel 1 bis 3 wurden weitere Untersuchungen durchgeführt und die hervorragenden Resultate sind in Tabelle gezeigt, wo die die Kultivierung im Kolben betreffenden Daten gemäß dem Stand der Technik für den Vergleich gezeigt sind. Tabelle 2-a Zellart Kultivierungsbed. Maus Hybridoma (NS-1 Mutterzelle) Art der Kultivierung mit FCS vollständ. Serumfrei Komponenten des inneren Mediums Volumen des inneren Mediums Anzahl der Zellen zu Beginn der Kultivierung Komponenten des äußeren Mediums (kein Insulin, BSA, Transferrin) Kultivierungsdauer Zellkonzentration am Ende der Kultivierung Gesamtvolumen des äuß. Mediums Vergleichsdaten: Kultivierung m. herk. Kolbenverfahren Kolbenmedium (vollst. Serumfrei obere Grenze bei Kultivierung mit Kolben erhöhte Dichte CR Gewebezellen ./. Kolben erhöhte Dichte von monoklonalen Antikörpern ./. Standardverfahren Zellen i. Kolben Bemerkungen Tabelle 2-b Zellart Kultivierungsbed. Raji-Zellen Lymphozyte (menschlich) Art der Kultivierung mit FCS LAK Induktion PHA Rejuvenation PHA BLAST Kultivierung Komponenten des inneren Mediums Volumen des inneren Mediums Anzahl der Zellen zu Beginn der Kultivierung Komponenten des äußeren Mediums Kultivierungsdauer Zellkonzentration am Ende der Kultivierung Gesamtvolumen des äuß. Mediums Vergleichsdaten: Kultivierung m. herk. Kolbenverfahren Kolbenmedium obere Grenze bei Kultivierung mit Kolben erhöhte Dichte CR Gewebezellen ./. Kolben erhöhte Dichte von monoklonalen Antikörpern ./. Standardverfahren Zellen i. Kolben Bemerkungen Tabelle 2-c Zellart Kultivierungsbed. HeLa Art der Kultivierung mit FCS vollständ. Serumfrei Komponenten des inneren Mediums Volumen des inneren Mediums Anzahl der Zellen zu Beginn der Kultivierung Komponenten des äußeren Mediums (kein Insulin, BSA, Transferrin) Kultivierungsdauer Zellkonzentration am Ende der Kultivierung Gesamtvolumen des äuß. Mediums Vergleichsdaten: Kultivierung m. herk. Kolbenverfahren Kolbenmedium (vollst. Serumfrei) obere Grenze bei Kultivierung mit Kolben erhöhte Dichte CR Gewebezellen ./. Kolben erhöhte Dichte von monoklonalen Antikörpern ./. Standardverfahren Zellen i. Kolben Bemerkungen Tabelle 2-d Zellart Kultivierungsbed. MDT-4 SU-1 HBS Art der Kultivierung mit FCS Komponenten des inneren Mediums Volumen des inneren Mediums Anzahl der Zellen zu Beginn der Kultivierung Komponenten des äußeren Mediums Kultivierungsdauer Zellkonzentration am Ende der Kultivierung Gesamtvolumen des äuß. Mediums Vergleichsdaten: Kultivierung m. herk. Kolbenverfahren Kolbenmedium obere Grenze bei Kultivierung mit Kolben erhöhte Dichte CR Gewebezellen ./. Kolben erhöhte Dichte von monoklonalen Antikörpern ./. Standardverfahren Zellen i. Kolben Bemerkungen
CR Gewebe : Bemerkungen
(1) FCS = Fetal Kalb-Serum
(2) PHA = Phytohemaglutinin Rejuvenation
(3) BSA = Rinder-Serum Albumin
(4) Epith = Epithelial - ähnliche Zelle
(5) Lymph = Lymphoblast - ähnliche Zelle
(6) E-NYSF-404 = angereich. NYSP-404
(7) SU-1 = abgeleitet V Ovar. Carcinom
Wie oben erwähnt, konnten gemäß der vorliegenden Erfindung die folgenden hervorragenden Effekte hervorgerufen werden.
(1) Im Vergleich mit dem Stand der Technik ist eine hervorragende und ökonomische Kultivierung möglich. Tatsächlich, z. B., können beim Beispiel 1 die verwendeten Mengen von IL-2 und dem menschlichen AB-Serum stark vermindert werden und bei den Zellkultivierungen in den Beispielen 2 und 3 und in Tabelle 2 ist eine hohe Konzentration möglich im Vergleich mit dem Stand der Technik. Es ist möglich, die Zellen zu kultivieren durch Wechseln, wenn nötig, des Mediums in dem halbdurchlässigen Filmbehälter und der Komponenten in dem Medium außerhalb des Films.
(2) Eine Kultivierung innerhalb der Abdichtung ist möglich und weil die Mediumsflüssigkeit nicht zirkuliert wird, wie es beim der herkömmlichen Hohlmembran getan wird, kann ein steriler Betrieb leicht vorgenommen werden.
(3) Eine Kultivierung ist möglich auf engen Räumen und in Einrichtungen mit kleinen Abmessungen in Vergleich mit der Drehkultivierung durch die herkömmliche Rollflasche. Weiterhin wird kein kompliziertes System wie bei der Kultivierung mit der Hohlmembran benötigt und es ist eine sehr komprimierte Kultivierung möglich.
(4) Die zu kultivierenden Zellen und das Kulturmedium werden in verschiedenen Behältern abgedichtet. Das Zugeben und Sammeln der Zellen, das Auswechseln des Kulturmediums und das Zuführen der sterilisierten Luft werden durch einfache "one touch"-Verbindung der Betriebseinrichtungen durchgeführt.
(5) Durch Verwendung jeder der obigen Einrichtungen kann das Sammeln der Zellen und Auswechseln des Kulturmediums unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
(6) Im Vergleich mit der Drehkultivierung durch die herkömmliche Rollflasche erfolgt der Durchtritt der Nahrung zu der Zellseite durch den halbdurchlässigen Film, und durch Auswechseln des Kulturmediums ist es möglich, die Zellen innerhalb des halbdurchlässigen Films bei hoher Konzentration zu kultivieren.
(7) Weil die Zellen und das Kulturmedium in gemäßigter Weise bewegt werden, wird die Zellkomponente gleichförmig verteilt und die Zellen haften nicht an der Wand des Behälters an oder bewirken eine Kondensation und es kann eine hohe Ausbeute erreicht werden. Zusätzlich wird die Kultivierung durch Drehen oder Schwenken des Kulturbehälters durchgeführt, so daß trotz der kleinen Fläche des Films im Vergleich mit dem herkömmlichen Kulturbehälter der Hohlmembran eine Kultivierung in großem Ausmaß möglich ist.

Claims

1. Verfahren zur Kultivierung von Gewebezellen, enthaltend ein Eindichten der zu kultivierenden Zellen in einem Behälter aus einem semi-permeablen Film zusammen mit einem Kulturmedium, wobei der semi-permeable Film eine zum Durchlassen des Kultermediums und von Gas ausreichende, nicht aber zum Durchlassen von Zellen innerhalb des semipermeablen Films ausreichende Porengröße hat, Positionieren des Behälters in einem Gehäusebehälter, Rückhalten des Kulturmedius und des Gases außerhalb des semi-permeablen Films, und Kultivieren der Zellen in dem Behälter aus semipermeablem Film aufgrund des Diffussionsphänomens durch Konzentrationsgefälle zwischen den in dem Kulturmedium innerhalb des Behälters aus semi-permeablem Film suspendierten Zellen und dem Kulturmedium außerhalb des Behälters aus semi-permeablem Film durch den semi-permeablen Film hindurch, einschließlich Bewegen des Zellkulturmediums während der Kultivierung, dadurch gekennzeichnet, daß das Bewegen ein Schwenken des den Behälter aus semi-permeablem Film und den Gehäusebehälter umfassenden Zellkutivierungsbehälters während der Kultivierung enthält, indem der Zellkultivierungsbehälter wiederholt in einer oszillierenden Bewegung um eine horizontale X-Achse bewegt, der Zellkultivierungsbehälter wiederholt in einer oszillierenden Bewegung um eine horizontale Y-Achse bewegt und die oszillierenden Bewegungen wiederholt werden.

2. Einrichtung zum Kultivieren von Zellen, enthaltend einen aus einem Kunststoffmaterial gebildeten äußeren Beutel (1), einen in dem äußeren Beutel (1) eingeschlossenen, aus einem semi-permeablen Film hergestellten inneren Beutel (3), einen zwischen dem äußeren Beutel (1) und dem inneren Beutel (3) definierten Abstandsteil (5) zum Halten eines Kultivierungsmediums und eines Gases, gekennzeichnet durch einen den inneren Beutel (3) umschließenden, aus einem Gitternetz hergestellten Schutz (6), eine erste Zuführungsmündung (4) zur Zuführung des die Zellen darin in Schwebe haltenden Kultivierungsmediums in den inneren Beutel (3), und eine zweite Zuführungsmündung (2) zur Zuführung des Kultivierungsmediums und des Gases in den Abstandteil (5), wobei der semi-permeable Film eine solche Porengröße hat, daß er die Zellen innerhalb des inneren Beutels nicht durchläßt, aber die Kultivierungsflüssigkeit und das Gas durchläßt.

3. Einrichtung zum Kultivieren von Zellen, enthaltend einer Behälter (3) aus einem semi-permeablen Film zum Halten der zu kultivierenden Zellen, wobei der semi-permeable Film eine Porengröße hat, die zum Durchlassen eines Kulturmediums und eines Gases ausreicht, jedoch nicht ausreicht, um Zellen innerhalb des semi-permeablen Films durchzulassen, der einen Teil (5) zum Halten eines Kulturmediums und eines Gases in einem Gehäusebehälter (1) außerhalb des besagten Behälters (3) bildet, eine Verbindung zwischen dem Gehäusebehälter (1) und dem inneren Behälter (3), und eine Verbindung eines Beutels (150) zur Zuführung des Kulturmediums zu dem Gehäusebehälter (1), ein Instrument zum Gießen von in Kulturmedium suspendierten Zellen in den Behälter (3) aus semi-permeablem Film, einen Beutel (110) zum Sammeln der kultivierten Zellen in dem Behälter aus semi-permeablem Film, einen Schlauch (111) zur Verbindung des Zellkultivierungsbehälters und Beutels (110) zum Gießen der Zellen, sowie ein Instrument zum Einbringen sterilisierter Luft in den Gehäusebehälter (1) oder den Behälter (3) aus semi-permeablem Film.

4. Einrichtung zum Kultivieren von Zellen, die mit einem Behälter (3) aus einem semi-permeablem Film zum Halten von zu kultivierenden Zellen versehen ist, wobei der semipermeable Film eine zum Durchlassen von Kulturmedium und einem Gas ausreichende, aber zum Durchlassen von Zellen innerhalb des semi-permeablen Films nicht ausreichende Porengröße hat, wobei in diesem ein Teil (1) zum Unterbringen von Kulturmedium und Gas außerhalb des Behälters ausgebildet und eine Verbindung zwischen dem Gehäuseteil (1) und dem semi-permeablen Behälter (3) vorgesehen ist, zur Drehung während der Zellkultivierung, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung eine drehbare Platte (40) für die Befestigung des Zellkultivierungsbehälters (1,3) und eine Dreheinrichtung (41) dafür enthält, und die drehbare Platte (40) mit einer Befestigungseinrichtung (60) für den Kultivierungsbehälter (1,3) versehen und gegenüber einer Horizontalfläche geneigt ist.

5. Drehbare Zellkultivierungseinrichtung, die mit einem Behälter (3) aus semi-permeablem Film zum Halten von zu kultivierenden Zellen versehen ist, wobei der semi-permeable Film eine Porengröße hat, die zum Durchlassen von Kulturmedium und Gas ausreicht, aber nicht zum Durchlassen von Zellen innerhalb des semi-permeablen Films ausreicht, in welchem ein Teil (1) zur Unterbringung von Kulturmedium und Gas außerhalb des Behälters ausgebildet und der mit einer Verbindung (4) zwischen dem Gehäuseteil (1) und dem Behälter (3) versehen ist, zur Drehung während der Zellkultivierung, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung eine an einem zentralen Punkt gelenkig gelagerte Schwenkplatte (70) zum Halten des Zellkultivierungsbehälters (1,3) aufweist, sowie eine Schubstange (82), die an ihrem einen Ende auf der X-Achse gelenkig gegen die Schwenkplatte (70) abgestützt ist, eine Schubstange (83), die an ihrem einen Ende auf der Y-Achse gelenkig abgestützt ist, und einen Antriebsmechanismus (80,81) zum vertikalen Bewegen dieser Schubstangen (82,83) abwechselnd oder gleichzeitig, um die Schwenkplatte (70) lateral und longitudinal zu bewegen.