DE3850593T2

DE3850593T2 - Synthetische Antigene zur Bestimmung der AIDS-bezogenen, von LAV-2 verursachten Krankheiten.

Info

Publication number: DE3850593T2
Application number: DE3850593T
Authority: DE
Inventors: Marc Alizon; Solange Chamaret; Wesley L Cosand; Raymond L Houghton; Luc Montagnier; Andrew J Watson
Original assignee: Institut Pasteur; Genetic Systems Corp
Current assignee: Institut Pasteur; Genetic Systems Corp
Priority date: 1987-03-25
Filing date: 1988-03-24
Publication date: 1994-12-15
Anticipated expiration: 2008-03-25
Also published as: EP0284383A1; EP0284383B1; GR3033885T3; ES2058259T5; ES2058259T3; ATE108457T1; DE3850593T3; EP0284383B2; DE3850593D1; CA1341436C

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG

Ein neues menschliches Retrovirus, bezeichnet als Lymphoadenopathievirus-Typ 2 ("LAV-2"), wurde kürzlich aus westafrikanischen Patienten mit "Acquired Immune Deficiency Syndrome" (AIDS) isoliert. Obwohl dieses Virus mit HIV-1 verwandt ist (auch bekannt als LAV/HTLV-III) waren Seren aus mit LAV-2 infizierten Patienten wiederholt negativ oder reagierten schwach in Screening-Assays auf Antikörper gegen HIV-1 Auf Grund der ernsthaften Bedrohung der Volksgesundheit, die durch ein neues mit AIDS assoziiertes Virus ausgeht, welches nicht ausreichend mit den gegenwärtig erhältlichen Tests für HIV-1 detektiert wird, ergab sich ein sofortiger Bedarf für einen neuen Antikörper-Screening Test. Wünschenswerterweise sollte der Test fähig sein, zwischen Individuen mit Antikörpern gegen HIV-1 gegenüber solchen gegen LAV-2 zu unterscheiden.
Um einen immunodiagnostischen Test für die Identifizierung von Individuen, die vorher LAV-2 ausgesetzt waren, zu entwickeln, ist es notwendig, LAV-2 Proteine und/oder Antikörper gegen solche Proteine zu haben. Wegen des mit dem Wachstum von LAV-2 verbundenen Risikos für die Laborangestellten und auch wegen der technischen Probleme und Unkosten einer Kultur in großem Maßstab und der Reinigung des Virus, gab es ein beträchtliches Interesse an der Entwicklung von alternativen Mitteln für den Erhalt der viralen Proteine oder ihrer immunologischen Äquivalente. Beim Auswählen von Alternativen mußte man mit der Tatsache vertraut sein, daß die HIV-Familie der Retroviren als höchst polymorph beschrieben wurde und auch mit der Möglichkeit, daß zusätzliche Mitglieder der HIV-Familie entdeckt werden können.

2. KURZE BESCHREIBUNG DES TECHNISCHEN HINTERGRUNDS

Die Isolation und teilweise Charakterisierung von LAV-2 aus zwei westafrikanischen AIDS-Patienten wurde anfänglich von Clavel et al., C.r. Acad. Sci. (Paris), 302 : 485-488 (1986) und Clavel et al., Science 233 : 343 (1986) beschrieben. Dieses Virus ist mit HIV-1, dem AIDS-Verursacher, in sowohl seiner Morphologie als auch seiner biologischen Eigenschaften verwandt, wobei die letzteren seinen T4 + - Lymphotropismus und seine cytopatische Wirkung auf T4-Zellinien und Lymphozyten einschließen. Jedoch legen DNA-Hybridisierungsstudien nahe, daß es Regionen ausgeprägter Homologie zwischen HIV-1 und LAV-2 gibt, insbesondere im gag- Gen, der reversen Transkripase-Domäne in pol, den Q-Genen, dem F-Gen und der 3'-LTR. Das Hüllgen, das tat-Gen und ein Teil des pol-Gens scheinen sehr abweichend voneinander zu sein. Clavel et al. (ibid.)
Somit kann, obwohl HIV-1 und LAV-2 verwandt sein können, die Heterogenität der Gene, die für die Hüllproteine kodieren, erklären, warum serologische Kreuz-Reaktivität zwischen den zwei Spezies auf die Epitrope der gag- und pol-Proteine beschränkt zu sein scheint. Dies kann auch für die Schwierigkeiten der käuflich erhältlichen HIV-1-Screening-Tests verantwortlich sein, Antikörper gegen LAV-2 ausreichend zu detektieren. Clavel et al., (ibid.) haben vorgeschlagen, daß trotz der großen Abweichung zwischen den unterschiedlichen env-Genen von HIV-1 und LAV-2 homologe Domänen der Hüllglycoproteine der zwei Viren vorhanden sein können, welche diese an T4-Rezeptoren der Target-Zellen binden.
Es scheint, daß LAV-2 auch mit einem Virus verwandt ist, das als Simian T-Iymphotropes Virus Typ 3 ("STLV-3") bekannt ist, ein Retrovirus, das zuerst aus gefangenen Makaken mit einer AIDS-ähnlichen Krankheit isoliert wurde. Clavel et al. (Nature 324 : 691-695 (1986)) verwendeten Radioimmunopräzipitations-Assays, um zu zeigen, daß Seren von mit LAV-2 infizierten Patienten mit allen STLV-3- Proteinen reagierten, obwohl die Proteine von LAV-2 und STLV-3 durch Unterschiede in den Molekulargewichten unterscheidbar waren. Die Nukleotidsequenz von LAV-2 kann auch sehr ähnlich zu STLV-3 sein, weil LAV-2-Sonden STLV-3 gag- und pol-Regionen unter stringenten Bedingungen gebunden haben, während HIV-1-Sonden nicht mit dem STLV-3-Genom reagierten. Southern Blots von STLV- 3-DNA zeigten ein Restriktionsmuster, welches jedoch von LAV-2-DNA klar unterschiedlich war.
Ein anderes menschliches Retrovirus, bezeichnet als HTLV-IV, wurde auch aus westafrikanischen Patienten isoliert, aber dieses war nicht mit einer AIDS-ähnlichen Krankheit verbunden. Dieses Virus schien auch mit STLV-3 und HIV-1 verwandt zu sein (Kanki et al., Science (1986) 232 : 238-243). Vergleiche von HTLV- IV und LAV-2 wurden nicht berichtet. Ein serologischer Beweis für ein anderes neues Retrovirus, das mit STLV-3 verwandt ist, wurde in Einwohnern von Westafrika berichtet. Barin et al., Lancet, 2 : 1387-89 (1985).
Hopp und Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78 : 3824, beschreiben Kriterien zum Auswählen von Peptiden als potentielle Epitope von Polypeptiden auf der Grundlage ihrer relativen Hydrophilizität. In einer Studie, die diese Kriterien anwendet, wurde ein 12-Aminosäuren-Peptid synthetisiert, das 9% der Antikörper gebunden hat, welche durch das native Protein hervorgerufen worden waren (Hopp, Molec Immuol. (1981) 18 : 869). Im allgemeinen wurde nicht gezeigt, daß die Hopp/Woods-Kriterien einen hohen vorhersagenden Wert haben, insbesondere für solche Regionen, die nicht mit dem höchsten Peak der Hydrophilizität für ein besonderes Protein assoziiert sind. Weiterhin wurden Epitope gezeigt, die nicht hydrophil sind (Kazim et al., Biochem. J. (1982) 203 : 201). Andere Studien der Polypeptid-Antigenizität schließen Green et al., Cell (1982) 28 : 477 ein, wo Peptide verwendet wurden, welche Antikörper hervorriefen, wobei diese Antikörper fähig waren, an das native Protein zu binden, während umgekehrt Antikörper, welche durch das native Protein hervorgerufen worden waren, bei der Bindung an die Peptide versagten; und Trainer et al., Nature (1984) 312 : 127, dessen Ergebnisse mit Myohaemerythrin solchen von Green et al. glichen.
Synthetische Peptide wurden erzeugt, welche durch HIV-1 kodierte Proteine immunologisch nachahmen oder von denen gesagt wurde, daß sie diese nachahmen. Siehe US-Patent 4,629,783 und die Patentveröffentlichung Nr. WO 86/06414, welche hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden; NTIS Veröffentlichungsnummer PB 86-131562 (US-Patentanmeldung mit der Serial No. 779,431) und Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 6159-63 (1986). Pauletti et al., Analyt. Biochem. 151 : 540-546 (1985) verwendet ein Computerprogramm, um mögliche antigene Determinanten für das Hüllglycoprotein (gp160) von HIV-1 vorherzusagen. Starcich et al., CelI 45 : 637-648 (1986) analysierten das gesamte Hüllgen von Isolaten von HIV-1 und postulierten auf der Grundlage einer vorhergesagten Sekundärproteinstruktur und Hydrophilizität, daß bestimmte hypervariable Regionen antigene Stellen darstellten.

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Peptidsequenzen, die fähig sind, in den env- und gag-Regionen des LAV-2-Retrovirus kodierte Proteine immunologisch nachzuahmen, werden als Reagenzien zur Verwendung beim Screening von Blut und Blutprodukten auf vorherigen Kontakt (Ausgesetztsein) mit dem Retrovirus bereitgestellt. Die Peptide sind mindestens fünf Aminosäuren lang und können in verschiedenen spezifischen Bindungsassays für die Detektion von Antikörpern gegen das LAV-2-Virus, für die Detektion von LAV-2-Antigenen oder als Immunogen verwendet werden. In den Beispielen beschriebene Peptide ermöglichen es einem, das Vorhandensein von Antikörpern gegen LAV-2 in einer Körperflüssigkeit von Antikörpern gegen HIV-1 zu unterscheiden.
Ein hier beschriebenes Peptid (41-2-1) hat die folgende Aminosäuresequenz:
worin
Y und Y' jeweils einen oder mehrere Aminosäurereste umfassen; und
n und n' jeweils eine ganze Zahl von mindestens 0 umfassen.
Ein anderes hier beschriebenes Peptid (41-2-2) hat die folgende Aminosäuresequenz:
worin
Y und Y' jeweils einen oder mehrere Aminosäurereste umfassen, und
n und n' jeweils eine ganze Zahl von mindestens 0 umfassen.
Ein anderes hier beschriebenes Peptid (25-2-2) aus der u-Region hat die folgende Aminosäuresequenz:
worin
Y und Y' jeweils einen oder mehrere Aminosäurereste darstellen; und
n und n' jeweils ganze Zahlen von mindestens 0 sind.

3.1. DEFINITIONEN

Wie es hier verwendet wird, bezieht sich "Nor" auf Norleucin und ist beabsichtigt als ein Austausch für bestimmte Methioninreste.
Wie es hier verwendet wird, bezieht sich HIV auf einen menschlichen Immunschwächevirus, der als ein menschliches Retrovirus gekennzeichnet ist, welches für CD4-Antigen exprimierende Zellen tropisch ist und cytopatisch für die Wirtszelle, die es infiziert. Diese Gruppe beinhaltet, aber ist nicht darauf beschränkt, HIV-1 (LAV-1/HTLV-III) und LAV-2.

4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 stellt die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Hüllregion (einschließlich des transmembranen Proteins) von HIV-1 und LAV-2 dar, und zwar unter Verwendung der Einbuchstaben-Symbole für Aminosäurereste wie folgt:
A (Alanin), R (Arginin), N (Asparagin), D (Asparaginsäure), C (Cystein), Q (Glutamin), E (Glutaminsäure), G (Glycin), H (Histidin), I (Isoleucin), L (Leucin), K (Lysin), M (Methionin), F (Phenylalanin), P (Prolin), S (Serin), T (Threonin), W (Tryptophan), Y (Tyrosin), V (Valin).
Fig. 2 stellt die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Kern-(gag)-Region von HIV-1 und LAV-2 dar, und zwar unter Verwendung der Einzel-Buchstaben-Symbole für Aminosäurereste, wie es für Fig. 1 beschrieben ist.
Die Sequenzen der Viren sind so ausgerichtet, daß sie maximale Homologien zwischen den zwei Sequenzen anzeigen.

5. BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Es werden neue Peptide bereitgestellt, die Proteine immunologisch nachahmen, welche durch das LAV-2-Retrovirus kodiert werden, insbesondere Proteine, die durch die env- und gag-Regionen des viralen Genoms kodiert werden. Um Stammzu-Stamm-Variationen zwischen den verschiedenen Isolaten anzupassen, sollten Angleichungen für konservative Austausche und Selektion zwischen den Alternativen, wo nicht-konservative Austausche beteiligt sind, durchgeführt werden. Diese Peptide können für die Detektion des Virus oder der Antikörper gegen das Virus in einer physiologischen Probe verwendet werden. Abhängig von der Natur des Testprotokolls können diese Peptide markiert oder unmarkiert, gebunden an eine feste Oberfläche, konjugiert an einen Träger oder andere Verbindungen o. ä. sein.
Die interessierenden Peptide werden aus der Hüllregion des Virus stammen. Diese Peptide können aus einer Region der Hülle stammen, von der angenommen wird, daß sie das transmembrane Protein analog zu gp41 in HIV-1 ist. Von besonderem Interesse ist die Region innerhalb des env-offenen Leserahmens (siehe Fig. 1), die sich von ungefähr Aminosäurerestnummer 556 bis ungefähr 675 und insbesondere von den Aminosäurerestnummern 578 bis 603, 578 bis 598 oder 578 bis 591 des offenen Leserahmens erstreckt oder von 587 bis 603 oder 590 bis 603. Auch von besonderem Interesse ist die Region, die sich von ungefähr Aminosäurerest 638 bis ungefähr 662 erstreckt.
Die interessierenden Peptide können auch aus der Kernregion des Virus stammen. Von besonderem Interesse sind die Regionen innerhalb des gag-offenen Leserahmens (siehe Fig. 2), der sich von ungefähr Aminosäurerestnummer 331 bis 352 und Aminosäurerestnummer 274 bis 316 des offenen Leserahmens erstreckt.
Die interessierenden Peptide umfassen mindestens 5, manchmal 6, manchmal 8, manchmal 12, manchmal 14, manchmal 17, manchmal 21, gewöhnlich weniger als ungefähr 50, am häufigsten weniger als ungefähr 35 und vorzugsweise weniger als ungefähr 26 Aminosäuren, welche innerhalb einer Sequenz, für die das LAV-2 Retrovirus kodiert, enthalten sind. Wünschenswerterweise werden die Peptide so klein wie möglich sein, während sie im wesentlichen die ganze Sensitivität des größeren Peptids noch beibehalten haben. In einigen Beispielen kann es wünschenswert sein, zwei oder mehrere Oligopeptide, welche sich nicht überlappen, zu verbinden, um eine einzelne Peptidstruktur zu bilden oder um sie als individuelle Peptide zur gleichen Zeit zu verwenden, welche zu dem Stamm(peptid) entsprechende Sensitivität getrennt oder zusammen, bereitstellen.
Das Peptid kann durch Einführen konservativer oder nicht-konservativer Austausche in dem Peptid modifiziert sein, gewöhnlich sind weniger als 20 Anzahl- Prozent, noch üblicher weniger als 10 Anzahl-Prozent der Aminosäuren ausgetauscht. In solchen Situationen, wo gefunden wird, daß Regionen polymorph sind, kann es wünschenswert sein, eine oder mehrere spezielle Aminosäuren zu variieren, um wirksamer die sich unterscheidenden Epitope der unterschiedlichen retroviralen Stämme nachzuahmen. In vielen Beispielen kann Methionin durch Norleucin (Nor) ersetzt werden, um chemische Stabilität zu schaffen.
Es sollte verstanden werden, daß das in der vorliegenden Erfindung verwendete Polypeptid nicht identisch zu irgendeiner speziellen LAV-2-Polypeptidsequenz zu sein braucht, solange wie die vorliegende Verbindung fähig ist, ein Epitop von mindestens einem der Stämme des LAV-2-Retrovirus immunologisch nachzuahmen.
Deshalb kann das vorliegende Polypeptid der Gegenstand verschiedener Veränderungen sein, wie z. B. Insertionen, Deletionen und Substitutionen, entweder konservativ oder nicht-konservativ, wo solche Veränderungen bestimmte Vorteile in ihrer Verwendung schaffen können. Durch konservative Austausche sind Austausche innerhalb Gruppen beabsichtigt, wie Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu,; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; Phe, Tyr; und Nor, Met. Gewöhnlich wird sich die Sequenz um nicht mehr als 20% von der Sequenz mindestens eines Stammes eines LAV-2- Retrovirus unterscheiden, außer wo zusätzliche Aminosäuren an jedem Terminus hinzugefügt werden können, und zwar aus dem Grund der Bereitstellung eines "Arm", durch den das Peptid dieser Erfindung geeignet immobilisiert werden kann. Die Arme werden gewöhnlich mindestens eine Aminosäure und können 50 oder mehr Aminosäuren, häufiger 1 bis 10 Aminosäuren lang sein. Das Peptid, in dem die Aminosäuresequenz durch Substitution, Addition oder Deletion von Aminosäureresten modifiziert ist, sollte im wesentlichen die gesamte immunologische Reaktivität des nicht-modifizierten Peptids beibehalten, welche geeignet durch Radioimmunopräzipitation, Immunfluoreszenz oder "enzyme-linked immunosorbant assays (ELISA)" gemessen werden kann.
Zusätzlich können ein oder zwei Aminosäuren an die Enden eines Oligopeptids oder Peptids hinzugefügt werden, um zur Erleichterung des Verbindens eines Peptids an ein anderes beizutragen, um an einen Träger oder ein größeres Peptid anzukoppeln, aus Gründen, die nachfolgend diskutiert werden, um die physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids oder Oligopeptids zu modifizieren o.a.
Aminosäuren, wie Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutamin- oder Asparaginsäure, o. ä., können an dem C- oder N-Terminus des Peptids oder Oligopeptids eingeführt werden, um eine nützliche Funktionalität zum Verknüpfen bereitzustellen. Cystein ist besonders bevorzugt, um die kovalente Bindung an andere Peptide zu erleichtern oder um Polymere durch Oxidation zu bilden. Um Polymere zu bilden, ist es bevorzugt, daß mindestens zwei Cystein-Reste in den zu verbindenden Molekülen vorhanden sind, vorzugsweise durch Verwendung von Cystein-Resten, die an die terminalen Teile der Peptide hinzugefügt wurden. Kombinationen von Cystein mit unterbrechenden Aminosäure-Spacern sind auch nützlich. Zum Beispiel können zwei Cystein-Reste durch einen oder mehrere Aminosäurereste getrennt sein. Glycinreste sind besonders nützlich und von einem bis drei Glycinreste können zwischen den Aminosäuren verwendet werden.
Zusätzlich können sich die Peptid- oder Oligopeptidsequenzen von der natürlichen Sequenz unterscheiden, und zwar durch die Sequenz, die durch terminale -NH&sub2;- Acylierung, z. B. Acetylierung, oder Thioglykolsäureamidierung, terminale -Carboxy- Amidierung, z. B. mit Ammoniak oder Methylamin, modifiziert wird, um Stabilität, vergrößerte Hydrophobizität zum Verknüpfen oder Binden an einen Träger oder ein anderes Molekül bereitzustellen oder zur Polymerisierung.
Die vorliegende Erfindung basiert, teilweise, auf der Erkenntnis, daß die Aminosäuresequenz von Peptiden, welche die Proteine von LAV-2 immunologisch nachahmen, auf der Grundlage ihrer Lokalisation innerhalb eines LAV-2-Proteins identifiziert werden kann. Solche Lokalisationen innerhalb der LVA-2-Proteine können durch Bezugnahme auf HIV-1-Sequenzdaten wie folgt identifiziert werden:
(a) die Aminosäuresequenzen von HIV-1 und LAV-2 können so ausgerichtet werden, um maximale Homologie zwischen den zwei Sequenzen zu erhalten (siehe Fig. 1);
(b) Peptide umfassend die LAV-2 Aminosäuresequenzen, die der Lokalisation von HIV-1-Peptiden entsprechen, welche immunologisch HIV-1-Proteine nachahmen, können identifiziert werden. Trotz des Verlusts der ausgeprägten Homologie zwischen solchen HIV-1 und LAV-2-Sequenzen sollten Peptide, die so identifizierte LAV-2-Aminosäuresequenzen umfassen, immunologisch LAV-2-Proteine nachahmen.
Das Verfahren zum Identifizieren von LAV-2-Aminosäuresequenzen, die immunologisch ein LAV-2-Protein nachahmen, ist durch die Identifikation der Peptide 41-2-1, 41-2-2 und 25-2-2, die in den Beispielen hier beschrieben sind, demonstriert. Die Sequenz der Peptide 41-2-1, 41-2-2 und 25-2-2 wurde durch Ausrichten der Hüll- und Kern-Aminosäuresequenzen von HIV-1 und LAV-2 entdeckt, um maximale Homologien zu erhalten. Die LAV-2-Aminosäuresequenzen, die der Lokalisation von Peptid 39 von HIV-1 entsprechen, wurden synthetisiert (Peptid 39 von HIV-1 ahmt immunologisch die HIV-1-Hülle nach; siehe US-Patent Nr. 4,629,783). Ähnlich wurde die LAV-2-Aminosäuresequenz, die der Lokalisation von Peptid 23 von HIV-1 (siehe US-Patent Nr. 4,629,783) entspricht, synthetisiert. Zusätzlich wurde die LAV-2-Aminosäuresequenz, die der Lokalisation von Peptid 15 von HIV-1 (siehe US-Patent Nr. 4,629,783) entspricht, synthetisiert. Die entsprechenden LAV-2-Peptide, genannt 41-2-1, 41-2-2 bzw. 25-2-2 ahmen LAV- 2 immunologisch nach, wie es in den Beispielen hier demonstriert ist, und sie können verwendet werden, um Antikörper in Körperflüssigkeiten zu detektieren. Dieses Verfahren kann ähnlich auf HIV-2-Stämme angewendet werden, die bisher noch nicht entdeckt sind. Zum Beispiel können, wenn neue Stämme von HIV identifiziert werden, ihre Hüll- und Kern-Aminosäuresequenzen so mit denen von HIV-1 und/oder LAV-2 ausgerichtet werden, um maximale Homologie zu erhalten. Die Verfahren, durch die die Sequenzen ausgerichtet werden können, sind dem Fachmann bekannt. Beim Ausrichten der Sequenzen ist es wünschenswert, soviel Homologie wie möglich zwischen Cystein-Resten beizubehalten. Die Aminosäuresequenz des neuen HIV-Stamms oder -Spezies, die der Lokalisation von Peptid 39 von HIV-1 oder Peptid 41-2-1 von LAV-2 entspricht, kann synthetisiert und erfindungsgemäß verwendet werden. Ebenso kann die Aminosäuresequenz, die Peptid 23 von HIV-1, wie es in US-Patent Nr. 4,629,783 offenbart ist, und Peptid 41-2-2 von LAV-2 entspricht, ähnlich identifiziert und synthetisiert werden.
Entsprechend kann die Aminosäuresequenz, die Peptid 15 von HIV-1, wie es im US-Patent Nr. 4,629,783 offenbart ist, und Peptid 25-2-2 von LAV-2 entspricht, identifiziert und synthetisiert werden.
Obwohl das oben beschriebene Verfahren Aminosäuresequenzen aus Regionen von Immunodominanz identifiziert, ist es für die vorliegende Erfindung nicht notwendig, daß die Epitope, die innerhalb solcher Sequenzen enthalten sind, mit Antikörpern aller Stämme oder Spezies von HIV kreuzaktiv sind. Peptide, die immunologisch Epitope umfassen, welche eine Spezies oder Serogruppe von einer anderen unterscheidet, werden beim Identifizieren spezieller Spezies oder Serogruppen Anwendung finden und können in der Tat beim Identifizieren von mit einer oder mehreren Spezies oder Serogruppen von HIV-infizierten Individuen helfen.
Eine Anzahl von interessierenden Peptiden, die aus der Hüllregion von LAV-2 stammen, insbesondere das Glykoprotein auf das als das transmembrane Protein analog zu gp 41 von HIV-1 Bezug genommen wird, sind unten beschrieben. Peptid I, aus als 41-2-1 bezeichnet, wird in dem env-offenen Leserahmen von ungefähr Aminosäurerestnummer 578 bis ungefähr 603 kodiert und hat die folgende Aminosäuresequenz, wo Oligopeptide, die innerhalb der folgenden Sequenz enthalten sind, lineare Epitope innerhalb solch einer Sequenz enthalten werden:
worin Y und Y', falls vorhanden, jeweils einen oder mehrere Aminosäurereste darstellen; und n und n' jeweils eine ganze Zahl von mindestens 0 umfassen. Wenn Y und/oder Y' vorhanden sind, können diese Aminosäuresequenzen umfassen, welche Aminosäurereste 578 bis 603 der LAV-2-Hüllsequenz (siehe Fig. 1) flankieren oder irgendeinen Teil dieser flankierenden Sequenzen. Insbesondere kann Y die ganze oder Teile der LAV-2-Hüllaminosäuresequenz von ungefähr Restnummer 556 bis 577 umfassen; Y' kann die ganze oder Teile der LAV-2-Hüllaminosäuresequenz von ungefähr Restnummer 604 bis 675 umfassen.
Alternativ können verkürzte Sequenzen des Peptids 41-2-1 hergestellt werden. In dieser Hinsicht kann die folgende Sequenz besonders nützlich sein:
worin Y und/oder Y', falls vorhanden, jeweils einen oder mehrere Aminosäurereste darstellen; und n und n' jeweils ganze Zahlen von mindestens 0 sind.
worin Y und/oder Y', falls vorhanden, jeweils einen oder mehrere Aminosäurereste darstellen; und n und n' jeweils ganze Zahlen von mindestens 0 sind.
worin Y und Y', falls vorhanden, jeweils einen oder mehrere Aminosäurereste darstellen; und n and n' jeweils ganze Zahlen von mindestens 0 sind.
worin Y und Y', falls vorhanden, jeweils einen oder mehrere Aminosäurereste darstellen; und n und n' jeweils ganze Zahlen von mindestens 0 sind.
Ein anderes interessierendes Peptid, das auch aus der Hüllregion von LAV-2 stammt und 41-2-2, oder Peptid VI, bezeichnet wird, umfaßt die ganze oder Teile der LAV-2-Aminosäuresequenz von ungefähr Restnummer 638 bis ungefähr 662 (Fig. 1), wo innerhalb der folgenden Sequenz enthaltende Oligopeptide lineare Epitope innerhalb solch einer Sequenz enthalten werden:
worin Y und Y' jeweils einen oder mehrere Aminosäurereste umfassen, und n und n' jeweils eine ganze Zahl von mindestens 0 umfassen.
Ein anderes interessierendes Peptid, das aus der u-Region von LAV-2 stammt und 25-2-2, oder Peptid VII, bezeichnet wird, umfaßt die ganze oder Teile der LAV-2-Aminosäuresequenz von ungefähr Restnummer 331 bis 352 (Fig. 2), wo innerhalb der folgenden Sequenz enthaltende Oligopeptide lineare Epitope innerhalb solch einer Sequenz enthalten werden:
worin Y und Y', falls vorhanden, jeweils einen oder mehrere Aminosäurereste darstellen; und n und n' jeweils ganze Zahlen von mindestens 0 sind.
Ein anderes interessierendes Peptid, das auch aus der gag-Region von LAV-2 stammt und als 25-2-6, oder Peptid VIII, bezeichnet wird, umfaßt die ganze oder Teile der LAV-2-Aminosäuresequenz von ungefähr Restnummer 274 bis ungefähr 316 (Fig. 2), wo innerhalb der folgenden Sequenz enthaltende Oligopeptide lineare Epitope innerhalb solch einer Sequenz enthalten werden:
worin Y und Y', falls vorhanden, jeweils einen oder mehrere Aminosäurereste darstellen; und n und n' jeweils ganze Zahlen von mindestens 0 sind.
Wenn Y oder Y' vorhanden sind, existiert ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel, wenn Y oder Y' einen oder mehrere Cystein-Reste oder eine Kombination eines oder mehrerer Cystein-Reste mit Spacer-Aminosäuren umfassen. Glycin ist ein besonders bevorzugter Spacer. Bevorzugte Peptide zur Verwendung bei der oxidativen Polymerisierung sind solche, in denen Y oder Y' mindestens zwei Cystein-Reste darstellen. Wenn zwei Cystein-Reste am gleichen Ende des Peptids vorhanden sind, existiert eine bevorzugte Ausführungsform, wenn die Cystein- Reste von einem bis drei Spacer-Aminosäureresten, vorzugsweise Glycin, getrennt sind. Das Vorhandensein von Glycinresten kann die Bildung von Dimeren des Peptids erlauben und/oder die Hydrophobizität des sich ergebenden Peptids vergrößern, was die Immobilisierung des Peptids in fester Phase oder immobilisierten Assay-Systemen erleichtert.
Von besonderem Interesse ist die Verwendung der Mercaptan-Gruppe von Cysteinen oder Thioglykolsäuren, die für die Acylierung terminaler Aminogruppen o. ä. zum Verknüpfen zweier Peptide oder Oligopeptide oder Kombinationen davon durch eine Disulfidbindung oder eine längere Bindung verwendet werden. Um dies zu erreichen, können Verbindungen mit bis-Haloacetylgruppen, Nitroarylhalogeniden o. ä. verwendet werden, wo die Reagenzien für Thiogruppen spezifisch sind. Somit kann die Verknüpfung zwischen den zwei Mercaptogruppen der verschiedenen Peptide oder Oligopeptide eine einzelne Bindung oder eine Verknüpfungsgruppe von mindestens 2, gewöhnlich mindestens 4, und nicht mehr als ungefähr 16, gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 14 Kohlenstoffatomen sein.
Die vorliegenden Peptide können verbunden mit einem löslichen makromolekularen (z. B. nicht weniger als 5 kDal)-Träger verwendet werden. Geeigneterweise kann der Träger eine Poly(aminosäure), entweder natürlich vorkommend oder synthetisch, sein, an den Antikörper gebunden werden, welche verschieden von denen sind, die man im menschlichen Serum antrifft. Illustrative Polypeptide beinhalten Poly-L-lysin, Rinderserumalbumin, Schlüsselloch-Napfschnecke-Hemocyanin, Rinder-gamma-Globulin etc. Die Wahl wird bestimmt von Geeignetheit und Verfügbarkeit.
Mit solchen Konjugaten gibt es mindestens ein Molekül von mindestens einem vorliegenden Peptid pro Makromolekül und nicht mehr als ungefähr 1 pro 0,5 kDal, gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 1 pro 2 kDal des Makromoleküls. Ein oder mehrere verschiedene Peptide können mit demselben Makromolekül verknüpft sein.
Die Verknüpfungsweise ist gewöhnlich, unter Verwendung solcher Reagenzien wie p-Maleinimidobenzoesäure, p-Methyldithiobenzoesäure, Maleinsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, Glutaraldehyd etc. Die Verknüpfung kann am N-Terminus, C-Terminus oder an Stellen zwischen den Enden des Moleküls stattfinden. Das betreffende Peptid kann durch Verknüpfung derivatisiert werden, kann verknüpft werden, während es an einen Träger gebunden ist, o. ä.
Die Verbindungen können als markierte oder unmarkierte Verbindungen abhängig von ihrer Verwendung verwendet werden. (Durch die Markierung ist ein Molekül beabsichtigt, das direkt oder indirekt ein detektierbares Signal bereitstellt.) Verschiedene Markierungen können verwendet werden, wie z. B. Radionuklide, Enzyme, Fluoreszierer, Chemiluminizierer, Enzymsubstrate, Kofaktoren oder Inhibitoren, Partikel, z. B. magnetische Partikel, Kombinationen von Liganden und Rezeptoren, z. B. Biotin und Avidin, o. ä. Zusätzlich können die Polypeptide in einer Vielzahl von Wegen zum Binden an eine Oberfläche modifiziert sein, z. B. an Mikrotiterplatten, Glaskügelchen, Chromatographieoberflächen, z. B. Papier, Zellulose, Silikagel o. ä. Die spezielle Weise, in der die Polypeptide an eine andere Verbindung oder Oberfläche gebunden werden, ist gewöhnlich und findet ausreichende Erläuterung in der Literatur. Siehe z. B. US-Patente Nrs. 4,371,515; 4,487,715; und darin zitierte Patente.
Verschiedene Assay-Protokolle können zum Detektieren des Vorhandenseins von entweder Antikörpern gegen retrovirale Proteine oder retrovirale Proteine selbst verwendet werden. Von speziellem Interesse ist die Verwendung des Peptids als markiertes Reagenz, wo die Markierung ein detektierbares Signal ermöglicht oder Bindung des Peptids, entweder direkt oder indirekt an eine Oberfläche, wo der Antikörper gegen das Peptid in der Probe an das Peptid auf der Oberfläche gebunden wird. Das Vorhandensein eines menschlichen Antikörpers, der an das Peptid gebunden ist, kann dann unter Verwendung eines xenogenetischen Antikörpers, der für menschliches Immunglobulin, normalerweise sowohl menschliches IgM als auch IgG, spezifisch ist, detektiert werden oder unter Verwendung eines markierten Proteins, das für Immunkomplexe spezifisch ist, z. B. Rf-Faktor oder S. aureus Protein A.
Verschiedene heterogene Protokolle können angewendet werden, entweder kompetitive oder nicht-kompetitive. Peptide können an eine Oberfläche oder einen Träger ("Träger") gebunden sein, und einem markierten Antikörper kann es erlaubt sein, mit einem Antikörper in der Probe um die limitierte Menge eines gebundenen Peptids zu kompetitieren. Die Menge der Markierung, die an den Träger gebunden ist, würde einen Bezug zu der Menge des kompetitiven Antikörpers in der Probe haben.
Der Antikörper kann an den Träger gebunden sein und die Probe mit dem markierten Peptid kombiniert sein. Nach Kontakt des Reaktionsgemischs mit dem gebundenen Antikörper würde die Menge der Markierung, die an den Träger gebunden ist, einen Bezug zu der Menge des verwandten Antikörpers in der Probe haben.
Xenogenische Anti-Menschen-Antikörper, z. B. Antikörper gegen Fc von IgG und IgM (Immunglobuline), können an einen Träger gebunden sein. Die Probe könnte mit den Immunglobulinen und dem markierten Peptid kontaktiert werden, wodurch die Menge des an den Träger gebundenen markierten Peptids auf das Vorhandensein der verwandten Antikörper hinweisend sein würde.
Alternativ können homogene Assays verwendet werden, wo das Peptid an ein Enzym, einen Fluoreszierer oder eine andere Markierung gebunden ist, wo die Bindung des Antikörpers an das Peptid dazu führt, zwischen der Markierung, die an einem spezifischen Bindungspaarkomplex beteiligt ist, und einer Markierung, die nicht an einem solchen Komplex beteiligt ist, unterscheiden zu können. Für Assays, die solche Techniken umfassen, siehe z. B. US-Patente Nrs. 3,817,837; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; und 4,098,876, deren Offenbarung durch Bezugnahme hier eingebaut ist.
Als eine Erläuterung der vorliegenden Erfindung kann das vorliegende Peptid an ein fluoreszierendes Molekül konjugiert sein, wie z. B. Fluoreszein, Rhodamin oder Umbelliferon. Verschiedene Techniken können zur Detektion der Komplexbildung mit Antikörpern verwendet werden, z. B. Fluoreszenzpolarisation. Bei diesem Assay ist die Fluoreszenzpolarisation unterschiedlich zwischen einem komplexierten und unkomplexierten Peptidkonjugat. Zum Messen der Veränderungen der Fluoreszenzpolarisation sind Vorrichtungen verfügbar, z. B. TDx, geliefert von Abbott Laboratories, Chicago, Illinois.
Erläuternd für eine Assaytechnik ist die Verwendung eines Probenbehälters, z. B. Mikrotiterplattenvertiefungen, wo das vorliegende Polypeptid oder dessen Konjugate an den Behälterboden und/oder die Wände entweder kovalent oder nichtkovalent angeheftet sind. Die Probe, normalerweise menschliches Blut oder Serum verdünnt in einem geeignet gepufferten Medium, wird in den Behälter hinzugefügt und eine ausreichende Zeit für die Komplexbildung zwischen dem/den Polypeptid(en) und irgendwelchen verwandten Antikörpern in der Probe wird zur Verfügung gestellt. Der Überstand wird entfernt und der Behälter gewaschen, um nicht spezifisch gebundene Proteine zu entfernen.
Ein markiertes spezifisches Bindungsprotein, das an den Komplex spezifisch bindet, wird zur Detektion verwendet. In den Behälter können xenogenetische Antiseren gegen menschliches Immunglobulin, insbesondere Anti- (menschliches IgM und IgG) in einem geeignet gepufferten Medium hinzugefügt werden. Die xenogenetischen Antiseren werden normalerweise mit einer detektierbaren Markierung markiert, z. B. einem Radionuklid oder Enzym. Anstelle von Antiseren können für den Immunkomplex spezifische Proteine verwendet werden, z. B. S aureus Protein A. Die Markierung kann dann detektiert werden. Zum Beispiel wird bei einem Enzym, nach Entfernung einer nicht-spezifisch gebundenen Enzymmarkierung, eine Entwicklerlösung hinzugefügt. Die Entwicklerlösung wird ein Enzymsubstrat und möglicherweise Enzymkofaktoren, Chromogene etc. enthalten, welche nach Reaktion ein gefärbtes oder fluoreszierendes Produkt bereitstellen, das kolorimetrisch bzw. fluorimetisch detektiert werden kann.
Das Peptid kann auf einer breiten Vielzahl von Wegen hergestellt werden. Das Peptid kann wegen seiner relativ kurzen Größe in Lösung oder auf einem festen Träger gemäß herkömmlicher Techniken synthetisiert werden. Verschiedene automatische Synthetisierer sind heute käuflich erhältlich und können gemäß bekannter Protokolle verwendet werden. Siehe z. B. Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, zweite Aufl., Pierce Chemical Co., 1984; und Tam et al., J. Am. Chem. Soc. (1983)105 : 6442.
Alternativ kann Hybrid-DNA-Technologie angewendet werden, wo ein synthetisches Gen durch Verwendung von Einzelsträngen hergestellt werden kann, welche für das Polypeptid oder im wesentlichen dessen komplementäre Stränge kodieren, wo die Einzelstränge überlappen und in einem "annealing"-Medium zusammengebracht werden können, und hybridisieren. Die hybridisierten Stränge können dann zur Bildung eines vollständigen Gens ligiert sein, und durch Auswahl geeigneter Termini kann das Gen in Expressionsvektoren, welche heute leicht erhältlich sind, insertiert sein. Siehe z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Oder die Region des viralen Genoms, das für das Peptid kodiert, kann durch herkömmliche rekombinate DNA-Technik kloniert und exprimiert werden (siehe Maniatis, supra).
Fragmente aus einer Sequenz können zur Expression von Peptidfragmenten verwendet werden, konservative Basenaustausche können gemacht werden, wo das/ die modifizierte(n) Kodon(s) für die selbe(n) Aminosäure(n) kodiert/kodieren oder nicht-konservative Veränderungen können in der kodierenden Sequenz gemacht werden, wo die sich ergebende Aminosäure eine konservative oder nicht-konservative Veränderung in der Aminosäuresequenz sein kann, welche vorher diskutiert wurde.
Die kodierende Sequenz kann am entweder 5'- oder 3'-Terminus oder an beiden Termini verlängert sein, um das Peptid zu verlängern, während seine epitope(n) Stelle(n) beibehalten wird/werden. Die Verlängerung kann einen Verknüpfungsarm, z. B. an eine Markierung, wie ein Enzym, bereitstellen, um dieses und andere Peptide zusammen in derselben Kette zu verbinden, zum Bereitstellen antigener Aktivität o. ä.
Zur Expression wird die kodierende Sequenz mit Start- und Stopkodons, Promotor und Terminatorregionen und gewöhnlich einen Replikationssystem ausgestattet werden, um einen Expressionsvektor für die Expression in einem zellulären Wirt bereitzustellen, z. B. einem prokaryotischen oder eukaryotischen, bakteriellen, Hefe- oder Säugetierwirt etc.
Die DNA-Sequenz selbst, deren Fragmente oder längere Sequenzen, gewöhnlich mindestens 15 Basen, vorzugsweise mindestens 18 Basen, können als Sonden für die Detektion retroviraler RNA oder proviraler DNA verwendet werden. Zahlreiche Techniken sind beschrieben, wie z. B. die Grundstein-Hogness-Technik, Southern- Technik, Northern-Technik, Dot-Blot, Verbesserungen davon, ebenso wie andere Methoden. Siehe z. B. WO 83/02277 und Berent et al., Biotechniaues (1985) 3 : 208.
Geeignet kann das Polypeptid als Fusionsprotein hergestellt werden, wo das Polypeptid der N- oder C-Terminus des Fusionspolypeptids ist. Das sich ergebende Fusionsprotein kann selbst direkt als Reagenz verwendet werden, oder das vorliegende Polypeptid kann von der ganzen oder einem Teil der verbleibenden Sequenz des Fusionsproteins abgespalten werden. Bei einem Polypeptid, wo es keine internen Methionine gibt, kann das Polypeptid durch Einführen eines Methionins an der Fusionsstelle unter Verwendung von Bromcyan gespalten werden. Wo es ein internes Methionin gibt, würde es notwendig, eine proteolytische Spaltstelle zu schaffen, z. B. Polylysin und/oder Arginin oder Kombinationen davon, oder das interne Methionin könnte durch eine Aminosäure, wie Leucin, ersetzt werden und ein N-terminales Methionin für die Bromcyanspaltung hinzugefügt werden. Eine breite Vielzahl von Proteasen einschließlich Dipeptidasen sind gut bekannt, und das geeignete Prozessierungssignal könnte an der geeigneten Stelle eingeführt werden. Das Prozessierungssignal kann, um eine Spaltung sicherzustellen, Tandem Repeats haben, weil das Vorhandensein von einer oder mehreren fremden Aminosäuren nicht die Verwendbarkeit der vorliegenden Polypeptide stören wird.
Abhängig von der Natur des Assays kann die physiologische Probe, z. B. Speichel, Blut, Plasma oder Serum durch Verdünnung in einem Assaymedium vorbehandelt sein, welches gewöhnlich eine wäßrige gepufferte Lösung unter Verwendung einer Vielzahl von Puffern, wie z. B. Phosphat, Tris o. ä. sein wird. Ein bevorzugtes Verdünnungsmittel ist 2,5% w/v fettarme Trockenmilch, 0,01% Thimerosal, 0,005% Antifoam A in 20 mM Natriumcitrat.
Gewöhnlich wird der pH im Bereich von ungefähr 6 bis 9 sein. Die Probe wird dann mit dem Reagenz gemäß des geeigneten Protokolls kombiniert, und es wird genügend Zeit zum Binden gelassen. Wo ein heterogenes System verwendet wird, folgen den Bindungsschritten gewöhnlich Waschschritte, um die nicht-spezifische Bindung zu minimieren. Am Ende der Prozedur wird die Markierung gemäß herkömmlicher Verfahren detektiert.
Neben der Verwendung des vorliegenden Peptids und seiner Analoga in Assays kann das vorliegende Peptid auch selbst oder in Kombination Verwendung in Vakzinen finden. Die Peptide können in einer gewöhnlichen Weise formuliert sein, gewöhnlich bei Konzentrationen im Bereich von 1 ug bis 20 mg/kg Wirt. Physiologisch verträgliche Medien können als Träger verwendet werden, z. B. steriles Wasser, Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung u.ä. Adjuvantien können verwendet werden, z. B. Aluminiumhydroxidgel o. ä. Die Verabreichung kann durch Injektionen erfolgen, z. B. intramuskulär, peritoneal, subkutan, intravenös etc. Die Verabreichung kann einmal oder mehrmals sein, gewöhnlich in ein bis vier Wochen Intervallen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung verdeutlichen, aber nicht beschränken.

6. EXPERIMENTALTEIL

Die Peptide I(41-2-1), IV (41-2-3), V (41-2-4) und VII (25-2-2) wurden auf einem t-Butyloxycarbonyl (BOC)-methylbenzylcystein-phenyl-acetamidomethyl (PAM)polystyrol/divinylbenzol-Harz (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California) zusammengesetzt. Symmetrische Anhydridkopplungen wurden in einem Applied Biosystems 430A-Synthetisierer durchgeführt.
Peptid II (41-2-2) wurde auf einem t-Butyloxycarbonyl (BOC)-methylbenzylasparagin-phenyl-acetamidomethyl (PAM)-polystyrol/divinylbenzol-Harz (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California) zusammengesetzt. Symmetrische Anhydridkopplungen wurden in einem Applied Biosystems 430A-Synthetisierer durchgeführt.
Peptid VIII (25-2-6) wurde auf einem t-Butyloxycarbonyl (BOC)-chlorbenzyloxycarbonyllysin-phenyl-acetamidomethyl (PAM)-polystyrol/divinylbenzol-Harz (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California) zusammengesetzt. Symmetrische Anhydridkopplungen wurden in einem Applied Biosystems 430A-Synthetisierer durchgeführt.
Dicyclohexylcarbodiimidkopplungen in Anwesenheit von Hydroxybenzotriazol wurden für Asparagin und Glutamin verwendet. Seitenkettenschutz auf Benzylbasis und BOC-alpha-amin-Schutz wurden verwendet. Anderer routinemäßig verwendeter Seitenkettenschutz war BOC-(formyl)-tryptophan, BOC-methioninsulfoxid, BOC-(tosyl)-arginin, BOC-(methylbenzyl)cystein, BOC-(tosyl)-histidin, BOC- (chlorbenzyloxycarbonyl)-lysin und BOC-(brombenzyloxycarbonyl)-tyrosin.
Schutzgruppenabspaltung und Abspaltung des Peptids vom Harz wurden durch das Tam "niedrig-hoch" HF-Protokoll (Tam et al., suora) durchgeführt. Die Extraktion von dem Harz wurde mit 5% Essigsäure durchgeführt, und das Extrakt wurde einer Gelfiltrationschromatographie in 5% Essigsäure unterworfen.
Peptid 39 wurde, wie es in US-Patent Nr. 4,629,783, welches hier durch bezugnahme eingebaut ist, beschrieben ist, hergestellt.

6.1 ANALYSE DURCH ELISA

Die Peptide 41-2-1 und 39 wurden als Stammlösungen von 4 mg/ml in 6 M Guanidin-HCl oder als oxidierte Peptidansätze, wie oben beschrieben, aufbewahrt. Die Peptide wurden in 0,05 M Natriumcarbonat/Bicarbonatpuffer (pH 9,3) auf Endkonzentrationen von 6,25 ug/ml (Peptid 41-2-1) und 20 ug/ml (Peptid 39) verdünnt. Einhundert Mikroliter Aliquots wurden pro Mikrotiter-Vertiefung (well) hinzugefügt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann mit Blotto (5% [w/v] fettarmer Trockenmilch, 0,01% Thimerosal, 0,01% Antifoam A in 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,2, 0,15 M Natriumchlorid) enthaltend 0,5 M Ethanolamin für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Serum- oder Plasmaproben wurden 1 : 101 mit Verdünnungsmittel (2,5% [w/v] fettarmer Trockenmilch, 0,01% Thimerosal, 0,005% Antifoam A in 20 mM Natriumcitrat) verdünnt und 100 ul des verdünnten Serums oder Plasmas wurde pro Vertiefung für eine Stunde bei 37 ºC hinzugefügt. Die Seren oder das Plasma wurden abgesaugt, und die Platten wurden dreimal in Waschpuffer (0,15 M NaCl, 0,05% [w/v] Tween 20) gewaschen bevor 100 ul des Ziegen-anti-Mensch Ig/Meerrettichperoxidasekonjugats (verdünnt 1 : 10.000 in Verdünnungsmittel enthaltend 1% normal-Ziegenserum in Citratpuffer, pH 7,0) für eine Stunde bei 37 ºC hinzugefügt wurde. Das Konjugat wurde entfernt, und die Platten wurden wieder dreimal, wie oben beschrieben, gewaschen. Der ELISA-Assay wurde durch Hinzufügen von 100 ul/Vertiefung der Substratlösung (80 ug/ml Tetramethylbenzidin, 0,0015% Wasserstoffperoxid in Citrat/Phosphat-Puffer, pH 6,0) für 30 Minuten bei Raumtemperatur entwickelt. Die Reaktionen wurden mit dem Zusatz von 100 ul 3 N H&sub2;SO&sub4; pro Vertiefung gestoppt, und das Verhältnis der optischen Dichte bei 450 nm zu 630 nm wurde durch ein automatisches ELISA-Lesegerät bestimmt.
Das Peptid 41-2-2 wurde, wie oben beschrieben, hergestellt, aber auf eine Endkonzentration von 1,6 ug/ml verdünnt bevor 100 ul Aliquots in die Vertiefungen gefüllt wurden. Die Peptide 41-2-3, 41-2-4, 25-2-2 und 25-2-6 wurden auf Endkonzentrationen von 3,1 ug/ml, 12,5 ug/ml, 50 ug/ml bzw. 12,5 ug/ml hergestellt bevor 100 ul Aliquots in die Vertiefungen gefüllt wurden. Die Seren oder das Plasma für Assays mit 41-2-2, 41-2-3, 41-2-4, 25-2-2 und 25-2-6 wurden, wie oben beschrieben, 1 : 41 verdünnt, dann für 30 Minuten bei 37 ºC inkubiert nachdem sie in die Vertiefungen eingefüllt worden waren. Alle anderen Bedingungen und Reagenzien waren, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Inkubation mit dem Konjugat bei 37 ºC für 30 Minuten durchgeführt wurde, und die Inkubation mit dem Substrat war bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
ELISAs unter Verwendung von zerstörtem HIV-1 wurden auf käuflich erhältlichen LAV-EIA-Platten (Genetic Systems, Seattle, WA) unter Verwendung des in CEM gewachsenen LAV-1-Isolats durchgeführt. ELISAs unter Verwendung von zerstörtem LAV-2, das auf Mikrowell-Platten aufgetragen worden war, wurden unter Verwendung der ROD-Isolate von LAV-2 ähnlich hergestellt. Die Assays wurden im wesentlichen, wie oben beschrieben, durchgeführt.

6.2 ANALYSE DURCH WESTERN-IMMUNOBLOT UND RADIOIMMUNOPRÄZIPITATIONSASSAY

Testseren wurden durch Western-Immunoblot und Radioimmunopräzipitation auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen spezifische Proteine und Glykoproteine von HIV-1 und LAV-2 analysiert. Für Immunoblotting wurden virale Extrakte aus CEM-Zellen infiziert mit HIV-1 (LAV-1-Isolat) oder LAV-2 (ROD-Isolat) adaptiert auf lytisches Wachstum, hergestellt. Das Virus wurde aus Zellkulturüberständen unter Verwendung der tangentiellen Fließfiltration und Sucrosegradienten-Zentrifugation gereinigt. Das konzentrierte Virus wurde dann in SDS-PAGE-Probenpuffer zerstört und die Proteine durch Polyacrylamid-Gradientengel-Elektrophorese (7,0 bis 15,0%) aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembran (NCM) durch Elektrophorese, die für vier Stunden bei 25 V in 25 mM Natriumphosphat (pH 7,0) durchgeführt worden war, übertragen. Nach der Übertragung wurde die NCM durch Inkubation in Blotto für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert, um nicht-spezifische Wechselwirkungen zu verhindern. Die NCM wurde mit Serum, das 1 : 100 in Blotto verdünnt worden war, über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und mit drei Wechseln von PBS-Tween gespült. Im zweiten Schritt wurde die NCM mit Anti- Mensch-IgG-Meerrettichperoxidase, verdünnt 1 : 10.000 in Blotto, für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dieser Inkubation folgte Waschen mit PBS-Tween und dann Eintauchen in Meerrettichperoxidase-Farbentwicklungslösung (0,5 mg/ml 4-Chloro-1-naphthol, 0,015% H&sub2;0&sub2; in Tris-gepufferter Kochsalzlösung) für 20 Minuten. Die Reaktion wurde durch Eintauchen in deionisiertes Wasser gestoppt.
Um virale Extrakte für die Radioimmunopräzipitation herzustellen, wenn infizierte CEM-Zellkulturen einen reversen Transkripitase-Aktivitätslevel größer als 1 · 10&sup6; cpm/ml erreichten, wurden die Zellen in Markierungs-Medien enthaltend ³&sup5;S- Methionin (0,05 mCi/ml) oder ³H-Glukosamin (0,025 mCi/ml) transferiert, dann für 24 Stunden inkubiert. Das Virus wurde aus Zellkulturüberständen (100.000 · g) gereinigt und Detergenzienextrakte unter Verwendung von P-RIPA-Puffer (PBS enthaltend 1,0% Triton X-100, 1,0% Deoxycholat, 0,1% Natriumdodecylsulfat und 1% Aprotinin) hergestellt. Ähnliche Extrakte wurden aus nicht-infizierten CEM-Zellen hergestellt. Immunopräzipitationsassays wurden mit 100 ul des Virusextrakt, der mit 5 ul Serum für eine Stunde auf Eis inkubiert worden war, durchgeführt. Immunopräzipitin (100 ul, BRL, Bethesda, MD) resupendiert in P-RIPA- Puffer enthaltend 1,0% Ovalbumin wurde zu jeder Probe hinzugefügt und für zusätzliche 30 Minuten inkubiert. Die gebundenen Komplexe wurden gewaschen und durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (15% Acrylamid-DATD-Gele hergestellt bei einem Verhältnis von 30% Acrylamid zu 1,2% DATD) aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele fixiert, in EnHance (New England Nuclear, Boston, MA) eingeweicht, getrocknet und ein Kodak EX-5-Film aufgesetzt.
Die Kriterien für positive Ergebnisse in Western Blots und RIPs waren die Anwesenheit von Antikörpern gegen mindestens eines der Hüllglykoproteine: gp110 und gp41 für HIV-1 und gp140 für LAV-2, mit oder ohne Antikörper gegen die Kernproteine p18 und p25 für HIV-1 und p16 und p26 für LAV-2. Seren mit Banden gegen nur innere Proteine wurden nicht als wirklich positiv eingestuft. Siehe Ray et al., Lancet 2 : 1391-1392 (1986).
Die Ergebnisse des Serum- und Plasma-"Screenings" mit den Peptiden 41-2-1 und 41-2-2 sind in Tabelle I gezeigt und werden wie folgt zusammengefaßt: Von den 22 für Antikörper gegen LAV-2 positiven Proben, wie sie entweder durch Immuno- Blot oder Radioimmunopräzipitation bestimmt worden waren, detektierten die ELISAs unter Verwendung der LAV-2-viralen Lysate 21 als positiv, Peptid 41-2-1 detektierte 19 als positiv und Peptid 39 (HIV-1) detektierte keines. Von den neun mit Peptid 41-2-2 getesteten Proben waren alle korrekt identifiziert. Die Spezifizität der Peptide 41-2-1 und 41-2-2 für Antikörper gegen LAV-2 wird durch ihren Mangel an Reaktivität mit Antikörpern gegen HIV-1 gezeigt. Die Peptide 41-2-1 und 41-2-2 reagierten mit keiner der 16 Proben, die durch Western Blot als positiv für Antikörper gegen HIV-1 bestimmt worden waren, während Peptid 39 (HIV-1- spezifisch) alle als positiv detektierte.
Die Ergebnisse des Serum- und Plasma-"Screenings" mit den Peptiden 41-2-3, 41-2-4, 25-2-2 und 25-2-6 sind in Tabelle II gezeigt. Von den 10 Proben, die Antikörper gegen LAV-2 enthielten und durch die Peptide 41-2-3 und 41-2-4 getestet worden waren, wurden alle als positiv detektiert und keines der Peptide zeigte Kreuzreaktionen mit Proben, die Antikörper gegen HIV-1 enthielten. Die gag- Peptide 25-2-2 und 25-2-6 wurden gegen eine begrenzte Anzahl von LAV-2 positiven Seren getestet, aber sie detektierten alle als positiv. Eine HIV-1-positive Probe war reaktiv mit Peptid 25-2-2.
Die vorliegende Erfindung wurde im Detail mit besonderer Bezugnahme auf die obigen Ausführungsformen beschrieben. Dies soll jedoch so verstanden werden, daß die vorliegende Erfindung in ihrem Umfang nicht durch die gezeigten Ausführungsbeispiele beschränkt ist, welche nur als Erläuterungen der Aspekte der Erfindung gedacht sind. TABELLE I VERGLEICH DER PEPTIDE 41-2-1, 41-2-2 UND 39 MIT LAV-2-LYSATEN FÜR DIE DETEKTION DER ANTIKÖRPER GEGEN LAV-2 ELISA Western Blot Serum Nr. Peptid TABELLE I, (Fortsetzung) ELISA Western Blot Serum Nr. Peptid
¹ N.D. = nicht bestimmt.
² Dieses Serum war negativ für Antikörper gegen HIV-1, wie es durch Radioimmunopräzipitationsassay bestimmt worden war.
³ NHS-1 und -2 sind normale menschliche Seren, die als Negativkontrollen dienten. Die Abschalt-Werte in den ELISAs sind als Mittel der Negativkontrollen plus 0,225 O.D.-Einheiten berechnet.
&sup4; Dieser Wert ist das Mittel von 13 normalen menschlichen Seren, die mit Peptid 41-2-2 getestet worden waren, obwohl die Seren NHS-1 und -2 nicht in dieser Gruppe enthalten waren. TABELLE II REAKTIVITÄT DER PEPTIDE 41-2-3, 41-2-4, 25-2-2 UND 25-2-6 IN ELISAS FÜR DIE DETEKTION DER ANTIKÖRPER GEGEN LAV-2 ODER HIV-1 Serum Nr. Antikörperstatus Peptid TABELLE II, (Fortsetzung) Serum Nr. Antikörperstatus Peptid (Cutoff³) "Abschalt"³
¹ Vorhandensein von Antikörpern gegen LAV-2 ("LAV-2 +") oder HIV-1 ("HIV-1 +") wurde durch Western Blot oder Radioimmunopräzipitation, wie in Tabelle 1 gezeigt, bestätigt.
² N.D. = nicht bestimmt
³ Abschalt-Werte wurden als Mittel von mindestens acht Negativkontrollseren plus 0,225 O.D.-Einheiten berechnet.

Claims

1. Peptid oder Protein, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:

worin Y und Y' jeweils einen Aminosäurerest umfassen, und n und n' jeweils eine ganze Zahl von mindestens 0 umfassen.

2. Peptid oder Protein, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:

worin Y und Y', wenn vorhanden, jeweils eine oder mehrere Aminosäurereste bedeuten, n and n' jeweils ganze Zahlen von mindestens 0 sind, und das Peptid oder Protein mit einem Antikörper reagiert, der mit einem Epitop des Peptids oder Proteins reagiert, wenn n und n' 0 sind.

3. Peptid oder Protein, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:

Val-Cys-Y'n,

worin Y und Y', wenn vorhanden, jeweils eine oder mehrere Aminosäurereste bedeuten, n und n' jeweils ganze Zahlen von mindestens 0 sind, und das Peptid oder Protein mit einem Antikörper reagiert, der mit einem Epitop des Peptids oder Proteins reagiert, wenn n und n' 0 sind.

4. Peptid oder Protein umfassend die folgende Aminosäuresequenz:

5. Peptid oder Protein, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:

6. Peptid- oder Protein-Zusammensetzung, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:

7. Peptid oder Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin Y Arginin, Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure umfaßt, so daß das Peptid oder Protein an ein weiteres Peptid, ein Makromolekül oder einen festen Träger gebunden sein kann.

8. Peptid oder Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin Y' Arginin, Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure umfaßt, so daß das Peptid oder Protein an ein weiteres Peptid, ein Makromolekül oder einen festen Träger gebunden sein kann.

9. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Aminosäuresequenz durch die Substitution, Addition oder Deletion von nicht mehr als 20% der Aminosäurereste modifiziert ist, so daß das modifizierte Peptid im wesentlichen die gesamte immunologische Reaktivität des nicht-modifizierten Peptids beibehält.

10. Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von Antikörpern gegen LAV-2 in einer Körperflüssigkeit, umfassend:

(a) Inkontaktbringen der Körperflüssigkeit unter Bedingungen, die eine immunspezifische Bindung erlauben, wodurch ein Reaktionsgemisch gebildet wird, mit einer Zusammensetzung, die mindestens ein Peptid oder Protein enthält, das die folgende Aminosäuresequenz umfaßt, wo Oligopeptide mit mindestens 5 Aminosäuren, die in der Sequenz von mindestens einer der folgenden Peptidsequenzen vorkommen, lineare Epitope in einer solchen Sequenz umfassen:

worin Y und Y' jeweils einen Aminosäurerest umfassen, n und n' jeweils eine ganze Zahl von mindestens 0 umfassen, und das Peptid oder Protein mit einem Antikörper reagiert, der mit einem Epitop des Peptids oder Proteins reagiert, wenn n und n' 0 sind,

(b) Nachweis, ob eine immunspezifische Bindung zwischen dem Peptid und einer Antikörperkomponente der Körperflüssigkeit stattgefunden hat, worin der Nachweis der immunspezifischen Bindung auf das Vorliegen von Antikörpern gegen LAV-2 in der Körperflüssigkeit hinweist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin das Peptid mit einem Träger-Makromolekül konjugiert ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, worin das Peptid immobilisiert ist.

13. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Zusammensetzung mindestens ein Peptid, ausgewählt aus einem Hüllprotein, und eines, ausgewählt aus einer Kernregion von LAV-2, umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 10, worin das Peptid durch die Substitution, Addition oder Deletion von nicht mehr als 20% der Aminosäurereste modifiziert ist, so daß das modifizierte Peptid im wesentlichen die gesamte immunologische Reaktivität des nicht-modifizierten Peptids beibehält.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die immunologische Reaktivität gemessen wird durch ein Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe von Radioimmunpräzipitation, Immunfluoreszenz und ELISA.

16. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend die Synthese der Amminosäuresequenzen davon.

17. Verfahren zur Herstellung eines Tests oder einer Zusammensetzung, z. B. einer Vakzine, umfassend die Formulierung eines Peptids oder eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9.