DE3850745T2 - Verfahren zur Reinigung von rückständigen Tumorzellen in vitro mit lymphokinaktivierten zytotoxischen Zellen. - Google Patents

Description

• Vorliegende Erfindung stellt ein Zellpräparat zur Verwendung bei der Repopulation und Regeneration des Blutbildungssystems eines Patienten, der an der neoplastischen Krankheit (Neubildung von Tumoren) leidet, bereit, wobei das Zellpräparat durch Reinigung von rückständigen Tumorzellen aus einem Zellpräparat, das aus autologem peripheren Blut abgeleitet wird und das hämatopoetische Vorläuferzellen (Blutbildungsvorläuferzellen) enthält, hergestellt wird durch die In-vitro-Behandlung des Zellpräparats mit lymphokinaktivierten zytotoxischen Zellen, und wobei das Zellpräparat durch Isolierung von Zellen mit geringer Schwebedichte aus mononukleären peripheren Blutzellen oder durch Trennverfahren auf der Grundlage der Zellgröße oder des Vorhandenseins bestimmter Zelloberflächenantigene mit hämatopoetischen Vorläuferzellen (Blutbildungsvorläuferzellen) angereichert wird.
• Leukämie ist eine Art der Krebserkrankung, welche die weißen Blutkörperchen (WBC) befällt. Es gibt verschiedene Typen der Leukämie, die jeweils eine spezielle Komponente der weißen Blutkörperchen befallen. Zu den befallenen weißen Blutkörperchen gehören beispielsweise B-Zellen (die Langerhans' Inseln) (z. B. die akute Lymphoblast-Leukämie oder "ALL") und Granulozyten (z. B. die akute myelogene Leukämie oder "AML"). Im typischen Fall werden diese leukämischen Zellen durch (1) verschiedene morphologische Merkmale, (2) geringe Reaktion auf normale regulatorische Mechanismen, (3) die verminderte Fähigkeit zur Zelldifferentierung und (4) die Fähigkeit zur Unterdrückung des Wachstums der normalen Myeloid- oder Lymphoidzellen identifiziert. Eine ausführlichere klinische Beschreibung der Leukämie und der verschiedenen Formen, die sie annehmen kann, wird in Scientific American, Medicine, Bd. 1, 5:VIII (1987), gegeben.
• Zu den gegenwärtig bei Leukämie verordneten Behandlungsmethoden gehören die Ganzkörperbestrahlung und die Chemotherapie. Diese beiden Behandlungsmethoden werfen jedoch ein schwerwiegendes klinisches Problem auf: da Leukämie eine Krebserkrankung des Blutes ist, müssen alle Zellen im Blut und alle Zellen, die aus dem Knochenmark hervorgehen (und die dann in das Blut wandern) behandelt (d. h., zerstört oder abgetötet) werden, um die Vernichtung der neoplastischen Zellen zu gewährleisten. Durch die Vernichtung all dieser Zellen gerät der Patient in einen Zustand schwerer Immunsuppression, der ebenso tödlich wie die Leukämie sein kann, daher ist also die Wiederherstellung der Blutkomponenten erforderlich. In diesem Fall erhält der Patient im typischen Fall ein Knochenmarktransplantat oder eine Infusion, um die durch die Behandlung zerstörten Komponenten zu ersetzen.
• Sowohl im Knochenmark als auch im Blut sind Zellen vorhanden, die als hämatopoetische Vorläuferzellen (Blutbildungsvorläuferzellen) (HP- Zellen) bekannt sind. Diese Zellen differentieren sich in Reaktion auf kolonie-stimulierende Faktoren und führen letztlich zur Bildung der verschiedenen Komponenten des Blutes (d. h., der Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten). Wenn also das Blutbildungssystem wiederhergestellt werden soll, muß man als Ansatzpunkt die HP-Zellen auswählen.
• Vorzugsweise sollten HP-Zellen aus dem autologen Knochenmark oder peripheren Blut für die Wiederherstellung des Blutbildungssystems genutzt werden. Durch die Verwendung einer autologen Quelle werden die schwerwiegenden Komplikationen, beispielsweise Abstoßung des Spendergewebes, vermieden, die bei der Verwendung von körperfremdem Gewebe auftreten. Ein Problem aber tritt bei der Verwendung einer autologen Quelle auf, wenn nämlich die HP-Zellen nicht rein sind, werden zusammen mit den HP-Zellen rückständige Tumorzellen isoliert, und der Patient wird letztlich wieder von der neoplastischen Krankheit (der Neubildung von Tumoren) befallen.
• Es wurde wenigstens eine Methode zur Isolierung reiner HP-Zellen vorgeschlagen. Civin u. a. haben einen monoklonalen Antikörper (anti-My- 10, ATCC HB-8483) identifiziert, der für ein HP-Zellen-Oberflächenantigen spezifisch ist und dazu verwendet werden kann, nur HP-Zellen aus dem Knochenmark eines Patienten zu isolieren. Siehe Civin u. a., Exp. Hematol. 15 : 10 (1987). Dieser monoklonale Antikörper bewirkt nichts an den rückständigen Tumorzellen im Knochenmark oder im Blut, sondern dient nur dazu, die HP-Zellkomponente zu reinigen.
• Als Alternative dazu ist bekannt, daß es im Blut eine Untermenge der Lymphozytpopulation gibt, die bestimmte Tumorzellen zerstört. Diese Untermenge wurde als natürliche Killerzellen (NK-Zellen) identifiziert. Diese natürlichen Killerzellen sind aber nicht nur gegen bestimmte Tumorzellen wirksam; wenn sie mit einem Lymphokin aktiviert werden, steigern sie auch deren Effektivität und erweitern den Bereich der Tumore, die abgetötet werden können. Kürzlich wurden von Rosenberg in US-PS 4 690 915 lymphokinaktivierte Killerzellen (LAK-Zellen) in Kombination mit rekombinantem Interleukin-2 (rIL-2) eingesetzt, um Patienten mit bestimmten festen Tumoren in vivo zu behandeln. Rosenberg stellt jedoch fest, daß bei dieser Behandlungsmethode signifikante Nebenwirkungen auftreten, und er beschreibt oder bringt diese Behandlungsmethode nicht in Verbindung mit der In-vitro-Isolierung und Reinigung von autologen HP- Zellen.
• Verschiedene Autoren [Blood (1987), 69, 246-254; J. Exp. Med. (1985), 162, 1512-1530; Blood (1984), 63, 260-269, und J. Imm. (1984), 133, 2933-2938] haben die Vermutung geäußert, daß die Kontrolle der Hämatopoese eine der Funktionen ist, die in vivo von natürlichen Killerzellen ausgeübt wird. Einer von ihnen [Blood (1987), 69, 246-254] beschreibt die Unterbindung der Entwicklung von Vorläuferzellen durch LAK- Zellen.
• Bisher nicht beschrieben wurde eine Methode, bei der das Zellpräparat eines Krebspatienten unter Verwendung von autologen, lymphokinaktivierten zytotoxischen Zellen von rückständigen Tumorzellen gereinigt wird.
• Folglich stellt die vorliegende Erfindung nach einem ersten Aspekt ein Zellpräparat zur Verwendung bei der Repopulation und Regeneration des Blutbildungssystems eines Patienten, der an der neoplastischen Krankheit leidet, bereit, wobei das Zellpräparat durch die Entfernung rückständiger Tumorzellen aus einem Zellpräparat, das von autologem peripheren Blut abgeleitet wird und das hämatopoetische Vorläuferzellen (Blutbildungsvorläuferzellen) enthält, hergestellt wird durch die Invitro-Behandlung des Zellpräparats mit lymphokinaktivierten zytotoxischen Zellen, und wobei das Zellpräparat durch Isolierung von Zellen mit geringer Schwebedichte aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes oder durch das Vorhandensein von bestimmten Zelloberflächenantigenen mit hämatopoetischen Vorläuferzellen angereichert wird.
• Nach einem anderen Aspekt ist die Verwendung eines Zellpräparats für die Herstellung eines pharmazeutischen Präparats für die Behandlung zur Repopulation und Regeneration des Blutbildungssystems eines Patienten, der an der neoplastischen Krankheit leidet, vorgesehen, wobei das Zellpräparat so hergestellt wird, wie das oben definiert wurde.
• Das Lymphokin kann ein Interleukin, beispielsweise rIL-2, oder ein Interferon sein. Die zytotoxischen Zellen können vom Knochenmark, aus peripherem Blut, den Lymphknoten, dem Lymphsystem, Milzzellen oder vom Thymus abgeleitet und weiter zu bestimmten Teilfraktionen verfeinert werden.
• Fig. 1 zeigt Säulendiagramme über die Bildung von hämatopoetischen Zellkolonien durch Zellen mit geringer Schwebedichte (LBD-Zellen) nach der Einwirkung von rIL-2, und
• Fig. 2 zeigt grafische Darstellungen der Zytotoxizität von aktivierten und nichtaktivierten LBD-Zellen von AML-Patienten in der Remissionsphase auf ungezüchteten Leukämiezellen (Tumor 1 und 2) und auf dem NK-resistenten Kolonkarzinom-Zellstamm (Colo-205).
• Von einem Patienten, der an der neoplastischen Krankheit leidet, wird ein autologes Zellpräparat gewonnen. Das Zellpräparat kann aus dem Knochenmark oder aus dem Blut gewonnen werden. Das Zellpräparat muß HP- Zellen oder Zellen enthalten, die ausreichend sind, um das Blutbildungssystem des Patienten im beachtlichen Maße zu repopulieren und zu regenerieren.
• Bei der Gewinnung des Zellpräparats, das die HP-Zellen enthält, wird auch ein Präparat von autologen zytotoxischen Zellen gewonnen. Als Quelle für die zytotoxischen Zellen können das Blut, die Lymphknoten, das Lymphsystem, Milzzellen und der Thymus dienen. Die zytotoxischen Zellen aus diesen Quellen werden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit ausgewählt, durch Lymphokine zur Zerstörung rückständiger Tumorzellen aktiviert zu werden.
• Die Lymphokine, welche die zytotoxischen Zellen aktivieren, können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Interleukinen und Interferonen besteht.
• Nachdem das zytotoxische Zellpräparat gewonnen worden ist, wird es einer ausreichenden Menge von Lymphokin ausgesetzt, um die zytotoxischen Zellen zu aktivieren. Danach werden die aktivierten zytotoxischen Zellen über eine ausreichende Zeitspanne mit dem Zellpräparat kombiniert, um alle rückständigen Tumorzellen zu zerstören. Sobald die rückständigen Tumorzellen aufgebraucht sind, kann das Zellpräparat rekonstituiert und dem Patienten wieder zugeführt werden, der nach den Standardmethoden von Bestrahlung, Chemotherapie oder nach jeder anderen Methode, die angewendet wird, um Tumorzellen im lebenden Menschen zu zerstören, behandelt worden ist.
• Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel, wird ein Zellpräparat von mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMC) von einem Krebspatienten, der sich in einer Phase der vorübergehenden Besserung (Remission) befindet, isoliert. Die Fraktion der Zellen mit geringer Schwebedichte (LBD-Fraktion) der mononukleären Zellen des peripheren Bluts wird isoliert, um das Zellpräparat mit HP-Zellen anzureichern. Das geschieht unter Anwendung der diskontinuierlichen Percoll-Gradientenzentrifugation. HP-Zellen (CD34&spplus;, identifiziert durch den monoklonalen Antikörper anti- HPCA-1, kommerziell erhältlich von Becton Dickinson Immunocytometry Systems), weisen in der Regel weniger als 2% der PBMC-Zellen von normalem Blut und 4 bis 10% an LBD-Zellen auf. Als Alternative dazu kann das Zellpräparat nach anderen Methoden gewonnen werden, bei denen Zellen auf der Grundlage ihrer Größe oder der Schwebedichte nach Standardverfahren, beispielsweise der Leukophorese, getrennt werden.
• LBD-Zellen, die aus PBMC-Zellen isoliert werden, weisen auch 45 bis 60% NK-Zellen (Leu19&spplus;, CD16&spplus;, CD3&supmin;) und 35 bis 50% T-Zellen (CD3&spplus;) auf. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird daher die Quelle für die zytotoxischen Zellen zusammen mit dem Zellpräparat isoliert. Rekombinantes Interleukin-2 (rIL-2) kann als solches dem Zellpräparat direkt in ausreichenden Mengen zugesetzt werden, um die zytotoxischen NK-Zellen darin zu aktivieren.
• Nach der Behandlung des Patienten durch Bestrahlung, Chemotherapie oder mit jedem anderen Mittel, das vom behandelnden Arzt angewiesen wurde, wird das Zellpräparat, das mit Lymphokin aktiviert wurde, um die zytotoxischen Zellen zu aktivieren, dem Patienten nach Standardmethoden wieder zugeführt.
• Die Wirksamkeit von rIL-2 bei der Aktivierung von NK-Zellen und bei der Zerstörung von Tumorzellen ohne jede schädliche Beeinträchtigung der HP-Zellen des peripheren Blutes kann den nachfolgenden Beispielen entnommen werden.
• Aus Blut, dessen Monozyten und B-Zellen erschöpft waren, wurden PBMC-Zellen nach Standardmethoden isoliert. Aus den PBMC-Zellen wurden LBD-Zellen durch die oben beschriebene Percoll-Gradientenzentrifugation isoliert. Das Vorhandensein von HP-Zellen in diesem Zellpräparat wurde durch den Einsatz von anti-HPCA-1 nachgewiesen. Die HP-Zellen wurden auf einem Durchflußzytometer (FACStarTM, Becton Dickinson Immonocytometry Systems) als CD34&spplus; aussortiert und dann in Methylcellulosekolonien gezogen, um die Fähigkeit der HP-Zellen zur Differentierung zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt. TABELLE I Bildung von hämatopoetischen Kolonien durch CD34&spplus;-Zellen von peripherem Blut Kolonien je 1,5 · 10&sup5; Zellen Spender FACS-sortiert
• Im wesentlichen waren die CD34&spplus;-Zellen in der Lage, sich zu granulozyt-koloniebildenden Einheiten (CFU-GM), erythrozyt-wurfbildenden Einheiten (BFU-E) und granulozyt-, erythrozyt-, monozyt- und metakaryozytkoloniebildenden Einheiten (CFU-GEMM) zu differentieren. CD34&supmin;-Zellen wiesen die Fähigkeit zur Koloniebildung nicht auf.
• Um die Wirkung der aktivierten NK-Zellen auf die HP-Zellen von PBMC- Zellen zu untersuchen, wurden LBD-Zellen bei 37ºC und bei Vorhandensein von rIL-2 inkubiert. Am Tag 0, 1 und 3 wurden die Zellen zum Koloniewachstum plattiert und auf ihre durch die NK-Zellen aktivierte zytotoxische Aktivität gegenüber dem NK-sensitiven Tumor-Zellstamm K562 (Erythromyeloleukämie, ATCC-Nr. CCL 243) und den NK-resistenten Zellstämmen Daudi (Lymphoblastoid, ATCC-Nr. CCL 213) und Colo-205 (Kolonkarzinom, ATCC-Nr. CCL 222) untersucht.
• Wie aus Fig. 1(A) deutlich wird, hatte die Züchtung von LBD-Zellen für die Dauer von 3 Tagen bei Vorhandensein von rIL-2 keine hemmenden Auswirkungen auf die Bildung von hämatopoetischen Kolonien. Wie aus Fig. 1(B) deutlich wird, zeigte die Analyse der zytotoxischen Aktivität dieser LBD-Zellkulturen eindeutig, daß die NK-Zellen im wesentlichen nach 24 Stunden Kultivierung mit rIL-2 aktiviert wurden und einen maximalen Pegel des zytotoxischen Potentials nach 3 Tagen erreichten. HP-Zellen des peripheren Blutes, die länger als 3 Tage mit oder ohne NK-Zellen kultiviert wurden, wiesen einen Rückgang der Bildung hämatopoetischer Kolonien und eine Verminderung der Lebensfähigkeit auf.
• Es wurden dann Untersuchungen unter Verwendung von PBMC-Zellen von Patienten mit akuter, vom Rückenmark ausgehender Leukämie (AML), bei denen durch Chemotherapie eine frühe Remission erreicht worden war, durchgeführt. Von den AML-Remissionspatienten wurden LBD-Zellen isoliert und auf den prozentualen Anteil an NK-Zellen, T-Zellen und CD34&spplus;-HP-Zellen untersucht. Diese Patienten wiesen einen normalen Prozentsatz an NK-Zellen und leicht erhöhte Werte an CD34&spplus;-HP-Zellen auf. Wie aus Fig. 2A-D hervorgeht, waren die NK-Zellen funktionell normal und wiesen, wenn sie über Nacht mit rIL-2 aktiviert wurden, eine starke, aktivierte Zytolyse gegenüber frischen, ungezüchteten AML-Tumorzellen sowie gegenüber dem NK- resistenten, festen Tumor-Zellstamm Colo-205 auf (Fig. 2A-D).
• CD34&spplus;-Zellen von LBD-Zellen der AML-Remissionspatienten wiesen auch die Fähigkeit auf, in vitro normale hämatopoetische CFU-GM-, BFU-E- und CFU-GEMM-Kolonien zu bilden. Die rIL-2-aktivierten NK-Zellen der meisten AML-Patienten waren auch in der Lage, autologe AML-Tumorzellen wirksam aufzulösen (Tabelle 2). TABELLE 2 Auflösung von autologen Tumoren von AML-Patienten durch rIL2-aktivierte NK-Zellen Tumor-Ziele Prozentuale Zytotoxizität Effektor Zellquelle Patient
• Bei diesen Untersuchungen wurden PBMC-Zellen von AML-Patienten mit einem unterschiedlichen Prozentsatz an Tumorblasten bei Vorhandensein von rIL-2 über 10 bis 14 Tage inkubiert. Dann wurden die NK-Zellen aus diesen Kulturen unter Verwendung eines FACStarTM-Durchflußzytometers entfernt und auf ihre zytolytische Fähigkeit gegenüber einer Reihe von Tumorzellen, einschließlich des autologen ungezüchteten Tumors und frischer, ungezüchteter allogener AML-Tumore, analysiert. Bei drei von vier untersuchten Patienten waren die durch rIL-2 aktivierten NK-Zellen stark zytolytisch gegenüber dem autologen AML-Tumor sowie gegenüber den allogenen AML-Tumoren, Colo-205 und K562. Der Patient AML-3 wies ein hohes Maß an cytolytischer Aktivität gegenüber Colo-205 auf, gegenüber autologen oder allogenen AML-Tumorzellen aber war die Killerwirkung gering.

Claims (10)

1. Zellpräparat zur Verwendung bei der Repopulation und Regeneration des Blutbildungssystems eines Patienten, der an der neoplastischen Krankheit (Neubildung von Tumoren) leidet, wobei das Zellpräparat durch Reinigung von rückständigen Tumorzellen aus einem Zellpräparat, das aus autologem peripheren Blut abgeleitet wurde und das Blutbildungsvorläuferzellen (HP-Zellen) enthält, hergestellt wurde durch die In-vitro-Behandlung des Zellpräparats mit lymphokinaktivierten zytotoxischen Zellen, und bei welcher das Zellpräparat durch Isolierung von Zellen mit geringer Schwebedichte aus den mononukleären Zellen des peripheren Blutes oder durch Trennverfahren auf der Grundlage der Zellgröße oder des Vorhandenseins von bestimmten Zelloberflächenantigenen mit Blutbildungsvorläuferzellen (HP-Zellen) angereichert wird.

2. Zellpräparat nach Anspruch 1, bei welchem die zytotoxischen Zellen aus einer autologen Quelle abgeleitet werden, die peripheres Blut, Lymphknoten, das Lymphsystem, den Thymus, Knochenmark oder die Milz umfaßt.

3. Zellpräparat nach Anspruch 2, bei welchem die zytotoxischen Zellen aus peripherem Blut abgeleitet werden und NK-Zellen (natürliche Killer- Zellen) sind.

4. Zellpräparat nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei welchem das Lymphokin ein Interleukin oder Interferon aufweist.

5. Zellpräparat nach Anspruch 4, bei welchem das Lymphokin rIL-2 ist.

6. Einsatz eines Zellpräparats für die Herstellung eines pharmazeutischen Präparats bei einer Behandlung zur Repopulation und Regeneration des Blutbildungssystems eines Patienten, der an der neoplastischen Krankheit leidet, wobei das Zellpräparat durch Reinigung von rückständigen Tumorzellen aus einem Zellpräparat, das aus autologem peripheren Blut abgeleitet wurde und das Blutbildungsvorläuferzellen (HP- Zellen) enthält, hergestellt wird durch die In-vitro-Behandlung des Zellpräparats mit lymphokinaktivierten zytotoxischen Zellen, und bei welcher das Zellpräparat durch die Isolierung von Zellen mit niedriger Schwebedichte aus den mononukleären Zellen des peripheren Blutes oder durch Trennverfahren auf der Grundlage der Zellgröße oder des Vorhandenseins von bestimmten Zelloberflächenantigenen mit Blutbildungsvorläuferzellen (HP-Zellen) angereichert wird.

7. Einsatz nach Anspruch 6, bei welchem die zytotoxischen Zellen von einer autologen Quelle abgeleitet werden, die peripheres Blut, Lymphknoten, das Lymphsystem, den Thymus, Knochenmark oder die Milz umfaßt.

8. Einsatz nach Anspruch 7, bei welchem die zytotoxischen Zellen von peripherem Blut abgeleitet werden und NK-Zellen sind.

9. Einsatz nach einem der Ansprüche 6 bis 8, bei welchem das Lymphokin ein Interleukin oder Interferon aufweist.

10. Einsatz nach Anspruch 9, bei welchem das Lymphokin rIL-2 ist.