DE3811245C2 - - Google Patents

Description

Verfahren zur Ermittlung der Schadstoffbelastung der Außenluft und der Luft in Innenräumen mit Bioindikatoren.

Die Erfindung betrifft eine Methode zur Erfassung der Lang­ zeittoxizität der Luft nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Natur und Mensch werden heute einer zunehmenden Konzentration von Luftschadstoffen ausgesetzt. Die äußere Luft wird durch Auto-, Industrie- und Hausheizungsabgase sowie durch andere diffuse Quellen wie Krankenhäuser und kontaminierte Standorte (Altlastdeponien, undichte Kanalisation, landwirtschaftliche Flächen mit großzügiger Anwendung von Pestiziden u. a.) in einer die Grenzwerte überschreitenden Weise verunreinigt. Daneben treten auch immer häufiger Belastungen der Luft in der Wohnumwelt und am Arbeitsplatz auf, die durch eine große Anzahl von Schadstoffen hervorgerufen werden. Mit der zuneh­ menden Industrialisierung wurde die Lokalisierung der Orte mit reiner Luft verwischt, die früher nur punktuelle Kontami­ nation wurde zu einem globalen Problem (Wint, 1986).

Durch die Immissionsgesetzgebung werden nur wenige Schadstoffe erfaßt und nur ihr Anteil an der Gesamtbelastung wird - pauschal betrachtet - vermindert. Es geht jedoch nicht nur um die ca. 120 gasförmigen Luftverunreinigungen, die in der "Technischen Anleitung zur Reinhaltung der Luft" (TA Luft) berücksichtigt werden, sondern um die ca. 6 Millionen Einzelstoffe, die oft in sehr niedrigen Mengen in die Umwelt ein­ dringen (Lühr, 1985). Diese Verbindungen werden weiter unge­ hemmt freigesetzt. Über die meisten dieser Stoffe liegen zur Zeit nicht einmal Daten über ihre aktute Toxizität vor und fast für keinen dieser Stoffe Daten über eine chronische Toxizität.

Da ein erwachsener Mensch pro Tag ca. 10-15 m³ einatmet, sind die gas- und dampfförmigen Luftverunreinigungen sicherlich an dem Wohlbefinden des Menschen beteiligt. Es handelt sich um eine Langzeitwirkung von der Dauer eines Menschenlebens (long-term effect). Die Symptome reichen von relativ diskreten, die der Betroffene nicht wahrnimmt, bis zu den ernsteren, wie Unwohlgefühle, Ohnmacht und Erkrankungen mit letalem Ausgang (Higgins, 1983). Daß wir weit davon entfernt sind, dieser Problematik zu begegnen, zeigt der drastische Anstieg der durch Luftschadstoffe verursachten Erkrankungsabläufe.

Der Mensch ist nicht im Stande diese Gefahren mit seinen Sinnesorganen wahrzunehmen. Die meisten bedenklichen Verbindungen liegen in so geringen Mengen vor, daß sie nur mit hochwertiger analytischer Technik erfaßt werden könnten.

Mit technischen und chemischen Untersuchungsmethoden kann jeweils nur ein Teilaspekt der tatsächlichen Belastungs­ situation erfaßt werden. Es kann jeweils nur gezielt nach bestimmten Substanzen untersucht werden. Viele Stoffe sind uns hinsichtlich ihrer Toxizität unbekannt, werden somit nicht berücksichtigt und entziehen sich dem Nachweis. Die qualitative und quantitative Bestimmung einzelner Stoffe sagt uns allerdings nichts über die Additions- und Synergiewir­ kungen. Der quantitative Nachweis der Toxizität ist letztlich durch den Zeitfaktor und oft durch die sehr niedrige Konzentration dieser Stoffe (long-term, low-level effect) begrenzt.

Langzeitmessungen sind sehr schwierig durchzuführen. Die chemischen Passivsammlermethoden sind zuerst nicht für alle Xenobiotika entwickelt und außerdem sind sie nur für einen relativ kurzen Expositionseinsatz geeignet. So zum Beispiel die Passivsammlerröhrchen für die Formaldehyd-Bestimmung, die nur bis zu zwei Tagen exponiert werden können. Bei längerer Exposition treten Formaldehydverluste auf, die nach sechs Tagen um 30% liegen (Prescher und Jander, 1987).

Mit technischen, physikalisch-chemischen Untersuchungs­ methoden können zudem keine Aussagen über die zu erwartenden Auswirkungen der Luftverunreinigung auf den menschlichen Organismus getroffen werden. Dies ist zur Zeit im Ansatz nur mit biologischen Methoden möglich. Zugrunde liegt die Prämisse, daß alle Umweltfaktoren zusammen auf Menschen wie auch auf Tiere und Pflanzen einwirken. Die zur Erfassung der Gesamtbeslastung durch alle Umweltfaktoren eingesetzten Methoden kann man in vier Kategorien einteilen.

1. EPIDEMIOLOGISCHE STUDIEN am Menschen. Hier werden Zu­ sammenhänge zwischen der Gesundheit und der Luftverunrei­ nigung ermittelt (Goldschmith, 1969). Es sind also Unter­ suchungen über die Häufigkeit und Verteilung von Krankheiten und Todesursachen in Bevölkerungsgruppen, die unterschiedlich starken Umweltbelastungen ausgesetzt sind.

2. KONTROLLIERTE KLINISCHE STUDIEN. Neben Studien an frei­ willigen Probanden (Hackney and Lynn, 1983; Hackney, 1984), sind die aussagekräftigsten Daten im Bereich der Arbeitsmedizin erreicht, da dort die Überwachung der Luftqualität regelmäßig durchgeführt wird. Diese Untersuchungen werden bei der jährlich aktualisierten Liste mit Angaben über die "Maximale Arbeitskonzentration" (MAK) zahlreicher Stoffe berück­ sichtigt.

Die Schwierigkeiten der Methoden unter Punkt 1. und 2. liegen darin, daß durch die unterschiedliche Anamnese der erfaßten Personen viele Einflüsse nicht berücksichtigt werden können. Neben der luftrelevanten Kontaminanten spielen hier viele Variablen eine bestimmte Rolle, da sie die Empfindlichkeit des Individuums beeinflussen. Zu diesen gehören, nur um einige zu erwähnen: die meteorologischen Bedingungen, das Alter, Geschlecht, Ernährungsgewohnheiten, Rauchen, allgemeiner Le­ bensstandard, physische und psychische Verfassung und Na­ tionalität.

3. TIERUNTERSUCHUNGEN. Da bei vielen Substanzen in der Regel keine experimentell gesicherten Angaben über die Toxizität existieren, geht man bei der Festsetzung der Grenzwerte von Tierversuchen aus. Diese Studien haben den Vorteil, daß sie unter besser definierbaren Bedingungen durchgeführt werden können. Hinsichtlich der Übertragbarkeit der Ergebnisse aus Tierversuchen auf den Menschen bestehen neben wissenschaftlich begründeten Vorbehalten auch emotionale Bedenken (Erbers­ dobler, 1981; Garattini, 1985).

4. BIOINDIKATOREN. Nach dem heutigen Stand werden Baumarten, Gräser, Moose, Flechten sowie Insekten und Würmer als "Bioin­ dikatoren" eingesetzt. Als Parameter werden hierbei neben der Absterberate auch Enzymbestimmungen herangezogen. Die Resultate stimmen dort wo ein Vergleich möglich ist, sehr gut mit den bekannten chemischen und physikalischen Methoden überein.

In der Umweltüberwachung mit Bioindikatoren (Biomonitoring) geht man zwei verschiedene Wege (Anon, 1984):

• - passives Monitoring (in-vivo-Untersuchungen). Es werden Organismen untersucht, die sich bereits in Untersuchungs­ standorten befinden. Man schließt aus ihrem Vorkommen, ihrem Zustand und unter Berücksichtigung ihrer stofflichen Zusammensetzung auf die Belastung der Umwelt.
• - aktives Monitoring (in-vitro-Untersuchungen). Hier sollten Bioindikatoren von einheitlicher genetischer Herkunft, unter standardisierten Wachstumsbedingungen herangezogen, über eine bestimmte Dauer exponiert werden.

Alle zur Zeit sowohl zu in vivo als auch zu in vitro Unter­ suchungen herangezogenen Indikatoren reagieren jedoch nicht nur auf gas- und dampfförmige Luftverunreinigungen, sondern auch auf Staub und Verunreinigungen im Boden und im Wasser. Es erfolgt gleichzeitig eine Beeinflussung durch das Stand­ ortklima, bei Pflanzen zusätzlich durch die verschiedenen Photosynthesebedingungen. Die eingesetzten Bioindikatoren sind entweder schwer definierbar oder schwer zu züchten. Es kommt hinzu, daß sie durch Symbionten oder Parasiten kontaminiert werden können. Eine zusätzliche, meist unterschätzte Beeinträchtigung der Auswertung und der Standardisierbarkeit ist durch Infektionen mikrobieller Art bedingt.

Die bisher am besten geeigneten bekannten Testorganismen für ein aktives Monitoring der Luft stellen die Flechten dar (Beckenkamp, 1987). Am Beispiel von Flechten sind die Probleme der Analyse deutlich erkennbar: Das Charakteristikum dieser Organismen ist die Symbiose zwischen Pilz und Alge. Ascomyceten, ganz selten Basidiomyceten, treten neben Chlorophyceen und Cyanophyceen auf, die einzellig oder fadenförmig sein können. Dabei kommt es nur zwischen ganz bestimmten Pilz- und Algen-Spezies zur Symbiose. Das Zusammenleben dieser beiden Organismen gestaltet sich so, daß der Pilz die Alge umspinnt oder durch Haustorien in die Membran der Alge eindringt, wobei er die C-Verbindungen von der Alge bezieht; die wiederum in bezug auf Wassergehalt und mineralische Verbindungen auf den Pilz angewiesen ist. Das Verhältnis der beiden Symbionten stellt sich automatisch ein, ist schwer steuerbar und definierbar. Diese Bioindikatoren werden an Ort der Exposition durch Aufnahme von undefinierten Nährstoffen aus undefinierbar kontaminierten Borken und durch Wasser beeinflußt. Da sie unter unsterilen Bedingungen exponiert werden, ist die Kontamination durch andere Lebewesen ein natürlicher, der Standardisierbarkeit der Methode im Weg stehende Vorgang. Es gehört zum Vorteil, aber auch zum Nachteil dieser Expositionsart, daß nicht nur die gas- und dampfförmige Pollutanten, sondern auch Staub (auch wenn untoxisch, die notwendige Photosynthese der Algen einschränkend) diese Bioindikatoren stark beeinträchtigt. Die Witterungseinflüsse oder das Kunstlicht tragen zur weiteren Destandardisierung der Versuchsbedingungen bei.

Es werden erhebliche Anstrengungen unternommen, in vitro Testsysteme zu entwickeln, die eine Standardisierung des Prüfverfahrens erlauben. Manche Testsysteme "im Reagenzglas" sind bei der Lösung zahlreicher toxikologischen Fragestellungen überlegen, da sich z. B. die Wirkmechanismen toxischer Chemikalien auf zellulärer Ebene an den in-vitro-Modellen besser als an lebenden Tieren analysieren lassen. In der letzten Zeit werden immer mehr Säugetierzellen zu den toxikologischen Untersuchungen herangezogen, da diese besser die cytologischen Verhältnisse beim Menschen wiederspiegeln als Bakterien (Sonnenfeld et al., 1985).

Bei den Untersuchungen der Mechanismen toxischer Wirkungen von Xenobiotika sind zwei Komponenten zu berücksichtigen:

• 1. Die Reaktion des Organismus auf die Chemikalien, d. h. vor allem die Möglichkeit einer Biotransformation, die häufig entscheidend für den Verlust oder sogar Ursache für die Entstehung einer Giftwirkung der Substanzen ist.
• 2. Die Wirkung der Chemikalien oder ihrer aktiven Stoffwechselderivate auf den Organismus, z. B. ihre Wechselwirkung mit Zellbestandteilen und eine daraus resultierende Schädigung der Zelle.

Der Nachteil dieser Methoden liegt im hohen apparativen Aufwand und in der Tatsache, daß die Luftpollutanten nur über die Nährlösung wirken können. Bei allen diesen Methoden kommt noch hinzu, daß es zwischen den Pollutanten und einigen Bestandteilen der Nährlösung zur Interaktion kommen kann, die eine Inaktivierung des Toxikanten bewirken. Der Testansatz erfolgt in vitro; das bedeutet, daß die zu prüfenden Toxikanten zugesetzt werden. Diese Verfahrensweise bedeutet einen schwerwiegenden Bruch mit dem Ziel der Untersuchungen: Der gas- oder dampfförmige Zustand der Substanzen geht verloren, der Wirkungsmechanismus dadurch möglicherweise in nicht nachvollziehbarer Weise beeinträchtigt. Hieraus ergibt sich die nur bedingte Brauchbarkeit der bisher bekannten in-vitro-Methoden für die Untersuchung der Luft.

Bei der Suche nach geeigneten Testorganismen für die Lang­ zeitanalyse der Luftqualität konnten somit die bislang be­ kannten Organismen nicht berücksichtigt werden. Als ungeeignet erwies sich auch der Mutagenitätstest nach Ames, der auf einer Histidin-defekten Mutante des Bakterium Salmonella typhimurium aufgebaut ist.

Erfindungsgemäß wurde ein Bioindikator für aktives Monitoring der Luftatmosphäre gesucht, der folgende Bedingungen erfüllt:

• - Einheitliche, definierte genetische Herkunft der Testorganismen
• - Möglichkeit zum gleichzeitigen Einsatz einer Vielzahl identischer Organismen (Zellen)
• - Klare Zusammenhänge zwischen Toxizität und der Reaktion der Testorganismen
• - Ausschließlichkeit der Luft als einzigen Parameter, d. h. Unabhängigkeit von Nährstoff- und Wasserzufuhr. Abgrenzung von anderen Noxen
• - Weitgehende Unabhängigkeit von Witterungseinflüssen und Lichtbedingungen
• - Einfache Systeme, Umwelteinflüsse standardisierbar
• - Exposition bei natürlichen Bedingungen; keine Beeinflussung durch Veränderung der Expositionsparameter, z. B. Mehrbelastung durch künstlich erhöhte Luftzufuhr
• - Gewährleistung von Expositionsbedingungen, bei denen eine Infektion durch Mikroorganismen und eine Kontamination der Probe durch Staub- oder andere Festpartikel ausgeschlossen wird
• - Einsatzmöglichkeit unter Feld- sowie unter Innenraumbedin­ gungen
• - Vergleichbarkeit der belasteten (exponierten) Proben mit Kontrollproben, die unter standardisierten Laborbedingungen über den gleichen Zeitraum exponiert wurden
• - Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen, d. h. die Möglichkeit einer Korrelation der Meßergebnisse mit Daten aus Tieruntersuchungen (z. B. LD 50) und klinischen Studien
• - Eine variable Expositionsdauer, die der Schadstoff-Aktivität und -Konzentration angemessen wird
• - Geringer Platzbedarf mit der Möglichkeit neben Parallelpro­ ben auch gezielt standortspezifische Belastungen zu loka­ lisieren
• - Einsatz objektiver, reproduzierbarer numerischer Methoden bei der Auswertung und Dokumentation
• - Statistisch überschaubares System, so daß die Auswertung problemlos erfolgt
• - Der Bioindikator sollte so gewählt werden, daß Aufwand und Kosten der Herstellung, des Transports, der Aufstellung, der Expositionsbedingungen und der Auswertung möglichst niedrig gehalten werden.

Obwohl sich aus den geschilderten Gründen das Reich der Pilze als Reservoir für Bioindikatoren anbietet, wurde es bislang nicht berücksichtigt und in seiner Bedeutung nicht erkannt. Die Pilze sind gut morphologisch definierbar (Ainsworth, 1973; 1976; Onions et al. 1986) und C-heterotroph (chemo- organoheterotroph). Sie wachsen unter aeroben Bedingungen und gewinnen Energie durch Oxidation organischer Substanzen. Die Atmungskette ist bei diesen Eukaryonten in Organellen organisiert, den Mitochondrien. Die kompliziertere Art des Aufbaus und der Funktion der Eukaryontenzelle hat zur Folge, daß die Zellen größer sein müssen als die der Prokaryonten. Wegen der längeren Transportwege und des schlechteren Ver­ hältnisses von Oberfläche zu Volumen ergeben sich eine lang­ samere Vermehrung und ein trägerer Stoffwechsel der Euka­ ryonten. Bei den höheren Pilzen (Eumyceten), zu denen die Aspergillus-Arten gehören, ist der Übergang zu dem vielzelligen Organismus, also zum Zellverband, charakteristisch. Die fadenförmigen, in Längsrichtung aneinander haftenden Zellen, die Hyphen, bauen einen Verband, das Myzel. Diese Myzel ist durch Querwände in einzelne Zellen geteilt. Die Vermehrung erfolgt durch die Konidien, die sich aus dem vielfach ver­ zweigten vielkernigen Myzel entwickeln. Sie werden oft als Pilzsporen bezeichnet. Aus jeder dieser Sporen kann sich auf einem geeigneten Nährboden wieder ein Pilzmyzel entwickeln. Im Gegenteil zu den Bakteriensporen sind Konidien keine Ruheform, sie sind nicht hitzeresistent und ihre Keimfähigkeit ist begrenzt. Die Konidien befinden sich in einem hypometa­ bolischen Zustand, d. h. sie metabolisieren weiter, nur lang­ samer. Sie gewinnen ihre lebensnotwendige Energie durch Oxi­ dation ihrer Stoffreserven. Der dazu benötigte Sauerstoff kann nur durch die Atmung gewonnen werden. Der verlangsamte Metabolismus ist aber nur ein relativer Begriff. Die Spore ist gerade gegen jedwelche Metabolismusstörung extrem emp­ findlich, da die gesamten Prozesse ununterbrochen auf die Keimung gerichtet sind. Es wurde gezeigt, daß die Sporen Aspergillus niger, A. flavus und Penicillium expansum wesentlich empfindlicher auf die im Nähragar vorhandenen Verbindungen wie Methylester der p-Hydroxybenzoesäure, Dehydro­ aceticsäure und Na-Pentachlorophenol reagierten als das Myzel dieser Testorganismen (Bomar, 1962).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Qualität der Luft im Interieur sowie im Exterieur zu untersuchen. Erfindungsgemäß wird so verfahren, daß mit trockenen Konidien (keine wäßrige Suspension!) bestimmter Pilze eine sterile Filterscheibe inokuliert wird, diese dann in einen sterilisierten Papierumschlag (Seidenpapier, Schleicher & Schüll, Nr. 2478) unter sterilen Bedingungen eingeschoben wird. Der Bioindikator im dicht verschlossenen Umschlag wird dann entsprechend den Analysezielen exponiert. Die Inkulation erfolgt nach einem neu entwickelten Verfahren (Bomar et al., 1988). Jedwelche Kontamination des Bioindikators wird durch den sterilen Umschlag für die gesamte Expositionsdauer ausgeschlossen.

Die Bedingungen für die Exposition zur Untersuchung der in-door- und out-door-Luftqualität (vgl. Patentanspruch 1-4) werden wie folgt gewählt:

1. out-door

Hierbei muß darauf geachtet werden, daß die Bioindikatoren vor Nässe geschützt werden. Die Proben werden auf vom Regen geschützten Standorten in bestimmter Höhe angebracht.

Bei extremen Witterungsbedingungen ist eine Standardisierung der Expositionsparameter (i. e. Temperatur) bei Verwendung geeigneter Expositionsgeräte angebracht.

2. in-door

Zur Untersuchung der Luftatmosphäre in Räumlichkeiten werden an jeweils mehreren geeigneten Stellen die Proben angebracht.

Zur Untersuchung der Oberflächenemission wird der Bioin­ dikator auf die emissionsverdächtige Oberfläche direkt auf­ gelegt. Das Auffangen der emissierten Gase oder Dämpfe wird durch das Auflegen einer Polyethylenfolie über die Probe und deren Abdichten mittels eines "Tesabandes" an die getestete Oberläche gewährleistet.

Für die Langzeituntersuchung der Luftatmosphäre sowie der schadstoffabgebenden Oberflächen, wurde eine einheitliche Expositionsdauer von 8 Wochen festgelegt. Bei hochtoxischer Atmosphäre kann die Expositionsdauer entsprechend verkürzt werden, um eine quantitative Auswertung zu ermöglichen.

Wenn die Konidien so beschädigt werden, daß sie nicht auskeimen können (lethale Wirkung), ist nur eine qualitative Aussage möglich.

Nach dieser Exposition werden die konidientragenden Filterpa­ pierscheiben aus den Umschlägen steril entnommen und unter sterilen Bedingungen auf einem geeigneten Nähragar inkubiert. Gleichzeitig erfolgt die Bebrütung der Kontroll-Bioindikato­ ren. Die Exposition der Kontroll-Bioindikatoren erfolgt an Standorten mit einwandfreier Luftqualität, unter Bedingungen (Temperatur, relative Feuchtigkeit) die annähernd den Test­ bedingungen entsprechen.

Nach einer festgelegten Inkubationsdauer wird das Wachstum des Myzeliums, die Bildung von Konidien und deren Pigmentierung ausgewertet.

Beispiel für die Inkubationsbedingungen

Bei dem Testorganismus Aspergillus niger: Inkubationszeit von 24 h und 48 h bei der Temperatur von 30°C auf dem Sabou­ raud Agar (Merck, Nr. 7315).

Auswertung: Bei der Verwendung von einer Filterpapierscheibe, Zuschnitt von 30×30 mm (Schleicher & Schüll, Nr. 2040A) mißt man die Zone des Myzeliumwachstums von dem Rand der Scheibe. Im Vergleich mit den Kontrollproben ist eine Verlang­ samung des Myzeliumwachstums zu beobachten, wenn eine Beein­ trächtigung der Konidien durch die Luft stattfand. Weitere Merkmale: Bildung von Konidien. Es sind folgende Effekte möglich: Keine Bildung von Konidien; Bildung von Konidien mit schwächerer oder keiner Pigmentierung (photometrische Auswertung). Bildung von pigmentierten oder nichtpigmentierten Konidien, die steril sind, d. h. nach dem Überimpfen auf den Nährboden nicht auskeimen. Alle diese Merkmale sind durch fotografische Aufnahme dokumentierbar.

Die erfindungsgemäß hergestellten und verwendeten Bioindika­ toren, erfüllen im Gegensatz zu den herkömmlichen zum Bio­ monitoring verwendeten Verfahren und Testorganismen, weit­ gehendst die oben für ein aktives Monitoring der Luftatmo­ sphäre geforderten Bedingungen.

Ausführungsbeispiel Untersuchung und Dokumentation des out- door-Luft-monitorings.

Es wurden ausgesuchte Standorte in der Nähe der Universität Karlsruhe (TH) katastriert.

Die erzielten Ergebnisse sind in der Tab. 1 zusammengefaßt. Bei der Bewertung der Konidien-Bildung und Konidien-Pigmentierung, wurde eine Bewertungsskala von "×××××" bis "-" gewählt.

Die erzielten Ergebnisse des Myzelienwachstums sind in der Abb. 1a zusammengefaßt. Die Konidien-Pigmentierung wurde densitometrisch ausgewertet (Abb. 1b).

Die Abb. 2 zeigt ein Beispiel der photographischen Dokumentation der Untersuchungsbefunde.

Ausführungsbeispiel 2

Für die Untersuchungen wurden Konidien von Reinkulturen (unter Berücksichtigung von Vertretern unterschiedlicher Klassen) aus der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) verwendet.

Die Verwendbarkeit folgender Testorganismen wurde untersucht:

• - Aspergillus niger, A. flavus, A. oryzae, A. ochraceus,
• - A. rugulosum, A. versicolor
• - Penicillium expansum
• - Rhizopus oligosporus,
• - Mucor hiemalis
• - Fusarium culmo

Anzucht der Subkultur

Diese erfolgte vorzugsweise auf Kartoffel-Glucose-Agar (PDA, Merck, No. 10 130), da hier die Konidiogenese wesentlich besser verläuft als auf Sabourand Agar. Der autoklavierte und auf 50°C abgekühlte PDA wurde mit Konidien der jeweiligen Testkultur beimpft und bis zu einer Höhe von 5 mm in ein steriles Einmachglas pipettiert. Die Bebrütung erfolgte bei der für den Testorgnismus optimalen Temperatur. Nach vollständig abgeschlossener Konidiogenese (7 Tage) sind die Konidien zum Einsatz geeignet. Eine Aufbewahrung der trockengehaltenen Konidien ist bis zu der Dauer von einigen Monaten (<12) möglich. Dadurch ist gleichzeitig die grundsätzliche Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auch über eine längere Zeitstrecke gewährleistet. In Versuchen mit A. niger und R. oligosporus wurde nachgewiesen, daß die Konidien noch nach einem Jahr voll einsatzfähig waren - ihre Myzelium- und Konidienentwicklung war nahezu identisch mit der am Anfang der Versuche. Neben dem trockenen Zustand war als weitere Voraussetzung die Haltung der Dosen mit dem Konidienrasen oder der beimpften Streifen in einer einwandfreien Luftatmosphäre. Das Aufbewahren der Kultur im herkömmlichen Labor ist z. B. unzulässig, da die Luft in der Regel mit Schadstoffen belastet ist.

Beimpfen der Teststreifen mit Konidien

Nach der Bebrütung wurden ca. 1 g steriler Glasperlchen (Durchm. 1,00-1,05 mm; Braun Melsungen, No. 85 418 019) in den Behälter gegeben. Anschließend wurden mit einer Pinzette sterile Teststreifen aus Filterpapier (30 × 30 mm, Schleiffer & Schüll, No. 2040 A) einzeln in das Glas eingeführt. Durch Schütteln des Behälters wurden die Konidien auf die Glasperlchen und von diesen auf die Teststreifen übertragen.

Konfektionieren der Proben

Nun werden die Teststreifen einzeln mit einer Pinzette dem Glas entnommen und in sterile Papierhüllen (aus untoxischem Seidenpapier oder Feinst-Filter-Papier, 40 × 50 mm, z. B. Whatman No. 2 105 841) eingeschoben. Diese Hüllen wurden mit einem Papier-Prägeapparat dicht verschlossen. Alternativ kann man auch tropfenweise mit untoxischem Kunststoff beschichtetes Feinst-Filterpapier thermisch schweißen.

Inkubation der exponierten Teststreifen

Nach der Exposition wurden die Teststreifen unter sterilen Bedingungen den Papierhüllen entnommen und erschütterungsfrei auf Nähragar (20 ml) in Petrischalen (94 × 16 mm, mit Nocken, Bender & Hobein, No. 9 408 045, Karlsruhe) aufgebracht. Die Bebrütungszeit hängt von dem verwendeten Spezies ab. Bei A. niger wird 48 h bei 30°C bebrütet, bei R. oligosporus 32 h lang.

Auswertung a) Wachstumszone

Kriterium ist die von Hyphen überwachsene Fläche des Nährmediums abzüglich der Fläche des Teststreifens, d. h. die Fläche des über den Teststreifen hinausgewachsenen Myzeliums. Diese Fläche wird in % der Kontrolle (100%) umgerechnet.

b) Konidienentwicklung

Selbst wenn die Konidien des Testorganismus durch die Exposition nicht so geschädigt sind, daß die Entwicklung des Myzeliums gehemmt wäre, kann bereits die Fertilität (die Bildung von Reproduktionsstrukturen) beeinträchtigt sein. Da die Konidien der zum Test geeigneten Mikroorganismen pigmentiert sind, drückt sich dies durch eine verringerte Farbintensität des Konidienrasens aus.

Es wird nur mit standardisiertem Medium und dem Medium aus der gleichen Produktionscharge gearbeitet. Bei jeder neuen Charge wird ein Vergleich der Wachstumsaktivität an Kontrollproben durchgeführt.

Die Pigmentierung einzelner Proben kann man direkt auf den Petrischalen fotometrisch (z. B.: Densitometer Chroma Meter CR 200, Minolta) messen.

Es gehört zu dem Bestandteil der Methode, daß die Ergebnisse fotographisch dokumentierbar sind. Somit ist sogar eine nachträgliche densitometrische Auswertung über die Bildaufnahme möglich.

Die Auswertung von Bioindikatoren zur direkten Analyse der Luftqualität gibt zudem Hinweise auf neue, bislang noch nicht nachgewiesene toxikologisch relevante Schadstoffe. Dadurch kommt den Bioindikatoren eine besondere Bedeutung als Frühwarnsystem zu. Es ist unbedingt notwendig, eine ganze Reihe von Bioindikatoren aufzustellen, wobei die Suche nach weiteren Spezies mit spezifischer Empfindlichkeit gegenüber bestimmten Xenobiotika als Gegenstand einer breit angelegten Forschung intensiv betrieben wird.

Die Abb. 3 zeigt die Ergebnisse der Luftanalyse (Biomonitoring mit Rhizopus oligosporus) in den Labor- und Büroräumen einer Landesanstalt für Umweltschutz.

Tabelle 1

Luftmonitoring Karlsruhe-Oststadt

Literatur

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Claims (4)

1. Verfahren zur Ermittlung der Schadstoffbelastung der Außenluft und der Luft in Innenräumen mit standardisierbaren Bioindikatoren in Form von Testmikroorganismen in Reinkulturen, wobei zur Beurteilung der vorliegende Schadwirkung eine Veränderung der qualitativen und quantitativen Merkmale der Testorganismen nach der Exposition unter standardisierten Bedingungen im Vergleich mit nichtexponierten Testorganismen (Kontrollproben ermittelt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Bioindikatoren Kulturen von Pilzen der Klassen Ascomycetes und Phycomycetes verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Bioindikator Kulturen von Aspergillus niger (Kondidien) verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beurteilung der vorliegenden Schadwirkung morphologische Kriterien wie Geschwindigkeit des Myzeliumwachstums, Wuchereffekte, Pigmentierung und Keimungsfähigkeit oder eventuelle Sterilität der neu gebildeten Konidien ausgewertet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beurteilung der vorliegenden Schadwirkung neben morphologische Kriterien auch biochemische und molekularbiologische Befunde berücksichtigt und verwendet werden.