DE3821809C2

DE3821809C2 -

Info

Publication number: DE3821809C2
Application number: DE3821809A
Authority: DE
Inventors: Akihiro Muko Kyoto Jp Kondo; Ikunoshin Kato; Akira Uji Kyoto Jp Obayashi; Sumihiro Ashiya Hyogo Jp Hase
Original assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1987-07-02
Filing date: 1988-06-28
Publication date: 1993-03-04
Also published as: US4975533A; GB2206691A; FR2617485A1; GB2206691B; JPH0565108B2; DE3821809A1; FR2617485B1; SE503507C2; GB8814944D0; SE8802478D0; SE8802478L; JPS6410177A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung eines Zuckers oder einer Zuckerkette und insbesondere ein Verfahren zur quantitativen Fluoreszenzmarkierung des reduzierenden Endes eines Zuckers oder einer Zuckerkette, so daß deren Analyse mit einer hohen Empfindlichkeit im Picomolbereich oder höher durchgeführt werden kann.

In den vergangenen Jahren wurde begonnen, die Beziehung zwischen physiologischen Aktivitäten von konjugierten Zuckern und der Strukturen ihrer Zuckerketten zu untersuchen. Ferner begann man, Unterschiede der Zuckerkettenstruktur und der Funktion zwischen gentechnologisch hergestellten und natürlichen Glycoproteinen zu untersuchen. Zu diesen und anderen Zwecken wurde die Durchführung der Analyse von Strukturen von Zuckern oder Zuckerketten erforderlich. Jedoch produzieren lebende Organismen gewöhnlich nur eine geringe Menge einer solchen Substanz, und somit kann zum Testen nur eine kleine Probenmenge davon erhalten werden. Deshalb ist ein hochempfindliches analytisches Verfahren notwendig.

Zu gegenwärtig verwendeten Verfahren zur Analyse von Spurenmengen von Zuckerketten gehören solche, in denen eine [³H]-Markierung zur Zeit der Umsetzung des reduzierenden Endes zu einem Zuckeralkohol eingeführt wird, deren Radioaktivität für die Messungen verwendet wird (C. J. Liang, K. Yamashita, C. G. Muellenberg, H. Shichi und A. Kobata, J. Biol. Chem., 254, 6414 (1979), und S. Takasaki, T. Mizuochi, und A. Kobata, Methods in Enzymology, 83, 263 (1982)). Die im Picomolbereich liegende Nachweisempfindlichkeit ist zufriedenstellend, jedoch ergeben sich Beschränkungen der Anwendung dieses Verfahrens, weil die Analyse die Verwendung einer radioaktiven Substanz einschließt. Aus diesem Grunde wurde ein Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung unter Verwendung einer Pyridylaminogruppe entwickelt (S. Hase, T. Ibuki, und T. Ikenaka, J. Biochem., 95, 197-203 (1984); nachfolgend wird auf dieses Verfahren als "herkömmliches Verfahren" Bezug genommen). Gemäß einem solchen herkömmlichen Verfahren wird eine Pyridylaminogruppe am reduzierenden Ende eines Zuckers oder einer Zuckerkette unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure zur Bildung einer Schiff'schen Base eingeführt, die dann durch die Verwendung einer nicht flüchtigen Borverbindung reduziert wird. Die Probe wird dann mit einer anregenden Wellenlänge von 320 nm bestrahlt und die Fluoreszenz bei 400 nm beobachtet. Die Empfindlichkeit liegt wieder im Picomolbereich.

Durch das oben erwähnte Verfahren, kann die Analyse leicht mittels einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) durchgeführt werden, die eine der nützlichsten Verfahren im Bereich der Mikroanalyse ist und deren Empfindlichkeit gleich oder größer ist als die mit Verfahren, die die Verwendung einer radioaktiven Substanz einschließen, erreichte Empfindlichkeit.

Bei dem herkömmlichen, oben beschriebenen Verfahren ist jedoch die Ausbeute der erwünschten Substanz aus der Reaktion, bezogen auf die Menge des Ausgangszuckers oder der Ausgangszuckerkette, mit 75 bis 85% gering, d. h. die Reaktion verläuft nicht quantitativ. Wird das herkömmliche Verfahren ferner mit einer Ketose durchgeführt, beträgt die Ausbeute der Reaktion nur etwa 10%, was sehr unbefriedigend ist. Zusätzlich sollte bei dem herkömmlichen Verfahren ein großer Überschuß 2-Aminopyridin, bezogen auf den Ausgangszucker oder die Ausgangszuckerkette, zur Erhöhung der Ausbeute an Schiff'scher Base verwendet werden; auch sollte ein großer Überschuß Natriumcyanoborhydrid (NaBH₃CN) als Reduktionsmittel eingesetzt werden. Zur Analyse des fluoreszenzmarkierten Zuckers oder der fluoreszenzmarkierten Zuckerkette ist deshalb überschüssiges 2-Aminopyridin und NaBH₃CN durch Säulenchromatographie zu entfernen, was sowohl Zeit und Übung erfordert als auch die Empfindlichkeit der Analyse beeinträchtigt.

Aus der Literaturstelle Carbohydrate Research 1985, 139, S. 1-11 ist aus Seite 3, dritter Absatz ein Verfahren zur Herstellung von fluoreszenzmarkierten Zuckern bekannt, bei dem die Reaktion unter Verwendung einer im wesentlichen wasserfreien Säure als Gegenion, jedoch erst bei der Reduktion der Schiff'schen Base und nicht bei deren Erzeugung durchgeführt wird.

Aus der Literaturstelle J. Carbohydrate Chemistry, 1987, 6 (1), 129-139 ist aus Seite 137 bekannt, daß Ausbeuten größer als 90% auch mit diesem herkömmlichen Verfahren erzielt werden können, wobei die gemäß diesem Verfahren hergestellten, fluoreszierenden Derivate direkt über HPLC analysiert werden können. Bei diesem letzteren Verfahren wird als Säure HCl verwendet.

Gegenüber beiden diesen Verfahren gemäß Stand der Technik werden jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung industriell signifikante Vorteile erzielt, nämlich kürzere Reaktionszeit, tiefere Reaktionstemperatur und höhere Ausbeute, wie sie nach dem Stand der Technik nicht möglich sind.

Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung bereitzustellen, in dem die Ausbeute aus der Reaktion der Fluoreszenzmarkierung verbessert und das Verfahren selbst vereinfacht ist, und dieses Verfahren die Mikroanalyse eines Zuckers oder einer Zuckerkette in Spurenmengen mit einer höheren Empfindlichkeit als bei bekannten Verfahren ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung eines Zuckers oder einer Zuckerkette gelöst, in welchem man als fluoreszierende Substanz 2-Aminopyridin, 2-Aminochinolin oder 2,3-Diaminopyridin einsetzt und die Reaktion zur Bildung einer Schiff'schen Base unter Verwendung von wasserfreier Essigsäure oder Trifluoressigsäure als im wesentlichen von Wasser freier Säure als Gegenion durchführt und die durch die Markierungsreaktion gebildete Schiff'sche Base unter Verwendung eines flüchtigen Boran-Komplexes reduziert.

Zu Zuckern, auf die diese Erfindung angewendet werden kann, zählen beispielsweise Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide und konjugierte Zucker wie Glycoproteine oder Glycolipide. Zu Verfahren, mit denen Zuckerketten aus konjugierten Zuckern wie Glycoproteinen oder Glycolipiden herausgetrennt werden können, zählen gut bekannte Verfahren wie Hydrazinolyse N-Acetylierung, Trifluoracetolyse, Alkalibehandlung, enzymatische Verdauung (beispielsweise durch Endoglycosidase oder Glycopeptidase).

Wenn Chlorwasserstoffsäure, die in der Reaktionsstufe zur Bildung einer Schiff'schen Base im herkömmlichen Verfahren, d. h. in der Reaktionsstufe zur Einführung der Fluoreszenzmarkierung, verwendet wird, durch eine im wesentlichen von Wasser freie Säure, nämlich wasserfreie Essigsäure oder Trifluoressigsäure (TFA) ersetzt wird, können wesentlich bessere Ergebnisse erzielt werden. So wird ein Zucker oder eine Zuckerkette mit einem Überschuß einer fluoreszierenden Substanz mit wenigstens einer Aminogruppe nämlich 2-Aminopyridin, 2-Aminochinolin oder 2,3-Diamino-pyridin in einer im wesentlichen von Wasser freien Säure, nämlich wasserfreien Essigsäure oder Trifluoressigsäure umgesetzt.

Essigsäure wird bevorzugt.

Standardreaktionsbedingungen sind eine Temperatur von Raumtemperatur bis 100°C und eine Reaktionszeit von einigen Minuten bis zu einer Stunde. Vorzugsweise beträgt die Temperatur etwa 90°C und die Reaktionszeit etwa 15 Minuten. Bei dieser Reaktion werden die Schiff'schen Basen quantitativ erhalten, und das erhaltene Reaktionssystem kann durch Konzentrierung gereinigt und unter verringertem Druck und durch azeotrope Behandlung getrocknet werden.

Zur Reduktion der Schiff'schen Base, die an sich bekannt ist, erweisen sich flüchtige Boran-Komplexe als besonders geeignet. Als solche sind beispielsweise Boran-Pydridin-Komplex, Boran-Triethylamin-Komplex und Boran-Dimethylamin-Komplex zu nennen. Die fluoreszierende Substanz, die zur Bildung der Schiff'schen Base verwendet wird, und die im wesentlichen wasserfreie Säure können zu diesem Reduktions-Reaktionssystem hinzugefügt werden. Die Standardbedingungen der Reduktionsreaktion sind eine Temperatur von Raumtemperatur bis zu 100°C und eine Reaktionszeit von einer bis zu 10 Stunden, eine Reaktionstemperatur von etwa 90°C und eine Reaktionsdauer von etwa einer Stunde werden bevorzugt. Nach der Reaktion können Verunreinigungen durch Konzentrierung der Reaktionsmischung unter verringertem Druck und durch azeotrope Behandlung entfernt werden, anschließend wird die Mischung in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und einer Analyse mittels HPLC unterworfen.

Erfindungsgemäß erfolgt die Reaktion zur Fluoreszenzmarkierung quantitativ, sogar bei einer Aldose (einschließlich Aminozuckern) und einer Ketose. Wird ein flüchtiges Reagens verwendet, kann dieses leicht entfernt werden.

Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen erläutert. Fig. 1 und Fig. 2 zeigen die Analysenergebnisse der Chromatographie von N-Acetylglucosamin und Fructose, die beide fluoreszenzmarkiert wurden, mittels HPLC, und Fig. 3 zeigt die durch Reversed-phase Säulenchromatographie des fluoreszenzmarkierten Fetuins erhaltenen Analysenergebnisse. Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Fluoreszenzmarkierung von N-Acetylglucosamin

In 100 ml Wasser wurden 11,06 mg N-Acetylglucosamin (in Methanol umkristallisiert); gelöst. Ein 2-µl-Anteil dieser Lösung (die 1 nmol N-Acetylglucosamin enthält) wurde in ein Teströhrchen gegeben und zur Entfernung des Wassers gefriergetrocknet. In das Teströhrchen wurden 10 µl Pyridylaminierungsmittel (23 M Lösung aus 2-Aminopyridin in Essigsäure) gegeben. Das Teströhrchen wurde verschlossen und auf 90°C erhitzt. Nach 15 Minuten wurden das Teströhrchen geöffnet und überschüssige Reagentien und die Essigsäure durch azeotrope Behandlung unter Verwendung von Triethylamin und Konzentrierung unter verringertem Druck entfernt. Der Rest wurde in 50 µl Methanol gelöst, und es wurden 2 µl Boran-Pyridin-Komplex hinzugefügt und das Röhrchen verschlossen. Zur Durchführung der Reduktion wurde das Teströhrchen eine Stunde lang bei 90°C gehalten. Anschließend wurde das Röhrchen geöffnet und die Reagenzien und das Lösungsmittel durch Konzentrierung unter verringertem Druck und azeotrope Destillation entfernt. Der Rest wurde in 200 µl Wasser gelöst und 2 µl dieser Lösung (entsprechend 10 pmol) mittels HPLC nach dem Verfahren von H. Takemoto, S. Hase, und T. Ikenaka (Anal. Biochem., 145, 245 (1985)) analysiert. Die Fig. 1 zeigt das Chromatogramm, das die Beziehung zwischen Elutionszeit (Minuten, Abszisse) und der Fluoreszenzintensität (Ordinate) wiedergibt. Es wurde eine Ultrasphere® C₁₈-Säule (4,6 × 250 mm, mit einem 0,025 M Natriumcitratpuffer (pH 4,0), der 0,1% Acetonitril als Lösungsmittel enthält, bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,8 ml/min verwendet. Die Fläche des erhaltenen Peaks wurde zur Berechnung der Ausbeute der Fluoreszenzmarkierung, die 94,1% betrug, verwendet.

Beispiel 2 Fluoreszenzmarkierung von Fructose

Zuerst wurden 9,01 mg Fructose abgemessen und in 100 ml Wasser gelöst. 2 µl (enthaltend 1 nmol Fructose) dieser Lösung wurden in ein Teströhrchen gegeben. Die gleichen Prozeduren wie sie in Beispiel 1 für N-Acetylglucosamin durchgeführt wurden, wurden wiederholt, und auch die Analyse erfolgte in gleicher Weise. Das Ergebnis der Analyse wird in Fig. 2 gezeigt. Die Ausbeute der Fluoreszenzmarkierungsreaktion wurde aus der Fläche des Peaks erhalten und betrug 92,3%.

Beispiel 3 Analyse der Zuckerketten von Fetuin (Glycoprotein aus fötalem Kalbsserum) (1) Analyse der Zuckerketten des Fetuins

Bei den herkömmlichen Verfahren wurden 480 µg (1 nmol) Fetuin hydrazinolysiert und dann N-acetyliert, wie bei S. Hase, T. Ikenaka und Y-Matsushima, J. Biochem., 90, 407-414 (1981) und von S. Takasaki, T. Mizuochi und A. Kobata, Methods in Enzymol., 83, 263 (1982) beschrieben. Die Zuckerketten und aufgeschlossenes Protein enthaltende Reaktionsmischung wurde gefriergetrocknet. Dieser gefriergetrockneten Substanz wurden 45 µl Methanol und 5 µl einer 5 M 2-Aminopyridinlösung in Essigsäure hinzugefügt. Die Lösung wurde bei 90°C 15 Minuten lang reagieren gelassen. Dann wurde das Lösungsmittel abdestilliert und nicht umgesetztes 2-Aminopyridin durch viermalige azeotrope Destillation mit Triethylamin entfernt. Zum Rest wurden 50 µl Methanol zur Auflösung hinzugefügt und anschließend 2 µl Boran-Pyridin-Komplex hinzugegeben. Das Teströhrchen wurde verschlossen und die Reduktionsreaktion 1 Stunde lang bei 90°C durchgeführt. Nach der Reaktion wurden das Lösungsmittel und die Reagentien durch azeotrope Destillation entfernt. Der erhaltene Rest wurde durch das bekannte Verfahren mittels HPLC mit einer Reversed-phase Säule (Cosmosil® C₁₈, 4,6 × 250 mm) durchgeführt (S. Hase, K. Okawa, und T. Ikenaka, J. Biochem., 91, 735 (1982)). Als Lösungsmittel wurde 0,1 M Ammoniumacetatpuffer (pH 4,0) in einem Gradienten von 0 bis 0,5% n-Butanol verwendet, und die Trennung führte zu einer Zuckerkette A, die sowohl durch enzymatische als auch instrumentelle Analyse identifiziert wurde. Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der chromatographischen Analyse in der gleichen Weise wie in Fig. 1. Unter Berücksichtigung der Elutionszeit scheint die Zuckerkette A eine komplexe Struktur aufzuweisen.

(2) Komponentenanalyse der aus Fetuin erhaltenen Zuckerkette A

Die wie nach Teil (1) erhaltene Zuckerkette A wurde nach zwei unten beschriebenen Verfahren hydrolisiert. Jedes der Produkte wurde unter Verwendung von 2-Aminopyridin fluoreszenzmarkiert und dann analysiert.

(a) Analyse der neutralen Zucker

Zuerst wurden 100 pmol der Zuckerkette in 60 µl einer wäßrigen 4 M TFA-Lösung gelöst und 3 Std. lang bei 100°C hydrolisiert. Die Reaktionsflüssigkeit wurde unter verringertem Druck konzentriert und der Rest in 200 µl einer 10%igen Lösung von Pydridin in Methanol aufgelöst. Zu dieser Mischung wurden 10 µl wasserfreie Essigsäure hinzugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur einige Minuten stehengelassen. Anschließend wurde der Druck auf 1,33× 10^-3mbar verringert und bis zur Trockenheit konzentriert. Der Rest wurde in 45 µl Methanol aufgelöst. Dazu wurden 5 µl 5 M 2-Aminopyridin in Essigsäure hinzugefügt und die Mischung bei 90°C 15 Minuten lang reagieren gelassen. Diese Reaktionsflüssigkeit wurde konzentriert und unter verringertem Druck von 1,33×10^-3mbar getrocknet und anschließend nicht umgesetztes 2-Aminopyridin durch viermalige azeotrope Destillation mit Triethylamin entfernt. Der Rückstand wurde in 50 µl Methanol aufgelöst, und 2 µl Boran-Pyridin-Komplex wurden hinzugefügt. Das Teströhrchen wurde verschlossen und die Mischung 1 Std. lang bei 90°C reagieren gelassen. Anschließend wurde die Reaktionsflüssigkeit konzentriert und unter verringertem Druck von 1,33×10^-3 mbar konzentriert und eine azeotrope Destillation wiederholt durchgeführt. Der Rückstand wurde durch ein bekanntes Verfahren analysiert (H. Takemoto, S. Hase und T. Ikenaka, Anal. Biochem., 145, 245 (1985)). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

(b) Analyse der Aminozucker

Zuerst wurden zu 100 pmol Zuckerketten 20 µl 6 M HCl, 20 µl 6 M TFA und 20 µl Wasser hinzugefügt und die Mischung 6 Std. lang bei 100°C hydrolisiert. Die sich anschließenden Arbeitsschritte waren die gleichen wie die in Teil (a) beschriebenen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 zeigt auch die Ergebnisse der Analyse der neutralen Zucker und Aminozucker mit Korrektur der Daten (als mol/mol Zuckerkette) unter Verwendung von Rhamnose als internem Standard.

Tabelle 1

Gemäß den oben gezeigten Ergebnissen scheint die interessierende Zuckerkette A, die der Hauptzuckerkettenstruktur des Fetuins entspricht, folgende Struktur aufzuweisen:

Wie zuvor detailliert erklärt wurde, ist es durch das erfindungsgemäße Verfahren möglich, Zucker oder Zuckerketten in einer quantitativen Reaktion zu fluoreszenzmarkieren und unter Verwendung eines flüchtigen Lösungsmittels wird das Verfahren vereinfacht, so daß es möglich ist, eine Mikroanalyse einer Spurenmenge eines Zuckers oder einer Zuckerkette durchzuführen.

Claims

1. Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung eines Zuckers oder einer Zuckerkette durch eine Fluoreszenzmarkierungsreaktion am reduzierenden Ende eines Zuckers oder einer Zuckerkette mit einer fluoreszierenden, wenigstens eine Aminogruppe enthaltenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszierende Substanz 2-Aminopyridin, 2-Aminochinolin oder 2,3-Diaminopyridin einsetzt und die Reaktion zur Bildung einer Schiff'schen Base unter Verwendung von wasserfreier Essigsäure oder Trifluoressigsäure als im wesentlichen von Wasser freier Säure als Gegenion durchführt und die durch die Markierungsreaktion gebildete Schiff'sche Base unter Verwendung eines flüchtigen Boran-Komplexes reduziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als flüchtigen Boran-Komplex einen Boran-Pyridin-Komplex, Boran-Triethylamin-Komplex oder Boran-Dimethylamin-Komplex einsetzt.